RU2602452C2 - Method of substances and their compositions detection with anticancer activity - Google Patents
Method of substances and their compositions detection with anticancer activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2602452C2 RU2602452C2 RU2014119354/15A RU2014119354A RU2602452C2 RU 2602452 C2 RU2602452 C2 RU 2602452C2 RU 2014119354/15 A RU2014119354/15 A RU 2014119354/15A RU 2014119354 A RU2014119354 A RU 2014119354A RU 2602452 C2 RU2602452 C2 RU 2602452C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- reporter protein
- protein
- egfp
- substances
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которому относится настоящее изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области разработки лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний, в частности к первичной идентификации перспективных веществ и их композиций, обладающих противоопухолевой активностью.The present invention relates to the field of development of drugs for the treatment of cancer, in particular to the primary identification of promising substances and their compositions with antitumor activity.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Онкологические заболевания продолжают оставаться одной из основный причин смертности, несмотря на существенный прогресс в разработке новых стратегий их лечения. Одно из основных мест в лечении онкологических заболеваний занимают лекарственные препараты, представляющие собой малые молекулы. Основным требованием для таких малых молекул является их селективное токсическое воздействие на опухолевые клетки в сочетании с отсутствием токсического действия на нормальные клетки организма. Исторически мишенью первых препаратов с противоопухолевой активностью являлся процесс клеточного деления, одна из основных характеристик опухолевых клеток. В этом случае селективность воздействия на опухолевые клетки достигалась за счет дифференциации по принципу присутствия процесса клеточного деления. В настоящее время процесс клеточного деления продолжает оставаться одной из мишеней при разработке противоопухолевых препаратов с различными механизмами действия. Однако современная тенденция в области разработки новых противоопухолевых препаратов состоит в специфическом воздействии на молекулярные мишени, существенные - и, желательно, уникальные - для опухолевых клеток. Такой рационально обоснованный подход основан на выявлении таких мишеней с последующим поиском малых молекул, специфически воздействующих на эту мишень. Одним из примеров такой комбинации опухоль-специфической молекулярной мишени и воздействующей на нее малой молекулы является мутированный протоонкоген B-Raf (V600E) и препарат вемурафениб (Zelboraf®). Разработка подобных таргетных препаратов позволяет повысить эффективность и специфичность воздействия на опухолевые клетки. Поиск новых малых молекул с анти-неопластичными свойствами продолжает оставаться актуальной областью исследования, являясь предтечей разработки на их основе противоопухолевых лекарственных препаратов.Oncological diseases continue to be one of the main causes of death, despite significant progress in the development of new treatment strategies. One of the main places in the treatment of cancer is occupied by drugs, which are small molecules. The main requirement for such small molecules is their selective toxic effect on tumor cells in combination with the absence of toxic effects on normal body cells. Historically, the target of the first drugs with antitumor activity was the process of cell division, one of the main characteristics of tumor cells. In this case, the selectivity of the effect on tumor cells was achieved due to differentiation according to the principle of the presence of cell division. Currently, the process of cell division continues to be one of the targets in the development of antitumor drugs with various mechanisms of action. However, the current trend in the development of new antitumor drugs is a specific effect on molecular targets, essential - and, preferably, unique - for tumor cells. Such a rationally justified approach is based on the identification of such targets, followed by the search for small molecules that specifically affect this target. One example of such a combination of a tumor-specific molecular target and a small molecule acting on it is the mutated B-Raf proto-oncogen (V600E) and the vemurafenib preparation (Zelboraf ® ). The development of such targeted drugs can increase the efficiency and specificity of the effect on tumor cells. The search for new small molecules with anti-neoplastic properties continues to be an important area of research, being the forerunner of the development of antitumor drugs based on them.
В настоящее время выявлено большое число молекулярных мишеней для воздействия с целью лечения онкологических заболеваний, многие из которых являются пригодными для воздействия на них с помощью малых молекул. Дальнейшая концепция развития этого направления состоит в выявлении малых молекул, воздействующих на эти мишени, с последующими исследованиями, призванными выявить действительную эффективность полученных молекул в экспериментах in vivo, в доклинических моделях и клинических исследованиях, с параллельной оптимизацией структуры молекулы для увеличения ее специфической активности и получения приемлемых фармакологических показателей. Для поиска таких молекул с целью последующей их оптимизации в части специфической активности и фармакологических характеристик применяют два основных подхода: поиск молекул, обладающих заданной специфической активностью, из набора (коллекции) широкого спектра химических веществ (библиотеки веществ), и выбор молекул(ы)-кандидата(ов) in silico на основании компьютерного моделирования с использованием 3D-структуры мишени (Liu R, Hsieh CY, Lam KS. New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Semin Cancer Biol. 2004; 14(1):13-21; Shoemaker RH, Scudiero DA, Melillo G, Currens MJ, Monks AP, Rabow AA, Covell DG, Sausville EA. Application of high-throughput, molecular-targeted screening to anticancer drug discovery. Curr Top Med Chem. 2002; 2(3):229-46). Также возможна и комбинация этих подходов, когда на первом этапе проводится скрининг небольшой библиотеки структурно различных веществ для первоначального выявления структур, принципиально позволяющих реализовать заданную активность, с последующей оптимизации структуры отобранных кандидатов на основании определенных 3D-структур комплекса молекул вещества и мишени.Currently, a large number of molecular targets have been identified for exposure to treat cancer, many of which are suitable for exposure to them using small molecules. A further concept for the development of this direction is to identify small molecules that act on these targets, with subsequent studies designed to reveal the actual effectiveness of the obtained molecules in in vivo experiments, in preclinical models and clinical studies, with parallel optimization of the structure of the molecule to increase its specific activity and obtain acceptable pharmacological indicators. To search for such molecules with a view to their subsequent optimization in terms of specific activity and pharmacological characteristics, two main approaches are used: the search for molecules with a given specific activity from a set (collection) of a wide range of chemicals (library of substances), and the choice of molecules (s) - in silico candidate (s) based on computer simulation using 3D target structure (Liu R, Hsieh CY, Lam KS. New approaches in identifying drugs to inactivate oncogene products. Semin Cancer Biol. 2004; 14 (1): 13-21 ; Shoemaker RH, Scudiero DA, Melillo G, Currens MJ, Monks AP, Rabow AA, Covell DG, Sausville EA. Application of high-throughput, molecular-targeted screening to anticancer drug discovery. Curr Top Med Chem. 2002; 2 (3): 229-46). A combination of these approaches is also possible, when at the first stage a small library of structurally different substances is screened for the initial identification of structures that fundamentally allow to realize a given activity, with subsequent optimization of the structure of the selected candidates based on certain 3D structures of the complex of molecules of the substance and target.
Технически отбор молекул-кандидатов по признаку присутствия заданной активности или анализ ее присутствия у предсказанных молекул может проводиться двумя способами: в системе in vitro, когда активность молекулы (например, способность ингибировать активность определенного фермента) анализируется непосредственно в ходе химической реакции, или в системах in vivo, основанных на анализе воздействия молекулы на клетки, которые, как правило, модифицированы надлежащим образом, что позволяет судить о воздействии исследуемой молекулы на заданную мишень по изменению регистрируемых параметров системы (например, пролиферативная активность, активность репортерного гена и т.п.). С очевидностью, в первом случае диапазон поиска строго ограничен единственной молекулой мишенью, анализ изменения активности которой в присутствии исследуемых малых молекул проводится in vitro. Во втором случае появляется возможность отбора молекул, которые воздействуют не только на непосредственную мишень, но и на ее регуляторы, эндогенно присутствующие в клетках, если такие существуют. Тем не менее, в обоих вариантах реализации поиска молекул с противоопухолевой активностью диапазон поиска по спектру мишеней ограничен или строго одной мишенью, или одной мишенью с регуляторами ее активности, то есть одним процессом (например, сигнальным каскадом) в клетке. При необходимости поиска молекул, воздействующих на иную мишень, возникает необходимость разработки новой системы скрининга. Очевидно, что при использовании систем скрининга, основанных на культурах клеток, потенциальная продуктивность системы скрининга в части выявления молекул, воздействующих на различные мишени (как заданную, так и ее регуляторов, которые часто также являются валидированными мишенями), существенно шире по сравнению с системами скрининга in vitro, что является несомненным преимуществом, позволяя мультиплицировать анализ, особенно в случае скринига в системах на основе эукариотических клеток (предпочтительно, клеток млекопитающих) в силу присутствия внутриклеточных систем регуляции мишени, принципиально сходных с таковыми в опухолевых клетках человека.Technically, selection of candidate molecules based on the presence of a given activity or analysis of its presence in the predicted molecules can be carried out in two ways: in an in vitro system, when the activity of a molecule (for example, the ability to inhibit the activity of a particular enzyme) is analyzed directly during a chemical reaction, or in systems vivo, based on the analysis of the effect of the molecule on the cells, which, as a rule, are properly modified, which makes it possible to judge the effect of the studied molecule on a given target change in the recorded parameters of the system (for example, proliferative activity, reporter gene activity, etc.). Obviously, in the first case, the search range is strictly limited to a single target molecule, the analysis of the change in activity of which in the presence of the studied small molecules is carried out in vitro. In the second case, it becomes possible to select molecules that act not only on the direct target, but also on its regulators, endogenously present in the cells, if any. However, in both versions of the search for molecules with antitumor activity, the range of searches in the spectrum of targets is limited either to strictly one target or one target with regulators of its activity, i.e., one process (for example, a signaling cascade) in a cell. If it is necessary to search for molecules acting on a different target, it becomes necessary to develop a new screening system. Obviously, when using screening systems based on cell cultures, the potential productivity of the screening system in terms of identifying molecules that act on different targets (both a given and its regulators, which are often also valid targets), is significantly wider than screening systems in vitro, which is an undoubted advantage, allowing you to multiply the analysis, especially in the case of screening in systems based on eukaryotic cells (preferably mammalian cells) due to t hat intracellular regulation systems target, essentially similar to those in human tumor cells.
При разработке клеточных систем скрининга, как правило, регистрируется косвенный результат воздействия на мишень, например, по активации определенного сигнального пути или изменении транскрипции репортерного гена. В каждом случае дизайн системы скрининга является уникальной задачей и должен принимать во внимание все известные молекулярные механизмы действия мишени. В ряде случаев мишень для воздействия является «суррогатной», то есть предоставляя возможность регистрации ее активности и являясь по своей сути сенсором, позволяет выявить молекулы, которые влияют не непосредственно на нее, а на ее регуляторы, тем самым достигая желаемого биологического противоопухолевого эффекта. Примером такого подхода является скрининг веществ по их способности индуцировать экспрессию белка p21(Waf), позволивший идентифицировать новый продукт природного происхождения псаммаплин А, действие которого основано на ингибировании активности гистон-деацетилаз, и на его основе создать молекулу с приемлемым фармакологическим профилем (NVP-LAQ824, dacinostat) (Remiszewski SW. The discovery of NVP-LAQ824: from concept to clinic. Curr Med Chem. 2003; 10(22):2393-402). Таким образом, проведение поиска малых молекул с противоопухолевой активностью на основании анализа суррогатного параметра, коррелирующего со свойствами опухолевых клеток и активностью существенных молекулярных мишеней, является жизнеспособным и экспериментально валидированным подходом при поиске новых молекул с противоопухолевой активностью. Очевидно, что использование суррогатного параметра, способного изменять свои характеристики в ответ на воздействие на множественные и не связанные между собой, но существенные для опухолевой клетки мишени, является актуальной задачей. Ее решение позволит вместо проведения процедур скрининга для каждой мишени в отдельности выявлять кандидатные вещества или их композиции, воздействующие на различные молекулярные мишени, в рамках одного первичного скрининга. При этом, с очевидностью, для возможности анализа активности большого числа веществ и их композиций система скрининга, удовлетворяющая таким требованиям, должна быть реализована в высокопроизводительном и, предпочтительно, в гомогенном формате, что исключает дополнительные манипуляции при проведении анализа активности исследуемых веществ и делает процедуру скрининга более простой, быстрой и менее затратной.When developing cellular screening systems, as a rule, an indirect result of exposure to a target is recorded, for example, by activating a specific signaling pathway or changing the transcription of a reporter gene. In each case, the design of the screening system is a unique task and should take into account all known molecular mechanisms of action of the target. In some cases, the target for exposure is "surrogate", that is, by providing the ability to register its activity and being inherently a sensor, it is possible to identify molecules that do not directly affect it, but its regulators, thereby achieving the desired biological antitumor effect. An example of this approach is the screening of substances by their ability to induce the expression of p21 protein (Waf), which allowed the identification of a new product of natural origin, psammaplin A, whose action is based on the inhibition of histone deacetylase activity, and based on it to create a molecule with an acceptable pharmacological profile (NVP-LAQ824 , dacinostat) (Remiszewski SW. The discovery of NVP-LAQ824: from concept to clinic. Curr Med Chem. 2003; 10 (22): 2393-402). Thus, the search for small molecules with antitumor activity based on the analysis of a surrogate parameter that correlates with the properties of tumor cells and the activity of essential molecular targets is a viable and experimentally validated approach for the search for new molecules with antitumor activity. Obviously, the use of a surrogate parameter that is able to change its characteristics in response to exposure to multiple targets that are not related to each other but are essential for a tumor cell is an urgent task. Its solution will allow, instead of conducting screening procedures for each target individually, to identify candidate substances or their compositions that act on different molecular targets in a single primary screening. In this case, obviously, for the possibility of analyzing the activity of a large number of substances and their compositions, a screening system that satisfies these requirements should be implemented in a high-performance and, preferably, in a homogeneous format, which excludes additional manipulations when analyzing the activity of the studied substances and makes the screening procedure simpler, faster and less expensive.
Ранее нами было установлено, что обработка клеток, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (EGFP) или иной белок, ингибиторами киназ LY294002 или LY303511, приводит к усилению экспрессии трансгена с увеличением продукции кодирующего его белка (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013;10(3):931-9).Previously, we found that treatment of cells infected with a recombinant replicatively-defective adenovirus encoding a green fluorescent protein (EGFP) or other protein with kinase inhibitors LY294002 or LY303511 leads to increased transgene expression with an increase in the production of the protein encoding it (Shepelev MV, Korobko EV , Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10 (3): 931-9).
Соединение LY294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-он) обладает способностью ингибировать фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы mTOR и казеинкиназу II. Указанное соединение само по себе не является фармакологически применимым ингибитором в силу его нерастворимости в воде и быстрого распада после введения. Однако его растворимое в воде производное (конъюгат с пептидом RGDS), SF1126 (Semaphore Pharmaceuticals Inc) является перспективным лекарственным средством и проходит в настоящее время клинические испытания как ингибитор РБК. В публикации Garlich et al. (Garlich JR, De P, Dey N, Su JD, Peng X, Miller A, Murali R, Lu Y, Mills GB, Kundra V, Shu HK, Peng Q, Durden DL. A vascular targeted pan phosphoinositide 3-kinase inhibitor prodrug, SF1126, with antitumor and antiangiogenic activity. Cancer Res. 2008; 68(1):206-15) приведены подробные сведения по эффективному действию SF1126 как противоопухолевого препарата на модели опухолей на мышах. К настоящему времени результаты клинических испытаний SF1126 (I фаза) свидетельствуют о хорошей толерантности к SF1126 у пациентов и его клинической активности у пациентов с солидными опухолями, выраженную в стабилизации болезни (Chiorean et al., ASCO 2009, J Clin Oncol).Compound LY294002 (2- (4-morpholinyl) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) has the ability to inhibit phosphoinositide-3-kinase (PI3K), mTOR protein kinase and casein kinase II. The specified compound in itself is not a pharmacologically applicable inhibitor due to its insolubility in water and rapid decomposition after administration. However, its water-soluble derivative (RGDS peptide conjugate), SF1126 (Semaphore Pharmaceuticals Inc) is a promising drug and is currently undergoing clinical trials as an inhibitor of RBC. In a publication by Garlich et al. (Garlich JR, De P, Dey N, Su JD, Peng X, Miller A, Murali R, Lu Y, Mills GB, Kundra V, Shu HK, Peng Q, Durden DL. A vascular targeted pan phosphoinositide 3-kinase inhibitor prodrug , SF1126, with antitumor and antiangiogenic activity. Cancer Res. 2008; 68 (1): 206-15) provides details on the effective action of SF1126 as an antitumor drug in a mouse tumor model. To date, the results of clinical trials of SF1126 (phase I) indicate good tolerance to SF1126 in patients and its clinical activity in patients with solid tumors, expressed in disease stabilization (Chiorean et al., ASCO 2009, J Clin Oncol).
Близкий структурный аналог LY294002 - соединение LY303511 (2-(4-пиперазинил)-8-фенил-4Н-1-бензопиран-4-он) - не способен ингибировать PI3K, но сохраняет способность ингибировать активность mTOR и казеинкиназы И. Будучи ингибиторами mTOR-сигнального пути, LY303511 и его производные рассматриваются как перспективные средства для ингибирования нежелательной пролиферации клеток, в том числе опухолевых (заявка на выдачу патента США №20070173514). Соединение LY303511 сенсибилизирует клетки к апоптозу, индуцированному химиотерапевтическими средствами (например, винкристином) (Poh TW, Pervaiz S. LY294002 and LY303511 sensitize tumor cells to drug-induced apoptosis via intracellular hydrogen peroxide production independent of the phosphoinositide 3-kinase-Akt pathway. Cancer Res. 2005; 65(14): 6264-74) и ингибирует пролиферацию клеток в культуре, а также рост опухоли у мышей в модельной системе (Kristof AS, Pacheco-Rodriguez G, Schremmer В, Moss J. LY303511 (2-piperazinyl-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) acts via phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathways to inhibit cell proliferation via mammalian target of rapamycin (mTOR)-and non-mTOR-dependent mechanisms. J Pharmacol Exp Ther. 2005; 314(3):1134-43), что делает его перспективным как противоопухолевое средство.A close structural analogue of LY294002 - the compound LY303511 (2- (4-piperazinyl) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) - is not able to inhibit PI3K, but retains the ability to inhibit the activity of mTOR and casein kinase I. Being inhibitors of mTOR- of the signaling pathway, LY303511 and its derivatives are considered as promising agents for inhibiting undesired cell proliferation, including tumor cells (US Patent Application No. 20070173514). Compound LY303511 sensitizes tumor cells to drug-induced apoptosis induced by chemotherapeutic agents (e.g., vincristine) (e.g., vincristine) (Poh TW, Pervaiz S. LY294002 and LY303511 via drug-induced apoptosis via intracellular hydrogen peroxide production independent of the phosphoinositide 3-kinase-Akt path. Res. 2005; 65 (14): 6264-74) and inhibits cell proliferation in culture as well as tumor growth in mice in a model system (Kristof AS, Pacheco-Rodriguez G, Schremmer B, Moss J. LY303511 (2-piperazinyl- 8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) acts via phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathways to inhibit cell proliferation via mammalian target of rapamycin (mTOR) -and non-mTOR-dependent mechanisms. J Pharmacol Exp Ther. 2005 ; 314 (3): 1134-43), which makes him a prospect tive as an antitumor agent.
Таким образом, LY294002, LY303511 и их производные являются основой для разработки перспективных препаратов, одной из ниш применения которых является лечение онкологических заболеваний.Thus, LY294002, LY303511 and their derivatives are the basis for the development of promising drugs, one of the niches of which is the treatment of cancer.
Ранее нами было показано, что при обработке клеток, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим белок EGFP, ингибитором LY294002 усиление продукции белка EGFP частично обусловлено способностью LY294002 ингибировать активность протеинкиназы mTOR (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10(3):931-9). Внутриклеточный сигнальный каскад, включающий в себя Р13-киназы, протеинкиназы Akt и mTOR, часто аномально активирован в опухолевых клетках. Компоненты этого сигнального каскада, в частности протеинкиназа mTOR, являются привлекательными мишенями для терапии опухолей путем ингибирования их активности (LoPiccolo J, Blumenthal GM, Bernstein WB, Dennis PA. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway: effective combinations and clinical considerations. Drug Resist Updat. 2008; 11(1-2):32-50; Engelman JA. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nat Rev Cancer. 2009; 9(8):550-62). В частности, производное ингибитора mTOR рапамицина, темсиролимус, в настоящее время одобрен для лечения некоторых типов опухолей. Однако опухолевые клетки часто приобретают резистентность к рапамицину, что делает необходимым поиск иных ингибиторов mTOR-сигнального пути. Результаты, полученные нами ранее, демонстрируют, что вещества-ингибиторы каталитической активности mTOR, в частности ингибитор Ku-63794, также способны приводить к увеличению продукции белка EGFP в клетках, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим EGFP. Таким образом, ингибирование активности протеинкиназы mTOR, молекулярной мишени для разработки противоопухолевых препаратов, может быть зарегистрировано по увеличению продукции белка EGFP в клетках, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим EGFP.We have previously shown that when treating cells infected with a recombinant replicatively-defective adenovirus encoding an EGFP protein, an inhibitor of LY294002, an increase in the production of EGFP protein is partially due to the ability of LY294002 to inhibit the activity of mTOR protein kinase (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Kopantsev EP, Kopantvv IV LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10 (3): 931-9). An intracellular signaling cascade, including P13 kinases, Akt protein kinases, and mTOR, is often abnormally activated in tumor cells. The components of this signaling cascade, in particular the mTOR protein kinase, are attractive targets for treating tumors by inhibiting their activity (LoPiccolo J, Blumenthal GM, Bernstein WB, Dennis PA. Targeting the PI3K / Akt / mTOR pathway: effective combinations and clinical considerations. Drug Resist Updat. 2008; 11 (1-2): 32-50; Engelman JA. Targeting PI3K signaling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nat Rev Cancer. 2009; 9 (8): 550-62). In particular, the mTOR rapamycin inhibitor derivative, temsirolimus, is currently approved for the treatment of certain types of tumors. However, tumor cells often become resistant to rapamycin, which makes it necessary to search for other inhibitors of the mTOR signaling pathway. The results we obtained earlier demonstrate that mTOR catalytic activity inhibitors, in particular the Ku-63794 inhibitor, can also lead to an increase in the production of EGFP protein in cells infected with recombinant replication-defective adenovirus encoding EGFP. Thus, inhibition of the activity of the mTOR protein kinase, a molecular target for the development of antitumor drugs, can be detected by an increase in the production of EGFP protein in cells infected with recombinant replication-defective adenovirus encoding EGFP.
Как отмечалось выше, эффект ингибитора LY294002 на усиление продукции белка при обработке клеток, зараженных рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, лишь частично обусловлено способностью LY294002 ингибировать активность протеинкиназы mTOR. В то же время, этот эффект также дополнительно обусловлен воздействием LY294002 на другие мишени, однако не из числа известных мишеней LY294002, к которым относятся PI3-киназы, казеин киназа II, протеинкиназа Pim-1 и ДНК-зависимая протеинкиназа (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10(3):931-9). Воздействие на эти неизвестные мишени также обуславливает активность ингибитора LY303511 в части увеличения продукции трансгена, кодируемого рекомбинантным аденовирусом (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10(3):931-9). Учитывая, что LY303511 обладает противоопухолевой активностью, это означает, что увеличение продукции трансгена, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, является результатом воздействия на неидентифицированные мишени, существенные для опухолевых клеток.As noted above, the effect of the LY294002 inhibitor on enhancing protein production during the treatment of cells infected with recombinant replicatively defective adenovirus is only partially due to the ability of LY294002 to inhibit the activity of the mTOR protein kinase. At the same time, this effect is also additionally due to the effect of LY294002 on other targets, but not among the known LY294002 targets, which include PI3 kinases, casein kinase II, Pim-1 protein kinase and DNA-dependent protein kinase (Shepelev MV, Korobko EV , Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10 (3): 931-9). Exposure to these unknown targets also determines the activity of the LY303511 inhibitor in terms of increasing the production of the transgene encoded by recombinant adenovirus (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective-defective-replication-defective-defective and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10 (3): 931-9). Given that LY303511 has antitumor activity, this means that increased production of the transgene encoded by recombinant adenovirus is the result of exposure to unidentified targets that are essential for tumor cells.
Таким образом, на основании вышеизложенного можно сделать вывод, что увеличение продукции трансгена, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, в частности белка EGFP, происходит в ответ на воздействие на молекулярные мишени для создания противоопухолевых препаратов, в число которых входит протеинкиназа mTOR, а также неизвестные молекулярные мишени, ингибируемые соединениями LY294002 и LY303511.Thus, based on the foregoing, we can conclude that the increase in the production of the transgene encoded by recombinant adenovirus, in particular the EGFP protein, occurs in response to exposure to molecular targets to create antitumor drugs, including mTOR protein kinase, as well as unknown molecular targets, inhibited by compounds LY294002 and LY303511.
Анализ опубликованных ранее результатов исследований показал, что способностью увеличивать продукцию трансгена, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, обладает и ряд других веществ с противоопухолевой активностью. К их числу относятся ингибиторы топоизомеразы I (этопозид) и топоизомеразы II (топотекан) (Shieh GS, Shiau AL, Yo YT, Lin PR, Chang CC, Tzai TS, Wu CL. Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase gene therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model. Cancer Res. 2006; 66(20):9957-66; Zamir G, Zeira E, Gelman AE, Shaked A, Olthoff KM, Eid A, Galun E. Replication-deficient adenovirus induces host topoisomerase I activity: implications for adenovirus-mediated gene expression. Mol Ther. 2007; 15(4):772-81), а также вещества из класса ингибиоторов гистон деацетилаз, которые также рассматриваются как перспективная основа для разработки противоопухолевых препаратов (Nguyen TL, Wilson MG, Hiscott J. Oncolytic viruses and histone deacetylase inhibitors - a multi-pronged strategy to target tumor cells. Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(2-3): 153-9). Таким образом, увеличение продукции трансгена, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, в частности белка EGFP, также будет происходить в ответ на воздействие на молекулярные мишени для создания противоопухолевых препаратов, в число которых, помимо вышеупомянутых, входят топоизомеразы I и II и гистон деацетилазы.An analysis of previously published research results showed that a number of other substances with antitumor activity have the ability to increase the production of the transgene encoded by recombinant adenovirus. These include topoisomerase I (etoposide) and topoisomerase II (topotecan) inhibitors (Shieh GS, Shiau AL, Yo YT, Lin PR, Chang CC, Tzai TS, Wu CL. Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase gene therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model. Cancer Res. 2006; 66 (20): 9957-66; Zamir G, Zeira E, Gelman AE, Shaked A, Olthoff KM, Eid A, Galun E. Replication-deficient adenovirus induces host topoisomerase I activity: implications for adenovirus-mediated gene expression. Mol Ther. 2007; 15 (4): 772-81), as well as substances from the class of histone deacetylase inhibitors, which are also considered promising basis for the development of antitumor drugs (Nguyen TL, Wil son MG, Hiscott J. Oncolytic viruses and histone deacetylase inhibitors - a multi-pronged strategy to target tumor cells. Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21 (2-3): 153-9). Thus, an increase in the production of the transgene encoded by recombinant adenovirus, in particular the EGFP protein, will also occur in response to molecular targets to create antitumor drugs, which, in addition to the aforementioned, include topoisomerases I and II and histone deacetylases.
Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention
Настоящее изобретение стало возможным на основании того факта, что ряд химических соединений с описанной противоопухолевой активностью обладает способностью при их воздействии на клетки, зараженные рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, усиливать продукцию белка, кодируемого трансгеном, содержащимся в рекомбинантном аденовирусе.The present invention was made possible on the basis of the fact that a number of chemical compounds with the described antitumor activity have the ability, when exposed to cells infected with a recombinant replicatively defective adenovirus, to enhance the production of a protein encoded by a transgene contained in a recombinant adenovirus.
Настоящее изобретение относится к новому способу выявления веществ и их композиций с противоопухолевой активностью, который основан на увеличении продукции белка (далее - репортерный белок), кодируемого трансгеном (далее - репортерный ген) в составе репликативно-дефектного рекомбинантного аденовируса в ответ на воздействие веществ или их композиций на одну или несколько молекулярных мишеней в опухолевых клетках из числа протеинкиназы mTOR, топоизомераз I и II, гистон деацетилаз и неизвестных мишеней, ингибируемых соединениями LY294002 и LY303511.The present invention relates to a new method for detecting substances and their compositions with antitumor activity, which is based on increasing the production of a protein (hereinafter referred to as the reporter protein) encoded by a transgene (hereinafter referred to as the reporter gene) as part of a replicatively defective recombinant adenovirus in response to exposure to substances or their compositions for one or more molecular targets in tumor cells from mTOR protein kinases, topoisomerases I and II, histone deacetylases and unknown targets inhibited by compounds LY294002 and LY303511.
Конкретно настоящее изобретение относится к способу идентификации веществ и их композиций с противоопухолевой активностью, предусматривающего следующие стадии:Specifically, the present invention relates to a method for identifying substances and their compositions with antitumor activity, comprising the following steps:
а) рассев клеток;a) sieving of cells;
б) заражение клеток рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим репортерный белок;b) infection of cells with a recombinant replicatively defective adenovirus encoding a reporter protein;
в) инкубацию зараженных клеток для наработки начального уровня репортерногоc) incubation of infected cells to produce an initial level of reporter
белка;squirrel;
г) добавление к клеткам испытуемого вещества или их композицией (опыт) или растворителя испытуемого вещества или их композиции (контроль);d) adding to the cells of the test substance or their composition (experience) or a solvent of the test substance or their composition (control);
д) инкубацию опытных и контрольных клеток;d) incubation of experimental and control cells;
е) измерение количества репортерного белка в опытных и контрольных клетках;f) measuring the amount of reporter protein in the experimental and control cells;
ж) определение количества опытных и контрольных клеток;g) determination of the number of experimental and control cells;
з) нормирование уровней репортерного белка в опыте и контроле на соответствующее количество клеток;h) normalization of the levels of reporter protein in the experiment and control on the appropriate number of cells;
и) сравнение уровней репортерного белка в опыте и контроле, причем увеличение уровня репортерного белка в опыте по сравнению с контролем означает, что испытуемое вещество или их композиция обладает потенциальной противоопухолевой активностью.i) comparing the levels of reporter protein in the experiment and control, and an increase in the level of reporter protein in the experiment compared with the control means that the test substance or their composition has potential antitumor activity.
Как следует из формулировки способа, идентификация веществ и их композиций проводится с использованием культивируемых in vitro клеток. Такими клетками могут являться опухолевые клетки различного происхождения. Специалисту в данной области будет очевидно, что из-за гетерогенности молекулярных изменений в различных опухолевых клетках чувствительность к воздействию на конкретную молекулярную мишень может варьировать в клетках различных линий. Поэтому изобретение предусматривает проведение анализа испытуемых веществ на опухолевых клетках различных линий и различного происхождения для исключения возможности получения ложно негативного результата при воздействии испытуемого вещества или их композиции на клетки с низкой чувствительностью к воздействию на такую мишень.As follows from the formulation of the method, the identification of substances and their compositions is carried out using cultured in vitro cells. Such cells may be tumor cells of various origins. One skilled in the art will appreciate that due to the heterogeneity of molecular changes in various tumor cells, the sensitivity to a specific molecular target may vary in cells of different lines. Therefore, the invention provides for the analysis of test substances on tumor cells of various lines and of different origin to exclude the possibility of obtaining a false negative result when the test substance or its composition is exposed to cells with low sensitivity to such a target.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии а) рассев клеток для испытания веществ или их композиций может осуществляться в лунки многолуночного планшета, что позволяет единовременно проводить испытания многочисленных веществ и их композиций.In accordance with one of the embodiments of the present invention, at the stage a) the sieving of cells for testing substances or their compositions can be carried out in the wells of a multi-well plate, which allows simultaneous testing of numerous substances and their compositions.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии а) рассева клеток в многолуночный планшет рассев клеток для испытания веществ или их композиций может осуществляться в лунки 96-луночного планшета, обеспечивая высокопроизводительность проводимого анализа.In accordance with one embodiment of the present invention, in step a), the cells are sown in a multi-well plate, the cells can be sown for testing substances or their compositions in the wells of a 96-well plate, providing high-throughput analysis.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии б) клетки заражаются рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим зеленый флуоресцентный белок EGFP, который выступает в качестве репортерного белка, что позволяет измерять уровень его продукции с помощью флуориметрии.In accordance with one embodiment of the present invention, in step b), the cells are infected with a recombinant replicatively defective adenovirus encoding a green fluorescent protein EGFP, which acts as a reporter protein, which makes it possible to measure the level of its production using fluorimetry.
Из существующего уровня техники известно, что увеличение продукции белка, кодируемого трансгеном, содержащимся в рекомбинантном аденовирусе, в результате воздействия ряда химических соединений с описанной противоопухолевой активностью не является уникальным свойством, присущим EGFP при его использовании в качестве такого белка (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013;10(3):931-9), и при включении в состав рекомбинантного аденовируса кДНК другого белка его продукция также будет увеличиваться в ответ на воздействие ряда химических соединений с описанной противоопухолевой активностью. Этот факт обосновывает возможность использования иных, чем EGFP, белки в качестве репортерных белков при осуществлении настоящего изобретения, проводя мониторинг изменения их количества в результате воздействия веществ на зараженные рекомбинантным аденовирусом клетки. В частности, учитывая существование известных из уровня техники методов определения количества некоторых белков, предпочтительным является использование в качестве репортерных белков, кодируемых применяемыми в молекулярно-биологических исследованиях репортерными генами, включая, но не ограничиваясь, иными флуоресцентными белками, люциферазами, щелочной фосфатазой, Р-галактозидазой.It is known from the prior art that an increase in the production of a protein encoded by a transgene contained in a recombinant adenovirus as a result of exposure to a number of chemical compounds with the described antitumor activity is not a unique property inherent in EGFP when used as such a protein (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10 (3): 931-9), and when turned on in the recombinant adenovirus cDNA of another protein of its pro production will also increase in response to the effects of a number of chemical compounds with the described antitumor activity. This fact justifies the possibility of using proteins other than EGFP as reporter proteins in the implementation of the present invention, by monitoring the changes in their number as a result of exposure to substances infected with recombinant adenovirus cells. In particular, given the existence of methods known in the art for determining the amount of certain proteins, it is preferable to use reporter genes used as reporter proteins encoded in molecular biological studies, including but not limited to other fluorescent proteins, luciferase, alkaline phosphatase, P- galactosidase.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии б) клетки заражаются рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, в котором уровень экспрессии репортерного гена может контролироваться внешними воздействиями, обеспечивающими изменение активности промотора, под контролем которого находится репортерный ген. В этом варианте возможно подобрать силу воздействия для обеспечения оптимального динамического диапазона уровня продукции репортерного белка, который будет достаточен для уверенной его детекции используемыми инструментальными средствами, и не быть максимально возможным или близким к максимально возможному, обеспечиваемому данными клетками, тем самым делая возможным существенное увеличение его уровня при воздействии испытуемых веществ на одну или несколько молекулярных мишеней.In accordance with one embodiment of the present invention, in step b), the cells are infected with a recombinant replicatively defective adenovirus, in which the expression level of the reporter gene can be controlled by external influences that alter the activity of the promoter that controls the reporter gene. In this option, it is possible to select the strength of the effect to ensure the optimal dynamic range of the production of reporter protein, which will be sufficient for its confident detection by the used tools, and not be as possible or close to the maximum possible provided by these cells, thereby making it possible to significantly increase it level when exposed to test substances on one or more molecular targets.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии б) клетки заражаются рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, в котором уровень экспрессии репортерного гена контролируется отвечающим на терациклин промотором, а сам аденовирус также кодирует зависимый от тетрациклина транскрипционный фактор. В этом варианте базовый уровень продукции репортерного белка в клетках, зараженных рекомбинантным аденовирусом, может контролироваться путем варьирования концентрации добавленного в культуральную среду тетрациклина или доксициклина, стимулирующих активность промотора, под контролем которого находится репортерный ген.According to one embodiment of the present invention, in step b), the cells are infected with a recombinant replicatively defective adenovirus, in which the expression level of the reporter gene is controlled by the teracycline-responsive promoter, and the adenovirus itself also encodes a tetracycline-dependent transcription factor. In this embodiment, the baseline level of reporter protein production in cells infected with recombinant adenovirus can be controlled by varying the concentration of tetracycline or doxycycline added to the culture medium, stimulating the activity of the promoter, which controls the reporter gene.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии е) в качестве репортерного гена используется ген EGFP. В этом варианте измерение количества репортерного белка производится с помощью флуориметрии по количеству испускаемой флуоресценции на длине волны, близкой или совпадающей с 509 нм при облучении клеток светом с длиной волны, близкой или совпадающей с 488 нм. В этом случае измеренный сигнал флуоресценции клеток будет пропорционален количеству белка EGFP в них.In accordance with one embodiment of the present invention, in step e), the EGFP gene is used as the reporter gene. In this embodiment, the amount of reporter protein is measured using fluorimetry based on the amount of emitted fluorescence at a wavelength close to or coinciding with 509 nm when the cells are irradiated with light with a wavelength close to or coinciding with 488 nm. In this case, the measured cell fluorescence signal will be proportional to the amount of EGFP protein in them.
Специалисту в данной области будет понятно, что при использовании иных репортерных белков должен быть применен тот или иной конкретный способ, обеспечивающий измерение его количества.A person skilled in the art will understand that when using other reporter proteins, one or another specific method must be used to measure its amount.
Стадия ж) подразумевает измерение количества клеток. Специалисту в данной области известно, что существует большое количество способов измерения количества клеток. Количество клеток может быть определено их прямым подсчетом с использованием гемоцитометра или иных специальных приборов-счетчиков клеток, однако данный способ не обеспечивает высокопроизводительности анализа. Количество клеток также может быть определено методами на основании определения содержания в них метаболитов или ферментов, которые совместимы с высокопроизводительным форматом. Однако, как известно, некоторые вещества могут вызывать изменения этих параметров, что будет приводить к неверному определению количества клеток. В то же время количество геномной ДНК остается постоянным в клетке вне зависимости от способа воздействия на нее.Stage g) involves measuring the number of cells. A person skilled in the art knows that there are a large number of methods for measuring cell numbers. The number of cells can be determined by direct counting using a hemocytometer or other special cell counter devices, however, this method does not provide high performance analysis. The number of cells can also be determined by methods based on the determination of the content of metabolites or enzymes in them, which are compatible with the high-performance format. However, as you know, some substances can cause changes in these parameters, which will lead to an incorrect determination of the number of cells. At the same time, the amount of genomic DNA remains constant in the cell, regardless of how it is exposed.
Поэтому в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии ж) измерение количества клеток проводится путем измерения количества ДНК.Therefore, in accordance with one embodiment of the present invention, in step g), the number of cells is measured by measuring the amount of DNA.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии ж) количество ДНК определяется по флуоресценции красителя Hoechst33342, связавшегося с ДНК в клетках, после их инкубации с красителем и удаления его несвязавшегося избытка. Поскольку спектры испускания и возбуждения для Hoechst33342 и EGFP существенно отличаются друг от друга (максимумы возбуждения/испускания 361 нм/486 нм и 488 нм/509 нм, соответственно), это позволяет измерять их флуоресценцию независимо друг от друга в одном образце с использованием соответствующих наборов оптических фильтров для возбуждения и испускания.In accordance with one of the embodiments of the present invention, in step g), the amount of DNA is determined by fluorescence of the Hoechst33342 dye that binds to the DNA in the cells after incubation with the dye and removal of its unbound excess. Since the emission and excitation spectra for Hoechst33342 and EGFP are significantly different from each other (excitation / emission maxima of 361 nm / 486 nm and 488 nm / 509 nm, respectively), this allows their fluorescence to be measured independently of one another in the same sample using the corresponding sets optical filters for excitation and emission.
Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть использованы и иные специальные красители для определения количества ДНК.One skilled in the art will understand that other special dyes can be used to determine the amount of DNA.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии е) и ж) могут быть объединены при использовании метода проточной цитофлуориметрии, который при использовании в качестве репортерного белка одного из флуоресцентных белков позволяет определять на основании интенсивности сигнала флуоресценции количество репортерного белка в каждой клетке, что исключает необходимость нормирования на количество клеток.In accordance with one embodiment of the present invention, steps e) and g) can be combined using flow cytofluorimetry, which, when using one of the fluorescent proteins as a reporter protein, makes it possible to determine the amount of reporter protein in each cell based on the fluorescence signal intensity, which eliminates the need for normalization to the number of cells.
Таким образом, настоящее изобретение позволяет расширить набор способов поиска веществ и их композиций с противоопухолевой активностью, позволяя единовременно проводить анализ по признаку влияния на единственную или несколько молекулярных мишеней, и обеспечивая проведение анализа в гомогенном и высокопроизводительном формате.Thus, the present invention allows to expand the range of methods for searching for substances and their compositions with antitumor activity, allowing a one-time analysis based on the effect on a single or several molecular targets, and providing analysis in a homogeneous and high-performance format.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные фигуры.The invention will now be described in more detail with reference to separate illustrative figures.
На фиг. 1 показана общая схема скрининга веществ на присутствие противоопухолевой активности.In FIG. 1 shows a general scheme for screening substances for the presence of antitumor activity.
На фиг. 2 показана зависимость результатов измерения флуоресценции клеток линии NCI-H1299, выращенных в 96-луночном планшете и окрашенных красителем Hoechst33342, от количества зассеянных в лунку клеток. Данные представлены в относительных единицах флуоресценции Hoechst33342 как среднее значение измерений в трех лунках ± стандартное отклонение после коррекции на уровень сигнала от клеток, не окрашенных красителем.In FIG. Figure 2 shows the dependence of the fluorescence measurements of NCI-H1299 cells grown in a 96-well plate and stained with Hoechst33342 dye on the number of cells seeded in the well. Data are presented in relative fluorescence units of Hoechst33342 as the average value of measurements in three wells ± standard deviation after correction for the signal level from cells not stained with dye.
На фиг. 3 показаны результаты определения интенсивности флуоресценции EGFP в клетках линии NCI-H1299, зараженных рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP, через 20, 40 и 65 часов инкубации в присутствии доксициклина в указанных концентрациях. Данные представлены в относительных единицах флуоресценции EGFP после коррекции на уровень сигнала от клеток, незараженных аденовирусом.In FIG. Figure 3 shows the results of determining the EGFP fluorescence intensity in NCI-H1299 cells infected with the recombinant Ad-Tet-EGFP adenovirus after 20, 40 and 65 hours of incubation in the presence of doxycycline at the indicated concentrations. Data are presented in relative EGFP fluorescence units after correction for signal level from cells not infected with adenovirus.
На фиг. 4 показаны результаты определения интенсивности флуоресценции EGFP в клетках линии NCI-H1299, зараженных рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP, через 18 часов после инкубации в присутствии доксициклина в концентрации 10 нг/мл в присутствии ингибитора LY294002 в концентрации 25 мкМ (LY2), ингибитора протеинкиназы mTOR Compound 401 в концентрации 50 мкМ (401), ингибиторов LY294002 или Compound 401 в тех же концентрациях в сочетании с ингибитором топоизомеразы II этопозидом в концентрации 10 мкМ (LY2+Eto и 401+Eto, соответственно), или растворителя ингибиторов диметилсульфоксида (DMSO). Данные представлены в относительных единицах флуоресценции EGFP как среднее значение измерений в трех лунках±стандартное отклонение после коррекции сигнала EGFP на уровень сигнала от клеток, незараженных аденовирусом, и нормировки на интенсивность флуоресценции клеток после окраски красителем Hoechst33342 с предварительной коррекцией на сигнал флуоресценции в лунках при отсутствии клеток.In FIG. Figure 4 shows the results of determining the EGFP fluorescence intensity in NCI-H1299 cells infected with recombinant Ad-Tet-EGFP adenovirus 18 hours after incubation in the presence of doxycycline at a concentration of 10 ng / ml in the presence of an inhibitor of LY294002 at a concentration of 25 μM (LY2), an inhibitor mTOR
Описание конкретных примеров осуществления изобретенияDescription of specific embodiments of the invention
Пример 1. Общее описание проведения процедуры выявления веществ и их композиций с противоопухолевой активностью с использованием рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса для экспрессии EGFP под контролем тетрациклин-индуцируемого промотораExample 1. General description of the procedure for identifying substances and their compositions with antitumor activity using recombinant replicative-defective adenovirus for the expression of EGFP under the control of a tetracycline-induced promoter
Схема проведения идентификации веществ и их композиций с противоопухолевой активностью с использованием рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса для экспрессии EGFP под контролем тетрациклин-индуцируемого промотора (далее - Ad-Tet-EGFP) представлена на фиг. 1.A scheme for identifying substances and their compositions with antitumor activity using a recombinant replicatively defective adenovirus for the expression of EGFP under the control of a tetracycline-induced promoter (hereinafter Ad-Tet-EGFP) is shown in FIG. one.
При скрининге веществ на противоопухолевую активность, выявляемую по увеличению продукции белка EGFP в клетках, зараженных аденовирусом Ad-Tet-EGFP, дизайн эксперимента предусматривает следующие экспериментальные точки, позволяющие провести корректную нормировку сигнала и сравнить его с базовым уровнем продукции EGFP в отсутствии воздействия веществ:When screening substances for antitumor activity, which is detected by an increase in the production of EGFP protein in cells infected with Ad-Tet-EGFP adenovirus, the experimental design includes the following experimental points that allow for the correct normalization of the signal and compare it with the baseline level of EGFP production in the absence of exposure to substances:
- лунка А1 - лунка со средой с растворителем испытуемого вещества без клеток. Измеряются фоновые интенсивности флуоресценции в диапазонах флуоресценции красителя Hoechst33342 IA1(H) и EGFP IA1(H). В случае, если испытуемые вещества растворены в различных растворителях, для каждого растворителя предусматривается отдельная лунка, аналогичная А1;- well A1 - a well with medium with a solvent of the test substance without cells. Background fluorescence intensities are measured in the fluorescence ranges of the dye Hoechst33342 I A1 (H) and EGFP I A1 (H). If the test substances are dissolved in different solvents, a separate well is provided for each solvent, similar to A1;
- лунка Б1 - лунка с клетками без заражения аденовирусом, которые инкубировались с растворителем испытуемого вещества. Измеряется интенсивность IБ1(E) для определения фонового значения флуоресценции лунки с клетками в диапазоне флуоресценции EGFP, а также измеряется интенсивность флуоресценции красителя Hoechst33342 IБ1(H) для нормирования интенсивности сигнала в диапазоне флуоресценции EGFP на количество клеток в лунке. В случае, если испытуемые вещества растворены в различных растворителях, для каждого растворителя предусматривается отдельная лунка, аналогичная Б1;- well B1 - a well with cells without infection with adenovirus, which were incubated with the solvent of the test substance. The intensity of I B1 (E) is measured to determine the background fluorescence of the cell well in the EGFP fluorescence range, and the fluorescence intensity of the Hoechst33342 I B1 (H) dye is measured to normalize the signal intensity in the EGFP fluorescence range by the number of cells in the well. If the test substances are dissolved in different solvents, a separate well is provided for each solvent, similar to B1;
- лунка Э1 - лунка с клетками, зараженными аденовирусом, которые инкубировались с растворителем испытуемого вещества. Измеряется интенсивность IЭ1(E) для определения базового значения флуоресценции EGFP, а также измеряется интенсивность флуоресценции красителя Hoechst33342 IЭ1(H) для нормирования интенсивности сигнала EGFP на количество клеток в лунке. В случае, если испытуемые вещества растворены в различных растворителях, для каждого растворителя предусматривается отдельная лунка, аналогичная Э1;- well E1 - well with cells infected with adenovirus, which were incubated with the solvent of the test substance. The intensity I E1 (E) is measured to determine the basic value of EGFP fluorescence, and the fluorescence intensity of the Hoechst33342 I E1 (H) dye is also measured to normalize the intensity of the EGFP signal to the number of cells in the well. If the test substances are dissolved in different solvents, a separate well is provided for each solvent, similar to E1;
- лунка An (n>1) - лунки со средой с испытуемыми веществами без клеток. Измеряются фоновые интенсивности флуоресценции в диапазонах флуоресценции красителя Hoechst33342 IAn(H) и EGFP IAn(Н);- well An (n> 1) - wells with medium with test substances without cells. Background fluorescence intensities are measured in the fluorescence ranges of the dye Hoechst33342 I An (H) and EGFP I An (H);
- лунки Бn (n>1) - лунки с клетками без заражения аденовирусом, которые инкубировались с испытуемыми веществами. Измеряются интенсивности IБn(Е) для определения фонового значения флуоресценции лунки с клетками в присутствии испытуемого вещества в диапазоне флуоресценции EGFP, а также измеряются интенсивности флуоресценции красителя Hoechst33342 IБn(Н) для нормирования интенсивности сигнала EGFP на количество клеток в лунке;- wells Bn (n> 1) - wells with cells without infection with adenovirus, which were incubated with the test substances. The I Bn (E) intensities are measured to determine the background fluorescence of the cell well in the presence of the test substance in the EGFP fluorescence range, and the Hoechst33342 I Bn (H) dye fluorescence intensities are measured to normalize the EGFP signal intensity to the number of cells in the well;
- лунки Эn (n>1) - лунки с клетками, зараженными аденовирусом, которые инкубировались с испытуемыми веществами. Измеряются интенсивности IЭn(E) для определения значения флуоресценции EGFP при воздействии испытуемого вещества для сравнения с базовым значением флуоресценции EGFP, определенного в лунке Э1, а также измеряются интенсивности флуоресценции красителя Hoechst33342 IЭn(H) для нормирования интенсивности сигнала EGFP на количество клеток в лунке.- En wells (n> 1) - wells with cells infected with adenovirus that were incubated with the test substances. The intensities I En (E) are measured to determine the EGFP fluorescence when exposed to the test substance for comparison with the base EGFP fluorescence value determined in well E1, and the fluorescence intensities of the Hoechst33342 I En (H) dye are measured to normalize the EGFP signal intensity to the number of cells in hole.
На первом этапе ((1) на фиг. 1) проводится рассев клеток в лунки 96-луночного культурального планшета, пригодного для последующего проведения измерения флуоресцентного сигнала (с белыми непрозрачными стенками лунок, например Costar #3610, США) в лунки Б1, Б2, …, Бn и Э1, Э2, …, Эn. Плотность рассева клеток подбирается таким образом, чтобы к моменту измерения флуоресцентных сигналов клетки находились в субконфлюентном состоянии. В лунки A1, А2, …, An добавляется среда без высева клеток для последующего использования для коррекции на фоновую флуоресценцию лунок в диапазонах флуоресценции красителя Hoechst33342 и белка EGFP.At the first stage ((1) in Fig. 1), the cells are sieved into the wells of a 96-well culture plate suitable for subsequent measurement of the fluorescent signal (with white opaque walls of the wells, for example Costar # 3610, USA) into wells B1, B2, ..., B n and E1, E2, ..., En. The sieving density of the cells is selected so that by the time the fluorescent signals are measured, the cells are in a subconfluent state. Cell-free medium was added to wells A1, A2, ..., An for subsequent use to correct for background fluorescence of the wells in the fluorescence ranges of the Hoechst33342 dye and EGFP protein.
После этого клетки инкубируются несколько часов для их прикрепления к поверхности лунок ((2) на фиг. 1) и затем в лунки Э1, Э2, …, Эn путем замены среды добавляется рекомбинантный репликативно-дефектный аденовирус для экспрессии EGFP под контролем тетрациклин-индуцируемого промотора (Ad-Tet-EGFP) с необходимой множественностью заражения, и индуктор экспрессии трансгена доксициклин (DOX) в подобранной концентрации. В лунки A1, А2, …, An и Б1, Б2 … Бn добавляется среда без аденовируса ((5) на фиг. 1).After this, the cells are incubated for several hours to attach to the surface of the wells ((2) in Fig. 1), and then recombinant replicatively defective adenovirus is added to wells E1, E2, ..., En to express EGFP under the control of the tetracycline-induced promoter (Ad-Tet-EGFP) with the necessary multiplicity of infection, and the inducer of expression of the doxycycline transgene (DOX) in the selected concentration. In the wells A1, A2, ..., An and B1, B2 ... Bn, medium without adenovirus is added ((5) in Fig. 1).
Клетки инкубируются в течение 18-24 часов для наработки базального уровня репортерного белка EGFP ((4) на фиг. 1), после чего с заменой среды в лунки добавляется растворитель испытуемых веществ S (лунки А1, Б1 и Э1) и испытуемые вещества (X, Y, …) (соответственно в лунки А2, Б2, Э2; …; An, Бn, Эn) ((5) на фиг. 1).Cells are incubated for 18-24 hours to produce the basal level of the EGFP reporter protein ((4) in Fig. 1), after which, with the replacement of the medium, the solvent of test substances S (wells A1, B1 and A1) and test substances (X , Y, ...) (respectively, in holes A2, B2, E2; ...; An, Bn, En) ((5) in Fig. 1).
После инкубации в течение 18 часов ((6) на фиг. 1) культуральная среда удаляется из всех лунок и добавляется фосфатно-солевой буфер, содержащий 10 мкг/мл красителя Hoechst33342. После инкубации в течение 30 мин при 37°С лунки дважды промываются фосфатно-солевым буфером для удаления несвязавшегося с клеточной ДНК красителя ((7) на фиг. 1). После этого измеряется флуоресценция лунок с параметрами длин волн возбуждения/испускания 485 нм / 538 нм для измерения интенсивности сигнала EGFP и 355 нм / 460 нм для измерения интенсивности сигнала красителя Hoechst33342 с использованием планшетного флуориметра (например, Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Copr., США)) ((5) на фиг. 1).After an incubation of 18 hours ((6) in Fig. 1), the culture medium is removed from all wells and a phosphate-buffered saline containing 10 μg / ml Hoechst33342 is added. After incubation for 30 min at 37 ° C, the wells are washed twice with phosphate-buffered saline to remove the dye that is not bound to the cell DNA ((7) in Fig. 1). After that, fluorescence of the wells with excitation / emission wavelength parameters of 485 nm / 538 nm is measured to measure the EGFP signal intensity and 355 nm / 460 nm to measure the signal intensity of the Hoechst33342 dye using a flatbed fluorimeter (e.g., Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Copr., USA)) ((5) in Fig. 1).
Расчет интенсивностей нормализованных сигналов флуоресценции EGFP в клетках, зараженных аденовирусом Ad-Tet-EGFP, после инкубации с испытуемыми веществами или их композициями для выявления факта увеличения продукции рекомбинантного белка в результате действия испытуемого вещества или их композиции, проводится следующим образом ((9) на фиг. 1).The calculation of the intensities of normalized EGFP fluorescence signals in cells infected with Ad-Tet-EGFP adenovirus after incubation with the test substances or their compositions to detect the fact of an increase in the production of the recombinant protein as a result of the action of the test substance or their composition is carried out as follows ((9) in FIG. . one).
Полученные значения интенсивностей флуоресценции красителя Hoechst33342 и EGFP в лунках Б1, …, Бn и Э1, …, Эn корректируются на фоновое значение флуоресценций лунок А1, … An, соответственноThe obtained fluorescence intensities of the dye Hoechst33342 and EGFP in wells B1, ..., Bn and A1, ..., En are corrected for the background fluorescence of wells A1, ... An, respectively
Затем рассчитывается нормированная на количество клеток флуоресценция EGFP в лунках Б1, …, Бn и Э1, …, ЭnThen, the EGFP fluorescence normalized to the number of cells in the wells B1, ..., Bn and E1, ..., En is calculated
После этого для получения истинного значения флуоресценции EGFP в экспериментальных лунках Э1, …, Эn проводится корректировка на фоновое значение флуоресценций лунок с клетками, незараженными аденовирусом:After that, in order to obtain the true value of EGFP fluorescence in experimental wells E1, ..., En, an adjustment is made to the background value of fluorescence of wells with cells not infected with adenovirus:
Истинные значения флуоресценции в опытных лунках Эп IЭn(Е)corr сравниваются со значением флуоресценции в контрольной лунке Э1 IЭ1(Е)corr в отсутствии воздействия испытуемых веществ и в присутствии их растворителя ((10) на фиг. 1). Вещества, вызывающие увеличение нормированного сигнала EGFP по сравнению с сигналом лунки Э1, отбираются как потенциально обладающие противоопухолевой активностью (вещество X на фиг. 1) благодаря воздействию на протеинкиназу mTOR, топоизомеразы I или II, гистон деацетилазы, неизвестные мишени, в частности, ингибируемые соединениями LY294002 и LY303511, или их комбинации, для последующего детального изучения и характеризации.The true fluorescence values in the experimental wells Ep I En (E) corr are compared with the fluorescence values in the control well El I E1 (E) corr in the absence of exposure to the test substances and in the presence of their solvent ((10) in Fig. 1). Substances causing an increase in the normalized EGFP signal compared to the E1 signal are selected as potentially having antitumor activity (substance X in Fig. 1) due to the effects on protein kinase mTOR, topoisomerases I or II, histone deacetylases, unknown targets, in particular, inhibited by compounds LY294002 and LY303511, or combinations thereof, for subsequent detailed study and characterization.
Пример 2. Валидация метода определения количества клеток по окраске красителем Hoechst33342Example 2. Validation of the method for determining the number of cells by staining with Hoechst33342 dye
Клетки линии NCI-H1299 (немелкоклеточный рак легкого человека) рассевали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета с белыми стенками (Costar #3610, США) в количестве 2, 5 и 10 тыс. на лунку в модифицированной среде Дульбекко: среде F12 (1:1) (среда DMEM/F12), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и инкубировались в ростовой среде. После этого культуральную среду удаляли из лунок и добавляли в каждую лунку по 100 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 10 мкг/мл красителя Hoechst33342. После 30-минутной инкубации лунки промывали 2 раза 100 мкл фосфатно-солевого буфера, и затем измеряли значение флуоресценции (длины волн возбуждения/испускания 355 нм/460 нм) в лунках с последующей коррекцией на значение флуоресценции в лунке без клеток (измерения выполнялись на планшетном флуориметре Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Copr., США). Для каждого высеваемого числа клеток эксперимент проводился в 3-кратном повторе. На фиг. 2 представлены результаты измерений. Видно, что присутствует линейная зависимость интенсивности сигнала флуоресценции Hoechst33342 от количества клеток.Cells of the NCI-H1299 line (non-small cell lung cancer) were scattered into the wells of a 96-well flat-bottom white-walled plate (Costar # 3610, USA) in the amount of 2, 5 and 10 thousand per well in a modified Dulbecco medium: F12 medium (1: 1) (DMEM / F12 medium) containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin and were incubated in growth medium. After that, the culture medium was removed from the wells and 100 μl of phosphate-buffered saline containing 10 μg / ml of Hoechst33342 dye was added to each well. After a 30-minute incubation, the wells were washed 2 times with 100 μl of phosphate-saline buffer, and then the fluorescence value (excitation / emission wavelength of 355 nm / 460 nm) was measured in the wells, followed by correction for the fluorescence value in the cellless well (measurements were performed on a plate Fluoroskan Ascent FL Fluorimeter, Thermo Electron Copr., USA). For each plated number of cells, the experiment was carried out in a 3-fold repetition. In FIG. 2 presents the measurement results. It can be seen that there is a linear dependence of the intensity of the Hoechst33342 fluorescence signal on the number of cells.
Пример 3. Подбор оптимального уровня продукции репортерного белка EGFPExample 3. The selection of the optimal level of production of reporter protein EGFP
Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета с белыми стенками (Costar #3610, США) в количестве 5 тыс. на лунку в среде DMEM/F12, не содержащей краситель феноловый красный (Invitrogene, США), и содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, скринированной на содержание тетрациклина (HyClone, США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Через несколько часов клетки заражали аденовирусом Ad-Tet-EGFP и инкубировали в присутствии доксициклина в концентрации 1, 10, 100 или 1000 нг/мл. Интенсивность сигнала флуоресценции EGFP измеряли через 20, 40 и 65 часов на планшетном флуориметре Fluoroskan Ascent FL (Thermo Electron Copr., США) с длинами волн возбуждения/испускания 485/538 нм. На фиг. 3 представлены результаты измерения интенсивности в относительных единицах флуоресценции после нормирования результатов измерений на фоновую флуоресценцию клеток, не зараженных аденовирусом. Видно, что при концентрации доксициклина 10 нг/мл через 40 часов интенсивность флуоресценции уверенно измеряется, в то время как уровень экспрессии EGFP не достигает насыщения, что следует из существенно (более чем в 2 раза) большего значения интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации доксициклина до 100 или 1000 нг/мл. Таким образом, при присутствии доксициклина в концентрации 10 нг/мл через 40-48 часов уровень продукции EGFP в клетках достаточно высок для его уверенного измерения по интенсивности флуоресценции, но не достигает насыщения, что обеспечивает необходимый динамический диапазон для возможности регистрации увеличения уровня белка EGFP в ответ на действие испытуемых веществ.Cells of the NCI-H1299 line were scattered into the wells of a 96-well flat-bottomed white-walled plate (Costar # 3610, USA) in the amount of 5 thousand per well in DMEM / F12 medium containing no phenol red dye (Invitrogene, USA) and containing 10 % fetal bovine serum screened for tetracycline (HyClone, USA), 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. After several hours, the cells were infected with Ad-Tet-EGFP adenovirus and incubated in the presence of doxycycline at a concentration of 1, 10, 100 or 1000 ng / ml. The intensity of the EGFP fluorescence signal was measured after 20, 40, and 65 hours on a Fluoroskan Ascent FL plate fluorometer (Thermo Electron Copr., USA) with excitation / emission wavelengths of 485/538 nm. In FIG. Figure 3 presents the results of measuring the intensity in relative fluorescence units after normalizing the measurement results to the background fluorescence of cells not infected with adenovirus. It can be seen that at a concentration of
Пример 4. Апробация системы скрининга на модельных веществахExample 4. Testing a screening system for model substances
Анализ проводился в соответствии с общей схемой анализа, описанной в примере 1. Использовались клетки линии NCI-H1299, которые высевались в количестве 5 тыс.клеток в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета с белыми стенками в среде DMEM/F12, не содержащей краситель феноловый красный, и содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, скринированной на содержание тетрациклина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки заражали аденовирусом Ad-Tet-EGFP и инкубировали в присутствии доксициклина в концентрации 10 нг/мл в течение 24 часов. Затем к клеткам со сменой культуральной среды добавляли ингибитор LY294002 до концентрации 25 мкМ, ингибитор протеинкиназы mTOR Compound 401 до концентрации 50 мкМ, ингибиторы LY294002 или Compound 401 в тех же концентрациях в сочетании с ингибитором топоизомеразы II этопозидом в концентрации 10 мкМ, или равный объем растворителя ингибиторов диметилсульфоксида, и инкубировали в течение 18 часов, после чего проводили окраску красителем Hoechst33342, как описано в примере 2. Расчет истинных значение флуоресценций проводили, как описано в примере 1. Результаты представлены на фиг. 4. Видно, что обработка клеток ингибитором LY294002 приводит к более чем 4-кратному увеличению уровня белка EGFP, кодируемого аденовирусом Ad-Tet-EGFP, что свидетельствует о воздействии ингибитора LY294002 на протеинкиназу mTOR и другие неизвестные фармацевтические мишени в опухолевых клетках, как это было продемонстрировано ранее (Shepelev MV, Korobko EV, Vinogradova TV, Kopantsev EP, Korobko IV. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013; 10(3):931-9). Аналогично, обработка клеток ингибитором протеинкиназы mTOR Compound 401 также вызывала почти 2- кратное увеличение уровня белка EGFP. Сочетание ингибиторов LY294002 или Compound 401 с ингибитором топоизомеразы II, еще одной мишени, ингибирование которой должно детектироваться системой скрининга, приводило к дальнейшему увеличению уровня белка EGFP в клетках, до приблизительно 6 и 3 раз соответственно.The analysis was carried out in accordance with the general analysis scheme described in Example 1. Cells of the NCI-H1299 line were used, which were plated in the amount of 5 thousand cells per well of a 96-well flat-bottom plate with white walls in DMEM / F12 medium without phenol dye red, and containing 10% fetal bovine serum screened for tetracycline, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Cells were infected with Ad-Tet-EGFP adenovirus and incubated in the presence of doxycycline at a concentration of 10 ng / ml for 24 hours. Then, LY294002 inhibitor was added to cells with a change in culture medium to a concentration of 25 μM, mTOR protein
Claims (10)
а) рассев клеток;
б) заражение клеток рекомбинантным репликативно-дефектным аденовирусом, кодирующим репортерный белок;
в) инкубацию зараженных клеток для наработки начального уровня репортерного белка;
г) добавление к клеткам испытуемого вещества или его композиции (опыт) или растворителя испытуемого вещества или его композиции (контроль);
д) инкубацию опытных и контрольных клеток;
е) измерение количества репортерного белка в опытных и контрольных клетках;
ж) определение количества опытных и контрольных клеток;
з) нормирование уровней репортерного белка в опыте и контроле на соответствующее количество клеток;
и) сравнение уровней репортерного белка в опыте и контроле, причем увеличение уровня репортерного белка в опыте по сравнению с контролем означает, что испытуемое вещество или его композиция обладает потенциальной противоопухолевой активностью.1. A method for detecting substances and their compositions with antitumor activity, based on increasing the production of a reporter protein encoded by a recombinant replicatively defective adenovirus, in response to the effect of substances or their compositions on molecular targets of the protein kinase mTOR, topoisomerases I and II, histone deacetylases and unknown targets inhibited by compounds LY294002 and LY303511, comprising the following steps:
a) sieving of cells;
b) infection of cells with a recombinant replicatively defective adenovirus encoding a reporter protein;
c) incubation of infected cells to produce an initial level of reporter protein;
d) adding to the cells of the test substance or its composition (experiment) or a solvent of the test substance or its composition (control);
d) incubation of experimental and control cells;
f) measuring the amount of reporter protein in the experimental and control cells;
g) determination of the number of experimental and control cells;
h) normalization of the levels of reporter protein in the experiment and control on the appropriate number of cells;
i) a comparison of the levels of reporter protein in the experiment and control, and an increase in the level of reporter protein in the experiment compared with the control means that the test substance or its composition has potential antitumor activity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014119354/15A RU2602452C2 (en) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | Method of substances and their compositions detection with anticancer activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014119354/15A RU2602452C2 (en) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | Method of substances and their compositions detection with anticancer activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014119354A RU2014119354A (en) | 2015-11-20 |
| RU2602452C2 true RU2602452C2 (en) | 2016-11-20 |
Family
ID=54553012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014119354/15A RU2602452C2 (en) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | Method of substances and their compositions detection with anticancer activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2602452C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2330886C2 (en) * | 2002-01-22 | 2008-08-10 | Закрытое Акционерное Общество "Евроген Айпи" | NEW FLUORESCENT PROTEINS Aequorea coerulscens AND METHODS OF APPLICATION THEREOF |
| WO2008150496A2 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Genelux Corporation | Assay for sensitivity to chemotherapeutic agents |
| WO2012071559A2 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Presage Biosciences, Inc. | Therapeutic methods and compositions for solid delivery |
-
2014
- 2014-05-14 RU RU2014119354/15A patent/RU2602452C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2330886C2 (en) * | 2002-01-22 | 2008-08-10 | Закрытое Акционерное Общество "Евроген Айпи" | NEW FLUORESCENT PROTEINS Aequorea coerulscens AND METHODS OF APPLICATION THEREOF |
| WO2008150496A2 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Genelux Corporation | Assay for sensitivity to chemotherapeutic agents |
| WO2012071559A2 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Presage Biosciences, Inc. | Therapeutic methods and compositions for solid delivery |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHEPELEV M.V. et al. LY294002 enhances expression of proteins encoded by recombinant replication-defective adenoviruses via mTOR- and non-mTOR-dependent mechanisms. Mol Pharm. 2013 Mar 4; 10(3): 931-939. Epub 2013 Feb 15. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014119354A (en) | 2015-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bacci et al. | Reprogramming of amino acid transporters to support aspartate and glutamate dependency sustains endocrine resistance in breast cancer | |
| Huang et al. | A systems pharmacology approach uncovers wogonoside as an angiogenesis inhibitor of triple-negative breast cancer by targeting hedgehog signaling | |
| Peng et al. | Repo-man controls a protein phosphatase 1-dependent threshold for DNA damage checkpoint activation | |
| Zimmer et al. | Small-molecule inhibitors of HIF-2a translation link its 5′ UTR iron-responsive element to oxygen sensing | |
| Patel et al. | RNF168 regulates R-loop resolution and genomic stability in BRCA1/2-deficient tumors | |
| Gammazza et al. | Doxorubicin anti-tumor mechanisms include Hsp60 post-translational modifications leading to the Hsp60/p53 complex dissociation and instauration of replicative senescence | |
| EP2986740B1 (en) | Companion diagnostic for cdk4 inhibitors | |
| Trakala et al. | Aurora B prevents delayed DNA replication and premature mitotic exit by repressing p21Cip1 | |
| Hou et al. | The NuRD complex-mediated p21 suppression facilitates chemoresistance in BRCA-proficient breast cancer | |
| Byun et al. | Antitumor activity of rutaecarpine in human colorectal cancer cells by suppression of Wnt/β-catenin signaling | |
| Peng et al. | Hypoxia stabilizes microtubule networks and decreases tumor cell chemosensitivity to anticancer drugs through Egr‐1 | |
| Rehman et al. | High-throughput screening discovers antifibrotic properties of haloperidol by hindering myofibroblast activation | |
| Devi et al. | Activation of prolyl hydroxylase‐2 for stabilization of mitochondrial stress along with simultaneous downregulation of HIF‐1α/FASN in ER+ breast cancer subtype | |
| Alafate et al. | Targeting Aurora kinase B attenuates chemoresistance in glioblastoma via a synergistic manner with temozolomide | |
| Nojima et al. | Differential properties of mitosis-associated events following CHK1 and WEE1 inhibitor treatments in human tongue carcinoma cells | |
| Tsukada et al. | The FHA domain of PNKP is essential for its recruitment to DNA damage sites and maintenance of genome stability | |
| Cui et al. | CASC5 is a potential tumour driving gene in lung adenocarcinoma | |
| CA2492772A1 (en) | Activated checkpoint therapy and methods of use thereof | |
| CN110300585A (en) | Anticancer compound and application thereof | |
| Luo et al. | Loss of phosphatase CTDNEP1 potentiates aggressive medulloblastoma by triggering MYC amplification and genomic instability | |
| Williams et al. | Generation and characterization of a stable MK2‐EGFP cell line and subsequent development of a high‐content imaging assay on the Cellomics ArrayScan platform to screen for p38 mitogen‐activated protein kinase inhibitors | |
| Wang et al. | Repression of TSC1/TSC2 mediated by MeCP2 regulates human embryo lung fibroblast cell differentiation and proliferation | |
| RU2602452C2 (en) | Method of substances and their compositions detection with anticancer activity | |
| Liu et al. | Mulberrofuran G inhibits proliferation and migration by inactivating JAK2/STAT3 signaling in lung cancer cells | |
| Kang et al. | GSK3β-driven SOX2 overexpression is a targetable vulnerability in esophageal squamous cell carcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20151124 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180515 |