RU2610178C1

RU2610178C1 - Method of purifying filamentous bacteriophage m13

Info

Publication number: RU2610178C1
Application number: RU2015144466A
Authority: RU
Inventors: Ксения Анатольевна Иванова; Наталья Вячеславовна Волкова; Дмитрий Николаевич Щербаков; Александр Алексеевич Ильичев
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2017-02-08

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a method of purifying filamentous bacteriophage M13. Method involves removal of bacterial mass after producing bacteriophage by first and second successive centrifugation followed by first purification of supernatant of bacteriophage by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2, further third centrifuging and re-suspension of precipitate with bacteriophage, as well as repeated purification of suspension of bacteriophage by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2 and fourth centrifugation of precipitate with bacteriophage to produce end product. For isoelectric precipitation agent used is sodium acetate buffer with pH = 4.2 in ratio to supernatant of bacteriophages of not less than 3:1 at first isoelectric precipitation, precipitate with bacteriophage after third centrifugation is re-suspended in TBS-buffer, and during repeated purification of re-suspended bacteriophage by isoelectric precipitation, sodium acetate buffer with pH = 4.2 is used in ratio to re-suspended bacteriophage of not less than 1:1. First and second centrifugation is carried out at 5,000 rpm and 12,000 rpm for 10 minutes at 20 °C, and third and fourth centrifugation is carried out at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 °C.

EFFECT: invention provides a higher level of sterility and purity of bacteriophage, especially in small quantities thereof using a simpler technique.

1 cl, 7 tbl, 9 ex

Description

Изобретение относится к методам очистки бактериофагов осаждением для применения их в технологии фагового дисплея, для изготовления медицинских биологических препаратов или в качестве матрицы для наноматериалов [1] и может быть использовано в биотехнологии.The invention relates to methods for cleaning bacteriophages by sedimentation for use in phage display technology, for the manufacture of medical biological preparations or as a matrix for nanomaterials [1] and can be used in biotechnology.

Нитчатые бактериофаги (фаги) - это нелитические вирусы, инфицирующие бактерии и безопасные для человека. Фаги используются в ряде отраслей. Для борьбы с нежелательной бактериальной контаминацией, в том числе как антибактериальные препараты для обработки труднозаживающих ран, как безопасный консервант для пищевых продуктов. Нашли свое использование бактериофаги и в науке: для получения антител и пептидов в технологии фагового дисплея, генной терапии, для генно-инженерных работ и в качестве матрицы для получения наночастиц.Filamentous bacteriophages (phages) are non-lytic viruses that infect bacteria and are safe for humans. Phages are used in a number of industries. To combat unwanted bacterial contamination, including as antibacterial drugs for treating difficult to heal wounds, as a safe preservative for food. Bacteriophages also found their use in science: for producing antibodies and peptides in phage display technology, gene therapy, for genetic engineering work and as a matrix for producing nanoparticles.

Нитчатый фаг М13 имеет размер около 880 нм в длину и 6,5 нм в ширину [2], кольцевую одноцепочечную ДНК. Капсид бактериофага М13 образован 5 копиями различных минорных оболочечных белков (р3, р6, р7, р9), однако большую часть его капсида составляет мажорный оболочечный белок р8, представленный 2700 копиями. Белок р8 это небольшой, длиной 50 а.о., альфа-спиральный белок. В составе вирусной частицы этот белок уложен в виде трубчатой структуры, при этом N-конец белка направлен в сторону раствора, и С-концевые белки образуют контакт с ДНК бактериофага. Подобная укладка белка приводит к тому, что, фактически, физико-химические свойства целой частицы определяются аминокислотной последовательностью N-конца белка р8 фага М13 - AEGDDPAK. В частности, изоэлектрическую точку (значение рН, при котором суммарный заряд этой молекулы равен нулю) вирусной частицы можно определить, если определить изоэлектрическую точку пептида - AEGDDPAK. Это значение было найдено теоретически, и подтверждено экспериментально, и равно 4,2 [3].The filamentous phage M13 has a size of about 880 nm in length and 6.5 nm in width [2], circular single-stranded DNA. The capsid of bacteriophage M13 is formed by 5 copies of various minor envelope proteins (p3, p6, p7, p9), however, most of its capsid is the major envelope protein p8, represented by 2700 copies. Protein p8 is a small, 50 amino acid long, alpha-helical protein. In the composition of the viral particle, this protein is arranged in the form of a tubular structure, with the N-terminus of the protein directed towards the solution, and the C-terminal proteins form contact with the bacteriophage DNA. Such a folding of the protein leads to the fact that, in fact, the physicochemical properties of the whole particle are determined by the amino acid sequence of the N-terminus of the p8 protein of phage M13 - AEGDDPAK. In particular, the isoelectric point (the pH value at which the total charge of this molecule is zero) of the viral particle can be determined by determining the isoelectric point of the peptide — AEGDDPAK. This value was found theoretically, and confirmed experimentally, and equal to 4.2 [3].

Методы осаждения фага М13 из культуры E. coli, как правило, основаны на использовании полиэтиленгликоля. Осаждение фагов с помощью ПЭГ и NaCl основано на эффекте «высаливания». Добавление больших количеств ПЭГ совместно с высокими концентрациями NaCl экранирует поверхностный заряд вирусной частицы и увеличивает гидрофобность ее поверхности, это приводит к слипанию вирусных частиц и выпадению их в осадок.Methods for the deposition of M13 phage from E. coli culture are typically based on the use of polyethylene glycol. The deposition of phages using PEG and NaCl is based on the salting out effect. The addition of large amounts of PEG together with high concentrations of NaCl shields the surface charge of the viral particle and increases the hydrophobicity of its surface, this leads to the adhesion of the viral particles and their precipitation.

Этот подход имеет ряд очевидных недостатков: осаждение происходит длительное время, а в результате в осадке фагов присутствует ПЭГ, NaCl и остатки культуральной среды. Очистка фагов от примесей после такого осаждения весьма затруднена. Процедура диализа проводится в течение недели [4].This approach has a number of obvious drawbacks: the deposition takes a long time, and as a result, PEG, NaCl, and residues of the culture medium are present in the phage pellet. The purification of phages from impurities after such deposition is very difficult. The dialysis procedure is carried out for a week [4].

В источниках информации опубликованы данные об использовании ионнобменной и гель-проникающей хроматографии [5, 6, 7]. Однако это дорогие и трудоемкие методы для очистки фагов, которые не нашли широкого применения.Information sources published data on the use of ion exchange and gel permeation chromatography [5, 6, 7]. However, these are expensive and time-consuming methods for cleaning phages that are not widely used.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого технического решения является способ очистки нитчатого бактериофага М13, описанный в работе [4] и включающий удаление бактериальной массы после наработки бактериофага М13 путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2. Для изоэлектрического осаждения бактериофага М13 из культуральной среды используют сильную кислоту - HCl. Добавление 5М HCl проводят до значения pH 4,2, контролируя его при помощи pH-метра. После доведения значения pH до нужного, суспензию бактериофагов помещают в холодильник на 1-, 5-2 часа для образования осадка. Далее проводят третье центрифугирование и ресуспендирование осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой суспензии бактериофага изоэлектрическим осаждением 5М HCl при pH 4,2 и четвертое центрифугирование осадка с бактериофагом с получением готового продукта.The closest analogue (prototype) of the proposed technical solution is the method for purification of filamentous bacteriophage M13 described in [4] and includes the removal of bacterial mass after the accumulation of bacteriophage M13 by first and second sequential centrifugation followed by the first purification of the bacteriophage supernatant by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4, 2. For isoelectric deposition of bacteriophage M13 from the culture medium, a strong acid, HCl, is used. The addition of 5M HCl was carried out to a pH of 4.2, controlling it with a pH meter. After adjusting the pH to the desired value, the suspension of bacteriophages is placed in the refrigerator for 1-, 5-2 hours to form a precipitate. Next, a third centrifugation and resuspension of the precipitate with a bacteriophage is carried out, as well as repeated purification of the suspension of the bacteriophage by isoelectric precipitation of 5M HCl at pH 4.2 and a fourth centrifugation of the precipitate with a bacteriophage to obtain the finished product.

Однако у этого метода есть ряд недостатков. Основная сложность связана с тем, что многие процедуры при работе с бактериофагами требуют работы с небольшими объемами (500-1500 мкл). Измерение pH таких объемов является сложной процедурой. Используют специализированные электроды (нестандартное оборудование), которые снижают уровень стерильности и чистоты бактериофага или наносят аликвоту образца на специальную индикаторную бумагу, что приводит к потерям искомого продукта. Процедура доведения pH до необходимого значения с помощью кислоты или основания требует добавления их в определенном объеме. Рассчитать добавляемый объем сложно, так как необходимо учесть множество параметров (объем суспензии фага, pH среды, вещества, присутствующие в суспензии и т.д.), а добавление кислоты (щелочи) сопряжено с ошибками.However, this method has several disadvantages. The main difficulty is that many procedures when working with bacteriophages require work with small volumes (500-1500 μl). Measuring the pH of such volumes is a complex procedure. Use specialized electrodes (non-standard equipment), which reduce the level of sterility and purity of the bacteriophage or apply an aliquot of the sample to a special indicator paper, which leads to the loss of the desired product. The procedure for adjusting the pH to the desired value with an acid or base requires adding them in a certain volume. It is difficult to calculate the added volume, since it is necessary to take into account many parameters (phage suspension volume, pH of the medium, substances present in the suspension, etc.), and the addition of acid (alkali) is error-prone.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа очистки бактериофага, особенно малых его количеств, и обеспечение более высокого уровня стерильности и чистоты бактериофага.The technical result of the claimed invention is to simplify the method of cleaning the bacteriophage, especially its small amounts, and to ensure a higher level of sterility and purity of the bacteriophage.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе очистки нитчатого бактериофага М13, включающем удаление бактериальной массы после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2, последующих третьего центрифугирования и ресуспендирования осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой суспензии бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2 и четвертого центрифугирования осадка с бактериофагом с получением готового продукта, согласно изобретению для изоэлектрического осаждения в качестве реагента используют натрий-ацетатный буфер со значением pH=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофагов не менее 3:1 при первом изоэлектрическом осаждении; осадок с бактериофагами после третьего центрифугирования ресуспендировали в TBS-буфере (Tris Buffer Saline), а при повторной очистке ресуспендированного бактериофага изоэлектрическим осаждением используют натрий-ацетатный буфер со значением pH=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1.The specified technical result is achieved by the fact that in the method for purifying filamentous bacteriophage M13, which involves removing the bacterial mass after the bacteriophage has been accumulated by first and second sequential centrifugation followed by first purification of the bacteriophage supernatant by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2, subsequent third centrifugation and resuspension of the pellet with the bacteriophage and also by re-cleaning the suspension of the bacteriophage with isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2 and the fourth centrifuge ation with bacteriophage precipitate to give the final product according to the invention for isoelectric precipitation of the reagent used sodium acetate buffer with a value of pH = 4,2 with the supernatant in a ratio of bacteriophages at least 3: 1 in the first isoelectric precipitation; after the third centrifugation, the pellet with bacteriophages was resuspended in a TBS buffer (Tris Buffer Saline), and when re-purifying the resuspended bacteriophage with isoelectric precipitation, sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 in relation to the resuspended bacteriophage was not less than 1: 1.

Причем первое и второе центрифугирование проводят соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С, а третье и четвертое центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С.Moreover, the first and second centrifugation is carried out respectively at 5000 rpm and 12000 rpm for 10 minutes at 20 ° C, and the third and fourth centrifugation is carried out at 10000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.

Изоэлектрическое осаждение фаговых частиц с помощью буфера имеет несколько преимуществ. В первую очередь это простота: для осаждения достаточно добавить определенный объем буферного раствора, при этом нет необходимости измерять значение pH, так как буфер сохраняет необходимое для осаждения бактериофагов значение pH. Осадок бактериофагов, полученный в результате очистки, промывается водой, остатки культуральной среды легко удаляются центрифугированием за минимальное время. Значение pH можно довести добавлением кислоты или щелочи, как это делают в прототипе, но при этом существует высокая вероятность ошибки, а данный метод требует точности. Использование буфера исключает такую ошибку, и даже при больших объемах, остается дешевым способом по сравнению с использованием полиэтиленгликоля.The isoelectric deposition of phage particles using a buffer has several advantages. First of all, it is simplicity: for precipitation it is enough to add a certain volume of buffer solution, and there is no need to measure the pH value, since the buffer stores the pH value necessary for the precipitation of bacteriophages. The precipitate of bacteriophages resulting from purification is washed with water, the remains of the culture medium are easily removed by centrifugation in a minimum time. The pH value can be adjusted by adding acid or alkali, as is done in the prototype, but there is a high probability of error, and this method requires accuracy. Using a buffer eliminates this error, and even with large volumes, it remains a cheap method compared to using polyethylene glycol.

Важным преимуществом является чистота получаемых таким способом препаратов бактериофагов. Использование буфера в качестве осадителя позволяет избежать попадания в препарат нежелательных примесей, таких как ПЭГ в случае осаждения способом ПЭГ - NaCl. Буферная система в заявляемом способе готовится заранее, автоклавируется и в него больше не вносится никаких реагентов или технических средств контроля pH, например, электроды, а в прототипе для достижения изоэлектрической точки требуется добавление реагентов и введения электродов pH-метра для контроля концентрации ионов водорода.An important advantage is the purity of bacteriophage preparations obtained in this way. The use of a buffer as a precipitant allows avoiding the ingress of undesirable impurities into the preparation, such as PEG in the case of precipitation by the PEG - NaCl method. The buffer system in the inventive method is prepared in advance, autoclaved and no pH reagents or technical means are added to it, for example, electrodes, and in the prototype, to achieve the isoelectric point, the addition of reagents and the introduction of pH meter electrodes to control the concentration of hydrogen ions are required.

Бактериофаги обычно стабильны в диапазоне pH от 5 до 8 [8], изоэлектрическая точка бактериофага М13 лежит ниже этих значений, однако, в данной работе было показано, что низкое значение pH используемого буфера не влияет на жизнеспособность фага М13, результат представлен в таблице 5.Bacteriophages are usually stable in the pH range from 5 to 8 [8], the isoelectric point of the bacteriophage M13 lies below these values, however, in this work it was shown that the low pH of the buffer used does not affect the viability of the M13 phage, the result is shown in Table 5.

Способ очистки нитчатого бактериофага М13 осуществляют следующим образом. Вначале удаляют бактериальную массу после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С. Далее проводят первую очистку супернатанта бактериофага М13 изоэлектрическим его осаждением натрий-ацетатным буфером со значением pH=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофага не менее 3:1. Третье центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Осадок бактериофага М13 ресуспендируют в TBS-буфере (Tris Buffer Sa line) и повторно очищают осаждением. Для этого ресуспендированный бактериофаг смешивают с натрий-ацетатным буфером со значением pH=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1 с последующим четвертым центрифугированием осадка с бактериофагом при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С с получением чистого продукта бактериофага М13.The method of purification of filamentous bacteriophage M13 is as follows. First, the bacterial mass is removed after the accumulation of the bacteriophage by first and second sequential centrifugation at 5000 rpm and 12000 rpm, respectively, for 10 minutes at 20 ° C. Next, the first purification of the supernatant of bacteriophage M13 is carried out by its isoelectric precipitation with sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 in the ratio with the supernatant of the bacteriophage at least 3: 1. The third centrifugation is carried out at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The pellet of bacteriophage M13 is resuspended in a TBS buffer (Tris Buffer Sa line) and re-purified by precipitation. To do this, the resuspended bacteriophage is mixed with sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 in relation to the resuspended bacteriophage at least 1: 1, followed by fourth centrifugation of the pellet with the bacteriophage at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to obtain pure bacteriophage product M13.

Ниже приведены пример 1 и примеры 4-9 конкретного выполнения заявленного способа очистки нитчатого бактериофага М13, а для сравнения воспроизведены способ-аналог (пример 2) и способ-прототип (пример 3).The following are example 1 and examples 4-9 of a specific implementation of the claimed method for purification of filamentous bacteriophage M13, and for comparison, the analogue method (example 2) and the prototype method (example 3) are reproduced.

Пример 1. Наращивание культуры фага М13.Example 1. The growth of the culture of phage M13.

Культуру наращивали в 200 мл среды LB. Состав среды: 10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, pH 7.0-7.5. В 500-миллиметровую колбу Эрленмейера приливали 200 мл среды LB, добавляли 200 мкл E.coli ER2738 и 10 мкл фаговой суспензии (примерно 1×10¹⁰ БОЕ/мл), полученной из одной отдельной колонии. Наращивание проводили при 37°С, 220 об/мин, 16 часов. Бактериальные клетки удаляли двумя последовательными центрифугированиями 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С.The culture was grown in 200 ml of LB medium. The composition of the medium: 10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l NaCl, pH 7.0-7.5. 200 ml of LB medium was poured into a 500 mm Erlenmeyer flask, 200 μl of E. coli ER2738 and 10 μl of phage suspension (approximately 1 × 10 ¹⁰ PFU / ml) obtained from one separate colony were added. The growth was carried out at 37 ° C, 220 rpm, 16 hours. Bacterial cells were removed by two sequential centrifugations of 5000 rpm and 12000 rpm for 10 minutes at 20 ° C.

Пример 2. Осаждение бактериофагов с помощью ПЭГ (аналог)Example 2. The deposition of bacteriophages using PEG (analog)

После удаления бактериального осадка (пример 1) 2.5 М NaCl / 20% PEG-8000 добавляли к супернатанту в соотношении 4:1. Осторожно перемешали, оставили на ночь для преципитации при 4°С. Фаги осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 4°С, 13000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл деионизированной воды.After removing the bacterial sediment (Example 1), 2.5 M NaCl / 20% PEG-8000 was added to the supernatant in a 4: 1 ratio. Gently mixed, left overnight for precipitation at 4 ° C. Phages were besieged by centrifugation for 10 minutes at 4 ° C, 13000 rpm. The supernatant was removed, the precipitate was resuspended in 10 ml of deionized water.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - сутки. Однако в полученном препарате фагов даже после кратных осаждений присутствуют остатки ПЭГ, что подтверждается качественной реакцией с тиоцианатом железа. В работе [4] фаговую суспензию очищали от остатков ПЭГ с помощью диализа в течение 7 суток, но даже после этого качественная реакция с тиоцианатом железа давала положительный результат.The total time required to clear the phages as described above is 24 hours. However, even after multiple precipitations, the resulting phage preparation contains PEG residues, which is confirmed by a qualitative reaction with iron thiocyanate. In [4], the phage suspension was purified from PEG residues by dialysis for 7 days, but even after that, a qualitative reaction with iron thiocyanate gave a positive result.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа. Кратное переосаждение с уменьшением объема ПЭГ привело к снижению титра на порядок, таблица 1.The titer of viable bacteriophages was determined by the Grazia method. Multiple reprecipitation with a decrease in PEG volume led to a decrease in titer by an order of magnitude, table 1.

Пример 3. Изоэлектрическое осаждение бактериофагов с помощью HCl (повторение методики прототипа).Example 3. Isoelectric deposition of bacteriophages using HCl (repetition of the prototype methodology).

После удаления бактериального осадка (Пример 1) pH супернатанта с бактериофагами выровняли до значения 4,2 с помощью 5М HCl. После осторожного перемешивания осадок с бактериофагами осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 20°С, 13000 об/мин. Супернатант удаляли, для удаления остатков LB среды осадок промывали 40 мл деионизированной воды, осторожно перемешивая, фаги осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 20°С, 13000 об/мин.After removing the bacterial sediment (Example 1), the pH of the supernatant with bacteriophages was adjusted to a value of 4.2 using 5M HCl. After careful mixing, the pellet with bacteriophages was precipitated by centrifugation for 10 minutes at 20 ° C, 13000 rpm. The supernatant was removed, to remove residual LB medium, the precipitate was washed with 40 ml of deionized water, stirring carefully, the phages were precipitated by centrifugation for 10 minutes at 20 ° С, 13000 rpm.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - 2 часа. Очистка полученного препарата фагов от ионов хлора не требуется, но полученный вышеописанным способом препарат содержит остатки бактериальной массы и нуждается в дополнительной очистке.The total time required to clean the phages as described above is 2 hours. Purification of the resulting phage preparation from chlorine ions is not required, but the preparation obtained by the above method contains the remains of the bacterial mass and needs further purification.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, он составил 10¹¹ БОЕ/мл.The titer of viable bacteriophages was determined by the Grazia method; it amounted to 10 ¹¹ PFU / ml.

Пример 4. Приготовление натрий-ацетатного буфера по заявляемому способуExample 4. The preparation of sodium acetate buffer according to the claimed method

Для приготовления натрий-ацетатного буфера со значением рН=4,2 использовали 0,2М раствор уксусной кислоты и 0,2М раствор ацетата натрия в пропорции 73,5:26,5 соответственно. 0,2М раствор уксусной кислоты готовили из расчета 1,2 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл воды; 0,2М раствор ацетата натрия готовили, используя тригидрат ацетата натрия из расчета 2,72 г на 100 мл воды.To prepare the sodium acetate buffer with a pH value of 4.2, we used a 0.2 M solution of acetic acid and a 0.2 M solution of sodium acetate in a ratio of 73.5: 26.5, respectively. A 0.2 M solution of acetic acid was prepared at the rate of 1.2 ml of glacial acetic acid per 100 ml of water; A 0.2 M sodium acetate solution was prepared using sodium acetate trihydrate at a rate of 2.72 g per 100 ml of water.

Для измерения pH использовали pH-метр Sartorius РВ-11.To measure the pH, a Sartorius PB-11 pH meter was used.

Пример 5. Определение объема натрий-ацетатного буфера со значением рН=4,2, необходимого для осаждения фагов из культуральной среды LBExample 5. Determination of the volume of sodium acetate buffer with a pH value of 4.2, necessary for the deposition of phages from the culture medium LB

Исходная среда LB имела значение рН=7,4. После удаления бактериального осадка (Пример 1) среда LB с бактериофагами имела значение рН=7,38. При добавлении трех объемов буфера значение pH достигало 4,29 - верхнего допустимого значения. При этом значении бактериофаги выпадали в осадок. Результаты осаждения представлены в таблице 2, эксперимент проведен в 14 повторностях.The initial LB medium had a pH value of 7.4. After removal of the bacterial sediment (Example 1), LB medium with bacteriophages had a pH value of 7.38. With the addition of three volumes of buffer, the pH reached 4.29, the highest acceptable value. At this value, bacteriophages precipitated. The deposition results are presented in table 2, the experiment was conducted in 14 replicates.

Таким образом, экспериментально было определено, что для осаждения бактериофагов из культуральной среды LB необходимо добавить не менее трех объемов натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2.Thus, it was experimentally determined that for the precipitation of bacteriophages from the LB culture medium, it is necessary to add at least three volumes of sodium acetate buffer with a pH value of 4.2.

После добавления буфера, бактериофаги охлаждали во льду в течение часа, центрифугировали 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.After adding the buffer, bacteriophages were cooled in ice for one hour, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the pellet was resuspended in TBS buffer. The suspension was centrifuged to remove residual bacterial mass, the phage supernatant was transferred to a clean tube.

Пример 6. Определение объема натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2, необходимого для осаждения фагов из буфера TBS (Tris-buffered saline)Example 6. Determination of the volume of sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 required for the deposition of phages from TBS buffer (Tris-buffered saline)

Исходный буфер TBS для ресуспендирования бактериофагов имел значение pH=7,5. После осаждения фагов из бактериальной массы, описанного в примере 5, суспензия фагов в TBS буфере имела значение pH=6,91. При добавлении одного объема буфера значение pH достигало 4,26 - близкого к верхнему допустимому значению. При этом значении бактериофаги выпадали в осадок. Результаты осаждения представлены в таблице 3, эксперимент проведен в 8 повторностях.The initial TBS buffer for resuspending bacteriophages had a pH value of 7.5. After the phage were precipitated from the bacterial mass described in Example 5, the phage suspension in TBS buffer had a pH value of 6.91. With the addition of one volume of buffer, the pH reached 4.26 - close to the upper allowable value. At this value, bacteriophages precipitated. The deposition results are presented in table 3, the experiment was carried out in 8 replicates.

Таким образом, экспериментально было определено, что для осаждения бактериофагов из буфера TBS необходимо добавить не менее 1 объема натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2.Thus, it was experimentally determined that for the precipitation of bacteriophages from the TBS buffer, it is necessary to add at least 1 volume of sodium acetate buffer with a pH value of 4.2.

После добавления буфера, бактериофаги центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.After adding the buffer, bacteriophages were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the pellet was resuspended in TBS buffer. The suspension was centrifuged to remove residual bacterial mass, the phage supernatant was transferred to a clean tube.

Пример 7. Изоэлектрическое осаждение бактериофагов с помощью буфера заявляемым способом.Example 7. Isoelectric deposition of bacteriophages using a buffer of the claimed method.

После удаления бактериального осадка (пример 1) к супернатанту с фагами добавляли натрий-ацетатный буфер Бриттона - Вальполя (табл. 4) в количестве не менее трех объемов и осторожно перемешивали. После добавления буфера, бактериофаги центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере (Tris Buffer Saline). Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.After removal of the bacterial sediment (Example 1), the Britton – Walpole sodium acetate buffer (Table 4) was added to the supernatant with phages in an amount of at least three volumes and carefully mixed. After adding the buffer, bacteriophages were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the pellet was resuspended in TBS buffer (Tris Buffer Saline). The suspension was centrifuged to remove residual bacterial mass, the phage supernatant was transferred to a clean tube.

Полученный препарат TBS с фагами очищали повторно. Добавляли один объем натрий-ацетатного буфера, бактериофаги центрифугировали 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.The resulting phage TBS preparation was re-purified. One volume of sodium acetate buffer was added, bacteriophages were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the pellet was resuspended in TBS buffer. The suspension was centrifuged to remove residual bacterial mass, the phage supernatant was transferred to a clean tube.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - 2 ч. При необходимости сменить TBS буфер на другой раствор, возможны кратные переосаждения с помощью натрий-ацетатного буфера, титр при этом остается стабильным. Полученный препарат готов к дальнейшему использованию в ИФА, иммунизации лабораторных животных и т.д.The total time required to purify the phages as described above is 2 hours. If necessary, change the TBS buffer to another solution, multiple reprecipitation using sodium acetate buffer is possible, and the titer remains stable. The resulting preparation is ready for further use in ELISA, immunization of laboratory animals, etc.

Пример 8. Проверка жизнеспособности фага М13 в кислой средеExample 8. Verification of the viability of phage M13 in an acidic environment

Было проведено изоэлектрическое осаждение бактериофага М13 с помощью натрий-ацетатного буфера с pH=4,2 в трех повторностях, полученные фаги инкубировали 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов.The isoelectric precipitation of bacteriophage M13 was carried out using sodium acetate buffer with pH = 4.2 in triplicate, the resulting phages were incubated for 1 hour, 2 hours, 4 hours and 8 hours.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, было показано, что pH=4,2 не влияет на его жизнеспособность, результаты представлены в таблице 5.The titer of viable bacteriophages was determined by the Grazia method, it was shown that pH = 4.2 does not affect its viability, the results are presented in table 5.

Пример 9. Определение выхода нитчатого бактериофага М13 гравиметрическим методом после очистки различными способамиExample 9. Determination of the filamentous bacteriophage M13 yield by gravimetric method after purification by various methods

Осадки бактериофагов, полученные в примерах 2 и 4, были высушены в сушильном шкафу при температуре 105°С. Результат представлен в таблице 6.Precipitation of bacteriophages obtained in examples 2 and 4 were dried in an oven at a temperature of 105 ° C. The result is presented in table 6.

Препараты бактериофагов, полученные осаждением с помощью ПЭГ, содержат примеси полиэтиленгликоля и составляют около половины массы препарата. Такой вывод можно сделать, сравнивая массу препаратов фагов, полученных осаждением ПЭГ и изоэлектрическим осаждением и имеющих одинаковое количество жизнеспособных частиц.Bacteriophage preparations obtained by PEG precipitation contain impurities of polyethylene glycol and make up about half the mass of the preparation. This conclusion can be made by comparing the mass of phage preparations obtained by PEG deposition and isoelectric deposition and having the same number of viable particles.

Из вышеприведенных результатов (примеры 1-9) следует, что разработан новый способ очистки бактериофагов, обеспечивающий достижение заявляемого технического результата, который заключается в упрощении способа очистки бактериофага, особенно малых его количеств, и обеспечение более высокого уровня стерильности и чистоты бактериофага.From the above results (examples 1-9) it follows that a new method for cleaning bacteriophages has been developed, which ensures the achievement of the claimed technical result, which consists in simplifying the method for cleaning bacteriophages, especially small amounts, and ensuring a higher level of sterility and purity of the bacteriophage.

Источники научно-технической информацииSources of scientific and technical information

1. Rakonjac J, Bennett NJ, Spagnuolo J, Gagic D, Russel M (2011) Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Mol Biol 13: 51-761. Rakonjac J, Bennett NJ, Spagnuolo J, Gagic D, Russel M (2011) Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Mol Biol 13: 51-76

2. Chung WJ, Oh JW, Kwak K, Lee BY, Meyer J, Wang E, Hexemer A, Lee SW (2011) Biomimetic self-templating supramolecular structures. Nature 478: 364-3682. Chung WJ, Oh JW, Kwak K, Lee BY, Meyer J, Wang E, Hexemer A, Lee SW (2011) Biomimetic self-templating supramolecular structures. Nature 478: 364-368

3. Zimmermann K, Hagedorn H, Heuck CC, Hinrichsen M, Ludwig H (1986) The ionic properties of the filamentous bacteriophages Pf1 and fd. J Biol Chem 261: 1653-16553. Zimmermann K, Hagedorn H, Heuck CC, Hinrichsen M, Ludwig H (1986) The ionic properties of the filamentous bacteriophages Pf1 and fd. J Biol Chem 261: 1653-1655

4. Dong Dexian et al. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation // Applied microbiology and biotechnology. - 2013. - T. 97. - №. 18. - C. 8023-8029 (прототип).4. Dong Dexian et al. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation // Applied microbiology and biotechnology. - 2013. - T. 97. - No. 18. - C. 8023-8029 (prototype).

5. Monjezi R, Теу ВТ, Sieo CC, Tan WS (2010) Purification of bacteriophage M13 by anion exchange chromatography. J Chromatogr В 878: 1855-18595. Monjezi R, Teu BT, Sieo CC, Tan WS (2010) Purification of bacteriophage M13 by anion exchange chromatography. J Chromatogr B 878: 1855-1859

6. Zakharova MY, Kozyr AV, Ignatova AN, Vinnikov IA, Shemyakin IG, Kolesnikov AV (2005) Purification of filamentous bacteriophage for phage display using size-exclusion chromatography. Biotechniques 38: 194-1986. Zakharova MY, Kozyr AV, Ignatova AN, Vinnikov IA, Shemyakin IG, Kolesnikov AV (2005) Purification of filamentous bacteriophage for phage display using size-exclusion chromatography. Biotechniques 38: 194-198

7. Reitinger S, Petriv OI, Mehr K, Hansen CL, Withers SG (2012) Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. J Virol Methods 185: 171-1747. Reitinger S, Petriv OI, Mehr K, Hansen CL, Withers SG (2012) Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. J Virol Methods 185: 171-174

8. Каттер Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение. / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. - М.: Научный мир, 2012. - С. 63.8. Cutter E. Bacteriophages. Biology and practical application. / E. Cutter, A. Sulakvelidze. - M.: Scientific World, 2012 .-- S. 63.

Claims

1. The method of purification of filamentous bacteriophage M13, including the removal of the bacterial mass after the accumulation of the bacteriophage by first and second sequential centrifugation, followed by first purification of the supernatant of the bacteriophage by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2, followed by third centrifugation and resuspension of the pellet with the bacteriophage, as well as re-purification of the resuspended bacteriophage by isoelectric precipitation with a reagent at pH 4.2 and fourth centrifugation of the precipitate with a bacteriophage to obtain a finished product, characterized in that for isoelectric deposition, a sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 in the ratio with the supernatant of bacteriophages of at least 3: 1 during the first isoelectric deposition is used as a reagent, the precipitate with bacteriophages after a third centrifugation was resuspended in TBS buffer (Tris Buffer Saline), and when re-cleaning the resuspended bacteriophage with isoelectric precipitation, a sodium acetate buffer with a pH value of 4.2 in relation to the resuspended bacteriophage is not less than her 1: 1.

2. The method according to p. 1, characterized in that the first and second centrifugation is carried out respectively at 5000 rpm and 12000 rpm for 10 minutes at 20 ° C, and the third and fourth centrifugation is carried out at 10000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.