RU2599544C2 - Вакцинный антиген бабезиоза собак - Google Patents
Вакцинный антиген бабезиоза собак Download PDFInfo
- Publication number
- RU2599544C2 RU2599544C2 RU2013135002/10A RU2013135002A RU2599544C2 RU 2599544 C2 RU2599544 C2 RU 2599544C2 RU 2013135002/10 A RU2013135002/10 A RU 2013135002/10A RU 2013135002 A RU2013135002 A RU 2013135002A RU 2599544 C2 RU2599544 C2 RU 2599544C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccine
- nucleic acid
- seq
- acid molecule
- cba
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 125
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 111
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 57
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 57
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 55
- 241000282465 Canis Species 0.000 title abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 134
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 130
- 241000223836 Babesia Species 0.000 claims abstract description 70
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 119
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 52
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 52
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 18
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- -1 ntigenic Species 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 69
- 241000414381 Babesia canis rossi Species 0.000 description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 241000223846 Babesia canis Species 0.000 description 44
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 239000000306 component Substances 0.000 description 28
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 208000009182 Parasitemia Diseases 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 10
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 10
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 10
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 10
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 2
- 241000222732 Leishmania major Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000223830 Plasmodium yoelii Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 101150095935 cba gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229940113484 imidocarb dipropionate Drugs 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- BXBHZLHTTHMUTG-UHFFFAOYSA-N methyl 1h-pyrrolo[3,2-b]pyridine-2-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=O)OC)=CC2=N1 BXBHZLHTTHMUTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000224482 Apicomplexa Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000414382 Babesia canis canis Species 0.000 description 1
- 241000414380 Babesia canis vogeli Species 0.000 description 1
- 241001466447 Babesia gibsoni Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BZUNJUAMQZRJIP-UHFFFAOYSA-N CPDA Natural products OCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O BZUNJUAMQZRJIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000010804 Caulobacter vibrioides Species 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001480824 Dermacentor Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000605314 Ehrlichia Species 0.000 description 1
- 241000605312 Ehrlichia canis Species 0.000 description 1
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001480796 Haemaphysalis Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000908651 Jarra Species 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241000402695 Leptospira interrogans serovar Bratislava Species 0.000 description 1
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 1
- 241000757412 Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa Species 0.000 description 1
- 241000292568 Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae Species 0.000 description 1
- 241000178947 Leptospira interrogans serovar Pomona Species 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 1
- FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylglycine Chemical compound CN(C)CC(O)=O FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001147660 Neospora Species 0.000 description 1
- 241001147662 Neospora caninum Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100029251 Phagocytosis-stimulating peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000223834 Piroplasmida Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000223777 Theileria Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010084754 Tuftsin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 108700003601 dimethylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 230000002497 edematous effect Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 229940051998 ehrlichia canis Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- GISJHCLTIVIGLX-UHFFFAOYSA-N n-[4-[(4-chlorophenyl)methoxy]pyridin-2-yl]-2-(2,6-difluorophenyl)acetamide Chemical compound FC1=CC=CC(F)=C1CC(=O)NC1=CC(OCC=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC=N1 GISJHCLTIVIGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 1
- 229940035670 tuftsin Drugs 0.000 description 1
- IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N tuftsin Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IESDGNYHXIOKRW-LEOABGAYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 244000000057 wild-type pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
- A61K39/018—Babesia antigens, e.g. Theileria antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной паразитологии, в частности, к бабезиозу собак. Описан полипептид, являющийся новым антигеном Babesia собак (CBA). Также раскрыта композиция, содержащая этот антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая антиген, антитело к такому антигену и медицинским применениям этого антигена в вакцинах против бабезиоза собак. Предложенная группа изобретений может быть использована в ветеринарии. 11 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 4 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности, к бабезиозу собак. В частности, изобретение относится к полипептиду, являющемуся новым антигеном Babesia собак (CBA), или его фрагментам и к композициям, содержащим этот антиген, к нуклеиновым кислотам, кодирующим антиген, антителам к антигену и медицинским применениям этого антигена, фрагментов, антител или кодирующих нуклеиновых кислот. В частности, изобретение относится к использованию таких компонентов в вакцинах против Babesia собак.
Простейшие микроорганизмы рода Babesia являются передаваемыми клещами внутриэрицитарными паразитами отряда Piroplasmida в типе Apicomplexa. Виды Babesia разделяют на подклассы на основании нескольких критериев, в числе других по клещу-переносчику (клещам-переносчикам), содержащемуся в окружающей среде, который может переносить конкретные виды паразита Babesia. Клещ-переносчик, в свою очередь, определяет географическое распространение паразита и позвоночного хозяина, который является инфицированным.
Инфекция позвоночного хозяина паразитами Babesia вызывает заболевание бабезиоз, также называемое пироплазмозом, с широкой вариацией симптомов и тяжести, заболевание и его симптомы первые были описаны в 1904 году (Nuttall, J. Hyg. (Lond.) vol. 4, p. 219-257).
Для предотвращения бабезиоза используют несколько подходов, таких как, например, борьба с клещами. Этого достигают в основном обработкой хозяина, на котором питаются клещи, лекарственными средствами. Такие обработки включают растворы, наносимые орошением составы или парентеральные лекарственные средства, которые отпугивают или уничтожают клещей. Недостатками таких способов являются себестоимость таких обработок, которые, возможно, необходимо часто повторять, возможная токсичность лекарственного средства, возможные остатки лекарственного средства, содержащиеся в мясе или молоке мясомолочного скота, и появление устойчивости к лекарственному средству в популяции клещей. Аналогичные недостатки применимы к лечению на основе лекарственных средств животных, которые уже стали инфицированными Babesia.
Таким образом, альтернативой является профилактика или облегчение состояния бабезиоза посредством вакцинации животного-мишени, которое в этом случае является хозяином, на котором могут питаться клещи, и которое в результате может становиться инфицированным Babesia. В большинстве случаев такие вакцины содержат иммунологически эффективное количество антигенной молекулы из клеща или паразита Babesia в фармацевтически приемлемом носителе. Однако вследствие того, что паразит, такой как Babesia, представляет собой очень сложный организм, доказано, что крайне трудно определять отдельные антигены для вакцинации животного-мишени, которые обеспечивают возникновение иммунного ответа, который является быстрым, безопасным и эффективным. Фактически указанное представляет собой одну из наиболее сложных задач иммунопаразитологии в целом в настоящее время.
Паразиты Babesia могут инфицировать широкую группу позвоночных животных, но инфекции домашних млекопитающих и людей являются наиболее актуальными для ветеринарной практики и медицины. Хотя некоторые виды Babesia могут инфицировать животных, относящихся к собакам, наиболее преобладающие Babesia собак представляют собой для Европы: B. canis, и для региона к югу от Сахары и Южной Африки: B. rossi.
Раньше Babesia собак таксономически классифицировали как подвид B. canis, таким образом, как: B. canis canis и B. canis rossi и т.д., следуя предложению триноминальной системы номенклатуры (Uilenberg et al., 1989, Vet. Quart., vol. 1, p. 33-40). Однако в последние годы было описано все больше и больше видов Babesia у собак, и информацию получали на основании их жизненного цикла, их членистоногих переносчиком и характеристики их генетического материала. Это привело к понятию, что эти подвиды Babesia canis следует классифицировать, каждый, как соответствующий отдельный вид. Это описано у Schetters, 2005 (Trends in Parasitology, vol. 21, p. 179-184). Эту новую классификацию используют на всем протяжении настоящего описания.
B. canis и B. rossi представляют собой так называемые "крупные" виды Babesia собак, т.е. крупнее, чем радиус эритроцита. B. canis переносят клещи-переносчики рода Dermacentor, и B. rossi клещи рода Haemaphysalis. Паразиты B. rossi являются наиболее патогенными видами Babesia собак, паразиты B. canis являются несколько менее патогенными. Основные симптомы заболевания представляют собой анемию или иммунопатологию, похожую на малярию. Другие симптомы представляют собой почечную недостаточность, отек легких и общую реакцию шока. Животные, которые выздоравливают, могут страдать рецидивами в дальнейшем. Обзором, например, является работа Jacobson & Clark (1994, J. of S. Afr. Vet. Assoc., vol. 65, p. 134-145).
Главным образом вакцины предназначены для профилактики или снижения (уровня) инфекции микроорганизмом или заболевания, вызываемого инфекцией. Вакцины против бабезиоза собак были описаны ранее. Например, Ristic et al. (1988, в Babesiosis of domestic animals and man, ed. M. Ristic, p.163-189, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, ISBN: 0849349087) и Schetters et al. (1992, Par. Immunol., vol. 14, p. 295-305).
В этих вакцинах использовали растворимые антигены паразита (SPA), которые представляют собой экзоантигены паразита, которые выделяет паразит, или которые происходят из разрушаемых или погибающих паразитов. При получении in vivo, например, таком как описано Sibinovic et al. (1967, The J. of Parasitology, vol. 53, p. 919-923), эти антигены накапливаются в плазме инфицированных собак-хозяев, альтернативно, при получении in vitro они накапливаются в супернатанте культуры эритроцитов, в которой амплифицируют Babesia (Schetters et al., 1992, Parasite Immunology, vol. 14, p. 295-305). SPA из культуры B. canis использовали для защиты собак от инфекции, вызываемой тем же (т.е. гомологичным = из источника, изолята или штамма, который является таким же, как тот, что использовали в культурах для получения антигена SPA, содержащегося в вакцине) штаммом B. canis. Стоит отметить, что гомологичная вакцинация не являлась эффективной в отношении B. rossi: SPA из культуры паразитов B. rossi не обеспечивали защиту собак от вызываемых B. rossi инфекции и заболевания. Для этого была необходима смесь SPA из культур SPA B. canis и B. rossi, как описано в EP 691131, в таком случае собаки могли быть эффективно иммунизованы SPA, выделяемыми из культур B. rossi и B. canis, с добавлением сапонина в качестве адъюванта, и развивали защитный иммунный ответ против паразитов B. canis и B. rossi и эритроцитов, инфицированных паразитами.
MSD Animal Health оптимизировала получение SPA в культуре in vitro в промышленном масштабе в запатентованном способе получения вакцины на их основе: Nobivac® Piro (Schetters et al., 1995, Parasitol. Today, vol. 11, p. 456-462). Однако культивирование in vitro или in vivo живых паразитов в промышленном применении имеет характерные недостатки, такие как необходимость всестороннего контроля для обеспечения качества и воспроизводимости продукта при значительной стоимости. Также может быть желательным уменьшение использования исходных веществ биологической природы, таких как кровь и сыворотка здоровых собак.
Дополнительный недостаток известных вакцин против Babesia на основе неочищенных SPA заключается в том, что они содержат остатки лизированных нормальных эритроцитов, которые сами могут вызывать аутоиммунный ответ против эритроцитов вакцинированного животного. В связи с этим существует острая необходимость в вакцине против бабезиоза собак, которая устраняет по меньшей мере некоторые из перечисленных выше недостатков.
Целью настоящего изобретения является получение антигенного компонента, который можно использовать для получения эффективной, безопасной и надежной вакцины для защиты от инфекции и/или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак, где компонент вакцины устранит недостатки классических вакцин на основе SPA и защитит не только от гомологичной, а также от гетерологичной инфекции паразитами Babesia.
Неожиданно обнаружено, что можно устранять недостатки известного уровня техники и можно достигать целей посредством конкретного выделенного полипептида, который можно использовать для получения вакцины для собак, которая является эффективной против инфекции паразитами Babesia и заболевания, которое она вызывает. Использование конкретного полипептида устраняет необходимость использовать неочищенную смесь растворимых (экзо-) антигенов паразита как в известных вакцинах против бабезиоза собак.
Очищенный и выделенный полипептид условно назван "антиген Babesia собак" (CBA), и обнаружено, что он принадлежит классу белковых антигенов CBA с представителями среди различных видов паразитов Babesia собак.
Различные полипептиды CBA имеют в целом рассчитанную молекулярную массу приблизительно 30 кДа (например, приблизительно от 29 до 33 кДа), относительно кислый pH (например, приблизительно 4,6-4,8) и содержат N-концевую сигнальную последовательность (например, приблизительно 16-18 аминокислот), которая соответствует тому факту, что полипептиды CAB активно секретируются Babesia после инфицирования эритроцита.
Обнаружено, что Babesia canis экспрессировала один антиген CBA, называемый в настоящем описании как CBA-1, тогда как B. rossi экспрессировала два гомолога CBA, обозначаемые в настоящем описании как CBA-2,1 и -2,2.
Члены этого нового класса антигенов Babesia являются частью консервативных областей аминокислотной последовательности, каждая из которых характеризует полипептиды CBA и отличает их от известных полипептидов.
Эти консервативные области последовательности предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 1-5 (см. таблицу 1), и неожиданно выявлено, что они располагаются на N- и C-концах полипептида CBA, где N-концевая характеризующая область находится непосредственно после сигнальной последовательности. Центральная область полипептидов CBA является менее консервативной.
Первая их двух характеризующих областей полипептидов CBA представляет собой N-конец полипептида CBA из B. rossi, фактически последовательность является одной и той же для CBA-2,1 и CBA-2,2: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY (SEQ ID NO:1).
При сравнении с известными полипептидами выявлено, что наибольшие совпадения с аминокислотами SEQ ID NO:1 имеют аминокислотную идентичность только 11 из 21 аминокислоты, которая представляет собой идентичность 52,3%.
Аналогично, вторую консервативную область последовательности: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL (SEQ ID NO:3), представленную C-концом CBA-2,1, также сравнивали с известными полипептидами. Выявлено, что наибольшее совпадение имеют только 11 из 19 аминокислот, что представляет собой аминокислотную идентичность 57,9%.
В противоположность этому, идентичность аминокислотных последовательностей между соответствующими областями B. canis и B. rossi самих полипептидов CBA является значительно выше, более 68%, как представлено в таблице 2.
Таблица 1 Список идентификаторов последовательностей, используемых в настоящем описании |
|
SEQ ID NO: | Описание |
1 | Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-2,1 и CBA-2,2 B. rossi |
2 | Характеризующая область 1 вблизи N-конца CBA-1 B. canis |
3 | Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,1 B. rossi |
4 | Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-2,2 B. rossi |
5 | Характеризующая область 2 вблизи C-конца CBA-1 B. canis |
6 | Аминокислотная последовательность CBA-1 B. canis |
7 | Аминокислотная последовательность CBA-2,1 B. rossi |
8 | Аминокислотная последовательность CBA-2,2 B. rossi |
9 | Последовательность мРНК CBA-1 B. canis (как кДНК) |
10 | Последовательность мРНК CBA-2,1 B. rossi (как кДНК) |
11 | Последовательность мРНК CBA-2,2 B. rossi (как кДНК) |
12 | Геномная последовательность CBA-1 B. canis |
13 | Геномная последовательность CBA-2,1 B. rossi |
14 | Геномная последовательность CBA-2,2 B. rossi |
15 | Коровая а/к последовательность характеризующей области 1 |
Таблица 2 Идентичность аминокислотных последовательностей между аминокислотными последовательностями характеризующих областей белков CBA различных видов Babesia собак |
||
Аминокислотная последовательность | Характеризующая область 1: MLLSNVSFPQPVSSVKLLEEY | Характеризующая область 2: VLMVLTKCNLKMHVTEEQL |
CBA-1 B. canis | 16/21 (76,2%) | 14/19 (73,7%) |
CBA-2,1 B. rossi | 21/21 (100%) | 19/19 (100%) |
CBA-2,2 B. rossi | 21/21 (100%) | 13/19 (68,4%) |
Аналогично, характеризующая область 2 (SEQ ID NO:3) обнаружена у видов Babesia собак с идентичностью по меньшей мере 68%, тогда как лучший гомолог в общедоступных базах данных являлся идентичным не более 57%. Кроме того, при исследование в BLAST молекулы, содержащей обе области, не получено каких-либо совпадений.
Полипептиды, определяемые в настоящем описании, таким образом, характеризуются наличием области высокой гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью одной или обеих SEQ ID NO 1 и 2.
Таким образом, изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотных последовательностей более 53% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, и/или обладающей идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, где указанный полипептид способен индуцировать иммунный ответ против паразитов Babesia собак и/или их продуктов или эффектов.
По изобретению "полипептид" относится к молекулярной цепи аминокислот. Полипептид не является конкретной длины, структуры или формы, при необходимости его можно модифицировать in vivo или in vitro, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием, фосфорилированием, пегилированием или изменениями пространственной укладки. В числе прочего белки, пептиды, олигопептиды входят в определение полипептида. Полипептид может быть биологического и/или синтетического происхождения.
Термин "выделенный" следует интерпретировать как выделенный из его естественной среды. Это также применимо к очистке полипептида CBA (или его кодирующей нуклеиновой кислоте) в композициях до количеств, которые являются больше количества других веществ в такой композиции, предпочтительно в намного большем количестве, таком что полипептид или нуклеиновая кислота составляет 70%, или 80%, или 90% или более от общей композиции. Предпочтительно полипептид или нуклеиновая кислота составляет 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или даже 99% от общей композиции.
Термин "идентичность аминокислотных последовательностей" следует интерпретировать как процент идентичных аминокислот в соответствующих положениях, когда два аминокислотные последовательности являются оптимально выровненными по всей их длине. Выравнивание можно проводить подходящим образом с использованием компьютерной программы, например, Blast® или ClustalW® с использованием параметров по-умолчанию.
Термин "способный индуцировать иммунный ответ" относится к способности полипептидов CBA по изобретению индуцировать иммунный ответ, который является эффективным против инфекции или заболевания, вызываемых паразитами Babesia собак. Такой эффективный иммунный ответ, например, представляет собой профилактику, предотвращение или улучшение состояния бабезиоза и/или паразитемии паразитов Babesia у собак.
Такой иммунный ответ может принимать различные формы и может действовать через различные ветви иммунной системы врожденного и/или приобретенного иммунитета, и может быть клеточного и/или гуморального типа. Существование или индукцию такого иммунного ответа можно детектировать хорошо известными способами и дополнительно способом, как описано в настоящем описании. Например, антитела к CBA можно детектировать, например, Elisa, посредством иммунофлуоресценции, иммуноблотингом и т.д. Клеточный иммунный ответ можно детектировать анализом активации лимфоцитов или посредством кожных реакций in vivo. Дополнительные способы включают наблюдение за симптомами иммунизированных пациентов или их физиологическими ответами, как правило, ассоциированными с инфекцией Babesia и заболеванием, такими как объем осажденных эритроцитов (также гематокритное число), количество инфицированных эритроцитов, размер селезенки и т.д., в дополнение к общим поведенческим шкалам.
В конечном итоге, полипептиды по изобретению (при применение в вакцине) способны предотвращать или снижать инфекцию и/или заболевание, вызываемое этой инфекцией, обусловленной инфекцией паразитами Babesia собак.
"Babesia собак" представляет собой паразита Babesia, который может инфицировать животное, являющееся собакой. Как правило, такие паразиты представляют собой Babesia canis, B. rossi, B. vogeli и B. gibsoni, а также описаны другие виды Babesia или ассоциированные с инфекциями собак (Uilenberg, 2006, Veterinary Parasitology, vol. 138, p. 3-10). В отношении точной таксономической классификации Babesia специалисту понятно, что она может изменяться со временем, т.к. новые представления приводят к реклассификации в новые или другие таксономические группы. Однако вследствие того, что характеристики и/или набор белков участвующего организма не изменяются, только их классификация, предполагают, что такие повторно классифицированные организмы входят в объем изобретения. "Собачьи" относятся ко всем (под)видам Canidae, в основном собакам, волкам и лисам, а также любым смешанным породам.
Кроме того, иммунологическая эффективность полипептида по изобретению против бабезиоза действует на различные виды Babesia различным образом, вакцинация может предотвращать паразитемию, а также заболевание от одного вида, но только противодействовать заболеванию от другого вида (см. например, Schetters et al., 1997, Parasitology, vol. 115, p. 485-493).
Авторы изобретения обнаружили, что не существует прямого способа выделения и характеристики полипептидов CBA по изобретению из неочищенных антигенных препаратов. В основном это обусловлено тем, что общепринятые способы являются не эффективными или не предоставляют необходимых данных. В результате существовала необходимость в применении нескольких адаптаций и не очевидных комбинаций известных способов для получения желаемых полипептидов. Например:
В качестве эффективной вакцины известной являлась только смесь экзоантигенов SPA: в обеих коммерческих вакцинах против Babesia, доступных на дату подачи настоящего изобретения, применяют неочищенную смесь экзоантигенов Babesia в качестве компонента вакцины. Также за многие десятилетия исследования бабезиоза собак еще не получено эффективной коммерческой вакцины на основе отдельных соединений. Таким образом, общепринято, что защита от бабезиоза, обеспечиваемая иммунизацией SPA собак, являлась обусловленной гетерогенным иммунным ответом, в который вовлечены многие антигены, и который нельзя приписывать отдельному белку. Этот факт разубедит любого специалиста в данной области приступать к исследованию отдельного вакцинного антигена.
Кроме того, отсутствие высокопродуктивных способов культивирования B. canis и B. rossi препятствует специалисту получать достаточные количества любого отдельного антигена Babesia для характеризации. Таким образом, хотя описаны общепринятые способы культивирования, существует необходимость в высокопродуктивном способе культивирования in vitro, который является собственностью заявителя, которым возможно получать достаточные количества белков Babesia для определения CBA в виде отдельных компонентов.
Также полипептид CBA по изобретению невозможно выделять непосредственно из SPA, т.к. SPA представляет собой неочищенную смесь многих различных компонентов из эритроцитов, из Babesia и из компонентов сыворотки животного, которая является необходимой для культивирования, до уровней 40% об./об.
Когда предпринимали попытку выделять CBA из окрашенных кумасси бриллиантовым голубым гелей полного SPA, это приводило к многочисленным неудачам, в основном вследствие того, что все фракции являлись сильно загрязненными белками сыворотки и гемоглобином из эритроцитов в культуре, а также большое количество полос от низкой до высокой молекулярной массы полностью препятствовало доступности любой одной полосы отдельного белка. Эксперименты, целью которых являлась очистка одностадийными способами, такими как аффинная хроматография с белком A, ионообменная хроматография и эксклюзионные колонки, являлись безуспешными. В дальнейшем удалось выделить CBA из SPA с использованием протокола сложной очистки, в котором применяют адаптированные способы культивирования и конкретную особенную комбинацию ряда последовательных способов разделения и осаждения.
В конечном итоге, этими способами получили достаточные количества полипептида CBA для дальнейшего анализа.
Однако не удалось визуализировать какой-либо выделенный полипептид CBA общепринятыми способами иммуноблотинга: авторы изобретения неожиданно обнаружили, что CBA является нераспознаваемым на иммуноблоте общего лизата паразита или из SPA ни стандартной антисывороткой от собак, иммунизированных SPA, ни антисывороткой от собак, которые являлись инфицированными Babesia. Это обусловлено тем, что количество CBA в SPA является слишком маленьким, или форма CBA в SPA является неподходящей для распознавания иммуноблотингом. Следует отметить, что CBA удалось определить только на иммуноблоте, когда авторы изобретения использовали сыворотку от собак, которых сначала многократно вакцинировали SPA, и затем экспериментально заражали Babesia, так называемая сыворотка после вакцинации и заражения.
Дополнительное ограничение заключалось в том, что необходимо получать такую сыворотку после вакцинации и заражения в очень конкретный период после заражения: между 6 сутками и 11 сутками. Для сыворотка, получаемой до или после этого периода, не удалось продемонстрировать слабую реактивность к полипептиду CBA с относительной молекулярной массой приблизительно 41 кДа.
В дальнейшем анализе, тот факт, что только N- и C-концы различных полипептидов CBA являлись консервативными, и, таким образом, совокупность (зрелых) полипептидов обладала небольшой консервативностью последовательности, вызывал значительное затруднение в определении соответствующего гена и последовательностей мРНК, кодирующих эти полипептиды в геноме Babesia. Кроме того, известны негеномные последовательности B. canis или B. rossi, так что эти геномы было необходимо секвенировать, анализировать возможные открытые рамки считывания и получать области вставок ПЦР. Для этого последнего этапа необходимо широкое применение вырожденных праймеров вследствие выявленных различий последовательностей в генах CBA.
В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1 и/или 2 составляет по меньшей мере 58%, предпочтительно по меньшей мере 59%, такую как 60% или 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 71%, 73%, 75% или 76%. В одном из вариантов осуществления полипептиды по изобретению отличаются тем, что они содержат аминокислотную последовательность, которая обладает идентичностью аминокислотных последовательностей более 58% с одной или более аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5.
По изобретению переходные фразы "содержащий" и "состоящий из" определяют область формулы изобретения в отношении того, что не перечисленные дополнительные компоненты или стадии, если таковые существуют, исключены из объема формулы изобретения.
Переходный термин "содержащий", который является синонимичным с "включающий" "состоящий" или "характеризующийся" является охватывающим или неограничивающим и не исключает дополнительных не перечисленных элементов или этапов способа.
Фраза "группа, состоящая из" является ограничивающим термином, который используют при составлении пункта формулы изобретения для обозначения "группы Маркуша", которая по своей природе является закрытой, и ее используют для различия или определения различных членов группы.
Переходная фраза "состоящий из" исключает любой элемент, этап или ингредиент, не описанный в пункте формулы изобретения.
Авторам изобретения в конечном итоге удалось получить полную аминокислотную последовательности ряда полипептидов CBA. Они предоставлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 6, 7 и 8.
При сравнении друг с другом для этих полноразмерных полипептидных последовательностей продемонстрирована замечательная консервативность их N- и C-концов с меньшей консервативностью в их основной центральной части, см. фиг.1. В кратком изложении, идентичность аминокислотных последовательностей между этими полными последовательностями является такой, как представлено в таблице 3.
При сравнении с известными полипептидами не удалось обнаружить значительных полноразмерных совпадений.
Таблица 3 Идентичность аминокислотных последовательностей между полноразмерными аминокислотными последовательностями полипептидов CBA, описываемых в настоящем описании |
||
% идентичности а/к последовательности | CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:6) | CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7) |
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:7) | 29 | × |
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:8) | 35 | 43 |
Таким образом, в одном из вариантов осуществления полипептиды CBA по изобретению отличаются тем, что они обладают идентичностью аминокислотных последовательностей более 29% по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.
Процент идентичности для этого варианта осуществления следует рассчитывать для полной длины полипептида CBA как в SEQ ID NO:6, 7 или 8. Термин "более 29%" можно интерпретировать как по меньшей мере 30%, 32%, 35%, 39%, 43%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или даже более 98%.
Выявлено, что характеризующая область № 1 сама по себе содержит коровую последовательность, которая является полностью консервативной для полипептидов CBA из B. canis и B. rossi. Эта последовательность: PVSSVKLL (SEQ ID NO:15) обнаружена в любом известном полипептиде с идентичностью аминокислотных последовательностей 8/8 (100%), таким образом, она может служить для дополнительной характеристики полипептида CBA по изобретению.
Таким образом, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления полипептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой PVSSVKLL (SEQ ID NO:15).
Предпочтительно последовательность SEQ ID NO:15 содержится в полипептид по изобретению в N-концевой области зрелого полипептида.
В одном из вариантов осуществления изобретение также относится к иммуногенному фрагменту полипептида по изобретению.
Такой иммуногенный фрагмент можно получать хорошо известным способом с использованием информации, предоставленной в настоящем описании. Например, получением триптического гидролизата полипептидов CBA и тестированием иммуногенности получаемых фрагментов. Или фрагменты можно синтезировать и тестировать, как в хорошо известном способе PEPSCAN (WO 84/003564, WO 86/006487 и Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, p. 3998-4002). Альтернативно, иммуногенные соответствующие области можно теоретически рассчитывать с использованием хорошо известных компьютерных программ. Иллюстративный пример эффективности применения этих способов опубликован Margalit et al. (1987, J. of Immunol., vol. 138, p. 2213-2229), которые описали показатель эффективности 75% при теоретическом расчете T-клеточных эпитопов.
Как хорошо известно, для того чтобы являться иммуногенными, полипептиды должны иметь минимальную длину, как правило 8-11 а/к для связывания с рецептором MHC I, и 11-15 н/к для связывания с рецептором MHC II (описано, например, Germain & Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403-450). Таким образом, по изобретению иммуногенный фрагмент полипептида по изобретению составляет по меньшей мере 8 аминокислот в длину.
Полипептидные фрагменты, которых еще не вызывают эффективный иммунный ответ, можно презентировать иммунной системе-мишени прикрепленными к или в виде молекулы носителя. Хорошо известные носители представляют собой бактериальные анатоксины, такие как столбнячный токсин или дифтеритный анатоксин, альтернативно, можно использовать KLH, BSA, или компоненты бактериальной клетки (выделяемые из) липида A и т.д. Также пригодными могут являться полимеры или другие частицы или повторяющиеся структуры, такие как вирусоподобные частицы и т.д. Связывание с молекулой носителя можно проводить известными в данной области способами с использованием химических или физических технологий.
Полипептиды CBA по изобретению или их иммуногенный фрагмент могут быть биологического или синтетического происхождения, и их можно получать выделением, очисткой, сборкой и т.д. Полипептиды можно выделять из in vivo или in vitro культур паразитов Babesia собак. Однако полипептиды получают более подходящим образом, способом рекомбинантной экспрессии посредством экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды или фрагмент.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, которая способна кодировать полипептид или его иммуногенный фрагмент по изобретению.
Понятие нуклеотидной последовательности, которая "способна кодировать" полипептид, хорошо известно в данной области и относится к центральной догме молекулярной биологии в отношении экспрессии генов и продукции белка: ДНК транскрибируется в РНК, и РНК транслируется в белок. Как правило, такая нуклеотидная последовательность, способная кодировать полипептид, называется открытой рамкой считывания (ORF), указывающей на то, что не содержится нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно завершат трансляцию белка рибосомой. Указанная нуклеотидная последовательность может представлять собой ген (т.е. ORF, кодирующую полный белок) или может представлять собой фрагмент гена. Она может быть природного или синтетического происхождения.
Изобретение предпочтительно относится к последовательности мРНК и геномной последовательности для ряда полипептидов CBA. Как указано, обнаружено, что геном B. rossi содержит два отдельных гена, кодирующих два различных варианта полипептида CBA, геном B. canis содержит только один ген CBA. Последовательности мРНК CBA (в виде кДНК) предоставлены в SEQ ID NO:9-11, и геномные последовательности CBA в SEQ ID NO:12-14 (см. таблицу 1).
Когда определяли и анализировали последовательности мРНК, выявили, что все соответствующие CBA гены содержат нетранслируемые области приблизительно 15-19% от полного гена. Хотя длины различных генов CBA отличаются, расположение и деление этих интронов являлось в высшей степени сходным, где все гены CBA содержат два интрона, расположенных приблизительно между номерами нуклеотидов от 170 и 200 и от 400 до 550 (см. таблицу 4 и фиг.2). Такая консервативная организация гена является дополнительной демонстрацией родства членов класса полипептидов CBA, определяемых в настоящем описании.
Таблица 4 Расположение интронов в генах CBA |
|||
Ген CBA | Расположение интронов (номера нуклеотидов) | % от гена интрона | |
CBA-1 B. canis (SEQ ID NO:12) | 170-203 | 408-550 | 15 |
CBA-2,1 B. rossi (SEQ ID NO:13) | 173-207 | 406-569 | 19 |
CBA-2,2 B. rossi (SEQ ID NO:14) | 170-204 | 406-552 | 18 |
Гены CBA или предпочтительно соответствующие последовательности кДНК можно подходящим образом применять для различных целей, например, для экспрессии и получения полипептидов CBA по изобретению. Однако, как хорошо известно в данной области, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же белок. Это приводит к тому, что известно в молекулярной биологии как "качание" или "вырожденность генетического кода", где несколько кодонов или триплетов мРНК обуславливают присоединение одной и той же аминокислоты к цепи аминокислот, растущей на рибосоме при трансляции. Это наиболее распространено во втором и особенно в третьем основании каждого триплета, кодирующего аминокислоту. Это явление может приводить к гетерологичности приблизительно 30% двух различных нуклеиновых кислот, которые все еще кодируют один и тот же белок. Таким образом, две нуклеиновые кислоты, обладающие идентичностью нуклеотидной последовательности только приблизительно 70%, все еще могут кодировать один и тот же белок.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению обладает идентичностью нуклеотидной последовательности более 70% по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
Как также хорошо известно, альтернативный путь характеристики нуклеотидной последовательности посредством уровня идентичности ее нуклеотидной последовательности является путем не посредством компьютерного анализа, а физическим измерением, подходящим образом такое измерение можно проводить анализом, тестирующим гибридизацию в условиях повышенной жесткости.
Таким образом, в альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность по изобретению может гибридизоваться в жестких условиях по меньшей мере до одной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
Термин "гибридизоваться" относится к процессу связывания (также называемого отжигом, или последовательность-специфическим спариванием оснований) между двумя цепями нуклеиновых кислот. В процессе гибридизации комплементарные области нуклеиновой кислоты-мишени и пробы находят друг друга, отжигаются и становятся связанными. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК при условии, что они являются одноцепочечными и развернутыми. В соответствующих условиях мишень и проба связываются посредством образования водородных мостиков между нуклеотидами A и T и между G и C.
Как правило, нуклеиновая кислота-мишень представляет собой более крупную молекулу ДНК (плазмиду, хромосому или геном) или (м)РНК, и проба, как правило, представляет собой ДНК (т.к. она является более стабильной, чем РНК), одноцепочечную и меньшего размера, чем мишень, например, от 50 до 5000 оснований.
"Жесткость" на практике определяют в основном как функцию концентрации солей и температуры, используемых для гибридизации, и стадий промывания в протоколе испытаний гибридизации. Ограничение жестких условий следует из формулы температуры плавления Tm Meinkoth & Wahl (1984, Anal. Biochem., vol. 138, p. 267-284):
Tm=[81,5°C+16,6(log M)+0,41(% GC)-0,61(% формамид)-500/л]-1°C/1% несоответствия
В этой формуле M представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процент нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, L представляет собой длину гибрида в парах оснований, и "несоответствие" представляет собой отсутствие идентичного совпадения.
Как хорошо известно, высокая концентрация соли и низкая температура представляют собой условия "низкой" жесткости, и низкая концентрация соли и высокая температура представляют собой высокую жесткость. Выбирая конкретную гибридизации и условия промывания, можно устанавливать определенный уровень жесткости, и таким образом определять минимальный уровень термостабильности, существование которой необходимо для дуплекса ДНК-ДНК (или РНК-ДНК), который образуется и сохраняется.
Стандартный буфер, используемый для установления жесткости, представляет собой буфер SSC (цитрат натрия в физиологическом растворе), где стандартный "20×" буфер SSC содержит 3 моль NaCl и 0,3 M цитрата в воде при pH 7. Таким образом, очень низкая жесткость представляет собой промывание в 20× SSC при комнатной температуре (3 M соли и 20°C), и более высокая жесткость представляет собой кипячение в дистиллированной воде (без соли и 100°C).
Это также подробно описано в руководствах, таких как Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986), pp. 75 78, и 84-87, Molecular Cloning, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), pp. 387-389, и 2001.
По изобретению "жесткие условия" представляют собой такие условия, при которых нуклеотидная последовательность еще может гибридизоваться, если ее несоответствие нуклеотидной последовательности по изобретению составляет 30% или менее (т.е., если существует идентичность нуклеотидной последовательности более 70%). Более предпочтительно условия, при которых нуклеотидная последовательность, обладающая приблизительно 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичностью нуклеотидной последовательности, может оставаться гибридизованной с нуклеотидной последовательностью по изобретению.
Предпочтительно неограничивающий пример условий жесткой гибридизации по изобретение представляет собой гибридизацию в 2-6× SSC и 0,5% SDS при приблизительно 45°C с последующим одним или более промываниями (например, приблизительно от 5 до 30 минут каждое) в 0,5-2× SSC, 0,1% SDS при 45-65°C.
Нуклеотидную последовательность по изобретению можно подходящим образом использовать различными путями. Одним из примеров является использование для диагностических целей различными способами и технологиями, например, для детекции инфицирования хозяина-собаки паразитами Babesia.
Общепринятые нуклеотидные последовательности, такие как нуклеотидные последовательности по изобретению, подходящим образом обрабатывают в отношении вектора, такого как плазмида ДНК, обеспечивающая ее амплификацию, например, в бактериальных культурах, и их использование в ряде способов молекулярной биологии. Широкий спектр подходящих плазмидных векторов является коммерчески доступным.
Когда нуклеотидные последовательности по изобретению необходимо использовать для экспрессии полипептидов, необходимо, чтобы они находились в виде, который обеспечивает транскрипцию мРНК и трансляцию белка. В частности, необходимо предоставлять нуклеотидную последовательность с соответствующими регуляторными сигналами для инициации транскрипции и трансляции, например, являлась функционально связанной с промотором и стоп-кодоном, когда нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, или с хвостом поли-A, когда нуклеиновая кислота представляет собой мРНК.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность по изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность находится под контролем функционально связанного промотора.
Элементы термина "нуклеотидная последовательность […] под контролем функционально связанного промотора" все являются хорошо известными в данной области, "промотор" представляет собой регуляторный участок ДНК, который может инициировать транскрипцию РНК. Для обеспечения этого действия промотора необходимо, чтобы он "контролировал" участок ДНК, который может транскрибироваться, такой как ORF или ген. Элемент, являющийся "функционально связанным" с рамкой считывания, которая должна экспрессироваться, означает, что не содержится элементов последовательности между этими двумя элементами, которая бы препятствовала действию промоторов. Как правило, промотор расположен непосредственно перед старт-кодоном ATG ORF. Специалистам в данной области очевидно, что выбор промотора по изобретения включает любой эукариотический, прокариотический или вирусный промотор, способный управлять транскрипцией, при условии, что промотор является функциональным в используемой экспрессирующей системе.
Посредством нуклеиновой кислоты по изобретению можно проводить модификации встраиваемой нуклеотидной последовательности, например, вставки, делеции или мутации общепринятыми способами расщепления рестрикционными ферментами или полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Например, с целью улучшения уровня экспрессии, для очистки или детекции белка после экспрессии или для того, чтобы сделать полипептид более иммуногенным, можно добавлять дополнительные нуклеотидные последовательности. Это может приводить к тому, что конечная нуклеотидная последовательность, содержащаяся в нуклеиновой кислоте, является больше, чем последовательности, необходимые для кодирования полипептида CBA по изобретению. Также, когда такие дополнительные элементы встраивают в рамку считывания, они становятся неотъемлемой частью экспрессируемого полипептида CBA, такие слитые полипептиды также входят в объем изобретения.
Предпочтительно слитый полипептид по изобретению представляет собой такой, как описано в WO 2004/007525: посредством прикрепления гидрофобного пептида к коровому полипептиду, слитый полипептид более эффективно взаимодействует со свободным сапонином в качестве адъюванта. Описаны примеры таких гидрофобных пептидов для слияния, например, C-концевой участок комплементзависимого стимулятора гемолиза (CD55).
Нуклеиновую кислоту по изобретению подходящим образом можно использовать для так называемой "ДНК-вакцинации". В таком варианте осуществления нуклеиновую кислоту по изобретению вводят в мишень, где нуклеиновая кислота поглощается в клетках, содержащаяся нуклеотидная последовательность начинает экспрессироваться, и продуцируемый полипептид является презентированным иммунной системе-мишени, вырабатывающей иммунный ответ. ДНК можно вводить различными способами, и она может находиться в различных формах в виде голой ДНК или прикрепленной или инкапсулированной в носителе, например, золотые частицы.
Прямая вакцинация ДНК, кодирующей полипептид, является эффективной для многих различных белков, как описано, например, у Donnelly et al. (1993, The Immunologist, vol. 2, p. 20-26). Например, в области противопаразитарных вакцин защиту, например, от Plasmodium yoelli, получают ДНК-вакцинацией геном спорозоита P. yoelli (Hoffman S. et al., 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1529-1533), и защиту от Leishmania major получают ДНК-вакцинацией гена поверхностного гликопротеина gp63 L. major (Xu & Liew, 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1534-1536).
Нуклеиновую кислоту по изобретению также можно использовать предпочтительно для экспрессии и получения полипептида CBA или его иммуногенного фрагмента по изобретению. В рекомбинантных экспрессирующих системах для этой цели, как правило, применяют клетку-хозяина, культивируемую in vitro. Хорошо известными в данной области являются клетки-хозяева из экспрессирующих систем на основе бактериальной, дрожжевой, грибной клетки, клетки насекомого или позвоночного.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеотидную последовательность или нуклеиновую кислоту по изобретению.
Клетка-хозяин, которую необходимо использовать для экспрессии полипептида CBA по изобретению, может представлять собой клетку бактериального происхождения, например, от Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. или Caulobacter crescentus, возможно в комбинации с использованием выделяемых из бактерий плазмид или бактериофагов для экспрессии последовательности, кодирующей полипептид CBA. Клетка-хозяин также может быть эукариотического происхождения, например, клетки дрожжей в комбинации с молекулами специфических дрожжам векторов, или клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых (Luckow et al., 1988, Biotechnology, vol. 6, p. 47-55), в комбинации с векторами или рекомбинантными бакуловирусами, или растительные клетки в комбинации, например, с векторами на основе Ti-плазмиды или векторами вирусов растений (Barton et al., 1983, Cell, vol. 32, p. 1033), или клетки млекопитающих, такие как клетки Hela, клетки китайского хомяка или клетки Мадин-Дарби почек собаки также с соответствующими векторами или рекомбинантными вирусами.
После таких экспрессирующих систем, экспрессирующие системы на основе растительной клетки или паразита являются привлекательными экспрессирующими системами. Экспрессирующие системы на основе паразита, например, описаны в French патентной заявке Франции номер 2714074. Экспрессирующие системы на основе растительной клетки для полипептидов для биологического применения, например, описаны Fischer et al. (Eur. J. of Biochem. 1999, vol. 262, p. 810-816) и Larrick et al. (Biomol. Engin. 2001, vol. 18, p. 87-94).
Экспрессию также можно проводить в так называемых не содержащих клеток экспрессирующих системах. Такие системы содержат все основные факторы для экспрессии соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, который функционирует в этой конкретной системе. Примеры представляют собой систему на основе лизата E. coli (Roche, Basel, Switzerland), или систему на основе лизата ретикулоцитов кролика (Promega corp., Madison, USA).
Эффективным путем экспрессии нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты по изобретению в клетке-хозяине или даже у животного является путь посредством их введения в носитель, который может проникать в клетки-хозяева или животное-хозяина. Носитель представляет собой живой рекомбинантный микроорганизм-носитель (LRCM), который может проникать в хозяина, не повреждая его.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к живому рекомбинантному микроорганизму-носителю, содержащему нуклеотидную последовательность или нуклеиновую кислоту по изобретению.
Такие живые рекомбинантные микроорганизмы-носители (LRCM) представляют собой, например, бактерии, паразитов, вирусы и дрожжевые клетки, их также можно использовать для инфицирования животного-хозяина. Репликация LRCM у животного-хозяина может представлять собой способ продуцирования полипептида или его фрагмента по изобретению, который затем можно выделять и использовать, например, для вакцинации или диагностических целей. Однако LRCM также подходящим образом можно использовать непосредственно для вакцинации, например, в качестве системы доставки полипептида или его фрагмента по изобретению животному-хозяину, и таким образом вакцинировать животное-хозяина. Этот путь презентирования иммунной системе хозяина может являться более эффективным, чем вакцинация в виде субъединичного белка с адъювантов, т.к. реплицирующийся микроорганизм является более близким к естественному пути инфицирования Babesia, и может походить на путь, которым полипептиды CBA или их иммуногенные фрагменты презентируются иммунной системе при естественной инфекции. Дополнительное преимущество LRCM заключается в их самовоспроизведении, таким образом, что для иммунизации необходимы только небольшие количества рекомбинантного носителя.
По изобретению подходящие LRCM представляют собой микроорганизмы, которые могут реплицироваться у животного, являющегося собакой, которые не являются (очень) патогенными для животного, и предпочтительно для которых доступны средства молекулярной биологии для их рекомбинации и обработки. Примеры представляют собой аттенуированные или непатогенные изоляты бактерий: Ehrlichia, Leptospira или Borrelia, паразитов: Leishmania или Neospora (предпочтительно как в WO 04/026903) или даже саму Babesia, или вирусы: парвовирус собак, вирус чумы, поксвирус, вирус гепатита, вирус парагриппа или вирус бешенства.
Для конструкции LRCM можно использовать хорошо известный способ гомологичной рекомбинации in vitro для стабильного введения нуклеиновой кислоты по изобретению в геном LRCM. Альтернативно, нуклеиновую кислоту также можно вводить в LRCM для транзиентной или эписомной экспрессии.
Как хорошо известно в данной области, эффект выбора определенной экспрессирующей системы представляет собой уровень посттрансляционного процессинга экспрессируемого белка, который применяют, например, прокариотическая экспрессирующая система не прикрепляет каких-либо сигналов гликозилирования к продуцируемому полипептиду, тогда как системы насекомых, дрожжей или млекопитающих прикрепляют N- и/или O-связанное гликозилирование увеличивающейся сложности. Соответствующий выбор представляет собой такой, что система обеспечивает наилучшее соотношение количества полипептида и иммунологической эффективности.
Полипептиды по изобретению или их фрагменты можно модифицировать во время или после трансляции, и это можно проводить биологически или синтетически. Примеры представляют собой гликозилирование или пегилирование. Конкретная предпочтительная модификация по изобретению представляет собой добавление так называемого GPI-якоря (гликозилфосфатидилинозитола), хорошо известной и высокоиммуногенной модификации некоторых экспрессируемых полипептидов паразитов.
Дополнительный аспект изобретения относится к выделенному антителу, которое может специфически связываться с полипептидом или его иммуногенным фрагментом по изобретению.
По изобретению "антитело" представляет собой иммуноглобулин или его иммунологически активную часть, например, фрагмент, которые еще содержат антигенсвязывающий участок, такой как одноцепочечное антитело или Fab, Fv, scFv, dAb или Fd-фрагмент, все хорошо известные в данной области.
Антитела характеризуются своей специфичностью, т.е. молекулой, с которой они связываются с такой силой, что их можно отличать от любого неспецифического или фонового связывания, как правило, посредством разбавления специфического антитела.
Специфические антитела, как правило, получают (гипер)иммунизацией животного-донора целевым полипептидом и сбором антител, получаемых из сыворотки животного. Хорошо известными донорами являются кролики и козы. Другой пример представляет собой кур, которые могут продуцировать высокие уровни антител в яичном желтке, так называемые IgY. Альтернативно, антитела можно получать in vitro, например, хорошо известной технологией моноклональных антител из культур иммортализованных B-лимфоцитов (гибридомных клеток), для которых известны системы получения в промышленном масштабе. Также антитела или их фрагменты могут сами экспрессироваться в рекомбинантной экспрессирующей системе посредством экспрессии клонированных генов тяжелой и/или легкой цепи Ig.
Такие антитела можно подходящим образом использовать для различных применений, в частности, диагностик и вакцинаций. Диагностики описаны в настоящем описании ниже. Использование антител в вакцинациях относится к так называемым пассивным вакцинам. В последнем случае антитела предпочтительно адаптированы так, чтобы соответствовать основным характеристикам антител у мишени, в этом случае антитела необходимо "канинизировать".
Предпочтительное применение полипептидов CBA, фрагментов и нуклеиновых кислот, кодирующих такие полипептиды или фрагменты, представляет собой их медицинское применение, в частности, для вакцинации.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к полипептиду или его иммуногенному фрагменту, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоте, живому рекомбинантному микроорганизму-носителю или антителу, все по изобретению, или к комбинации любых этих компонентов для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
В дополнительном аспекте изобретение относится к вакцине для собак против бабезиоза, содержащей полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность, нуклеиновую кислоту, живой рекомбинантный микроорганизм-носитель или антитело, все по изобретению, или комбинацию любых этих компонентов и фармацевтически приемлемый носитель.
Такие медицинские применения изобретения приводят к улучшению иммунитета собак, обеспечению профилактики, предотвращения или улучшения состояния бабезиоза и/или паразитемии паразитами Babesia у собак. Это продемонстрировано, с одной стороны, происхождением пептидов CBA, описываемых в настоящем описании, а именно из SPA, для которых хорошо известно, что они являются защитными с иммунологической точки зрения. В частности, это следует из подробного описания, как предоставлено в разделе "Примеры" в настоящем описании, в частности, эксперименте на животных и результатах анализа конкурентного связывания антител, как продемонстрировано посредством AlphaLisa®.
Специалист в данной области может легко наблюдать различие, которое вызывает вакцина по изобретению у собаки-мишени, посредством наблюдения симптомов заболевания, как правило, вызываемых инфекцией Babesia, в частности анемии, и изменений объема осажденных эритроцитов или гематокритного числа, температуры, почечной функции, поведения и т.д.
Такая эффективность вакцины становится очевидной при сравнении вакцинированного и невакцинированного животного-мишени. В данной области хорошо известны способы оценки такой эффективности вакцины.
Например, паразитемию паразитами Babesia у хозяина можно легко определять посредством подсчета под световым микроскопом числа эритроцитов, которые содержат паразитов Babesia в мазке крови, как описано Jarra and Brown для малярии (1985, Parasite Immunol., vol. 7, p. 595-606). Для улучшенной видимости образец можно контрастно окрашивать, например, красителем Гимза.
Затем паразитемию можно представлять в виде процента инфицированных эритроцитов по сравнению с неинфицированными эритроцитами или можно представлять в виде общего числа инфицированных эритроцитов в фиксированном числе исследуемых эритроцитов. Их, в свою очередь, можно подсчитывать в сутки, или как нарастающий итог в течение продолжительности паразитемии, так называемой "паразитарной нагрузки".
По изобретению паразитемию выражают в виде паразитарной нагрузки, где 10Log значения количества инфицированных паразитом эритроцитов на 105 эритроцитов в суточных образцах крови, отбираемых из яремной вены, суммируют в течение периода времени, в который можно детектировать паразитов. Как правило, паразитемия Babesia возникает через от 3 до 14 суток после заражения с пиком через от 5 до 10 суток после заражения.
Конкретно вакцина по изобретению способна уменьшать паразитемию, вызываемую инфекцией B. rossi, вакцинированного животного-мишени более чем на 70%. Предпочтительно уменьшение паразитемии составляет 75, 80, 85, 90, 95, 97 или даже 100% в порядке предпочтения. Аналогично, вакцина по изобретению способна уменьшать признаки заболевания, вызываемого инфекцией B. canis более чем на 50%, предпочтительно более 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 или даже 100% в порядке предпочтения.
Альтернативно, симптомы заболевания, вызываемого инфекцией Babesia, можно выражать в клиническом балле, таким образом, что затем можно сравнивать эффект вакцинации в клинических баллах вакцинированных и невакцинированных животный-мишеней после инфекции. Специалист может составлять таблицы для ранжирования таких клинических баллов, например, как описано Schetters et al., 1994 (Vet. Parasitol., vol. 52, p. 219-233) для симптомов инфекции B. canis у собак.
Предпочтительно вакцина по изобретению способна уменьшать клинические баллы у вакцинированных хозяев, инфицированных Babesia на 50%, более предпочтительно на 60, 70, 80, 90 или даже 100% в порядке предпочтения.
Дополнительный предпочтительный эффект вакцинации, как описано по изобретению, заключается в предотвращении или снижении распространения инфекции Babesia в популяции собак, так называемого горизонтального распространения инфекции. Это обусловлено тем, что клещи, которые еще не являются инфицированными при питании на вакцинированных собаках с меньшей вероятностью станут инфицированными, и таким образом не будут быстро распространять инфекцию Babesia последующим собакам. Таким образом, это приводит к уменьшению распространенности Babesia у клещей-переносчиков определенной географической области, и в свою очередь, к меньшему переносу Babesia новым собакам-хозяевам. В этом варианте осуществления вакцина работает как вакцина, препятствующая переносу возбудителя.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению способна уменьшать распространенность Babesia у клещей-переносчиков географической области.
Способы определения распространенности Babesia у клещей-переносчиков хорошо известны в данной области, например, как описано Lewis et al. (1996, Vet. Paras., vol. 63, p. 9-16), или более современными способами с использованием обратного линейного блоттинга или PCR ткани клещей.
Для получения и применения вакцины и медицинского использования по изобретению, изобретение в дополнительном аспекте относится к способу получения вакцины по изобретению, где способ включает смешивание полипептида или его иммуногенного фрагмента, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоты, живого рекомбинантного микроорганизма-носителя или антитела по изобретению, или комбинации любых этих компонентов и фармацевтически приемлемого носителя.
В одном из вариантов осуществления способ по изобретению также включает экспрессию нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты по изобретению в рекомбинантной экспрессирующей системе, как описано выше.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению полипептида или его иммуногенного фрагмента, нуклеотидной последовательности, нуклеиновой кислоты, живого рекомбинантного микроорганизма-носителя или антитела по изобретению, или комбинации любых этих компонентов для получения вакцины против бабезиоза у собак.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу вакцинации собаки против бабезиоза, включающему стадию инокуляции указанных собак вакциной по изобретению.
Термин "вакцина" подразумевает наличие иммунологически эффективного количества полипептида или иммуногенного фрагмента по изобретению и наличие фармацевтически приемлемого носителя.
То, что составляет иммунологически эффективное количество вакцины по изобретению, зависит от желаемого действия и от конкретных характеристик вакцины, которую используют. Определение эффективного количества находится в компетенции специалиста-практика, например, посредством наблюдения за иммунным ответом после вакцинации или после заражения инфекцией, например, наблюдения за клиническими признаками заболевания мишени, серологическими параметрами или посредством повторного выделением патогена, и сравнением их с ответами, наблюдаемыми у невакцинированных животных.
Как правило, вакцина индуцирует иммунный ответ, который способствует предотвращению, улучшению состояния, уменьшению восприимчивости или лечению заболевания или нарушения, возникающего вследствие инфекции микроорганизмом. Защиту получают в результате введения (композиции, содержащей) одного или более антигенов, выделяемых из микроорганизма, такого как аттенуированного или убитого микроорганизма, и/или его субъединицы. Это приводит к тому, что у животного-мишени выявляют уменьшения числа или выраженности клинических признаков, вызываемых микроорганизмом. Это может являться результатом снижения колонизации или снижения скорости распространения инфекции микроорганизмом, приводящих к уменьшению числа или тяжести повреждений и эффектов, вызываемых микроорганизмом или ответом-мишени на него.
Предполагают, что "фармацевтически приемлемый носитель" способствует эффективному введению соединения без оказания (тяжелых) неблагоприятных воздействий на здоровье животного, которому его вводят. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой, например, стерильную воду или стерильный физиологический солевой раствор. В более сложных формах носитель может представлять собой, например, буфер, который может содержать дополнительные добавки, такие как стабилизаторы или консерванты. Более подробное описание и примеры, например, описаны в хорошо известном руководстве, например, таком как "Remington: the science и practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) и "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
В предпочтительном варианте осуществления соединения, используемые для получения вакцины по изобретению, не содержат сыворотку (без сыворотки животного), белок (без животного белка, но могут содержать другие компоненты, выделяемые у животного), соединения животного происхождения (ACF, не содержащие какого-либо компонента, выделяемого у животного); или даже "определенного химического состава" в порядке предпочтения.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению дополнительно содержит стабилизатор.
Как правило, вакцину смешивают со стабилизаторами, например, для защиты компонентов, подверженных деградации, от деградации, для увеличения срока хранения вакцины и/или для улучшения эффективности лиофилизации. В основном, стабилизаторы представляют собой крупные молекулы большой молекулярной массы, такие как липиды, углеводы или белки, например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.
Предпочтительно стабилизатор не содержит соединений животного происхождения или даже имеет определенный химический состав, как описано в WO 2006/094974.
Также можно добавлять консерванты, такие как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин.
Например, для стабильности или экономичности антиген по изобретению может быть лиофилизированным. Как правило, это обеспечит длительное хранение при температурах выше нуля °C, например, при 4°C.
Специалистам в данной области известны способы лиофилизации, и оборудование для лиофилизации в различном масштабе является коммерчески доступным.
Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению отличаются тем, что указанные вакцины находятся в лиофилизированной форме.
Для восстановления лиофилизированной вакцинной композиции ее суспендируют в физиологически приемлемом разбавителе. Как правило, это проводят непосредственно перед применением для обеспечения наилучшего качества вакцины. Разбавитель может представлять собой, например, стерильную воду или физиологический солевой раствор. Разбавитель, который используют для восстановления вакцины, сам по себе может содержать дополнительные соединения, такие как адъювант. В более сложной форме он может быть суспендированным в эмульсии, как указано в EP 382271.
В одном из вариантов осуществления лиофилизированной вакцины, получаемой по изобретению, адъювант для вакцины поставляют отдельно от лиофилизата, содержащего оставшуюся часть вакцины, и предпочтительно он содержится в забуференном разбавителе. В этом случае лиофилизированная вакцина и специальная композиция разбавителя образуют набор из частей, которые совместно осуществляют настоящее изобретение.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления лиофилизированной вакцины по изобретению лиофилизированная вакцина содержится в наборе, состоящем по меньшей мере из двух типов контейнеров, где один контейнер содержит лиофилизированную вакцину, и один контейнер содержит водный разбавитель, содержащий буфер и адъювант сапонин.
Предпочтительно лиофилизированная вакцина находится в форме, как описано в EP 799613.
Вакцина по изобретению может дополнительно содержать так называемый "носитель". Носитель представляет собой соединение, к которому белки, белковые фрагменты, нуклеиновые кислоты или их части, кДНК, рекомбинантные молекулы, живые рекомбинантные носители и/или клетки-хозяева по изобретению прикрепляются, не являясь ковалентно связанными с ним. Такие носители представляют собой, в частности, биомикрокапсулы, микроальгинаты, липосомы, макрорастворы, гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфат или оксид алюминия, диоксид кремния, Kaolin® и Bentonite®, все известны в данной области.
Примером является носитель, в котором антиген частично встроен в иммуностимулирующий комплекс, так называемый ISCOM® (EP 109942, EP 180564, EP 242380).
Кроме того, вакцина по изобретению может содержать одно или более подходящих поверхностно-активных соединений или эмульгаторов, например, Span® или Tween®.
Возраст, масса, пол, иммунологический статус и другие параметры собак, которые подлежат вакцинации, не являются критическими, хотя, очевидно, что благоприятно вакцинировать здоровых мишеней и вакцинировать как можно раньше для предотвращения любой полевой инфекции. Вследствие того, что инфекцию Babesia можно устанавливать уже в очень молодом возрасте, таким образом, вакцину по изобретению можно применять в первые 2 недели после рождения, однако необходимо учитывать содержание материнских антител в молозиво для эффективной вакцинации в молодом возрасте.
Индивидуумы-мишени для вакцинации по изобретению представляют собой собак, которые могут быть здоровыми или заболевшими, и могут являться серопозитивными или серонегативными к паразитам Babesia или к антителам к паразитам Babesia. Собака-мишень может быть любого возраста, в котором она является восприимчивой к вакцинации.
Вакцину по изобретению в равной степени можно использовать в качестве профилактического и в качестве терапевтического лечения, и она препятствует укоренению и/или прогрессированию инфекции Babesia или ее клинических признаков заболевания.
Вакцина по изобретению может эффективно служить в качестве первичной вакцинации, за которой в дальнейшем может следовать, и усиливать ее, вторичная вакцинация, например, классической инактивированной вакциной с добавлением адъювантов.
Схема применения вакцины по изобретению у собаки-цели может состоять из однократных или многократных доз, которые можно вводить в одно и то же время или последовательно способом, соответствующим дозированию и составу, и в таком количестве, которое будет иммунологически эффективным.
Протокол введения вакцины по изобретению идеально включать в существующие схемы вакцинации другими вакцинами для собак.
Вакцины по изобретению предпочтительно применяют в однократной годовой дозе.
Получение вакцины по изобретению проводят хорошо известным специалистам способом.
Такое получение вакцины, как правило, включает стадии смешивания и формулирования компонентов по изобретению с фармацевтически приемлемыми эксципиентами с последующим пропорциональным распределением в контейнеры подходящего размера. Различные стадии способа получения необходимо контролировать соответствующими тестами, например, иммунологическими тестами на качество и количество антигенов, микробиологическими тестами на стерильность и отсутствие посторонних веществ, и в конечном итоге, экспериментами на животных на эффективность вакцины и безопасность. Все они хорошо известны специалисту.
Вакцина по изобретению может находиться в любой форме, которая является подходящей для введения животным, являющимся собаками, и которая подходит для желаемого пути применения и желаемого действия.
Вакцина по изобретению может находиться в нескольких формах, например, в форме жидкости, геля, мази, порошка, таблетки или капсулы, в зависимости от желаемого способа применения у мишени. Предпочтительно вакцину по изобретению составляют в форме, подходящей для инъекции, таким образом, инъецируемой жидкости, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия. Как правило, такие вакцины получают стерильными.
Вакцины по изобретению можно вводить в количествах, содержащих от 0,1 до 1000 мкг полипептида или его фрагмента по изобретению. В принципе, можно использовать более низкие и более высокие дозы, предпочтительно используют от 50 до 250 мкг полипептида в дозе.
Вакцины по изобретению можно вводить в объеме, который соответствует собакам-мишеням, например, одна доза вакцины для собаки может составлять от 0,5 до 5 мл. Предпочтительно одна доза составляет от 1 до 3 мл.
Вакцину по изобретению можно вводить собакам-мишеням известными в данной области способами. Например, парентеральными путями введения, такими как через все пути инъекции в или через кожу, например, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, внутрикожно, под слизистую или подкожно. Альтернативные пути введения, которые являются подходящими, представляют собой пути посредством местного применения в виде капель, спрея, геля или мази на эпителий слизистой оболочки глаза, носа, ротовой полости, ануса или влагалища, или на эпидермис наружного слоя кожи любой части тела, распылением в виде аэрозоля или порошка. Альтернативно, применение можно проводить через пищевой путь, объединяя с пищей, кормом или питьевой водой, например, в виде порошка, жидкости или таблетки, или введением непосредственно в ротовую полость в виде жидкости, геля, таблетки или капсулы, или в анус в виде суппозитория.
Предпочтительный путь введения представляет собой путь посредством внутримышечной или подкожной инъекции. Само собой разумеется, что оптимальный путь введения зависит от конкретного состава вакцины, который используют, и от конкретных характеристик собак-мишеней.
Вакцину по изобретению предпочтительно используют в виде маркерной вакцины, маркерная вакцина известна как вакцина, которая позволяет проводить различие между вакцинированными и инфицированными полевой инфекцией индивидуумами. Это определяют, например, детекцией панели антител, характерных для вакцины, которая отличается от панели антител, индуцированной инфекцией возбудителя дикого типа. Такое различие, например, получают, когда иммуногенный белок, содержащийся в или у микроорганизма дикого типа, не содержится в вакцине. Это можно подходящим образом детектировать посредством серологического анализа, такого как ELISA или иммунофлуоресцентный анализ.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению представляет собой маркерную вакцина.
Специалист в данной области способен дополнительно оптимизировать вакцину по изобретению. Как правило, это включает точную регулировку эффективности вакцины, таким образом, что она обеспечивает достаточную иммунную защиту. Это можно проводить подбором дозы вакцины или использованием вакцины в другой форме или другом составе, или подбором других компонентов вакцины (например, стабилизатора или адъюванта), или введением через другой путь.
Вакцина может дополнительно содержать другие соединения, такие как адъювант, дополнительный антиген, цитокин и т.д. Альтернативно, вакцину по изобретению можно предпочтительно объединять с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон или противовоспалительное лекарственное средство.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что она содержит адъювант.
"Адъювант" представляет собой хорошо известный ингредиент вакцин, который в основном представляет собой вещество, которое стимулирует иммунный ответ у мишени неспецифическим образом. В данной области известно много различных адъювантов. Примеры адъювантов представляют собой полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин E, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, карбопол и пиран.
Кроме того, часто в качестве адъюванта используют пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, тафцин, и предпочтительно можно использовать минеральное масло, например, Bayol® или Markol®, растительные масла или их эмульсии и DiluvacForte®.
Предпочтительный адъювант для вакцины по изобретению представляет собой сапонин, более предпочтительно Quil A®. Адъювант сапонин предпочтительно содержится в вакцине по изобретению на уровне от 10 до 10000 мкг/мл, более предпочтительно от 100 до 500 мкг/мл. Сапонин и компоненты вакцины можно комбинировать в ISCOM® (EP 109942, EP 180564, EP 242380).
Само собой разумеется, что другие способы добавления адъювантов, добавления соединений-носителей или разбавителей, эмульгирующих или стабилизирующих вакцину, также входят в объем изобретения. Такие введения добавок, например, описаны в хорошо известных руководствах.
Вакцина по изобретению можно предпочтительно объединять с другим антигеном.
Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что она содержит дополнительный иммуноактивный компонент.
"Дополнительный иммуноактивный компонент" может представлять собой антиген, иммуностимулирующее вещество и/или вакцину, любой их них может содержать адъювант.
Дополнительный иммуноактивный компонент, когда находится в форме антигена, может состоят из любого антигенного компонента, представляющего интерес для человека или ветеринарии. Например, он может содержать биологическую или синтетическую молекулу, такую как белок, углевод, липополисахарид, нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый антиген. Также клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту или живой рекомбинантный микроорганизм-носитель, содержащий такую нуклеиновую кислоту, может представлять собой путь доставки нуклеиновой кислоты или дополнительного иммуноактивного компонента. Альтернативно, она может содержать фракционированный или убитый микроорганизм, такой как паразит, бактерия или вирус.
Дополнительный иммуноактивный компонент(-ы) может находиться в форме иммуностимулирующего вещества, например, хемокина, или иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, например, мотив CpG. Альтернативно, вакцину по изобретению можно саму добавлять в вакцину.
Например, вакцину по изобретению можно объединять с препаратом белка паразита субъединичной вакцины, не являющегося полипептидом по изобретению, для получения комбинированной субъединичной вакцины против паразитарной инфекции или ассоциированных клинических признаков заболевания.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина по изобретению отличается тем, что дополнительный иммуноактивный компонент или нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный дополнительный иммуноактивный компонент, получают из микроорганизма, инфекционного для собак.
Преимущество такой комбинированной вакцины заключается в том, что она индуцирует иммунный ответ не только против Babesia, а также против других патогенов (собак), при этом необходима только однократная обработка животного для вакцинации, тем самым предотвращая излишний стресс для животного-мишени, а также затраты времени и трудовые затраты.
Примеры патогенов собак представляют собой следующие: Ehrlichia canis, Leishmania donovani-complex, Neospora caninum, парвовирус собак, вирус чумы собак, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa или bratislava, вирус гепатита собак, вирус парагриппа собак, вирус бешенства, Hepatozoon canis и Borrelia burgdorferi и виды Babesia и Theileria.
Полипептид, нуклеотидную последовательность и антитела по изобретению можно предпочтительно использовать для диагностических целей.
Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к диагностическому тестовому набору, содержащему полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность или антитело по изобретению.
Как правило, такие тесты основаны на Elisa или иммунофлуоресцентных способах.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции нуклеотидной последовательности Babesia собак с использованием нуклеотидной последовательности по изобретению. Нуклеотидную последовательность предпочтительно используют в анализе на основе ПЦР, и ее длина составляет от 10 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции антител к Babesia собак, где указанный тест содержит полипептид или его иммуногенный фрагмент по изобретению.
Например, полипептид CBA связан с твердофазным носителем, его инкубируют с образцом, который необходимо тестировать, отмывают и детектируют наличие связанных антител из тестируемого образца. Тестируемый образец, например, получают из биологических жидкостей собак.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к диагностическому тесту для детекции антигенного вещества Babesia собак, где тест содержит антитело к полипептиду (или его иммуногенному фрагменту) по изобретению.
Например, антитела к полипептиду CBA связаны с твердофазным носителем, его инкубируют с образцом, который необходимо тестировать, отмывают и детектируют наличие связанных полипротеинов из тестируемого образца. Тестируемый образец, например, получают из крови или ткани собак.
Согласно изобретению "диагностически тестовый набор" относится к набору для проведения способов диагностики по изобретению. Набор содержит один или более компонентов по изобретению: полипептид или его иммуногенный фрагмент, нуклеотидную последовательность или антитело в подходящей форме и контейнер необязательно с разбавителем, реагентом и/или инструкции, как проводить способ.
В одном из вариантов осуществления набор может содержать контейнер с множеством лунок, такой как планшет для микротитрования. Лунки контейнера можно обрабатывать, чтобы они содержали любой из компонентов по изобретению для применения в способе диагностики по изобретению.
Инструкции, необязательно содержащиеся в диагностическом наборе по изобретению, например, могут быть напечатаны на коробке, содержащей компоненты набора, могут содержаться на информационном листе в этой коробке или их можно просматривать или загружать с интернет веб-сайта дистрибьютора набора и т.д.
По изобретению диагностический набор также может представлять собой предложение на продажу указанных частей (касающиеся коммерческой продажи), например, на интернет веб-сайте, для комбинированного использования в анализе, включающем способы по изобретению.
Изобретение дополнительно описано в отношении следующих ниже неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: Получение
Стандартными способами экспрессировали полноразмерную кДНК каждой мРНК CBA в E. coli, и очищали полипептиды CBA для последующего применения и анализа.
Очищенные CBA-1 использовали для получения гибридомной клеточной линии стандартными способами. Клеточная линия называлась 7E6, и она экспрессировала специфическое моноклональное антитело к CBA-1.
Пример 2: Определение общего эпитопа CBA и конкурентного связывания со специфическими к SPA антителами
Поликлональные антитела получали от многократно вакцинированных SPA, а затем зараженных собак, как описано ранее (Schetters et al., 1996, Parasite Immunol., vol. 18, p. 1-6). Эти антитела использовали в так называемом способе AlphaLisa® (Perkin Elmer) для исследования общих эпитопов.
Способ AlphaLisa обеспечивает детекцию антигенов, содержащих по меньшей мере два различных эпитопа, т.к. донорная и акцепторная гранула, каждая, несет различное антитело, распознающее различный эпитоп на антигене. В присутствии антигена донорная и акцепторная гранула сближаются до непосредственной близости так, что может возникать перенос энергии между гранулами. Это можно детектировать соответствующим детектором. В подробном описании, иммуноглобулин после вакцинаций и заражения подвергали биотинилированию стандартными способами. Затем его инкубировали в течение 60 минут с антигеном и акцепторными гранулами, которые покрывали небиотинилированным Ig после вакцинации и заражения. В этой смеси на акцепторных гранулах образуются комплексы с антигеном и биотинилированным Ig после вакцинации и заражения. На втором этапе добавляют покрытые стрептавидином донорные гранулы и инкубируют в течение 30 минут, которые взаимодействует с биотиновыми группами на комплексе акцепторных гранул. Уникальные свойства обоих типов гранул обеспечивают детекцию гранул, которые взаимодействуют друг с другом (посредством комплексов антиген-антитело), что является величиной концентрации антигена в образце.
Сначала анализировали, можно ли распознавать рекомбинантный полипептид CBA-1 B. canis в анализе AlphaLisa с использованием поликлональной сыворотки после вакцинации и заражения. Этим исследовали то, что содержит ли CBA-1 по меньшей мере два эпитопа, которые могут быть распознаны поликлональной антисывороткой.
В качестве отрицательного контроля в этих анализах использовали нерелевантный рекомбинантный антиген, экспрессируемый аналогичным образом в E. coli, HSP70 Mycobacterium paratuberculosis.
Положительный контроль и вещество сравнения представляли собой SPA из концентрированного супернатанта из in vitro культур соответствующих паразитических видов: B. canis или B. rossi.
Результаты демонстрировали, что рекомбинантная молекула CBA-1 B. canis являлась недетектируемой в двух отдельных анализах AlphaLisa с поликлональными антителами к SPA B. canis или SPA B. rossi. (фиг.3 и 4). Образец положительного контроля давал сильный сигнал в этих соответствующих анализах.
Это демонстрирует, что рекомбинантная молекула CBA-1 B. canis не содержит двух или более отдельных эпитопов на одной молекуле, где эпитопы распознавались бы антителами к SPA. Таким образом, рекомбинантный антиген CBA-1 B. canis не содержит эпитопа вообще или содержит только один эпитоп.
Аналогичные результаты получают, когда рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi тестируют в анализе AlphaLisa B. canis или B. rossi. Это демонстрирует, что рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi также не содержит двух или более отдельных эпитопов на одной молекуле. Аналогично, это означает, что рекомбинантный полипептид CBA-2,1 B. rossi не содержит эпитопа вообще или содержит только один эпитоп.
Для того чтобы провести различие между этими двумя вариантами, разработали анализ ингибирования AlphaLisa, подобный хорошо известному конкурентному Elisa, но в котором применяют технологию AlphaLisa двойной способности связывания.
Тест проводили для определения, способен ли рекомбинантный CBA-1 B. canis конкурировать с антигеном SPA сравнения за связывание с поликлональными антителами на донорных и акцепторных гранулах.
Результат являлся таким, что рекомбинантный полипептид CBA-1 B. canis фактически подавлял сигнал AlphaLisa в обоих анализах и фактически подавлял почти в количественном отношении, см. фиг.5 и 6.
В противоположность этому, рекомбинантный CBA B. rossi также был способен подавлять сигнал AlphaLisa в обоих анализах почти в количественном отношении (данные не показаны).
Заключение:
Полипептид CBA-1 содержит эпитоп, который распознает сыворотка после вакцинации и заражения против SPA B. canis и сыворотка против SPA B. rossi. Это же справедливо для CBA-2,1 B. rossi и, возможно, также для CBA-2,2.
Как определено в AlphaLisa, CBA-1 и CBA-2, которые содержат эпитоп, являются только (единственными) антигенами, которые были распознаны в неочищенном образце SPA B. canis и B. rossi, соответственно.
Принимая во внимание, что известно, что SPA связан с вакцинальной защитой, и что такая вакцинальная защита в значительной степени является антителоопосредованной, таким образом, тот факт, что полипептиды CBA могут специфически и очень эффективно конкурировать с иммунопротективными антигенами из образца SPA, означает, что полипептиды CBA сами являются иммунопротективными антигенами.
Также известно, что SPA B. canis в комбинации с SPA B. rossi является эффективным в гетерологичной вакцинации и защите против B. rossi, однако, т.к. не было показано, что CBA содержит два распознаваемых эпитопа, таким образом, выявлено, что CBA экспрессирует отдельный кросс-протективный эпитоп. Таким образом, CBA представляет собой гетерологичный иммунопротективный антиген против B. rossi и B. canis.
Пример 3: CBA защищает собак от гомологичного и гетерологичного заражения Babesia
Рекомбинантный антиген CBA Babesia тестируют на его способность защищать собак от гомологичного заражения инфекцией после первичной и вторичной вакцинации. Для оценки уровня защиты, собак заражали паразитами B. canis штамма A. Инокулят для заражения получали из крови инфицированной спленэктомированной собаки. Затем за собаками наблюдали в течение 14 суток после заражения инфекцией.
План исследования
Использовали две группы из 7 собак/группа. Пол и пометы равномерно распределяли в двух группах.
Одну группу вакцинируют 50 мкг/доза CBA, вторая группа служит в качестве контроля и не получает инъекций. Ко всем антигенам добавляют 250 мкг/дозу сапонина в качестве адъюванта. Через три недели группа 1 получает вторичную вакцинацию в основном тем же антигеном. Еженедельно отбирают образцы сыворотки для определения антител к антигенам B. canis штамма A и B. rossi с использованием антител Elisa. Через две недели после заключительной вакцинации собак заражают паразитами B. canis штамма A, которых получают у инфицированной собаки. В течение периода после заражения у животных ежесуточно наблюдают клинические признаки бабезиоза. Для определения объема осажденных эритроцитов и паразитемии ежесуточно отбирают образцы крови.
Тестируемые вещества
Сапонин Supersap® получают от Desert King (Chile). Сапонин получают с 10 мМ буфером Sorenson pH 6,0 в концентрации 250 мкг/мл. Лиофилизированный антиген восстанавливают в растворе адъюванта. После восстановления антигена один мл раствора представляет собой однократную дозу.
Используют собак породы бигль обоих полов и в возрасте приблизительно 5-6 месяцев. Собак получают от коммерческого заводчика. Используют только здоровых животных. Животные не должны иметь в анамнезе бабезиоза или клинической бактериальной инфекции. Животные имеют индивидуальный номер, вытатуированный на ухе для обеспечения идентификации. Кроме того, животные оснащены транспондером для измерения изменений температуры тела. Собак кормят стандартным рационом, и они получают питьевую воду в неограниченном количестве.
Животных вакцинируют тестируемым препаратом посредством подкожной инъекции в заднюю часть шеи общепринятыми способами. Через три недели после первичной вакцинации проводят вторичную вакцинацию.
На сутки нуль, до вакцинации, у каждой собаки собирают 8 мл крови из яремной вены для получения сыворотки отрицательного контроля. Сыворотку хранят при ниже -15°C до анализа. С этой даты кровь собирают с интервалом в неделю в течение пяти недель для получения сыворотки. Сыворотку хранят при ниже -15°C до анализа. Титры антител к антигенам B. canis и B. rossi определяют общепринятыми способами, как описано на известном уровне техники.
Местные реакции на участке инъекции регистрируют с интервалом в 24 часа в течение продолжительности появления признаков или максимально в течение 5 суток. Характер местной реакции описывают как (количественный показатель): S=мягкая, H=тяжелая, O=отечная, W=теплая, P=болезненная.
Здоровую собаку породы бигль любого пола инфицируют 1 мл инфицированной B. canis крови, которую хранили в виде консервированной в жидком азоте. Одну ампулу консервированной крови извлекают из хранилища жидкого азота и сразу же переносят в транспортный контейнер с жидким азотом. Ампулу сразу же размораживают при 30-38°C непосредственно перед инъекцией спленэктомированной собаке-донору. Развитие паразитемии у собаки-донора оценивают по мазкам крови, получаемым из венозной крови, собираемой через сутки после инфекции до суток развития классической паразитемии. Образцы крови отбирают из яремной вены с использованием пробирок с CPDA (Greiner или сравнимые) для предотвращения коагуляции. Когда паразитемия является классической, собирают кровь (объем зависит от паразитемии) и дополнительно обрабатывают известными специалисту способами до получения инокулятов для заражения.
Всех собак инфицируют кровью от инфицированной спленэктомированной собаки-донора. Кровь отмывают средой для Babesia (Schetters et al., 1994, выше). Количество крови, содержащей 106 пораженных паразитами эритроцитов на мл, инъецируют внутривенно экспериментальным животным (1 мл/собака).
После заражения инфекцией всех экспериментальных животных ежесуточно обследуют на клинические признаки бабезиоза. Особое внимание уделяют поведению, размеру селезенки, размеру лимфоузлов, цвету слизистых оболочек рта и века и времени наполнения капилляров. Эти параметры оценивают в баллах согласно критериям, описанным у Schetters et al. 1994 (выше).
Гематокритную величину выражают в виде объема осажденных эритроцитов (PCV) образца венозной крови, отобранной из яремной вены (2 мл гепаринизированной крови/собака). Гематокритные капилляры наполняют гепаринизированной кровью и центрифугируют в гематокритной центрифуге (Hettich) в течение 5 минут при 10000 об./мин.
Объем осажденных эритроцитов определяют с использованием считывающего устройства для определения гематокрита.
Мазки получают из образца крови, которой собирают для определения гематокритного числа крови. Процент инфицированных эритроцитов определяют по мазкам крови, окрашенным растворами Май-Грюнвальда/Гимза.
Плазму собирают после заражения инфекцией. Ее получают из образца крови, который собирают для определения гематокритного числа. Образец хранят при температуре окружающей среды. Клетки осаждают центрифугированием (1500×g, 5 минут, 4°C), и отсасывают прозрачную плазму, и хранят при -20°C до использования.
Если указано после клинического осмотра, собаки получают лечение от бабезиоза внутримышечной инъекцией имидокарбом дипропионатом (0,6 мл карбезии, Schering-Plough Animal Health) в течение двух последующих суток.
Интерпретация результатов
Среднюю температуру тела (± стандартное отклонение) рассчитывают для каждой экспериментальной группы. Различия анализируют ANOVA. P-значения <0,05 считают статистически значимыми.
Местным реакциям присваивают числовое значение согласно следующей ниже таблице:
Балл | Описание | Значение |
S, H или O | Мягкая, тяжелая, отечная | 1 |
W | Теплая | 1 |
P | Болезненная | 1 |
Балл каждого животного суммируют и рассчитывают среднее значение каждой экспериментальной группы. Различия анализируют ANOVA. P-значения <0,05 считают статистически значимыми.
Титры антител к антигенам B. canis A и B. rossi определяют для каждой собаки. На основании этих титров антител рассчитывают титр активности.
По меньшей мере 80% животных в группах выживают до завершения эксперимент.
Пример 4: CBA-1 защищает собак от тяжелого заражения Babesia canis
Белок CBA-1 получали и проводили эксперимент вакцинация-заражение на собаках, в частности, как описано в примере 3. В кратком изложении:
4.1 Получение и рефолдинг белка CBA-1:
CBA-1 получали от бактерий E. coli с использованием E. coli штамма BL21(DE3), трансфицированных вектором pET-101, содержащим полноразмерную последовательность кДНК CBA-1 с C-концевой гексагистидиновой меткой, в ферментере объемом 3 литра, функционирующим в режиме периодических культур с подпиткой при 37°C. Основная среда представляла собой LB с фосфатным буфером (6 г/л Na2HPO4 и 3 г/л KH2PO4), питательная среда содержала 10-кратный фосфатный буфер, 50% глюкозы и 5% экстракт дрожжей. Управление питающим насосом устанавливали на поддержание уровня растворенного кислорода при 40%. После подачи 50 мл подпитки добавляли IPTG (до конечной концентрации 1 мМ) для индукции экспрессии, и поддерживали культуру еще в течение 4 часов до сбора.
Сбор, 30 г (сырой масса) клеточной массы, разрушали в гомогенизаторе высокого давления (Emulsiflex™ от Avestin) в PBS при 1200 бар. Поручаемый лизат центрифугировали (10000×g в течение 20 минут) и отмывали осадок 3 раза в PBS с 1% Triton-X100®. Вследствие того, что рекомбинантный CBA-1 содержался в виде нерастворенного вещества, его растворяли в буфере, содержащем 6 M мочевины, 50 мМ NaH2PO4 и 300 мМ KCl при pH=8. Собранный рекомбинантный белок CBA-1 иммобилизовали 5 мл HisTrap® на колонке для очистки, а также для рефолдинга, чтобы обеспечить презентирование конформационных эпитопов и удаление мочевины при сохранении белка растворенным. Применяли рефолдинг на колонке с использованием 50 объемов колонки градиентного буфера (509 мМ NaH2PO4, 300 мМ KCl, и содержащего в качестве окислительно-восстановительной пары 3 мМ/0,3 мМ окисленного/восстановленного глутатиона). Элюирование проводили в градиенте фосфат-KCl буфера, содержащего до 400 мМ имидазола. Отогнанные фракции выбирали посредством детекции содержания белка в УФ при 280 нм, и подтверждения способом гель-электрофорез SDS-PAGE. Соответствующие фракции объединяли.
Получаемый рекомбинантный белок CBA-1 составлял 20 мл при 250 мкг/мл (приблизительно 5 мг от общего белка) в элюирующем буфере. Чистота составляла более 85%, как определено SDS-PAGE и окрашиванием CBB.
4.2 Эксперимент вакцинации и заражения
Эксперимент вакцинации-заражения проводили, как описано в примере 3, за исключением того, что применяемую вакцинацию проводили повторно два раза через 3 и 6 недель после вакцинации вместо однократной вакцинации. Заражение проводили через 2 недели после последней вакцинации. Контроли не вакцинировали, т.к. в предшествовавшем исследовании было показано, что вакцинация даже одним адъювантом или смешенным с лизированными эритроцитами, не препятствует укоренению или прогрессированию заражения инфекцией.
4.2.1 Результаты
Общие результаты: измерения температуры включали в результаты клинических баллов. Коэффициент выживаемости составлял 100%, вследствие того, что любая собака с уровнем клинических баллов 2 или выше получала лечение Carbesia™ (имидокарб дипропионат) для препятствия инфекции и предотвращения дальнейшего заболевания. Местные реакции наблюдали как временные умеренные припухлости на участке инъекции, как и ожидалось вследствие применения сапонина в качестве адъюванта.
Наиболее наглядные результаты эффективного иммунного ответа против заражения инфекцией Babesia представляют собой: клинический балл, паразитарная нагрузка в мазках крови и уменьшение гематокритного числа у животных во время заражения. Для эксперимента вакцинации-заражения с использованием экспрессируемого E. coli белка CBA-1 эти результаты представлены в таблице 5 и на фиг.7, 8 и 9.
В таблице 5 представлены результаты этих трех основных параметров и для сравнения также представлены результаты более ранних исследований с использованием вакцины на основе неочищенных SPA, которая является коммерчески доступной как Nobivac® Piro, результаты которых опубликованы Schetters et al., 2006 (Vet. Parasitol., vol. 138, p. 140-146).
Таблица 5 Результаты наиболее важных параметров эксперимента вакцинации-заражения на собаках |
|||
Антиген | Максимальный клинический балл | Паразитарная нагрузка | Максимальное снижение PCV |
CBA-1 | 1,3 | 3,5 | 46,6 |
sem | 0,2 | 0,8 | 3,0 |
Невакцинированные контроли | 2,7 | 7,2 | 57,1 |
sem | 0,3 | 1,4 | 4,3 |
Nobivac® Piro | 2,8 | 8,9* | 54,0 |
sem | 0,7 | 0,9 | 4,0 |
Невакцинированные контроли | 4,2 | 9,7* | 64,6 |
sem | 0,9 | 0,8 | 4,9 |
sem = стандартная ошибка среднего * = значения не отличающиеся достоверно |
Клинический балл
Клинические баллы рассчитывали ранее описанным способом (Schetters et al. 1994 Vet. Parasitol. 52, 219-233). Максимальное значение клинических баллов, выявленных в эксперименте, представлено в таблице 5, тогда как на фиг.7 представлены средние значения, выявленные в группе за сутки.
Основные симптомы, наблюдаемые у невакцинированных контролей, которые обуславливали относительно высокие клинические баллы, представляли собой белый внешний вид слизистой оболочки и увеличенное время наполнения капилляров. Сделан вывод о том, что вакцинация CBA-1 приводила к значительному уменьшению клинического балла после заражения.
Паразитарная нагрузка
Паразитарную нагрузку рассчитывали как сумму суточных 10Log значений паразитемии, значение на 14 сутки после заражения (конец эксперимента) представлено в таблице 5.
Результаты демонстрируют значительное снижение паразитарной нагрузки у вакцинированных CBA-1 собак. Это ранее было невозможным с использованием вакцины по типу неочищенных SPA, и это значительно способствует уменьшению симптомов заболевания и времени выздоровления. Также это играет важную роль в уменьшении распространения заболевания клещами и, таким образом, другими собаками в окружающей среде. Результаты представлены на фиг.8.
Объем осажденных эритроцитов
Значения PCV представляют собой средние значения групп, которые выражены в виде процентных величин относительно значений на сутки 0 (до заражения). Максимальное снижение PCV представлено в таблице 5, т.к. не у всех собак выявляли наибольшее снижение PCV на одни и те же сутки.
Вакцинация CBA-1 значительно снижала гематокритное число, обусловленное заражением инфекцией B. canis. Результаты представлены на фиг.9.
4.3 Заключения
Как представлено в таблице 5 и на фиг.7-9 вакцинация рекомбинантным экспрессируемым белком CBA-1 была способна обеспечивать собак значительным уровнем иммунной защиты против инфекции паразитами Babesia canis, а также против симптомов заболевания, вызываемых ими. Эта защита значительно превосходила существующие коммерческие вакцины против Babesia собак.
Подписи к чертежам
Фиг.1: Выравнивание аминокислотной последовательности полипептидов CBA из Babesia canis и Babesia rossi. Две характеризующие области обведены рамкой, и предполагаемая сигнальная последовательность указана двойной стрелкой.
Фиг.2: Выравнивание нуклеотидных последовательностей мРНК CBA-1 (в форме кДНК, SEQ ID NO:9) и гена CBA-1 из генома B. canis (SEQ ID NO:12).
Фиг.3: Детекция AlphaLisa рекомбинантной молекулы CBA-1 B. canis. Детекцию проводили с использованием поликлональных антител, специфических к SPA B. canis.
Фиг.4: Детекция AlphaLisa рекомбинантной молекулы CBA-2 B. rossi. Детекцию проводили с использованием поликлональных антител, специфических к SPA B. rossi.
Фиг.5: Детекция ингибирующим AlphaLisa ингибирования рекомбинантным полипептидом CBA-1 B. canis связывания поликлональных антител, специфических к SPA B. canis, с антигеном сравнения SPA B. canis.
Фиг.6: Детекция ингибирующим AlphaLisa ингибирования рекомбинантным полипептидом CBA-1 B. canis связывания поликлональных антител, специфических к SPA B. rossi, с антигеном сравнения SPA B. rossi.
Фиг.7: Средний клинический балл, получаемый для группы в сутки (после заражения), со стандартной ошибкой среднего в эксперименте вакцинация-заражение на собаках.
Фиг.8: Результаты паразитарной нагрузки в эксперименте вакцинация-заражение.
Фиг.9: Результаты гематокрита (в виде объема осажденных эритроцитов, в % относительно суток 0 [до заражения]) в эксперименте вакцинация-заражение.
Claims (19)
1. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, обладающий идентичностью аминокислотной последовательности более 70% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, и где указанный полипептид способен индуцировать иммунный ответ против паразита Babesia собак.
2. Полипептид по п. 1 для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, способная кодировать полипептид по п. 1.
4. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, обладающая идентичностью нуклеотидной последовательности более 70% по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, которая может гибридизоваться в жестких условиях по меньшей мере с одной нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
6. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5 для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, способный индуцировать иммунный ответ против паразита Babesia собак, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.3-5, где указанная нуклеотидная последовательность находится под контролем функционально связанного промотора.
8. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 7 для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
9. Живой рекомбинантный микроорганизм-носитель, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, для применения в вакцине.
10. Живой рекомбинантный микроорганизм-носитель по п. 9 для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
11. Выделенное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п. 1, полученное путем иммунизации животного-донора полипептидом по п. 1, для применения в вакцине для пассивной иммунизации.
12. Антитело по п. 11 для применения в вакцине для собак против бабезиоза.
13. Выделенное антитело, такое как описано в п. 11, для применения в диагностическом тестовом наборе.
14. Вакцина для собак против бабезиоза, содержащая полипептид по п. 1, или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5, или молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, или живой рекомбинантный микроорганизм-носитель по п. 9, или антитело по п. 11, или их комбинацию и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ получение вакцины по п. 14, включающий смешивание полипептида по п. 1, или молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5, или молекулы нуклеиновой кислоты по п. 7, или живого рекомбинантного микроорганизма-носителя по п. 9, или антитела по п. 11, или их комбинации и фармацевтически приемлемого носителя.
16. Способ по п. 15, включающий стадию экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5, молекулы нуклеиновой кислоты по п. 7 в рекомбинантной экспрессирующей системе.
17. Применение полипептида по п. 1, или молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5, или молекулы нуклеиновой кислоты по п. 7, или живого рекомбинантного микроорганизма-носителя по п. 9, или антитела по п. 11, или их комбинации для получения вакцины против бабезиоза у собак.
18. Способ вакцинации собаки против бабезиоза, включающий стадию инокуляции указанным собакам иммунологически эффективного количества вакцины по п. 14.
19. Диагностический тестовый набор для выявления молекулы нуклеиновой кислоты паразита Babesia собак, или антигенного материала паразита Babesia собак, или антител к паразиту Babesia собак, где указанный набор включает полипептид по п. 1 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 3-5, или молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, или антитело по п. 11.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10197303 | 2010-12-29 | ||
EP10197303.0 | 2010-12-29 | ||
US201161430298P | 2011-01-06 | 2011-01-06 | |
US61/430,298 | 2011-01-06 | ||
PCT/EP2011/074120 WO2012089748A1 (en) | 2010-12-29 | 2011-12-28 | Canine babesiosis vaccine antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013135002A RU2013135002A (ru) | 2015-02-10 |
RU2599544C2 true RU2599544C2 (ru) | 2016-10-10 |
Family
ID=44009896
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013135002/10A RU2599544C2 (ru) | 2010-12-29 | 2011-12-28 | Вакцинный антиген бабезиоза собак |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20130287786A1 (ru) |
EP (1) | EP2658568A1 (ru) |
JP (1) | JP5980810B2 (ru) |
BR (1) | BR112013016694A2 (ru) |
RU (1) | RU2599544C2 (ru) |
WO (1) | WO2012089748A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR100931A1 (es) * | 2015-06-22 | 2016-11-09 | Inst Nac De La Tecnología Agropecuaria (Inta) | Polipéptido quimérico, vacuna contra la babesiosis, métodos de inmunización, métodos de detección y kit |
JP7364264B2 (ja) | 2022-02-14 | 2023-10-18 | 株式会社クリス・コーポレーション | 吊り足場 |
CN114957406B (zh) * | 2022-05-26 | 2024-02-02 | 吉林大学 | 一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1238983A1 (en) * | 2001-03-06 | 2002-09-11 | Akzo Nobel N.V. | "Babesia canis vaccine" |
RU2380115C1 (ru) * | 2008-07-03 | 2010-01-27 | Владислав Валерьевич Белименко | Способ получения крови для изготовления антигенов из гемоспоридий |
US20100248390A1 (en) * | 2009-03-02 | 2010-09-30 | Duke University | Compositions and methods for identifying ligands of odorant receptors |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8205892D0 (sv) | 1982-10-18 | 1982-10-18 | Bror Morein | Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin |
NZ207394A (en) | 1983-03-08 | 1987-03-06 | Commw Serum Lab Commission | Detecting or determining sequence of amino acids |
SE8405493D0 (sv) | 1984-11-01 | 1984-11-01 | Bror Morein | Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel |
WO1986006487A1 (en) | 1985-04-22 | 1986-11-06 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Method for determining mimotopes |
EP0382271B1 (en) | 1989-02-04 | 1994-12-21 | Akzo Nobel N.V. | Tocols as adjuvant in vaccine |
FR2714074B1 (fr) | 1993-12-20 | 1996-03-01 | Pasteur Institut | Promoteurs des gènes GRA1, GRA2, GRA5 et GRA6 de toxoplasma gondii et vecteurs d'expression comprenant lesdits promoteurs. |
EP0691131B1 (en) | 1994-06-06 | 1999-10-06 | Akzo Nobel N.V. | Babesia vaccine |
IL120202A (en) | 1996-03-07 | 2001-03-19 | Akzo Nobel Nv | Container with freeze-dried vaccine components |
US7700359B2 (en) * | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
ZA200201446B (en) * | 2001-03-06 | 2002-09-02 | Akzo Nobel Nv | Babesia canis vaccine. |
AU2003246674B2 (en) | 2002-07-10 | 2008-08-14 | Intervet International B.V. | Immunogenic composition comprising a fusion protein and a saponin adjuvant |
CA2498604A1 (en) | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Akzo Nobel N.V. | Live antenuated parasite vaccine |
AU2004235952A1 (en) * | 2003-05-07 | 2004-11-18 | Intercell Ag | Streptococcus agalactiae antigens I + II |
CA2531329A1 (en) * | 2003-07-10 | 2005-02-10 | Akzo Nobel N.V. | Family of 28 kda babesia proteins as vaccines |
TWI398272B (zh) | 2005-03-08 | 2013-06-11 | Intervet Int Bv | 化學定義的安定劑 |
-
2011
- 2011-12-28 RU RU2013135002/10A patent/RU2599544C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-12-28 EP EP11802442.1A patent/EP2658568A1/en active Pending
- 2011-12-28 JP JP2013546700A patent/JP5980810B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-28 US US13/997,805 patent/US20130287786A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-28 WO PCT/EP2011/074120 patent/WO2012089748A1/en active Application Filing
- 2011-12-28 BR BR112013016694A patent/BR112013016694A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-12-02 US US14/557,833 patent/US9346862B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1238983A1 (en) * | 2001-03-06 | 2002-09-11 | Akzo Nobel N.V. | "Babesia canis vaccine" |
RU2380115C1 (ru) * | 2008-07-03 | 2010-01-27 | Владислав Валерьевич Белименко | Способ получения крови для изготовления антигенов из гемоспоридий |
US20100248390A1 (en) * | 2009-03-02 | 2010-09-30 | Duke University | Compositions and methods for identifying ligands of odorant receptors |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SCHETTERS T.P. et al., "Immunity against Babesia rossi infection in dogs vaccinated with antigens from culture supernatants", Vet Parasitol. 2007 Mar 15;144(1-2):10-9. Epub 2006 Oct 23;RU 2380115 C1, 27.01.2010. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112013016694A2 (pt) | 2018-05-22 |
US20150079127A1 (en) | 2015-03-19 |
EP2658568A1 (en) | 2013-11-06 |
US9346862B2 (en) | 2016-05-24 |
RU2013135002A (ru) | 2015-02-10 |
JP2014505470A (ja) | 2014-03-06 |
WO2012089748A1 (en) | 2012-07-05 |
JP5980810B2 (ja) | 2016-09-07 |
US20130287786A1 (en) | 2013-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cannas et al. | Vaccination of mice against experimental Neospora caninum infection using NcSAG1-and NcSRS2-based recombinant antigens and DNA vaccines | |
EA016648B1 (ru) | Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген cs возбудителя малярии, и белкового антигена, содержащего белок cs или его фрагмент, для лечения или профилактики малярии | |
AU2020304652A1 (en) | African swine fever vaccine | |
Arce-Fonseca et al. | Recombinant enolase of Trypanosoma cruzi as a novel vaccine candidate against Chagas disease in a mouse model of acute infection | |
Wright et al. | Protection of Babesia bigemina-immune animals against subsequent challenge with virulent Babesia bovis | |
RU2599544C2 (ru) | Вакцинный антиген бабезиоза собак | |
ZA200600180B (en) | Babesia vaccines | |
US7799330B2 (en) | Piroplasmid vaccine | |
CA2491704A1 (en) | Immunogenic composition comprising a fusion protein and a saponin adjuvant | |
AU2018214451B2 (en) | Immunostimulating compositions and uses therefore | |
WO2019153029A1 (en) | Polypeptide, compositions and uses thereof | |
CA2548582A1 (en) | Use of gene ncsag4 for the diagnosis and prevention of neosporosis and as a marker for analysis of the pathogenesis | |
Arce-Fonseca et al. | Research Article Recombinant Enolase of Trypanosoma cruzi as a Novel Vaccine Candidate against Chagas Disease in a Mouse Model of Acute Infection | |
WO2021142445A1 (en) | Antibodies to pfgarp kill plasmodium falciparum malaria parasites and protect against infection and severe disease | |
Piraine et al. | Journal of Vaccines & Vaccination | |
MXPA06002871A (en) | Piroplasmid vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201229 |