RU2600868C2 - Preparation for cleaning soil from oil contaminants - Google Patents
Preparation for cleaning soil from oil contaminants Download PDFInfo
- Publication number
- RU2600868C2 RU2600868C2 RU2014138219/10A RU2014138219A RU2600868C2 RU 2600868 C2 RU2600868 C2 RU 2600868C2 RU 2014138219/10 A RU2014138219/10 A RU 2014138219/10A RU 2014138219 A RU2014138219 A RU 2014138219A RU 2600868 C2 RU2600868 C2 RU 2600868C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oil
- soil
- vkm
- microorganisms
- soils
- Prior art date
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв от нефтезагрязнений.The invention relates to microbiology and biotechnology, namely the technology for the production of preparations intended for the purification of soils from oil pollution.
Сущность: представлен препарат для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащий биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.Essence: a preparation is presented for cleaning soil from oil pollution, containing the biomass of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D, taken in equal proportions, immobilized on the natural zeolite of the Honguruu deposit at a ratio of 1:10.
Препарат позволяет в сравнительно короткий срок произвести эффективную очистку почв от нефтезагрязнений.The drug allows for a relatively short time to effectively clean the soil from oil pollution.
Известен биопрепарат «Путидойл» (1. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (2. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151). Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м3) до +18+28°С, перемешивание, аэрирование и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.Known biological product “Putidul” (1. USSR author's certificate No. 1076446, Strain Pseudomonas putida 36, used to clean water and soil from oil and oil products. A1, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/20, C02F 3 / 34, C02F 101: 32, C12N 1/20, C12R 1:40 Application: 3474745, 07/22/1982 Published: 02/28/1984 Applicant: West Siberian Oil and Gas Research Institute Authors: Dyadechko VN , Tolstokorova L.E., Morozova T.N.), used for cleaning the soil from oil pollution. The biological product is based on a monoculture of bacteria Pseudomonas putida 36 (2. Dyadechko V.N., Tolstokorova L.E., Gashev S.N. et al. On the biological reclamation of oil-contaminated sandy soils of the Middle Ob region // Soil Science. - 1990, No. 9. - S. 148-151). Its disadvantage is the complicated technology of preparation of the drug, which provides for spray drying of a live culture of bacteria, which causes injury to bacteria and, as a result, their death or loss of necessary activity due to inactivation of cells under high temperatures (+ 60 ° C). To restore the vital activity of bacteria, the authors apply a complex set of measures: heating a large amount of water (5 m 3 ) to + 18 + 28 ° C, mixing, aeration and all this for a long time (16-24 hours), which is quite enough to perform in the field complicated.
Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м2 (3. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Автор(ы): Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ"), где ризоторфин - землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов.A known method of cleaning soils from oil and oil products contaminants, in which a consortium of oil-oxidizing microorganisms Pseudomonas putida PI Ko-1, Pseudomonas fluorescens PI-896, Micrococcus sp. PI Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 with a weight ratio of 3-12 wt. % of each microorganism, while together with a suspension of a biological product, rhizotorfin is introduced into the contaminated medium in an amount of 30-120 g / m 2 (3. Patent RU 2191643. A method for cleaning soils from contamination by oil and oil products. C1, B09C 1/10, C12N 1 / 20, C12N 1/20, C12R 1:01. Application: 2001119562/13, 07/09/2001. Published: 10/27/2002. Applicant: Closed Joint-Stock Company Polyinform Author (s): Saxon VM, Kuznetsov S .A., Boykova I.V., Novikova I.I. Patentee: Closed Joint-Stock Company Polyinform), where rizotorfin is a fertilizer of nitrogen-fixing microorganisms.
Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+4+8°С).The disadvantage is that when preparing a working suspension of microorganisms, the temperature is maintained at + 18 + 22 ° C, i.e. microorganisms that are part of the consortium are not capable of degradation of oil products at low positive temperatures (+ 4 + 8 ° C).
Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата "Деворойл", содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (4. Патент RU 2114071. Способ очистки почвы, природных и сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием биопрепаратов. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02. Заявка: 97107716/13, 22.05.1997. Опубликовано: 27.06.1998. Заявитель: Борзенков Игорь Анатольевич. Авторы: Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин P.P., Поспелов М.Е., Свитнев А.И. Патентообладатель: Борзенков Игорь Анатольевич). Недостатком является то, что несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.A known method of cleaning the soil using a biological product "Devoroil" containing a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. This method involves the storage of a suspension of microorganisms using NaCl, biologically active substances (vitamins) and osmoprotectors (betaine) (4. Patent RU 2114071. A method for cleaning soil, natural and waste water contaminated with oil and oil products, using biological products. C02F 3/34 , B09C 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02. Application: 97107716/13, 05.22.1997. Published: 06/27/1998. Applicant: Borzenkov Igor Anatolevich Authors: Borzenkov I.A. , Belyaev S.S., Ibatullin PP, Pospelov M.E., Svitnev A.I. Patentee: Igor Anatolyevich Borzenkov). The disadvantage is that despite the addition of protective substances to the bacterial suspension, the number of microorganisms decreases regardless of the storage temperature.
Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0·109 кл./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 мас. % и воду в количестве 58,95-53,25 мас. %. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 мас. %) и нормальные парафины (1,0-1,5 мас. %). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре 10-15°С с момента его изготовления (5. Патент RU 2053205. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. C1, C02F 3/34, C09K 3/32, В09С 1/10, В09С 101:00. Заявка: 94034274/13, 29.09.1994. Опубликовано: 27.01.1996. Заявитель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт. Авторы: Белонин М.Д., Рогозина Е.А., Свечина P.M., Хотянович А.В., Орлова Н.А. Патентообладатель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт). Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6.8-7.0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.Known bacterial preparation consisting of highly active live aerobic oil-oxidizing bacteria (Mycobacterium, Pseudomonas, etc.) grown on solid carrier substrates with titers of 2.5-7.0 · 10 9 cells / g. As a carrier substrate for the immobilization of microorganisms, gamma-sterile peat with a pH of 6.8-7.0 in an amount of 40-45 wt. % and water in the amount of 58.95-53.25 wt. % In order to maintain oil-oxidizing activity during storage, nutrient substrates are additionally introduced into the preparation: ammonium oxalate (0.05-1.0 wt.%) And normal paraffins (1.0-1.5 wt.%). The shelf life of a biological product is 6 months at a temperature of 10-15 ° C from the moment of its manufacture (5. Patent RU 2053205. Biological product for cleaning soil and water from oil and oil products. C1, C02F 3/34, C09K 3/32, B09C 1 / 10, B09C 101: 00. Application: 94034274/13, 09/29/1994 Published: 01/27/1996 Applicant: All-Russian Petroleum Research and Development Institute of Geology, Authors: Belonin MD, Rogozina EA, Svechina PM, Khotyanovich A.V., Orlova N.A. Patentee: All-Russian Petroleum Research and Exploration Institute). The biological product contains oil-oxidizing bacteria, which require a pH of 6.8-7.0 and a large amount of water (about 60% water) to maintain their vital functions, which reduces its effectiveness over time.
Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м3 почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (6. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1:01. Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть"). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.A known method of cleaning soils and soils contaminated with oil and oil products using an oleophilic biological product based on the association of oil-oxidizing microorganisms - Rhodococcus erythropolis IEGM 708 and Rhodococcus ruber IEGM 327 and biosurfactant-Rhodococcus, characterized in that the soil is thoroughly cultivated to reach the initial level residual oil 5-10 weight. % and the subsequent addition of an organic baking powder, an oleophilic biological product is applied in an amount of at least 10 liters per 0.5-1.0 m 3 of soil / soil at least once a week for the first month and subsequently at least once a month before the end of the bioremediation cycle, in combination with periodic loosening and moistening, and additionally produce phytoremediation - sowing with perennial grasses (6. Patent RU 2193464. Method for bioremediation of soils and soils contaminated with oil and oil products. C1, B09C 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1:01. Application: 2001130686/13, 11/14/2001. flashed: 11/27/2002 Applicants: Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, PermNIPIneft Limited Liability Company Authors: Ivshina IB, Kostarev SM, Kuyukina MS, Zakshevskaya LV Patent holders: Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Limited Liability Company PermNIPIneft). However, the above method involves the use of solid-liquid phase bioreactor and / or aerated soil pads as the initial treatment of highly contaminated soil. This method of reducing the level of pollution is time-consuming and involves disruption of the fertile soil layer (humus part of the soil profile), which is not applicable for accidents and oil spills in the Far North (including in the tundra zone). Since a prerequisite for cleaning and restoring oil-contaminated permafrost soils is the preservation of the fertile soil layer. This is explained by the fact that at the place of removing the soil cover under permafrost conditions, the formation of thermokarst defrost with the formation of funnels, dips or alas is possible, which in turn leads to the development of thermoerosion and causes great damage to the vulnerable and difficult to restore soil ecosystem of the Far North.
Нетрудоемким и наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ очистки почв от нефтяных углеводородов, предусматривающий иммобилизацию выделенных с конкретных загрязненных объектов углеводородокисляющих микроорганизмов на природном цеолите месторождения Хонгуруу и внесение его в почву, загрязненную нефтяными углеводородами. При этом степень деструкции осуществляется за 4 месяца (7. Ерофеевская Л.А., Бурмистрова Т.И., Алексеева Т.П., Терещенко Н.Н. // Цеолит как незаменимый компонент в реабилитации нарушенных земель. Биологические науки. Новое слово в науке и практике: гипотезы, апробация результатов исследований. 2013, №3. - С. 7-9).A non-laborious and closest to the proposed technical solution is a method of cleaning soils from petroleum hydrocarbons, which provides for the immobilization of hydrocarbon-oxidizing microorganisms extracted from specific contaminated objects on the natural zeolite of the Honguruu deposit and its introduction into soil contaminated with petroleum hydrocarbons. Moreover, the degree of destruction is carried out in 4 months (7. Erofeevskaya L.A., Burmistrova T.I., Alekseeva T.P., Tereshchenko N.N. // Zeolite as an indispensable component in the rehabilitation of disturbed lands. Biological sciences. New word in science and practice: hypotheses, approbation of research results. 2013, No. 3. - S. 7-9).
Одним из недостатков данного способа является его относительно невысокая скорость (4 месяца) очистки загрязненных почв от нефти, что не всегда приемлемо в условиях короткого северного лета. Кроме того, получение препарата на основе выделенных с конкретных загрязненных объектов углеводородокисляющих микроорганизмов не всегда удобно при быстром реагировании для устранения аварийного разлива нефти в полевых условиях и требует дополнительного времени и выполнения дополнительных исследований: выезд на место аварийного разлива, отбор проб почвы для выделения микроорганизмов, культивирование и выделение микроорганизмов, контроль нефтеокисляющей способности выделенных культур микроорганизмов, накопление биомассы, иммобилизацию микроорганизмов на сорбент-носитель, высушивание полученного биопрепарата, контроль полученного препарата и т.д. Все эти этапы продлевают сроки подготовки почв к самовосстановлению. Следует также подчеркнуть, что в процессе окисления нефти практическое использование микробной деградации нефти определяется составом биопрепарата, что определяет жизнеспособность бактерий, их количеством и технологией использования препаратов в практических целях.One of the disadvantages of this method is its relatively low speed (4 months) for cleaning contaminated soils from oil, which is not always acceptable in the conditions of a short northern summer. In addition, the preparation of a drug based on hydrocarbon-oxidizing microorganisms isolated from specific contaminated sites is not always convenient with a quick response to eliminate an emergency oil spill in the field and requires additional time and additional research: going to the emergency spill site, taking soil samples to isolate microorganisms, cultivation and isolation of microorganisms, control of the oil-oxidizing ability of selected cultures of microorganisms, the accumulation of biomass, immobil zatsiyu microorganisms to the sorbent carrier, drying the resulting biological preparation, control of the obtained preparation, etc. All these stages extend the preparation of soils for self-healing. It should also be emphasized that in the process of oil oxidation, the practical use of microbial degradation of oil is determined by the composition of the biological product, which determines the viability of bacteria, their number and the technology of using drugs for practical purposes.
Еще одним недостатком данного способа является то, что он применим для очистки почв от свежих нефтезагрязнений и не применим для очистки почв с застарелыми нефтезагрязнениями (до 10 лет).Another disadvantage of this method is that it is applicable for cleaning soils from fresh oil pollution and is not applicable for cleaning soils with chronic oil pollution (up to 10 years).
Задачей изобретения является ускорение процессов деструкции как свежего, так и застарелого нефтезагрязнения и сокращение сроков подготовки почв к самовосстановлению.The objective of the invention is to accelerate the degradation processes of both fresh and old oil pollution and reduce the timing of soil preparation for self-healing.
Технический результат заключается в снижении уровня нефтезагрязнения в почвах до 83% за 80 суток в почвах с застарелым нефтезагрязнением (10 лет) и до 53-55% за 60 суток - в почвах со свежим нефтезагрязнением.The technical result consists in reducing the level of oil pollution in soils to 83% in 80 days in soils with a long-term oil pollution (10 years) and to 53-55% in 60 days in soils with fresh oil pollution.
Задача выполняется, а технический результат достигается созданием препарата для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащего биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.The task is carried out, and the technical result is achieved by creating a preparation for cleaning soils from oil pollution, containing the biomass of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D, taken in equal proportions, immobilized on the natural zeolite of the Honguruu deposit at a ratio of 1:10.
Характеристика штаммов.Characterization of strains.
1) Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D1) Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D
Штамм Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D выделен из мерзлотного грунта (Якутск, Центральная Якутия).Strain Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D isolated from permafrost soil (Yakutsk, Central Yakutia).
Штамм характеризуется следующими признаками: грамположительные, неподвижные палочки. В односуточной культуре на минеральной среде Мюнца образует короткие толстые палочки. При делении наблюдается характерное расположение клеток под углом друг к другу.The strain is characterized by the following symptoms: gram-positive, fixed sticks. In a one-day culture on the mineral environment, Müns forms short thick sticks. During division, a characteristic arrangement of cells at an angle to each other is observed.
На МПА формирует гладкие колонии, кремовато-розового цвета, диаметром 1-5 мм.On the MPA it forms smooth colonies, creamy pink in color, with a diameter of 1-5 mm.
Штамм растет при температуре +4+30±1°С в аэробных условиях и слабо в анаэробных условиях. Оптимум роста +4+20±1°С.The strain grows at a temperature of + 4 + 30 ± 1 ° C under aerobic conditions and weakly under anaerobic conditions. Growth optimum + 4 + 20 ± 1 ° С.
Оксидазаотрицательный, не декарбоксилирует лизин, декарбоксирует орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Не активен в отношении инозита. Уреаза отрицателен. Тест с β-галактозидазой отрицателен. Не ферментирует лактозу, глюкозу, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.Oxidase negative, does not decarboxylate lysine, decarboxes ornithine, is not able to break down phenylalanine. Indolenegative. Hydrogen sulfide does not produce. Not active against inositol. Urease is negative. The β-galactosidase test is negative. Does not ferment lactose, glucose, sodium citrate, sodium malonate. Uses petroleum hydrocarbons as an energy source.
Устойчив к амоксиклаву, ампициллину, каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амосину. Слабоустойчив к левомицетину. Чувствителен к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу.Resistant to amoxiclav, ampicillin, kaotima, amoxicillin, pefloxacin, amosin. Low resistance to chloramphenicol. It is sensitive to benzylpenicillin, mozivar, oxacillin, cefatoxime, ceftriaxone, polymyxin, furazolidone, metranidazole.
При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:When sequencing the variable regions of 16SpPHK, the following assembled nucleotide sequence was obtained for the studied strain:
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Rhodococcus sp.According to the results of the analysis of sequencing of variable regions of 16SpPHK, the test strain is classified as Rhodococcus sp.
Результаты обработки секвенсов представлены в таблице 1.The results of processing sequences are presented in table 1.
Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к роду Rhodococcus, причем гомология с видами R. qingshengii и R. jialingiae составляет 100%.Screening using the GenBank and RDP-II database showed that the studied strain is closest to the genus Rhodococcus, and the homology with the species R. qingshengii and R. jialingiae is 100%.
Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).The strain is not virulent, not toxic, not toxigenic, not phytotoxic (the test was carried out on white mice and seeds of higher plants (oats cultivar Skakun and wheat cultivar Prilenskaya-19)).
Условия хранения:Storage conditions:
1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°С.1. In lyophilized form in ampoules at + 4 ° C.
2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time in 2 weeks) on the slanted MPA.
Штамм идентифицирован и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН (г. Пущино, Московской обл., пр. Науки, дом 5). Коллекционный номер ВКМ Ac-2626D.The strain was identified and deposited by the All-Russian Collection of Microorganisms (VKM) of the IBPM RAS (Pushchino, Moscow Region, Nauki Ave., Building 5). Collector number VKM Ac-2626D.
2) Serratia plymuthica VKM B-2819D2) Serratia plymuthica VKM B-2819D
Штамм Serratia plymuthica VKM B-2819D выделен из почвы, загрязненной арктическим дизельным топливом (Чапчылган, Центральная Якутия).The strain Serratia plymuthica VKM B-2819D was isolated from soil contaminated with Arctic diesel fuel (Chapchylgan, Central Yakutia).
Штамм характеризуется следующими признаками: грамотрицательные, палочковидные, перитрихиальные, аспорогенные, хемороганотрофные, факультативно-анаэробные бактерии.The strain is characterized by the following symptoms: gram-negative, rod-shaped, peritrichial, asporogenous, hemorrhotrophic, facultative anaerobic bacteria.
Растет при температуре +4+25±1°С, оптимум роста +4+15±°С в аэробных условиях, но может расти при температуре +30°С и в анаэробных условиях, однако теряет пигмент.It grows at a temperature of + 4 + 25 ± 1 ° C, the optimum growth is + 4 + 15 ± ° C under aerobic conditions, but can grow at a temperature of + 30 ° C and under anaerobic conditions, however, it loses pigment.
На МПА формирует влажные от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм. На минеральной среде Мюнца с нефтью растет в виде пастообразных колоний малинового цвета.On MPA it forms wet colonies with a diameter of 1-3 mm from raspberry to orange. On the mineral environment, Muntz with oil grows in the form of pasty colonies of raspberry color.
Оксидазаположительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Активен в отношении инозита. Уреазаположителен. Тест с β-галактозидазой положительный. Ферментирует сахарозу, маннит, сорбит, мальтозу. Не ферментирует лактозу, ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.Oxidase-positive, does not decarboxylate lysine and ornithine, is not able to break down phenylalanine. Indolenegative. Hydrogen sulfide does not produce. Active against inositol. Urease positive. The test with β-galactosidase is positive. Ferments sucrose, mannitol, sorbitol, maltose. Does not ferment lactose, sodium acetate, sodium citrate, sodium malonate. Uses petroleum hydrocarbons as an energy source.
Устойчив к каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амоксиклаву, левомицетину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу, амосину. Слабоустойчив к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, ампициллину.Resistant to caotima, amoxicillin, pefloxacin, amoxiclav, chloramphenicol, cefatoxime, ceftriaxone, polymyxin, furazolidone, metranidazole, amosin. Weakly resistant to benzylpenicillin, mozivar, oxacillin, ampicillin.
При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:When sequencing the variable regions of 16SpPHK, the following assembled nucleotide sequence was obtained for the studied strain:
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Serratia plymuthica. Результаты обработки секвенсов представлены в таблице 2.According to the results of the analysis of sequencing of variable regions of 16SpPHK, the test strain is assigned to the species Serratia plymuthica. The results of processing sequences are presented in table 2.
Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Serratia plymuthica (99,77%).Screening using the GenBank and RDP-II database showed that the studied strain is closest to the species Serratia plymuthica (99.77%).
Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).The strain is not virulent, not toxic, not toxigenic, not phytotoxic (the test was carried out on white mice and seeds of higher plants (oats cultivar Skakun and wheat cultivar Prilenskaya-19)).
Условия хранения:Storage conditions:
1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°С.1. In lyophilized form in ampoules at + 4 ° C.
2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time in 2 weeks) on the slanted MPA.
Штамм идентифицирован и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН (г. Пущино, Московской обл., пр. Науки, дом 5). Коллекционный номер VKM B-2819D.The strain was identified and deposited by the All-Russian Collection of Microorganisms (VKM) of the IBPM RAS (Pushchino, Moscow Region, Nauki Ave., Building 5). Collector Number VKM B-2819D.
Характеристика субстрата-носителя.Characterization of the substrate carrier.
По мнению многих авторов для иммобилизации УОМ предпочтительны естественные минеральные и органические материалы. При этом сорбент-носитель, используемый для иммобилизации клеток УОМ, должен обладать следующими основными свойствами: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.According to many authors, natural mineral and organic materials are preferable for immobilization of UOM. At the same time, the sorbent carrier used to immobilize UOM cells should have the following basic properties: permeability, oil capacity, non-caking, porosity, and flowability.
Наиболее полно этим требованиям отвечает природный цеолит месторождения Хонгуруу (Западная Якутия) - каркасный аллюмосиликат, светло-зеленого цвета, в структуре которого имеются сообщающиеся полости, занятые крупными ионами различных элементов и молекулами воды, имеющими значительную свободу движения, благодаря чему происходят ионный обмен и обратимая дегидратация (8. Колодезников К.Е., Новгородов П.Г., Степанов В.В. Типы цеолитового сырья месторождения Хонгуруу // Перспективы применения цеолитовых пород месторождения Хонгуруу: Сб. науч. Тр. - Якутск: ЯНЦ СО РАН, 1993. - С. 5-13).The natural zeolite of the Khonguruu deposit (Western Yakutia) is the most fully compliant - a light-green frame aluminosilicate, in the structure of which there are communicating cavities occupied by large ions of various elements and water molecules that have significant freedom of movement, due to which ion exchange and reversible dehydration (8. Kolodeznikov KE, Novgorodov PG, Stepanov VV Types of zeolite raw materials of the Honguruu deposit // Prospects for the use of zeolite rocks of the Honguruu deposit: Sat. Tr. - Yakutsk: NSC SB RAS, 1993. - S. 5-13).
Кристаллическая решетка цеолитов сформирована тетраидами с хорошо развитой внутренней поверхностью, что обеспечивает сорбционную способность минералу и хорошую адгезию микробным клеткам, позволяя закрепляться нефтедеструкторам не только на поверхности носителя, но и внутри, что позволяет его использование в качестве сорбента - носителя для иммобилизации УОМ.The zeolite crystal lattice is formed by tetraids with a well-developed inner surface, which ensures the sorption ability of the mineral and good adhesion to microbial cells, allowing oil destructors to be fixed not only on the surface of the carrier, but also inside, which allows its use as a sorbent carrier for immobilization of UOM.
Установлено, что насыщение цеолита месторождения Хонгуруу нефтью происходит практически сразу после погружения образца в нефть. Через 1 минуту нефтеемкость образца достигает 0,4-0,5 г/г и не меняется в течение шести часов, что соответствует литературным источникам других исследователей (9. Аренс В.Ж., Саушин А.З., Гридин О.М., Гридин А.О. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений. - М., Изд-во «Интербук», 1999. - 371 с.; 10. Новгородов П.Г., Ерофеевская Л.А., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И. Влияние цеолита на деструкцию нефтяных углеводородов // Химия нефти и газа. - Тезисы докладов VII Международной конференции. - Томск - 2009. - С. - 843-846).It was established that the zeolite of the Honguruu deposit is saturated with oil almost immediately after the sample is immersed in oil. After 1 minute, the oil capacity of the sample reaches 0.4-0.5 g / g and does not change for six hours, which corresponds to the literature of other researchers (9. Arens V.Zh., Saushin A.Z., Gridin O.M. , Gridin AO Purification of the environment from hydrocarbon pollution. - M., Publishing house "Interbook", 1999. - 371 p .; 10. Novgorodov P.G., Erofeevskaya L.A., Alekseeva T.P. , Burmistrova TI Influence of zeolite on the destruction of petroleum hydrocarbons // Chemistry of oil and gas. - Abstracts of the VII International Conference. - Tomsk - 2009. - P. - 843-846).
Являясь катализатором реакций деструкции нефтяных углеводородов, цеолит при внесении его в нефтезагрязненные почвы способствует и формированию в загрязненном грунте центров активной деструкции нефтяных углеводородов благодаря сорбции на его поверхности нефтеусваивающих культур микроорганизмов (11. Терещенко Н.Н., Лушников С.В., Пышьева Е.В. Рекультивация нефтезагрязненных почв // Экология и промышленность России. - 2002. - №10. - С. 17-20).As a catalyst for the destruction of petroleum hydrocarbons, zeolite, when introduced into oil-contaminated soils, also contributes to the formation of centers of active destruction of petroleum hydrocarbons in contaminated soil due to the sorption of oil-absorbing cultures of microorganisms on its surface (11. Tereshchenko NN, Lushnikov SV, Pysheva E .V. Reclamation of oil-contaminated soils // Ecology and Industry of Russia. - 2002. - No. 10. - P. 17-20).
Внесение цеолита в нефтезагрязненную почву может усилить также ее азотфиксирующую способность за счет наличия в цеолите таких микроэлементов, как Мо и Fe, которые активируют нитрогеназный ферментный комплекс азотфиксирующих микроорганизмов (в частности, бактерии рода Azotobacter и цианобактерий) (12. Терещенко Н.Н., Лушников С.В., Пышьева Е.В. Биологическая азотфиксация как фактор ускорения микробной деструкции нефтяных углеводородов в почве и способы ее стимулирования // Биотехнология. - 2004. - №5. - С. 41-45).The introduction of zeolite into oil-contaminated soil can also enhance its nitrogen-fixing ability due to the presence of microelements such as Mo and Fe in the zeolite, which activate the nitrogenase enzyme complex of nitrogen-fixing microorganisms (in particular, bacteria of the genus Azotobacter and cyanobacteria) (12. Tereshchenko NN, Lushnikov S.V., Pysheva E.V. Biological nitrogen fixation as a factor in accelerating the microbial destruction of petroleum hydrocarbons in the soil and methods of its stimulation // Biotechnology. - 2004. - No. 5. - P. 41-45).
Химический состав цеолита месторождения Хонгуруу позволяет использовать его как источник макро- и микроэлементов, необходимых для активации и питания нефтеокисляющих микроорганизмов почвы (13. Новгородов П.Г., Ерофеевская Л.А., Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И. Влияние цеолита на деструкцию нефтяных углеводородов // Химия нефти и газа. - Тезисы докладов VII Международной конференции. - Томск - 2009. - С. - 843-846) (таблица 3).The chemical composition of the zeolite of the Honguruu deposit allows it to be used as a source of macro- and microelements necessary for activation and nutrition of oil-oxidizing soil microorganisms (13. Novgorodov P.G., Erofeevskaya L.A., Alekseeva T.P., Burmistrova T.I. zeolite for the destruction of petroleum hydrocarbons // Chemistry of oil and gas. - Abstracts of the VII International Conference. - Tomsk - 2009. - S. - 843-846) (table 3).
Физические характеристики цеолита месторождения Хонгуруу соответствуют значениям таблицы 4.The physical characteristics of the zeolite of the Honguruu deposit correspond to the values of table 4.
Таким образом, природный цеолит является перспективным сорбентом-носителем, используемым для иммобилизации клеток УОМ, так как обладает перечисленными выше основными свойствами, а именно: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.Thus, natural zeolite is a promising carrier sorbent used for immobilization of UOM cells, as it possesses the basic properties listed above, namely: permeability, oil capacity, non-caking, porosity and flowability.
На основании выше изложенных результатов исследований был составлен препарат для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащий биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованную на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10.Based on the above stated research results, a preparation was prepared for cleaning soil from oil pollution, containing the biomass of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D, taken in equal proportions, immobilized on the natural zeolite of the Honguruu deposit at a ratio of 1:10.
Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 5.The parameters and characteristics of the biological product must correspond to the values of table 5.
Технология приготовления препарата для очистки почв от нефтезагрязненийThe technology of preparation of the drug for cleaning soils from oil pollution
- Получение маточной культуры- Obtaining uterine culture
Для получения маточных культур используют агаровые культуры штаммов Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D. Эти культуры являются посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.To obtain uterine cultures, agar cultures of strains of Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D. These crops are seeds used for sowing in fermenters.
Для каждого бактериального изолята, являющегося на данном этапе производственным штаммом, готовят отдельный посевной материал и проводят культивирование в отдельном ферментере. При этом учитываются индивидуальные видовые и штаммовые особенности бактериального деструктора. Для получения маточной культуры используют минеральную среду (14. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки // Микробиология, 1963, №5, С. 1024-1030) следующего состава (масс. %): KNO3 - 0,4; MgSO4·7Н2О - 0,08; NaCl - 0,1; K2 HPO4 - 0,14; KH2 PO4 - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.For each bacterial isolate, which is at this stage a production strain, a separate seed is prepared and cultivation is carried out in a separate fermenter. In this case, individual species and strain features of the bacterial destructor are taken into account. To obtain a uterine culture, a mineral medium is used (14. Kersten D.K. Morphological and cultural properties of indicator microorganisms in oil and gas surveys // Microbiology, 1963, No. 5, P. 1024-1030) of the following composition (wt.%): KNO 3 - 0 ,four; MgSO 4 · 7H 2 O - 0.08; NaCl - 0.1; K 2 HPO 4 0.14; KH 2 PO 4 - 0.06; distilled water - the rest; pH is 7.2. The amount of seed should be 5-10% of the volume of the nutrient medium.
Культуры изолятов, выращенные на скошенном ГРМ-агаре, основой которого является гидролизат рыбной муки либо мясо-пептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять 1×109 кл/см-3 по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича; объем - не менее 25-50 см3.Isolate cultures grown on chamfered timing agar, the basis of which is a fish meal hydrolyzate or industrial meat-peptone agar (MPA), are washed off with physiological saline and a suspension is prepared. The concentration of cells in suspension should be 1 × 10 9 cells / cm -3 according to the optical standard GISK them. AM Tarasevich; volume - not less than 25-50 cm 3 .
- Культивирование посевного материала в колбах- Cultivation of seed in flasks
Питательную минеральную среду того же состава разливают по 150 см3 в колбы вместимостью 500 см3, в среду засевают 15-25 см3 бактериальной суспензии, приготовленной методом смыва. Туда же вносят 1,5 см3 стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в УВМТ в течение 72 часов при 200 об/мин, температуре выращивания 29+1°С.Nutrient mineral medium of the same composition is poured into 150 cm 3 into flasks with a capacity of 500 cm 3 , 15-25 cm 3 of bacterial suspension prepared by flushing are inoculated into the medium. 1.5 cm 3 of sterile oil is added there. Crops in flasks are incubated in UVMT for 72 hours at 200 rpm, a cultivation temperature of 29 + 1 ° C.
- Получение посевного материала для иммобилизации- Obtaining seed for immobilization
Выращивание бактерий, составляющих основу препарата, проводят на той же среде; в качестве единственного источника углерода используют стерильную сырую нефть, концентрация углеводородсодержащих продуктов в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре 29+1°С в течение 36-48 часов.The cultivation of the bacteria that make up the basis of the drug is carried out on the same medium; sterile crude oil is used as the sole carbon source; the concentration of hydrocarbon-containing products in the fermentation liquid is at least 1% (by volume). The fermentation process is carried out with vigorous stirring at a temperature of 29 + 1 ° C for 36-48 hours.
По окончании процесса культивирования наработанную жидкость сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя.At the end of the cultivation process, the produced fluid is poured into sterile containers and used to immobilize the carrier sorbent.
- Иммобилизация штаммов на сорбент-носитель- Immobilization of strains on a sorbent carrier
Посевной материал для иммобилизации смешивают в аппарате с мешалкой с цеолитовой крошкой фракции 1-3 мм, в соотношении 1:10 (1 часть бактериальной суспензии: Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D на 10 частей цеолитового сырья). После пропитки цеолита посевным материалом для иммобилизации его высушивают контактным способом при температуре 37°С до постоянной массы или при комнатной температуре в течение 2-х суток. Препарат готов к использованию. Сухой биопрепарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают. Препарат вносят в количестве 100 г на 10 кг почвы.The seeds for immobilization are mixed in an apparatus with a stirrer with a zeolite crumb of a fraction of 1-3 mm in a ratio of 1:10 (1 part of a bacterial suspension: Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D per 10 parts of zeolite raw materials). After impregnation of the zeolite with seed for immobilization, it is dried by contact at a temperature of 37 ° C to constant weight or at room temperature for 2 days. The drug is ready to use. Dry biological product is placed in kegs or two-layer plastic bags and sealed. The drug is applied in an amount of 100 g per 10 kg of soil.
Параметры и характеристики препарата должны соответствовать значениям таблицы 5.The parameters and characteristics of the drug should correspond to the values of table 5.
Требования к условиям производства и техники безопасностиRequirements for production and safety conditions
Помещения для работы с микроорганизмами должны отвечать Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».Premises for working with microorganisms must comply with the Sanitary and Epidemiological Rules SP 1.3.2322-08 "Safety in Working with Microorganisms of the III-IV Pathogenicity (Hazard) Groups and Parasitic Pathogens".
К работам на оборудовании при работе с микроорганизмами и изготовлении сорбента-носителя должны допускаться лица, достигшие 18-летнего возраста, прошедшие обучение.Work on equipment when working with microorganisms and the manufacture of a sorbent carrier should be allowed to persons who have reached the age of 18 years who have been trained.
Все работающие должны проходить периодические медицинские осмотры в порядке, установленном органами здравоохранения (15. Приказ Минздравмедпрома России от 14.03.96 №90 «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии»; Приказ Минздравсоцразвития России от 16.08.04 №83 «Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования), и порядка проведения этих осмотров (обследований)» (с изменениями от 16 мая 2005 г.).All employees must undergo periodic medical examinations in the manner prescribed by the health authorities (15. Order of the Ministry of Health of Russia dated 14.03.96 No. 90 “On the procedure for preliminary and periodic medical examinations of employees and medical regulations for admission to the profession”; Order of the Ministry of Health and Social Development of Russia of 08.16.04 No. 83 “On approval of lists of harmful and (or) hazardous production factors and work, during the implementation of which preliminary and periodic medical examinations (examinations) are carried out, and the procedure and conducting these examinations (examinations) ”(as amended on May 16, 2005).
Выполнение требований техники безопасности должно обеспечиваться соблюдением соответствующих утвержденных инструкций и правил по технике безопасности при осуществлении соответствующих работ.Compliance with safety requirements must be ensured by complying with the relevant approved safety instructions and rules when carrying out appropriate work.
Технология биоремедиации нефтезагрязненных почв с применением препарата.Bioremediation technology of oil-contaminated soils using the drug.
Препарат вносят в почву без предварительной подготовки, в том виде, в котором он поступил на объект, под поверхностную обработку из расчета 100 г препарата на 10 кг почвы.The drug is applied to the soil without preliminary preparation, in the form in which it entered the object, under surface treatment at the rate of 100 g of the drug per 10 kg of soil.
Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах почвы выше +4°С. Допустимый уровень кислотности рН 5,0-8,0. Влажность почвы в пределах 40-60%. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата в почву - 30-45 суток.The drug is recommended to be applied at average daily soil temperatures above + 4 ° C. Permissible acidity is pH 5.0-8.0. Soil moisture in the range of 40-60%. The recommended time interval between introducing a biological product into the soil is 30-45 days.
Через 30-45 суток проводится повторный отбор почвенных проб на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.After 30-45 days, re-sampling of soil samples for the content of residual amounts of oil and oil products is carried out. This analysis will determine the need for re-processing.
Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролируется весовым методом согласно инструкции по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома (16. РД 39-0147098-90. Инструкция по охране окружающей среды при строительстве скважин на нефть и газ на суше, 1990 г.).The quality of soil cleaning from oil pollution is controlled by the gravimetric method in accordance with the instructions for monitoring the state of soils at the facilities of the Minneftegazprom enterprises (16. RD 39-0147098-90. Environmental protection instructions for the construction of oil and gas wells on land, 1990).
Ускорение сроков восстановления (рекультивации почв) с применением препарата для очистки почв от нефтезагрязненийAcceleration of terms of restoration (soil remediation) with the use of a drug for cleaning soils from oil pollution
Процесс самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем в регионах с благоприятными климатическими условиями занимает 10-25 лет, в то время как деструкция нефти и ее производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет (17. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Масливец Т.А. и др. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. Тр. М.: Наука, 1988. - С. 140-159). При соблюдении требований по условиям хранения, транспортировки и использованию предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений концентрация нефтепродуктов в почве не более 10%; глубина проникновения нефти до 20 см; температура не ниже +4°С; рН среды 5,0-8,0; влажность не менее 40-60%; аэрация почвы путем рыхления, поскольку в препарат входят аэробные бактерии, работающие при доступе кислорода воздуха, внесение препарата в нефтезагрязненную почву способствует созданию оптимальных условий для размножения и функционирования аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов, устойчивости растений к неблагоприятным факторам, что обуславливает стимулирование разложения нефти в почве и ведет к сокращению сроков восстановления нарушенных земель (до 3-5 лет). При низких концентрациях до 3% этот срок может быть сокращен до 1 года.The self-healing process of oil-contaminated soil ecosystems in regions with favorable climatic conditions takes 10-25 years, while the destruction of oil and its derivatives in the North is at least 50 years (17. Oborin A.A., Kalachnikova I.G., Maslivets T .A. Et al. Biological reclamation of oil-contaminated lands in the taiga zone // Restoration of oil-contaminated soil ecosystems: Collection of scientific papers, Moscow: Nauka, 1988. - P. 140-159). Subject to the requirements for storage, transportation and use of the proposed drug for cleaning soils from oil pollution, the concentration of oil in the soil is not more than 10%; oil penetration depth up to 20 cm; temperature not lower than + 4 ° С; pH of the medium is 5.0-8.0; humidity not less than 40-60%; soil aeration by loosening, since the preparation includes aerobic bacteria that work with the access of atmospheric oxygen, introducing the drug into oil-contaminated soil helps to create optimal conditions for the reproduction and functioning of indigenous hydrocarbon-oxidizing microorganisms, plant resistance to adverse factors, which leads to the stimulation of oil decomposition in the soil and leads to to reduce the terms of restoration of disturbed lands (up to 3-5 years). At low concentrations up to 3%, this period can be reduced to 1 year.
Для ускоренной рекультивации нефтезагрязненных почв необходимо соблюдение следующих мероприятий мероприятий:To accelerate the rehabilitation of oil-contaminated soils, the following measures must be observed:
1) нефтезагрязненные почвы необходимо смешать с чистым плодородным почвенным слоем или торфом;1) oil-contaminated soils must be mixed with a clean fertile soil layer or peat;
2) по результатам агрохимических исследований (при необходимости) - внесение в расчетных дозах недостающих в почве минеральных компонентов в виде удобрений. Обычно в сельском хозяйстве для основного, предпосевного и местного внесения при посеве или для подкормки растений применяют азотно-фосфорно-калийные удобрения (нитроаммофорску, аммофоску или азофоску), Данные удобрения универсальны и используются на всех типах почв и под все сельскохозяйственные культуры. При основном внесении на черноземных и тяжелых глинистых почвах удобрения целесообразно вносить осенью, а на легких почвах - весной. Нормы внесения зависят от плодородия почвы и в среднем составляют 35-45 кг на гектар;2) according to the results of agrochemical studies (if necessary) - introduction of mineral components in the form of fertilizers that are missing in the soil in calculated doses. Usually, in agriculture, for basic, pre-sowing and local application, when sowing or for feeding plants, nitrogen-phosphorus-potassium fertilizers are used (nitroammophores, ammofoska or azofoska). These fertilizers are universal and are used on all types of soils and under all agricultural crops. With the main application on chernozem and heavy clay soils, it is advisable to apply fertilizers in the fall, and on light soils in the spring. Application rates depend on soil fertility and average 35–45 kg per hectare;
3) увеличение кратности обработки почв препаратом до 3-4 раз за 1 вегетационный сезон;3) increase in the frequency of soil treatment with the drug up to 3-4 times for 1 growing season;
4) рыхление почвы не реже 1 раза в неделю;4) loosening the soil at least 1 time per week;
5) поддержание оптимальной влажности и рН почвы;5) maintaining optimal moisture and soil pH;
6) посев многолетних нефтетолерантных трав (овсяница, пырей ползучий, пырейник сибирский, тимофеевка луговая, осот полевой, костер безостый, клевер луговой).6) sowing of perennial oil-tolerant grasses (fescue, creeping wheatgrass, Siberian wheatgrass, meadow timothy grass, field sow thistle, beechless campfire, meadow clover).
Использование предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений подтверждается конкретными примерами.The use of the proposed drug for cleaning soils from oil pollution is confirmed by specific examples.
Пример 1. Очистка почвы от застарелых нефтезагрязненийExample 1. Cleaning the soil from chronic oil pollution
Препарат был испытан для очистки суглинистой почвы от застарелого нефтезагрязнения на территории нефтебазы, расположенной в Центральной Якутии. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до внесения биопрепарата составило 50294 мг/кг. Срок нефтезагрязнения 10 лет. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения, динамике численности основных групп почвенных микроорганизмов и фитотоксичности почвы.The drug was tested to clean the loamy soil from chronic oil pollution in the tank farm located in Central Yakutia. The initial content of oil products (NP) in the soil before the introduction of the biological product was 50294 mg / kg. The duration of oil pollution is 10 years. The effectiveness of the drug was evaluated by the degree of degradation of oil pollution, the dynamics of the number of major groups of soil microorganisms and phytotoxicity of the soil.
Содержание нефти в почве определялось весовым методом согласно инструкции по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома (18. РД 39-0147098-90. Инструкция по охране окружающей среды при строительстве скважин на нефть и газ на суше, 1990 г.).The oil content in the soil was determined by the gravimetric method in accordance with the instructions for monitoring the condition of soils at the facilities of the Minneftegazprom enterprises (18. RD 39-0147098-90. Environmental protection instructions for the construction of oil and gas wells on land, 1990).
Установлено, что степень биодеградации застарелого нефтезагрязнения в экспериментальном участке через 80 суток после внесения в почву препарата составила 83,58% (таблица 6).It was found that the degree of biodegradation of chronic oil pollution in the experimental plot 80 days after the drug was introduced into the soil was 83.58% (table 6).
Динамика биодеградации нефтезагрязнения согласовывалась с динамикой накопления гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтедеструкторов, численность которых через 80 суток после внесения биопрепарата в почву увеличилась в среднем на 2 порядка (таблица 7).The dynamics of oil pollution biodegradation was consistent with the dynamics of the accumulation of heterotrophic microorganisms, including oil destructors, the number of which 80 days after the introduction of a biological product into the soil increased by an average of 2 orders of magnitude (table 7).
Биотестирование показало, что в процессе очистки от застарелого нефтезагрязнения в почве экспериментального участка снизилась фитотоксичность, о чем свидетельствует увеличение процента прорастаемости семян тест-растений с 30 до 90%.Biotesting showed that phytotoxicity decreased in the process of cleaning up old oil pollution in the soil of the experimental plot, as evidenced by an increase in the percentage of germination of seeds of test plants from 30 to 90%.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности предлагаемого препарата для очистки почв от застарелого нефтезагрязнения.Thus, the results indicate the effectiveness of the proposed drug for cleaning soils from chronic oil pollution.
Пример 2. Очистка почвы от свежих нефтезагрязненийExample 2. Cleaning the soil from fresh oil pollution
Препарат был испытан для очистки суглинистой почвы от свежего нефтезагрязнения в условиях лабораторного опыта. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения и динамике численности основных групп почвенных микроорганизмов.The drug was tested to clean the loamy soil from fresh oil pollution in a laboratory experiment. The effectiveness of the drug was evaluated by the degree of degradation of oil pollution and the dynamics of the number of main groups of soil microorganisms.
Содержание нефти в почве определялось весовым методом аналогично примеру 1.The oil content in the soil was determined by the gravimetric method analogously to example 1.
Для эксперимента почву помещали в специальные емкости и добавляли необходимый объем нефти, после чего тщательно перемешивали для равномерного распределения. Затем в каждую емкость вносили препарат.For the experiment, the soil was placed in special containers and the required volume of oil was added, after which it was thoroughly mixed for uniform distribution. Then, a drug was added to each container.
В качестве контроля использовалась почва, загрязненная нефтью, без добавления биопрепарата. Каждый опыт проводили в трех повторностях. Экспонирование опытов составило 60 суток при комнатной температуре. Схема модельного эксперимента представлена в таблице 8.As a control, soil contaminated with oil was used without the addition of a biological product. Each experiment was carried out in triplicate. The exposure of the experiments was 60 days at room temperature. The scheme of the model experiment is presented in table 8.
Установлено, что степень биодеградации свежего нефтезагрязнения за одно внесение в почву препарата через 60 суток составила 53,42-55,32% (таблица 11).It was found that the degree of biodegradation of fresh oil pollution for one application to the soil after 60 days was 53.42-55.32% (table 11).
Динамика биодеградации нефтезагрязнения согласовывалась с динамикой накопления гетеротрофных микроорганизмов, в том числе нефтедеструкторов, численность которых через 60 суток после внесения биопрепарата в почву значительно увеличилась (таблица 9).The dynamics of biodegradation of oil pollution was consistent with the dynamics of the accumulation of heterotrophic microorganisms, including oil destructors, the number of which significantly increased 60 days after the introduction of the biological product into the soil (table 9).
Полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата для очистки почв от свежего нефтезагрязнения.The results obtained indicate the effectiveness of the drug for cleaning soils from fresh oil pollution.
Таким образом, преимуществом предлагаемого препарата для очистки почв от нефтезагрязнений, является наличие в его составе биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus sp. ВКМ AC-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D, взятых в равных соотношениях, иммобилизованных на природном цеолите месторождения Хонгуруу при соотношении 1:10, позволяющим в сравнительно короткий промежуток времени (60-80 суток) стимулировать в почвах как со свежим, так и с застарелым нефтезагрязнением (до 10 лет) микробиологическую деградацию нефтепродуктов (НП) и снижать фитотоксичность по отношению к высшим растениям.Thus, the advantage of the proposed drug for cleaning soil from oil pollution is the presence in its composition of the biomass of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus sp. VKM AC-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D, taken in equal proportions, immobilized on the natural zeolite of the Khonguruu deposit at a ratio of 1:10, which allows stimulating in soils with both fresh and fresh soil in a relatively short period of time (60-80 days) with long-standing oil pollution (up to 10 years) microbiological degradation of oil products (NP) and reduce phytotoxicity in relation to higher plants.
Способ приготовления и использования предлагаемого препарата экономически выгоден, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования. А цеолит, служащий в данном способе носителем для микроорганизмов, является одновременно и доступным, и дешевым сырьем, поскольку цеолиты имеют поверхностное залегание и разрабатываются открытым способом. На месторождении Хонгуруу утверждены запасы 11462 тыс. тонн. По стоимости природные цеолиты в 20-200 раз дешевле субститутов.The method of preparation and use of the proposed drug is economically viable, since it does not require complex technological equipment for its implementation. And the zeolite, which serves as a carrier for microorganisms in this method, is both affordable and cheap raw materials, since zeolites have a surface occurrence and are developed in an open way. The reserves of 11462 thousand tons were approved at the Honguruu field. At the cost of natural zeolites are 20-200 times cheaper than substitutes.
Очистка почвы от нефтезагрязнений предлагаемым препаратом позволяет предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты и добиться устранения пятен загрязненного грунта, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенной территории.Purification of the soil from oil pollution by the proposed preparation allows to prevent the spread of pollutants to the associated landscapes and to eliminate stains of contaminated soil, which significantly improves the sanitary and environmental condition of the disturbed area.
Предлагаемый препарат для очистки почвы от нефтезагрязнений является экологически безопасным, поскольку основой для его приготовления являются природные образования - не патогенные микроорганизмы в составе: Rhodococcus sp. ВКМ Ac-2626D и Serratia plymuthica VKM B-2819D и природный цеолит месторождения Хонгуруу (Западная Якутия).The proposed drug for cleaning the soil from oil pollution is environmentally friendly, since the basis for its preparation are natural formations - not pathogenic microorganisms in the composition: Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D and Serratia plymuthica VKM B-2819D and natural zeolite of the Honguruu deposit (Western Yakutia).
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014138219/10A RU2600868C2 (en) | 2014-09-22 | 2014-09-22 | Preparation for cleaning soil from oil contaminants |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014138219/10A RU2600868C2 (en) | 2014-09-22 | 2014-09-22 | Preparation for cleaning soil from oil contaminants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014138219A RU2014138219A (en) | 2016-04-10 |
RU2600868C2 true RU2600868C2 (en) | 2016-10-27 |
Family
ID=55647581
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014138219/10A RU2600868C2 (en) | 2014-09-22 | 2014-09-22 | Preparation for cleaning soil from oil contaminants |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2600868C2 (en) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4480132C2 (en) * | 1993-12-17 | 1997-03-13 | Gni Skij I Genetiki I Selekcii | Method and Rhodococcus rhodochrous strain for the preparation of amides from nitriles |
RU2191643C1 (en) * | 2001-07-09 | 2002-10-27 | Закрытое акционерное общество "Полиинформ" | Method of removing crude oil and petroleum product impurities from ground |
RU2215596C2 (en) * | 2001-04-18 | 2003-11-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт гидротехники и мелиорации им. А.Н. Костякова | Composition for biological treatment of grounds to remove crude oil and petroleum products |
RU2378060C2 (en) * | 2007-07-05 | 2010-01-10 | Андрей Евгеньевич Филонов | Biological preparation for cleaning of soils from contaminations with oil and oil products, method of its production and application |
RU2446900C2 (en) * | 2010-07-13 | 2012-04-10 | Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии | Method of cleaning out of frozen soil from crude oil by spore-forming bacteria bacillus subtilis |
-
2014
- 2014-09-22 RU RU2014138219/10A patent/RU2600868C2/en active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4480132C2 (en) * | 1993-12-17 | 1997-03-13 | Gni Skij I Genetiki I Selekcii | Method and Rhodococcus rhodochrous strain for the preparation of amides from nitriles |
US5827699A (en) * | 1993-12-17 | 1998-10-27 | Gosudarstvenny. Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promshlennykh Mikroorganizmov | Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase |
RU2215596C2 (en) * | 2001-04-18 | 2003-11-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт гидротехники и мелиорации им. А.Н. Костякова | Composition for biological treatment of grounds to remove crude oil and petroleum products |
RU2191643C1 (en) * | 2001-07-09 | 2002-10-27 | Закрытое акционерное общество "Полиинформ" | Method of removing crude oil and petroleum product impurities from ground |
RU2378060C2 (en) * | 2007-07-05 | 2010-01-10 | Андрей Евгеньевич Филонов | Biological preparation for cleaning of soils from contaminations with oil and oil products, method of its production and application |
RU2446900C2 (en) * | 2010-07-13 | 2012-04-10 | Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии | Method of cleaning out of frozen soil from crude oil by spore-forming bacteria bacillus subtilis |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЕРОФЕЕВСКАЯ Л.А., БУРМИСТРОВА Т.И., и др. Цеолит- как незаменимый компонент в реабилитации нарушенных земель, Биологические науки. Новое слово в науке и и практике: гипотезы и апробация результатов исследований, 2013, N3, с.7-9; * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2014138219A (en) | 2016-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20170196227A1 (en) | Biological product for clearing of water, industrial wastewater and soil from chemicals, which are resistant to degradation and method for using the same | |
Muratova et al. | Oil-oxidizing potential of associative rhizobacteria of the genus Azospirillum | |
RU2518349C1 (en) | STRAIN OF Rhodococcus sp-DESTRUCTOR OF PETROLEUM HYDROCARBONS | |
RU2565549C2 (en) | Biopreparation for bioremediation of oil-contaminated soils for climatic conditions of far north | |
CN113215033B (en) | Sulfonamide antibiotic degrading bacteria and application thereof | |
RU2319740C2 (en) | Biopreparation as oil-destructing agent | |
RU2509150C2 (en) | Association of strains of bacteria-oil decomposers, and remediation method of oil-contaminated objects | |
RU2292326C2 (en) | Biopreparation-petroleum destructor | |
RU2307869C2 (en) | Method of biological restoration of oil-polluted land | |
RU2300561C1 (en) | Strain rhodococcus globerulus h-42 for decomposition of petroleum and petroleum products | |
RU2323970C1 (en) | Bioapparatus-oildestructer for land cleaning from oil and oilproducts | |
RU2421291C2 (en) | Method to reclaim soils contaminated with oil and oil products | |
RU2414313C2 (en) | Method to clean land from oil and oil products and to recultivate agricultural soils | |
RU2615464C1 (en) | Preparation for soils and water bodies purification from oil products | |
RU2499636C1 (en) | Method of biological reclamation of oil-contaminated soils | |
RU2600868C2 (en) | Preparation for cleaning soil from oil contaminants | |
RU2735870C1 (en) | Method of extracting microorganisms for purification and recovery of oil-contaminated soil and soil by phyto-bioremediation | |
RU2616398C1 (en) | Bioremediant for carrying out remediation of soils polluted with oil and/or oil products | |
Girigiri et al. | Bioremediation of Crude Oil Polluted Soil Using Biofertilizer from Nitrogen-fixing and Phosphatesolubilizing Bacteria | |
Nwokem et al. | Biodegradation of endosulfan by mixed bacteria culture strains of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus | |
RU2529948C2 (en) | Pseudomonas stutzeri BACTERIA STRAIN - DECOMPOSER OF ALIPHATIC AND AROMATIC PETROLEUM HYDROCARBONS AND PLANT GROWTH STIMULANT AND USE THEREOF | |
RU2529735C1 (en) | Method of producing biopreparation for cleaning and restoring fertility of soil contaminated with petroleum products | |
RU2600872C2 (en) | Preparation for cleaning soil and water from oil contaminants | |
RU2628692C2 (en) | Biosorbent for soil and water purification from oil and oil products | |
RU2176164C2 (en) | Method of biological remediation of soil polluted with oil |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20191203 |