RU2592228C2

RU2592228C2 - Method (versions) and kit for diagnosing infection urinary tract diseases, method of treating and determination of predisposition to urinary tract infection

Info

Publication number: RU2592228C2
Application number: RU2014114138/15A
Authority: RU
Inventors: Владимир Игоревич Павлов
Original assignee: Владимир Игоревич Павлов
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2016-07-20
Also published as: RU2014114138A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: present invention refers to medicine, namely urology, and can be used to detect urinary tract infection in the patient. Method involves obtaining a sample from the patient and detection in the above sample CD1d receptor expression on NKT-cells and BCL6 in bladder tissues. Higher expression of CD1d on NKT-cells and reduction of BCL6 in tissues of the bladder is diagnosed infection urinary tract.

EFFECT: using the given biomarkers enables diagnosing the presence of infection urinary tract diseases, as well as use for estimating clinical effectiveness.

1 cl, 1 ex, 7 dwg

Description

Способ обнаружения инфекции мочевыводящих путей у пациентаA method for detecting a urinary tract infection in a patient

Область изобретенияField of Invention

Изобретение относится к области медицины. Предложен биомаркер Инфекции Мочевыводящих Путей (ИМП) для использования в диагностике, определении предрасположенности пациента к заболеванию и реакции на лечение и терапевтического/профилактического применения. В особенности, настоящее изобретение описывает CD1d и BCL6 в качестве биомаркеров ИМП.The invention relates to the field of medicine. A biomarker of Urinary Tract Infection (UTI) has been proposed for use in the diagnosis, determination of a patient's predisposition to the disease and response to treatment and therapeutic / prophylactic use. In particular, the present invention describes CD1d and BCL6 as UTI biomarkers.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Инфекция Мочевыводящих Путей (ИМП) является часто встречающимся заболеванием у человека. В настоящее время при наличии инфекции диагноз устанавливается на основании обнаружения бактериальной культуры в образце мочи с использованием классических микробиологических методов. Лечение инфекции проводится путем системного введения антибиотиков при отсутствии устойчивости к ним бактериального возбудителя.Urinary Tract Infection (UTI) is a common disease in humans. Currently, in the presence of infection, the diagnosis is established based on the detection of a bacterial culture in a urine sample using classical microbiological methods. Treatment of infection is carried out by systemic administration of antibiotics in the absence of resistance to them of the bacterial pathogen.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность антибактериального лечения инфекции мочевыводящих путей, благодаря предложению, использовать биомаркеры ИМП для применения в диагностике, определении реакции на лечение и для терапевтического/профилактического применения.The present invention improves the effectiveness of antibacterial treatment of urinary tract infections, thanks to the proposal, the use of UTI biomarkers for use in diagnosis, determination of response to treatment and for therapeutic / prophylactic use.

Способ обнаружения инфекции мочевыводящих путей у пациента, содержит: а) получение образца от пациента; б) обнаружение в указанном образце экспрессии рецептора CD1d на NKT-клетках и BCL6 в тканях мочевого пузыря и в) при повышении экспрессии CD1d на NKT-клетках и снижении BCL6 в тканях мочевого пузыря диагностируют наличие инфекции мочевыводящих путей.A method for detecting a urinary tract infection in a patient, comprises: a) receiving a sample from a patient; b) the detection of CD1d receptor expression on NKT cells and BCL6 in the bladder tissue in the indicated sample; and c) the presence of urinary tract infection is diagnosed with an increase in CD1d expression on NKT cells and a decrease in BCL6 in the bladder tissue.

В частности, настоящее изобретение описывает рецептор CD1d и BCL6 как биомаркеры ИМП. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики ИМП в испытуемом, включающий получение образца от испытуемого и обнаружение рецептора CD1d и BCL6 в образце. В одном варианте исполнения изобретения обнаружение рецептора CD1d и BCL6 включает в себя обнаружение присутствия матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) дляIn particular, the present invention describes the CD1d receptor and BCL6 as UTI biomarkers. Therefore, the present invention provides a method for diagnosing UTI in a test subject, including obtaining a sample from a test subject and detecting a CD1d and BCL6 receptor in a sample. In one embodiment, detecting a CD1d and BCL6 receptor includes detecting the presence of template ribonucleic acid (mRNA) for

рецептора CD1d и BCL6. Возможно, что обнаружение экспрессии рецептора CD1d и BCL6 мРНК включает обратную транскрипцию и/или аплификацию мРНК рецептора CD1d и BCL6. Возможно также, что обнаружение экспрессии мРНК рецептора CD1d и BCL6 включает в себя взаимодействие мРНК рецептора CD1d и BCL6 с зондом из нуклеиновой кислоты, комплементарным к мРНК рецептора CD1d и BCL6. Также может быть, что обнаружение экспрессии рецептора CD1d и BCL6 включает в себя обнаружение полипептида (белка) рецептора CD1d и BCL6. Может быть, что обнаружение наличия полипептида рецептора CD1d и BCL6 включает в себя взаимодействие полипептида рецептора CD1d и BCL6 с антителом, специфичным к полипептиду рецептора CD1d и BCL6 и обнаружение связывания антитела с полипептидом рецептора CD1d и BCL6. В варианте исполнения, объектом является испытуемый человек или животное (например, лошадь, собака, кошка, свинья или другой домашний скот). В других вариантах образцом является жидкость организма (например, моча, кровь, сперма, секрет и т.д.) и/или ткань или клетки (например, ткань/клетки мочевого пузыря). Настоящее изобретение также описывает способ выбора действий в терапевтическом курсе, например, для лечения ИМП, включающий в себя получение образца от испытуемого (объекта); обнаружение продукции рецептора CD1d и BCL6, например, белка или мРНК в образце; и лечении испытуемого на основании продукции рецептора CD1d и BCL6. Предлагаются способы мониторинга эффективности лечения ИМП, включающие в себя обнаружение продукции рецептора CD1d и BCL6, например, белка или мРНК в испытуемом, лечение испытуемого, например, на основании обнаруженной продукции, и последующий после лечения повторный контроль уровней продукции. Иногда необходимость в терапевтическом курсе определяется после повторного контроля уровней продукции.CD1d and BCL6 receptor. It is possible that detection of expression of the CD1d receptor and BCL6 mRNA includes reverse transcription and / or aplification of mRNA of the CD1d and BCL6 receptor. It is also possible that the detection of CD1d and BCL6 receptor mRNA expression involves the interaction of CD1d and BCL6 receptor mRNA with a nucleic acid probe complementary to the CD1d and BCL6 receptor mRNA. It may also be that detecting expression of a CD1d and BCL6 receptor includes detecting a CD1d and BCL6 receptor polypeptide (protein). It may be that detecting the presence of a CD1d and BCL6 receptor polypeptide includes reacting a CD1d and BCL6 receptor polypeptide with an antibody specific for a CD1d and BCL6 receptor polypeptide and detecting binding of the antibody to a CD1d and BCL6 receptor polypeptide. In an embodiment, the object is a test person or animal (e.g., a horse, dog, cat, pig, or other livestock). In other embodiments, the sample is body fluid (e.g., urine, blood, semen, secretion, etc.) and / or tissue or cells (e.g., bladder tissue / cells). The present invention also describes a method for selecting actions in a therapeutic course, for example, for the treatment of UTI, including obtaining a sample from a test subject (object); detecting CD1d and BCL6 receptor production, for example, protein or mRNA in a sample; and treating a subject based on CD1d and BCL6 receptor production. Methods are proposed for monitoring the effectiveness of treatment of UTI, including detection of CD1d and BCL6 receptor products, for example, protein or mRNA in a test subject, treatment of a test subject, for example, based on the detected product, and subsequent post-treatment re-monitoring of production levels. Sometimes the need for a therapeutic course is determined after re-monitoring the levels of production.

Настоящее изобретение предлагает наборы для описания ИМП в испытуемом, включающие в себя один или более реагентов, способные специфически обнаруживать присутствие или отсутствие продукции рецептора CD1d и BCL6 (например, белка или мРНК); и инструкции по использованию набора для характеризации ИМП в испытуемом. В одном варианте, реагент представляет собой зонд из нуклеиновой кислоты, комплементарный к мРНК рецептора CD1d и BCL6. В другом варианте реагент включает в себя антитело, которое связывается конкретно с полипептидом рецептора CD1d и BCL6.The present invention provides kits for describing a UTI in a test subject, including one or more reagents capable of specifically detecting the presence or absence of production of a CD1d and BCL6 receptor (eg, protein or mRNA); and instructions for using the kit to characterize UTI in a test subject. In one embodiment, the reagent is a nucleic acid probe complementary to the CD1d and BCL6 receptor mRNAs. In another embodiment, the reagent includes an antibody that binds specifically to the CD1d and BCL6 receptor polypeptide.

Настоящее изобретение также предоставляет способ отбора соединений для лечения ИМП, включающего в себя получение образца, например, мочи, клеток, ткани, животного); и один или более тестируемых соединений; и взаимодействие образца с тестируемым соединением; и обнаружение изменения в продукции рецептора CD1d и BCL6 и/или концентрации в образце в присутствии тестируемого соединения поThe present invention also provides a method for selecting compounds for the treatment of UTI, including obtaining a sample, for example, urine, cells, tissue, animal); and one or more test compounds; and the interaction of the sample with the test compound; and detecting a change in CD1d and BCL6 receptor production and / or concentration in a sample in the presence of a test compound according to

сравнению с вариантом отсутствия тестируемого соединения (или по сравнению с контрольным соединением). Обнаружение изменения включает в себя обнаружение мРНК рецептора CD1d и BCL6. В определенном исполнении, детекция включает в себя обнаружение белков рецептора CD1d и BCL6. Тестируемые клетки существуют in vitro и in vivo. Иногда тестирующие соединения включают в себя нуклеиновую кислоту (например, siPHK, антисенс соединение, miPHK и т.д.), белок/полипептид/пептид (например, антитело или фрагмент из него), небольшую молекулу (например, лекарство) и т.д. Настоящее изобретение также предлагает способ определения предрасположенности пациента к развитию ИМП. Уровни продукции биомаркера рецептор CD1d и BCL6, или панель биомаркеров определяется в образце от испытуемого. В другом варианте восприимчивость к ИМП определяется на основании анализа уровня биомаркеров. Профилактический способ действий определяется и/или развивается на основании предрасположенности пациента. Способ действий может включать дополнительное тестирование биомаркера (например, регулярное тестирование, тестирование дома и т.д.), изменение диеты, пищевых добавок, лекарств и т.д.compared with the lack of a test compound (or compared with a control compound). Detection of change includes detection of CD1d and BCL6 receptor mRNA. In a specific embodiment, detection includes detection of CD1d and BCL6 receptor proteins. Test cells exist in vitro and in vivo. Sometimes test compounds include a nucleic acid (e.g., siRNA, antisense compound, miRNA, etc.), a protein / polypeptide / peptide (e.g., an antibody or fragment thereof), a small molecule (e.g., a drug), etc. . The present invention also provides a method for determining a patient’s susceptibility to UTI. CD1d and BCL6 receptor biomarker production levels, or a biomarker panel, is determined in a sample from a test subject. In another embodiment, susceptibility to UTI is determined based on an analysis of the level of biomarkers. The preventive mode of action is determined and / or developed on the basis of the patient's predisposition. The method of action may include additional testing of the biomarker (for example, regular testing, testing at home, etc.), changing diets, nutritional supplements, medicines, etc.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

РИС. 1 - показывает (А) процентное содержание (18,8±3,6%) TCRβ⁺NK1.1⁺ Т-лимфоцитов (НКТ-клеток) в клеточной суспензии мочевого пузыря мыши в физиологических условиях с помощью проточной цитометрии и (Б) долевое распределение TCRβ⁺NK1.1⁺ Т-лимфоцитов между CD4+ и CD8+ субпопуляциями.FIG. 1 - shows (A) the percentage (18.8 ± 3.6%) of TCRβ ⁺ NK1.1 ⁺ T-lymphocytes (tubing cells) in the cell suspension of the mouse urinary bladder under physiological conditions using flow cytometry and (B) lobar distribution of TCRβ ⁺ NK1.1 ⁺ T-lymphocytes between CD4 + and CD8 + subpopulations.

РИС. 2 - показывает найденное с помощью проточной цитометрии, повышение экспрессии активационных рецепторов (CD25, CD44, CD62L и CD69), а также хемокинового рецептора CXCR5 на поверхности НКТ-клеток до и через 1 сутки после инъекции в мочевой пузырь уропатогенной палочки (УПКП) или физиологического раствора (ПБС).FIG. 2 - shows the increase in the expression of activation receptors (CD25, CD44, CD62L, and CD69) found by flow cytometry, as well as the CXCR5 chemokine receptor on the surface of tubing cells before and 1 day after injection of uropathogenic bacillus (UCTD) or physiological solution (PBS).

РИС. 3 - показывает увеличение абсолютного числа НКТ-клеток в мочевом пузыре мыши через 24 часа после инъецирования УПКП или физиологического раствора (ПБС).FIG. 3 - shows an increase in the absolute number of tubing cells in the mouse urinary bladder 24 hours after injection of VAR or physiological saline (PBS).

РИС. 4 - показывает усиление экспрессии рецептора CD1d на поверхности уротелия после через 24 часа после инъецирования УПКП или физиологического раствора (ПБС), обнаруженное с помощью проточной цитометрии.FIG. 4 - shows the increased expression of the CD1d receptor on the surface of urothelium after 24 hours after injection of UPKP or physiological saline (PBS), detected by flow cytometry.

РИС. 5 - показывает снижение TCRβ⁺NK1.1⁺ Т-лимфоцитов в CD1d-дефицитных мышах по сравнению с диким типом мышей, обнаруженное с помощью проточной цитометрии.FIG. 5 shows a decrease in TCRβ ⁺ NK1.1 ⁺ T lymphocytes in CD1d-deficient mice compared to wild-type mice detected by flow cytometry.

РИС. 6 - показывает количество бактерий в мочевом пузыре через 24 часа после инъекции УПКП у диких и CD1d-дефицитных мышей.FIG. 6 - shows the number of bacteria in the bladder 24 hours after injection of VAR in wild and CD1d-deficient mice.

РИС. 7 - иллюстрирует кривую зависимости концентрации мРНК транскрипционного фактора BCL6 от времени инфекционного процесса, вызванном УПКП, в мышином мочевом пузыре.FIG. 7 - illustrates the curve of the concentration of mRNA transcription factor BCL6 from the time of the infectious process caused by VAR in the mouse bladder.

Описание терминологииTerminology Description

В целях понимания настоящего изобретения ряд терминов и формулировок пояснен ниже.In order to understand the present invention, a number of terms and wording are explained below.

Термин "испытуемый" относится к любому животному, например, млекопитающему, включая, но не ограничиваясь, людей, нечеловекоподобных обезьян, грызунов и им подобных, которые являются получателями особого лечения или объектом в различных тестах, например, диагностических тестах, которые могут быть представлены в настоящем изобретении. В данном документе определение "испытуемый" и "пациент" используются взаимозаменяемо со ссылкой на человеческий объект.The term “test subject” refers to any animal, for example, a mammal, including, but not limited to, humans, non-human monkeys, rodents and the like, which are recipients of special treatment or an object in various tests, for example, diagnostic tests that may be presented in the present invention. In this document, the definitions of "test subject" and "patient" are used interchangeably with reference to a human object.

Термин "испытуемый, подозреваемый в наличии ИМП" относится к испытуемому, у которого обнаружены один или более симптомов, указывающих на ИМП, или обнаруженных в результате скрининга ИМП. Испытуемый, подозреваемый в наличии ИМП, может иметь один или более факторов риска. Обычно испытуемый, подозреваемый в наличии Инфекции Мочевыводящих Путей, предварительно не тестировался на ИМП. Данный термин будет включать также людей, которые ранее имели ИМП и имели определенные признаки, указывающие на ее повторение.The term “suspected UTI suspect” refers to a subject who has one or more symptoms indicative of an UTI or is detected by screening for an UTI. A test subject suspected of having a UTI may have one or more risk factors. Typically, a test subject suspected of having Urinary Tract Infection has not previously been tested for UTI. This term will also include people who previously had a UTI and had certain signs indicating its recurrence.

Определение "испытуемый с риском ИМП" относится к испытуемому с одним или более факторами риска развития ИМП (например, история болезней в прошлом, окружающая среда, поведение, анатомия, генетика и т.д.).The term “UTI risk test” refers to a test subject with one or more risk factors for UTI (for example, past medical history, environment, behavior, anatomy, genetics, etc.).

Определение "испытуемый с диагнозом Инфекции Мочевыводящих Путей" относится к испытуемому, который был обследован и у которого было обнаружена Инфекция Мочевыводящих Путей. Инфекция Мочевыводящих Путей может быть диагностирована с использованием любого подходящего метода, включая, но неThe definition “test subject diagnosed with Urinary Tract Infection” refers to a test subject who has been examined and who has been diagnosed with Urinary Tract Infection. Urinary Tract Infection can be diagnosed using any suitable method, including but not

ограничиваясь, диагностическими методами настоящего изобретения.limited to the diagnostic methods of the present invention.

Определение "характеризация Инфекции Мочевыводящих Путей в испытуемом" относится к распознанию одного или более отличительных особенностей Инфекции Мочевыводящих Путей в испытуемом.The definition of “characterization of Urinary Tract Infection in a test subject” refers to the recognition of one or more of the distinctive features of Urinary Tract Infection in a test subject.

Понятия "тестируемое соединение" и "соединение-претендент" относятся к любому химическому веществу, лекарственному препарату, наркотику, и тому подобному, которое является кандидатом для лечения или предупреждения заболевания, болезни, недомогания или расстройства функции организма (например, Инфекции Мочевыводящих Путей). Тестируемые соединения включают в себя известные и потенциальные терапевтические соединения. Тестируемое вещество может рассматриваться терапевтическим после скринирования, используя методы скрининга настоящего изобретения.The terms “test compound” and “candidate compound” refer to any chemical substance, drug, drug, and the like that is a candidate for treating or preventing a disease, illness, malaise, or dysfunction of the body (for example, Urinary Tract Infection). Test compounds include known and potential therapeutic compounds. The test substance may be considered therapeutic after screening using the screening methods of the present invention.

Понятие "образец" используется в широком смысле. Первое значение включает образец или культуру, добытую из любого источника, равно как биологические образцы и образцы из окружающей среды. Биологические образцы могут быть взяты от животных, включая людей, и включают жидкости, сухие вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают, среди другого, жидкости тела (например, моча), продукты крови (например, плазма, сыворотка и тому подобное), и их составные части.The concept of "sample" is used in a broad sense. The first value includes a sample or culture obtained from any source, as well as biological samples and samples from the environment. Biological samples can be taken from animals, including humans, and include liquids, solids, tissues and gases. Biological samples include, among others, body fluids (eg, urine), blood products (eg, plasma, serum, and the like), and their components.

Понятие "биомаркер ИМП" или "гены биомаркеров ИМП" касаются гена, чей уровень экспрессии, например, по обнаружению продукции мРНК или белка, в единственном экземпляре или в комбинации с другими генами, коррелирует с Инфекцией Мочевыводящих Путей или прогнозом для Инфекции Мочевыводящих Путей. Корреляция может иметь отношение либо к повышенной, либо к пониженной экспрессии гена. Например, экспрессия гена может указывать на Инфекцию Мочевыводящих Путей, или сниженный уровень экспрессии гена может коррелировать с ответом на терапию против Инфекции Мочевыводящих Путей у пациента с Инфекцией Мочевыводящих Путей. Экспрессия биомаркера ИМП может быть охарактеризована с помощью использования любого подходящего метода, включая, но не ограничиваясь теми, что описаны в этом документе.The term "UTI biomarker" or "UTI biomarker genes" refers to a gene whose expression level, for example, by detecting mRNA or protein production, in a single copy or in combination with other genes, is correlated with Urinary Tract Infection or a prognosis for Urinary Tract Infection. Correlation may relate to either increased or decreased gene expression. For example, gene expression may indicate Urinary Tract Infection, or a reduced level of gene expression may correlate with a response to therapy against Urinary Tract Infection in a patient with Urinary Tract Infection. The expression of the UTI biomarker can be characterized using any suitable method, including but not limited to those described in this document.

Употребляемое здесь понятие "профильная карта экспрессии для Инфекции Мочевыводящих Путей" используется в представлении уровней экспрессии генов в образце (например, в моче). Карта может быть представлена как в графическом изображении (например, на бумаге или на экране компьютера), физическом представлении (например, гель или матрица), так и в цифровом изображении, хранимом в компьютерной памяти. Каждая карта соответствует особому виду образца и, такимAs used herein, “expression profile map for Urinary Tract Infection” is used to represent the levels of gene expression in a sample (eg, urine). A card can be represented both in a graphic image (for example, on paper or on a computer screen), a physical representation (for example, a gel or matrix), and in a digital image stored in computer memory. Each card corresponds to a special kind of sample and, therefore,

образом, представляет эталон для сравнения с образцом больного. В предпочтительном варианте, карты создаются из общего фонда образцов, охватывающих образцы от множества пациентов со схожим видом образца.thus represents a reference for comparison with a patient sample. In a preferred embodiment, maps are created from a common stock of samples spanning samples from a plurality of patients with a similar sample view.

Термины "компьютерная память" и "устройство для компьютерной памяти" относится к любому средству для хранения, читаемому компьютерным процессором. Примеры компьютерной памяти включают, но не ограничиваются, РАМ, РОМ, компьютерные чипы, цифровые видео-диски (ДВД), компакт-диски (КД), накопители на жестких дисках (НМД) и магнитную ленту.The terms “computer memory” and “computer memory device” refer to any storage medium readable by a computer processor. Examples of computer memory include, but are not limited to, RAM, ROM, computer chips, digital video disks (DVDs), compact discs (CDs), hard disk drives (NMDs), and magnetic tape.

Термин "компьютерочитаемый носитель" относится к любому устройству или системе для хранения и снабжения информацией (например, данные и инструкции) с компьютерного процессора. Примеры компьютерочитаемых носителей включают, но не ограничиваются, ЦВД, КД, накопители на жестких дисках, магнитную ленту и серверы для потоковых технологий через сети.The term "computer-readable medium" refers to any device or system for storing and supplying information (eg, data and instructions) from a computer processor. Examples of computer-readable media include, but are not limited to, CVPs, CDs, hard disk drives, magnetic tape, and servers for streaming technology over networks.

Термины "процессор" и "центральный процессорный элемент" или "ЦПЭ" используются взаимозаменяемо и относятся к устройству, которое способно читать программу из компьютерной памяти (например, РОМ или другая компьютерная память) и выполнять ряд действий в соответствии с программой.The terms “processor” and “central processing unit” or “CPE” are used interchangeably and refer to a device that is capable of reading a program from computer memory (eg, ROM or other computer memory) and performing a series of actions in accordance with the program.

Понятие "выделенный", когда используется в отношении нуклеиновой кислоты, например, как "выделенный нуклеотид" или "выделенный полинуклеотид", относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, по крайней мере, от одного компонента или примеси, с которой она обычно связана в ее естественном состоянии. Выделенная нуклеиновая кислота является таким веществом в виде или осадке, который отличен от найденного в природе.The term "isolated" when used in relation to a nucleic acid, for example, as "isolated nucleotide" or "isolated polynucleotide", refers to a nucleic acid sequence that is identified and separated from at least one component or impurity with which it is usually bound in its natural state. An isolated nucleic acid is such a substance in the form or precipitate that is different from that found in nature.

Термин "очищенный" или "очищать" относится к удалению компонентов (например, загрязняющих веществ) из образца. Например, рекомбинантные полипептиды продуцируются в клетках хозяина и полипептиды очищаются, благодаря удалению белков хозяйской клетки. Таким образом, процент рекомбинантных полипептидов в образце увеличивается.The term “cleaned” or “clean” refers to the removal of components (eg, contaminants) from a sample. For example, recombinant polypeptides are produced in host cells and the polypeptides are purified by removing host cell proteins. Thus, the percentage of recombinant polypeptides in the sample increases.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение представляет биомаркеры ИМП для использования в постановке диагнозов, скрининге лекарств, мониторинге лечения, определении предрасположенности пациента к заболеванию и лечебно-профилактическом употреблении. В частности, настоящее изобретение представляет рецептор CD1d и BCL6The present invention provides UTI biomarkers for use in diagnosing, screening drugs, monitoring treatment, determining a patient’s susceptibility to the disease, and for prophylactic use. In particular, the present invention provides a CD1d and BCL6 receptor.

в качестве биомаркеров ИМП.as biomarkers of UTI.

Соответственно, настоящее изобретение предлагает маркеры, чья экспрессия специфически меняется у испытуемых из группы риска, наиболее предрасположенных к и/или страдающих ИМП. Данные маркеры находят применение в диагностике и описании заболевания и пациентов.Accordingly, the present invention provides markers whose expression specifically changes in subjects at risk most susceptible to and / or suffering from UTI. These markers are used in the diagnosis and description of the disease and patients.

В течение проработки исполнения данного изобретения об обнаружении мочевых биомаркеров ИМП были выполнены следующие эксперименты. При изучении механизмов иммунных ответов на мышиной модели ИМП было обнаружено, что CD1d и BCL6 играют специфическую роль в организме хозяина на наиболее часто встречающегося возбудителя воспаления мочевыводящих путей - уропатогенную кишечную палочку (УПКП).During the development of the invention of the detection of urinary UTI biomarkers, the following experiments were performed. When studying the mechanisms of immune responses in a mouse UTI model, it was found that CD1d and BCL6 play a specific role in the host organism on the most common pathogen of urinary tract inflammation - uropathogenic Escherichia coli (APC).

НКТ-клетки распределены неравномерно в организме хозяина (преимущественно, в печени) и их роль в развитии патологических процессов неоднозначна и определяется, главным образом, классом НКТ-клеток, типом патогена и локализацией воспалительного процесса. Для разработки воплощения настоящего изобретения были выполнены эксперименты для определения присутствия НКТ-клеток в мочевом пузыре и их возможной роли в бактериальном воспалении ИМП. НКТ-клетки были найдены в мочевом пузыре мышей при отсутствии воспаления, и их число увеличивается через 24 часа после инсталляции УПКП в мочевой пузырь. НКТ-клетки экспрессируют рецепторы активации через 24 часа после УПКП-инфекции. Удаление НКТ-клеток усиливает защитные антибактериальные механизмы в мочевом пузыре. В ткани мочевых пузырей мышей с ИМП были обнаружены повышенный уровень CD1d и пониженный уровень BCL6, указывающие на то, что CD1d и BCL6 являются биомаркерами ИМП. В течение разработки настоящего изобретения выполненные эксперименты показали, что УПКП в интересах выживания способствует патогенезу ИМП через повышение концентрации CD1d и снижения транскрипционного фактора BCL6, что, в конечном итоге, приводит к активации и пролиферации НКТ-клеток. В свою очередь, активированные НКТ-клетки предотвращают очищение пузыря от бактерий.The tubing cells are distributed unevenly in the host organism (mainly in the liver) and their role in the development of pathological processes is ambiguous and is determined mainly by the class of tubing cells, the type of pathogen and the localization of the inflammatory process. To develop an embodiment of the present invention, experiments were performed to determine the presence of tubing cells in the bladder and their possible role in the bacterial inflammation of UTI. Tubing cells were found in the bladder of mice in the absence of inflammation, and their number increased 24 hours after the installation of VAR in the bladder. Tubing cells express activation receptors 24 hours after VARC infection. Removal of tubing cells enhances the protective antibacterial mechanisms in the bladder. In the urinary bladder tissue of mice with UTI, an elevated level of CD1d and a lower level of BCL6 were detected, indicating that CD1d and BCL6 are biomarkers of UTI. During the development of the present invention, the performed experiments showed that VARP in the interest of survival promotes the pathogenesis of UTI through an increase in the concentration of CD1d and a decrease in the transcription factor BCL6, which ultimately leads to the activation and proliferation of tubing cells. In turn, activated tubing cells prevent the bladder from bacteria.

Таким образом, настоящее изобретение представляет биологические маркеры для ИМП (например, рецептор CD1d и BCL6). Обнаружение определенного уровня рецептора CD1d и BCL6 в образце позволяет устанавливать диагноз ИМП (например, инфекции, вызванной УПКП). Биомаркеры данного изобретения (например, рецептор CD1d и BCL6) используются для дополнительного понимания и описания ИМП (например, инфекции, вызванной УПКП).Thus, the present invention provides biological markers for UTIs (e.g., CD1d and BCL6 receptor). Detection of a specific level of the CD1d and BCL6 receptors in the sample allows the diagnosis of UTI (e.g., infection caused by VAR). The biomarkers of the present invention (e.g., CD1d and BCL6 receptor) are used to further understand and describe UTIs (e.g., infections caused by VAR).

Предполагается, что определенные уровни биомаркера (например, рецептор CD1dCertain biomarker levels (e.g., CD1d receptor)

и BCL6) обнаруживаются в образце. Образцы, полученные от испытуемого (например, пациента), включают в себя, но не ограничиваются, жидкости, сухие вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают, среди прочего, жидкости тела (например, моча, кровь, сперма или слюна), продукты крови (например, плазма, сыворотка и тому подобное) и их составные части. Образцы включают в себя выделенные ткани или клетки (например, из мочевого пузыря или окружающих тканей и/или органов).and BCL6) are detected in the sample. Samples obtained from a test subject (eg, a patient) include, but are not limited to, liquids, solids, tissues, and gases. Biological samples include, but are not limited to, body fluids (e.g., urine, blood, semen, or saliva), blood products (e.g., plasma, serum, and the like) and their components. Samples include isolated tissue or cells (e.g., from the bladder or surrounding tissues and / or organs).

Настоящее изобретение обеспечивает обнаружение и измерение биомаркера (например, рецептор CD1d и BCL6), свидетельствующих о присутствии или отсутствии ИМП (например, инфекции, вызванной УПКП) в испытуемом. Пациентов разбивают на группы и терапию выбирают в соответствии с выявленными определенной концентрацией биомаркера (к примеру, рецептор CD1d и BCL6). Предполагается, что испытуемые с определенной концентрацией биомаркера (к примеру, рецептор CD1d и BCL6) классифицируются как имеющие ИМП (например, инфекцию, вызванную УПКП), по сравнению с контрольной группой. Те классифицируемые, что имеют повышенную концентрацию биомаркера и/или имеют ИМП, отвечают на выбранный вид лечения.The present invention provides for the detection and measurement of a biomarker (e.g., CD1d and BCL6 receptor) indicative of the presence or absence of UTI (e.g., infection caused by VAR) in a test subject. Patients are divided into groups and therapy is selected in accordance with the identified specific concentration of the biomarker (for example, the CD1d receptor and BCL6). It is assumed that subjects with a specific biomarker concentration (e.g., CD1d and BCL6 receptor) are classified as having UTI (e.g., an infection caused by VAR), compared with the control group. Those classified that have an increased biomarker concentration and / or have an UTI respond to the chosen type of treatment.

Биомаркеры (например, рецептор CD1d и BCL6) обнаруживают по одному. В другом варианте биомаркеры (например, рецептор CD1d и BCL6) обнаруживают вместе. Предполагается, что в соответствии с экспериментами, проведенными во время разработки данного изобретения, обнаружение двух биомаркеров (например, рецептор CD1d и BCL6) усиливает чувствительность в прогнозировании заболевания (например, ИМП) и классификации заболевания (например, инфекции, вызванной УПКП), чем при использовании каждого по отдельности. В определенном варианте обнаружение рецептор CD1d и BCL6 используется в сочетании с нахождением других цитокинов/хемокинов, для того, чтобы обнаружить или классифицировать заболевание.Biomarkers (e.g., CD1d receptor and BCL6) are detected one at a time. In another embodiment, biomarkers (e.g., CD1d receptor and BCL6) are detected together. It is believed that, in accordance with experiments conducted during the development of this invention, the detection of two biomarkers (e.g., CD1d and BCL6 receptor) enhances sensitivity in predicting a disease (e.g., UTI) and classifying a disease (e.g., an infection caused by VAR) than using each individually. In a specific embodiment, detection of the CD1d receptor and BCL6 is used in combination with the discovery of other cytokines / chemokines in order to detect or classify the disease.

Настоящее изобретение предлагает способы обнаружения экспрессии для биомаркера ИМП. Экспрессия измеряется напрямую (например, на уровне РНК или белка). В другом варианте экспрессию обнаруживают в образцах (например, жидкость тела, ткань, клетки и т.п.). Возможно, что экспрессию обнаруживают в жидкостях тела (например, включая, но не ограничиваясь, плазму, сыворотку, цельную кровь, слизь и мочу и соскоб влагалища). Более того, настоящее изобретение предоставляет панели и наборы для обнаружения маркеров. В предпочтительном воплощении изобретения, присутствие маркера ИМП используется для предоставления прогноза испытуемому. К примеру, обнаружение рецептора CD1d и BCL6 в образцах указывает на ИМП (например, инфекции, вызванной УПКП). Предоставленная информация также используется для определения курса лечения. Например, если у испытуемого обнаружен маркер (например,The present invention provides methods for detecting expression for a UTI biomarker. Expression is measured directly (for example, at the level of RNA or protein). In another embodiment, expression is detected in samples (e.g., body fluid, tissue, cells, etc.). It is possible that expression is found in body fluids (for example, including, but not limited to, plasma, serum, whole blood, mucus and urine, and vaginal scrapings). Moreover, the present invention provides panels and kits for detecting markers. In a preferred embodiment of the invention, the presence of an UTI marker is used to provide a prognosis to the subject. For example, detection of the CD1d and BCL6 receptors in samples indicates UTIs (e.g., infections caused by VAR). The information provided is also used to determine the course of treatment. For example, if a marker is found in the subject (e.g.

описанный здесь), указывающий на присутствие ИМП, лечение (например, анти-CD1d и про-BCL6 средствами) можно начинать немедленно вместо или в дополнение к лечению антибиотиками и/или другим видам лечения. Дополнительно, если у испытуемого обнаружена ИМП, которая не отвечает терапии антибиотиками, то данного лечения можно будет избежать.described here), indicating the presence of UTI, treatment (e.g., anti-CD1d and pro-BCL6 agents) can be started immediately instead of or in addition to antibiotic and / or other treatments. Additionally, if a subject has a UTI that does not respond to antibiotic therapy, this treatment can be avoided.

Настоящее изобретение не ограничивается маркерами, описанными выше. Может быть использован любой подходящий маркер, который коррелирует с ИМП (например, инфекцией УПКП), включая, но не ограничиваясь, другие цитокины и/или хемокины. В рамках данного изобретения также предусмотрены дополнительные маркеры. Любой подходящий метод может быть использован в обнаружении и описании маркеров, подходящих для использования в методах для настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь теми, что описаны здесь. Например, иногда маркеры обнаруживают по повышенной или пониженной регуляции при ИМП у испытуемых, или у испытуемых, которые наиболее восприимчивы к ИМП; используются в данном изобретении такие методы как микрочипы для генной экспрессии, также дополнительно описываются микрочипы, иммуногистохимия, Нозерн блот анализ, подавление с помощью сиРНК или антисмысловых РНК, анализ мутаций, исследование экспрессии с клиническим результатом, равно как и другие методы, раскрытые здесь или известные в этой научной области.The present invention is not limited to the markers described above. Any suitable marker can be used that correlates with UTI (for example, UCID infection), including but not limited to other cytokines and / or chemokines. Additional markers are also provided within the scope of this invention. Any suitable method can be used in the detection and description of markers suitable for use in the methods of the present invention, including, but not limited to those described herein. For example, sometimes markers are detected by increased or decreased regulation in UTI in subjects, or in subjects who are most susceptible to UTI; methods such as microarrays for gene expression are used in the invention, microarrays, immunohistochemistry, Northern blot analysis, siRNA or antisense RNA suppression, mutation analysis, clinical expression studies, as well as other methods disclosed here or known, are also additionally described. in this scientific field.

Данное изобретение предлагает карты для экспрессионных профилей, охватывающие профили экспрессии ИМП и/или предрасположенности к ИМП. Подобные карты можно использовать для сравнения с образцами пациентов. Сравнения могут быть сделаны при использовании любого соответствующего способа, включая, но не ограничиваясь, компьютерное сравнение цифровых данных. Сравнение данных используется для постановки диагнозов и/или прогнозов у пациентов.The present invention provides maps for expression profiles encompassing expression profiles of UTIs and / or susceptibility to UTIs. Similar cards can be used for comparison with patient samples. Comparisons can be made using any appropriate method, including, but not limited to, computer-aided comparison of digital data. Data comparison is used to make diagnoses and / or prognoses for patients.

В определенном предпочтительном исполнении обнаружение маркера ИМП осуществляется путем измерения экспрессии соответствующей мРНК в ткани или жидком образце. Измерение мРНК может осуществляться любым соответствующим методом, включая Нозерн блот, ферментное расщепление определенных структур (например, тест ИНВАДЕР, Ферд Вейв Текноложис; смотри, к примеру, патенты США 5,846,717, 6,090,543; 6,001,567; 5,985,557; и 5,994,069), гибридизация с олигонуклеотидным зондом (например, тест ТакМан (ПИ Биосистемс, Город Фостер, Калифорния; смотри, описанный в патентах США 5,962,233 и 5,538,848), и т.д. В некоторых воплощениях ПЦР с обратной транскрипцией и/или методы амплификации (например, ПЦР) используют с тем, чтобы обнаружить экспрессию РНК. В некоторых воплощениях используется методIn a specific preferred embodiment, the detection of an UTI marker is carried out by measuring the expression of the corresponding mRNA in a tissue or liquid sample. Measurement of mRNA can be carried out by any appropriate method, including Northern blot, enzymatic digestion of certain structures (for example, INVADER test, Ferd Wave Wave Technologies; see, for example, US patents 5,846,717, 6,090,543; 6,001,567; 5,985,557; and 5,994,069), hybridization with oligonucleotide for example, the TacMan test (PI Biosystems, Foster City, California; see, described in US Patents 5,962,233 and 5,538,848), etc. In some embodiments, reverse transcription PCR and / or amplification methods (e.g., PCR) are used to to detect RNA expression In some embodiments, a method is used

количественной ПЦР с обратной транскрипцией для стандартизированных смесей со сравниваемыми образцами, описанный в Патентах США 5,639,606, 5,643,765, и 5,876,978.quantitative reverse transcription PCR for standardized mixtures with reference samples described in US Patents 5,639,606, 5,643,765, and 5,876,978.

В одном из вариантов экспрессию гена для маркера ИМП обнаруживают путем измерения экспрессии соответствующего белка или полипептида. Белковая экспрессия может быть обнаружена любым подходящим способом (например, иммуногистохимией или иммуноферментным анализом).In one embodiment, gene expression for a UTI marker is detected by measuring the expression of the corresponding protein or polypeptide. Protein expression can be detected by any suitable method (e.g., immunohistochemistry or enzyme immunoassay).

В определенном исполнении связывание антитела обнаруживается способами, известными в этой области (например, радиоиммуный метод, иммуноферментный анализ, иммунный тест "сэндвич", иммунорадиометрические методы, реакции диффузионного осаждения в геле, методы иммунодиффузии, иммунологические тесты in situ (к примеру, использование коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных маркеров), Вестерн блот, реакции осаждения, методы агглютинации (например, способы агглютинации в геле, методы гемагглютинации и т.д.), методы связывания комплемента, иммунофлюоресцентные методы, тесты с белком А, методы иммуноэлектрофореза и т.д. В одном исполнении обнаружение связывания антитела осуществляется путем мечения первичного антитела. В другом воплощении первичное антитело обнаруживают путем связывания вторичного антитела или реактива с первичным антителом. В дополнительном воплощении метится вторичное антитело. В рамках данного изобретения находятся много иммунных методов связывания, известных в данной научной области.In a specific embodiment, antibody binding is detected by methods known in the art (e.g., radioimmunoassay, enzyme immunoassay, sandwich immunoassay, immunoradiometric methods, gel diffusion deposition reactions, immunodiffusion methods, in situ immunological tests (for example, the use of colloidal gold enzyme or radioisotope markers), Western blot, precipitation reactions, agglutination methods (e.g. gel agglutination methods, hemagglutination methods, etc.), complement binding methods , immunofluorescence methods, protein A tests, immunoelectrophoresis methods, etc. In one embodiment, antibody binding is detected by labeling the primary antibody. In another embodiment, the primary antibody is detected by binding of the secondary antibody or reagent to the primary antibody. In a further embodiment, the secondary antibody is labeled In the framework of this invention are many immune binding methods known in this scientific field.

В некотором воплощении используется компьютерная исследовательская программа для перевода необработанных данных клиницисту, наработанных тестами обнаружения (например, отсутствие, присутствие или количество данного маркера или маркеров) в данные с прогностическим значением. Таким образом, в некотором воплощении настоящее изобретение обеспечивает дополнительное преимущество, заключающееся в том, что клиницист, не имеющий глубоких знаний в генетике или молекулярной биологии, не нуждается в понимании необработанных данных. Данные напрямую демонстрируются клиницисту в наиболее удобной форме. Следовательно, врач способен сразу применить информацию для повышения эффективности лечения.In some embodiment, a computer research program is used to translate raw data to a clinician generated by detection tests (e.g., the absence, presence, or amount of a given marker or markers) into data with a predictive value. Thus, in some embodiment, the present invention provides an additional advantage that a clinician who does not have a thorough knowledge of genetics or molecular biology does not need to understand the raw data. Data is directly shown to the clinician in the most convenient form. Therefore, the doctor is able to immediately apply the information to increase the effectiveness of treatment.

Настоящее изобретение рассматривает любой метод, позволяющий получение, обработку и передачу информации в или из лаборатории, для выполнения тестов, обеспечения информацией медицинского персонала и больных. Например, образец (к примеру, клетка, ткань и/или образец мочи) выделяется из испытуемого и направляется в профильное учреждение (например, клиническую лабораторию в медицинском здании, геномное профильное предприятие и т.д.), расположенное в любой части мира (например, в стране отличной от той, где живет больной или где информация используется вThe present invention considers any method that allows the receipt, processing and transmission of information to or from the laboratory, to perform tests, provide information to medical personnel and patients. For example, a sample (for example, a cell, tissue and / or urine sample) is extracted from a test subject and sent to a specialized institution (for example, a clinical laboratory in a medical building, a genomic specialized enterprise, etc.) located in any part of the world (for example , in a country different from where the patient lives or where the information is used in

конечном итоге) с тем, чтобы выдать необработанные данные. В том случае, если образец включает в себя ткань или другой биологический образец, испытуемый может посетить медицинское учреждение для получения образца и отсылки его в профильный центр, или испытуемые способны собрать образцы сами (например, мочу) и напрямую выслать в профильный центр.ultimately) in order to produce raw data. In the event that the sample includes tissue or another biological sample, the subject can visit a medical institution to receive the sample and send it to the profile center, or the subjects are able to collect the samples themselves (for example, urine) and send them directly to the profile center.

В том случае, если образец включает в себя предварительно установленную биологическую информацию, эта информация может быть напрямую направлена испытуемым в профильную службу (к примеру, информационная карточка, содержащая информацию просматриваемую компьютером и данные переносятся в компьютер профильного учреждения с помощью электронной системы коммуникации). Однажды полученный профильной службой, образец обрабатывается и создается профиль (т.е. выражения данных), точный для диагностической или прогностической информации, желаемой для больного.In the event that the sample includes pre-installed biological information, this information can be directly sent to the subjects in the profile service (for example, an information card containing information viewed by a computer and data is transferred to the computer of the profile institution using an electronic communication system). Once obtained by the profile service, the sample is processed and a profile (i.e. data expression) is created that is accurate for the diagnostic or prognostic information desired by the patient.

В определенном исполнении профильные данные далее подготавливаются в формате удобном для толкования лечащим клиницистом. К примеру, подготовленный формат может показывать диагноз или оценку риска (например, ИМП, инфекцию УПКП, высокую предрасположенность к ИМП и т.д.) об испытуемом, наряду с рекомендациями для выбора точного лечения, что предпочтительнее, чем имеющиеся в наличие необработанные данные выражения. Данные могут быть показаны клиницисту любым удобным методом. Например, в некотором воплощении, профильная служба делает сообщение, которое можно распечатать для клинициста (к примеру, по месту лечения больного) или показать ему на компьютерном мониторе.In a specific implementation, the profile data is further prepared in a format convenient for interpretation by the treating clinician. For example, a prepared format may show a diagnosis or risk assessment (e.g., UTI, UTI infection, high susceptibility to UTI, etc.) about the test subject, along with recommendations for choosing the exact treatment, which is preferable to the existing unprocessed expression data . Data can be shown to the clinician by any convenient method. For example, in some embodiment, the profile service makes a message that can be printed for the clinician (for example, at the place of treatment of the patient) or shown to him on a computer monitor.

В определенном исполнении информацию сначала обрабатывают по месту лечения или в региональном учреждении. Затем необработанные данные посылаются в центральное учреждение обработки для дальнейшего анализа и/или преобразования необработанных данных в информацию полезную для клинициста или пациента. Центральное учреждение обработки обеспечивает конфиденциальность (все данные хранятся в центральном учреждении с постоянными протоколами безопасности), скорость и неизменность в обработке данных. В этом случае центральное учреждение может управлять судьбой данных после лечения пациента. К примеру, через электронную коммуникационную систему центральное учреждение может предоставлять данные клиницисту, пациенту или исследователю.In a specific implementation, the information is first processed at the place of treatment or at a regional institution. The raw data is then sent to the central processing facility for further analysis and / or conversion of the raw data into information useful to the clinician or patient. The central processing facility ensures confidentiality (all data is stored in the central office with permanent security protocols), speed and consistency in data processing. In this case, the central institution can control the fate of the data after treatment of the patient. For example, through an electronic communication system, a central agency can provide data to a clinician, patient, or researcher.

В определенном исполнении испытуемый имеет право напрямую оценивать данные, используя электронные коммуникационные системы. На основании результатов испытуемый может выбрать дополнительное медицинское вмешательство илиIn a particular performance, the subject has the right to directly evaluate data using electronic communication systems. Based on the results, the subject may choose additional medical intervention or

консультацию. Данные могут использоваться для научного исследования. Например, данные могут быть употреблены для дальнейшего улучшения определенного состояния, связанного с заболеванием, путем включения или удаления маркеров в качестве полезных показателей.consultation. Data can be used for scientific research. For example, data can be used to further improve a particular condition associated with a disease by including or removing markers as useful indicators.

В рамках изобретения предлагаются наборы для обнаружения и характеризации ИМП. В некотором воплощении наборы содержат антитела, специфичные к маркеру ИМП, в дополнение к реагентам и буферам для обнаружения маркера. В другом варианте наборы содержат реагенты, специфичные для обнаружения мРНК или кДНК (например, олигонуклеотидные зонды или праймеры). Наборы также могут содержать все компоненты, необходимые для выполнения теста обнаружения, включая контроль, руководство при выполнении тестов и любое нужное программное обеспечение для анализа и подачи результатов.Within the scope of the invention, kits for detecting and characterizing UTIs are provided. In some embodiment, the kits comprise antibodies specific for the UTI marker, in addition to reagents and buffers for detecting the marker. In another embodiment, the kits contain reagents specific for the detection of mRNA or cDNA (for example, oligonucleotide probes or primers). The kits can also contain all the components necessary for performing a detection test, including monitoring, guidance on performing tests, and any software needed to analyze and report the results.

В некотором исполнении, методы получения изображения in vivo используются для визуализации экспрессии маркеров ИМП в животном (например, человеке или другом млекопитающем). К примеру, в некотором исполнении маркерные для ИМП мРНК или белок мечутся антителом, специфичным к маркеру ИМП. Специфически связавшееся и маркированное антитело может быть обнаружено в субъекте, используя метод получения изображения in vivo, включая, но не ограничиваясь, радионуклидное изображение, позитрон-эмиссионную томографию, компьютеризированную аксиальную томографию, рентгеновский анализ или метод магнитно-резонансного изображения, флюоресцентное изображение и хемилюминисцентное изображение. Методы создания антител к маркерам ИМП в настоящем изобретении хорошо понятны. В некотором исполнении реагенты (например, антитела), специфичные к маркерам ИМП в данном изобретении, мечены флуоресцентными, хромофорными, радиоактивными метками и т.д.In some embodiments, in vivo imaging techniques are used to visualize the expression of UTI markers in an animal (eg, a human or other mammal). For example, in some embodiments, the mRNA marker or protein for UTI is labeled with an antibody specific for the UTI marker. A specifically bound and labeled antibody can be detected in a subject using an in vivo imaging method, including, but not limited to, a radionuclide image, positron emission tomography, computerized axial tomography, X-ray or magnetic resonance imaging, fluorescence image and chemiluminescent image . Methods for creating antibodies to UTI markers in the present invention are well understood. In some embodiments, reagents (e.g., antibodies) specific for UTI markers in this invention are labeled with fluorescent, chromophore, radioactive labels, etc.

Настоящее изобретение предлагает способы отбора лекарств (например, скрининг лекарств для ИМП). В настоящем изобретении методы отбора применяются для найденных маркеров ИМП, используемых в настоящем изобретении (например, включая, но не ограничивая рецептор CD1d и BCL6), или, например, методы отбора соединения (соединений), которые изменяют (к примеру, повышают или понижают) экспрессию генов-маркеров ИМП.The present invention provides drug selection methods (e.g., drug screening for UTIs). In the present invention, selection methods are applied to found UTI markers used in the present invention (for example, including but not limited to the CD1d and BCL6 receptor), or, for example, methods for selecting compounds (compounds) that change (for example, increase or decrease) expression of marker genes for UTI.

В одном способе отбора кандидатурные соединения оцениваются по их способности изменить продукцию маркера ИМП при помощи взаимодействия вещества с клеткой, экспрессирующей маркер ИМП, и затем тестирование потенциальных веществ по действию на экспрессию. В некотором исполнении, действие кандидатурного соединения на экспрессию гена к маркеру ИМП тестируется с помощью обнаруженияIn one selection method, candidate compounds are evaluated for their ability to alter the production of the UTI marker by interacting with a cell expressing the UTI marker, and then testing the potential substances for expression. In some embodiment, the effect of a candidate compound on gene expression for a UTI marker is tested by detection

концентрации мРНК и/или белка для маркера ИМП, которые клетка продуцирует.mRNA and / or protein concentrations for the UTI marker that the cell produces.

В некотором исполнении данное изобретение предоставляет способы отбора для обнаружения модуляторов, т.е. тестируемых или кандидатурных соединений или средств (например, белки, пептиды, пептидомиметики, пептоиды, молекулы малого размера или другие лекарства), которые связываются с маркерами ИМП в данном изобретении (например, рецептор CD1d и BCL6), обладают подавляющим (или стимуляторным) эффектом, к примеру, на экспрессию маркера ИМП или активность маркеров ИМП, или, к примеру, имеющие действие на экспрессию или активность субстрата к маркеру ИМП. Таким образом, соединения могут быть использованы для изменения активности продуктов для гена-мишени (например, генов для маркеров ИМП) либо прямо, либо опосредованно для лечебного протокола, с тем, чтобы детально разработать биологические функции продукта для гена-мишени или определить соединения, которые разрушают обычные для гена-мишени взаимодействия.In some embodiments, the present invention provides screening methods for detecting modulators, i.e. test or candidate compounds or agents (e.g., proteins, peptides, peptidomimetics, peptoids, small molecules, or other drugs) that bind to UTI markers in the present invention (e.g., CD1d and BCL6 receptor) have an inhibitory (or stimulatory) effect, for example, the expression of an UTI marker or the activity of an UTI marker, or, for example, having an effect on the expression or activity of a substrate for an UTI marker. Thus, the compounds can be used to change the activity of products for the target gene (for example, genes for UTI markers), either directly or indirectly for the treatment protocol, in order to develop in detail the biological functions of the product for the target gene or to determine the compounds that destroy normal interactions for the target gene.

Соединения, которые подавляют активность или экспрессию маркеров ИМП, являются полезными в лечении ИМП (например, инфекции УПКП). В некотором исполнении вещества, полезные в лечении ИМП, обнаруживают по их способности к? активации или подавлению веществ выше- или нижерасположенных по отношению к биомаркерам, описанным здесь. Любая удобная библиотека молекул может быть полезна в методах по отбору лекарств, описанных здесь, к примеру: De Witt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993); Erb et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678 (1994); Cho et al., Science 261:1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 (1994); и Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 (1994). Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (например, Houghten, Biotechniques 13:412-421 (1992)), или на бусинах (Lam, Nature 354:82-84 (1991)), чипах (Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), в бактериях или спорах (U.S. Pat. No. 5,223,409; указанный здесь по ссылке), в плазмидах (Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 (1992)) или в фагах (Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222:301 (1991)). Методы отбора лекарств могут быть выполнены in vivo или in vitro.Compounds that inhibit the activity or expression of UTI markers are useful in the treatment of UTI (e.g., UCID infection). In a certain embodiment, substances useful in the treatment of UTIs are detected by their ability to? activation or suppression of substances upstream or downstream of the biomarkers described herein. Any convenient library of molecules may be useful in the drug selection methods described herein, for example: De Witt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993); Erb et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678 (1994); Cho et al., Science 261: 1303 (1993); Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 (1994); and Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233 (1994). Libraries of compounds can be presented in solution (e.g., Houghten, Biotechniques 13: 412-421 (1992)), or on beads (Lam, Nature 354: 82-84 (1991)), chips (Fodor, Nature 364: 555-556 (1993)), in bacteria or spores (US Pat. No. 5,223,409; referenced here), in plasmids (Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89: 18651869 (1992)) or in phages (Scott and Smith, Science 249: 386-390 (1990); Devlin Science 249: 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222: 301 (1991)). Drug selection methods may be performed in vivo or in vitro.

В некотором исполнении, данное изобретение предоставляет экспрессию маркеров ИМП. К примеру, в данном изобретении используются смеси, состоящие из олигомерных антисмысловых веществ (например, сиРНК, мРНК, анти-смысловые олигонуклеотиды), особенно олигонуклеотиды (например, идентифицированные в методах, описанных выше, по отбору лекарств), для использования в модулировании функции молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих маркеры ИМП в данномIn some embodiments, the invention provides expression of UTI markers. For example, this invention uses mixtures consisting of oligomeric antisense substances (e.g., siRNA, mRNA, anti-sense oligonucleotides), especially oligonucleotides (e.g., identified in the methods described above for drug selection), for use in modulating the function of molecules nucleic acid encoding UTI markers in a given

изобретении, и, в конечном счете, модулирующие количество экспрессируемого маркера ИМП.the invention, and ultimately modulating the amount of the expressed UTI marker.

Настоящее изобретение также подразумевает создание трансгенных животных, содержащих экзогенный ген-маркер ИМП (например, рецептор CD1d и BCL6) или мутанты и их варианты (например, укорочение гена или полиморфизм отдельного нуклеотида). В предпочтительном техническом исполнении трансгенное животное показывает измененный фенотип (например, повышенный или пониженный уровни маркеров) по сравнению с животными дикого типа. Методы для анализа присутствия или отсутствия такого фенотипа включают в себя, но не ограничиваются, теми методами, что описаны здесь. В предпочтительном исполнении трансгенные мыши дополнительно демонстрируют повышенное или сниженное наличие симптомов, схожих с ИМП и/или предрасположенности к ИМП. Трансгенные животные для данного изобретения будут полезными в отборе лекарств (например, для лечения ИМП). В некотором исполнении, тестируемые соединения (к примеру, лекарство, которое, предположительно, будет полезным в лечении ИМП) и контрольные соединения (например, плацебо) вводятся в трансгенных и контрольных животных и оцениваются действия. Трансгенные животные могут быть созданы разнообразными методами, известными в научной области.The present invention also contemplates creating transgenic animals containing an exogenous UTI marker gene (e.g., CD1d and BCL6 receptor) or mutants and variants thereof (e.g., gene shortening or single nucleotide polymorphism). In a preferred technical embodiment, the transgenic animal shows an altered phenotype (e.g., elevated or decreased marker levels) compared to wild-type animals. Methods for analyzing the presence or absence of such a phenotype include, but are not limited to, those methods described herein. In a preferred embodiment, transgenic mice additionally exhibit an increased or decreased presence of symptoms similar to UTIs and / or susceptibility to UTIs. Transgenic animals for this invention will be useful in the selection of drugs (for example, for the treatment of UTI). In some embodiments, test compounds (eg, a drug that is expected to be useful in the treatment of UTIs) and control compounds (eg, placebo) are administered to transgenic and control animals and actions are evaluated. Transgenic animals can be created by a variety of methods known in the scientific field.

Экспериментальные данныеExperimental data

Пример 1Example 1

CD1d - ограниченные Т-клетки опосредуют чувствительность к УПКП in vivoCD1d - restricted T cells mediate in vivo sensitivity to VAR

Во взрослых мышах C57BL/6J (самки, в возрасте 10-12 недель) с помощью катетера была инсталлирована УПКП, в концентрации 2×10⁸ единиц, образующих колонии (CFU). Далее были собраны органы из мышей (моча, сыворотка и лимфоузлы) в различные периоды времени после впрыскивания бактерий в мочевой пузырь.In adult C57BL / 6J mice (females, 10-12 weeks old), a catheter was used to install a UCPP at a concentration of 2 × 10 ⁸ colony forming units (CFU). Then organs from mice (urine, serum, and lymph nodes) were collected at different time periods after the bacteria were injected into the bladder.

В отсутствии воспаления мочевого пузыря, согласно анализу с помощью проточной цитометрии, содержание NK 1.1-положительных Т-клеток составило около 18,8% (см. рис 1). Дальнейший анализ показал, что преимущественно NK1.1⁺ Т-клетки мочевого пузыря представлены двухнегативной (CD4^-CD8^-) популяцией Т-лимфоцитов этого органа (83±3,9%), и в меньшей степени CD4⁺ популяцией (15±2,6%).In the absence of bladder inflammation, according to flow cytometry analysis, the NK content of 1.1-positive T cells was about 18.8% (see Figure 1). Further analysis showed that predominantly NK1.1 ⁺ T-cells of the bladder are represented by a dual negative (CD4 ^- CD8 ^- ) population of T-cells of this organ (83 ± 3.9%), and to a lesser extent CD4 ⁺ population (15 ± 2, 6%).

NK1.1⁺ Т-клетки активируются в результате воспаления, вызванного УПКП через 24 часа, что было показано на проточной цитометрии по повышенной экспрессии активационных маркеров CD69, CD25, CD62L, CD44, а также хемокинового рецептора CXCR5 (см. рис. 2).NK1.1 ⁺ T cells are activated as a result of inflammation caused by VAR after 24 hours, which was shown by flow cytometry by increased expression of activation markers CD69, CD25, CD62L, CD44, as well as the chemokine receptor CXCR5 (see Fig. 2).

Наблюдение за количеством НКТ-клеток в мочевом пузыре позволило обнаружить, что инфекция, вызванная УПКП, вызывает накопление этих клеток через 24 часа после инсталляции УПКП в мочевой пузырь (см. рис. 3).Observation of the number of tubing cells in the bladder revealed that infection caused by VCPD causes the accumulation of these cells 24 hours after the installation of VCPC in the bladder (see Fig. 3).

Так как НКТ-клетки - CD1d-ограниченные, то был проведен проточно-цитометрический анализ экспрессии этого рецептора в мочевом пузыре, показавший, что уротелий ответственен за экспрессию CD1d в этом органе. Рецептор CD1d на уротелии активировался через 24 часа после введения УПКП (см. рис. 4).Since the tubing cells are CD1d-limited, a flow-cytometric analysis of the expression of this receptor in the bladder was carried out, showing that urothelium is responsible for the expression of CD1d in this organ. The urothelium CD1d receptor was activated 24 hours after the administration of the CAP (see Fig. 4).

Анализ с помощью проточной цитометрии ткани мочевых пузырей из CD1d-дефицитных мышей обнаружил снижение NK1.1⁺ Т-клеток приблизительно в 1,4 раза в отсутствии воспаления органа (см. рис. 5).Analysis by flow cytometry of bladder tissue from CD1d-deficient mice showed a decrease of NK1.1 ⁺ T cells by about 1.4 times in the absence of organ inflammation (see Fig. 5).

Анализ бактериальной нагрузки мочевого пузыря через 1 сутки после инсталляции УПКП выявил развитие резистентности к бактериальному воспалению в CD1d-дефицитных мышах по сравнению с диким типом мышей, что свидетельствует о вредоносной роли НКТ-клеток в патогенезе ИМП (см. рис. 6).An analysis of the bacterial load of the bladder 1 day after the installation of VAR showed the development of resistance to bacterial inflammation in CD1d-deficient mice compared to the wild type of mice, which indicates the harmful role of tubing cells in the pathogenesis of UTI (see Fig. 6).

Анализ экспрессии мРНК транскрипционного фактора BCL6 с помощью РТ-ПЦР в ткани мочевого пузыря на 0,5, 1, и 3 дни после впрыскивания УПКП, обнаружил падение количества мРНК BCL6 при бактериальном воспалении (см. рис. 7).Analysis of the expression of BCL6 transcription factor mRNA using RT-PCR in the bladder tissue at 0.5, 1, and 3 days after injection of VCPC revealed a decrease in the amount of BCL6 mRNA during bacterial inflammation (see Fig. 7).

Таким образом, с учетом представленного описания, в частности примеров, можно сделать вывод, что заявленный способ позволяет повысить эффективность антибактериального лечения инфекции мочевыводящих путей, благодаря предложению использовать биомаркеры ИМП для применения в диагностике, определении реакции на лечение и для терапевтического/профилактического применения.Thus, taking into account the presented description, in particular examples, we can conclude that the claimed method allows to increase the effectiveness of antibacterial treatment of urinary tract infections, thanks to the proposal to use UTI biomarkers for use in diagnosis, determination of response to treatment and for therapeutic / prophylactic use.

Claims

A method for detecting a urinary tract infection in a patient, comprising: a) receiving a sample from a patient; b) the detection of CD1d receptor expression on NKT cells and BCL6 in the bladder tissue in the indicated sample; and c) the presence of urinary tract infection is diagnosed with an increase in CD1d expression on NKT cells and a decrease in BCL6 in the bladder tissue.