RU2586482C2 - Полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его ген и способ его получения - Google Patents
Полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его ген и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2586482C2 RU2586482C2 RU2013146600/10A RU2013146600A RU2586482C2 RU 2586482 C2 RU2586482 C2 RU 2586482C2 RU 2013146600/10 A RU2013146600/10 A RU 2013146600/10A RU 2013146600 A RU2013146600 A RU 2013146600A RU 2586482 C2 RU2586482 C2 RU 2586482C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- cyanobacterial
- antibody
- recombinant
- colicin
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 131
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 130
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 8
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims abstract description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 16
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 15
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 5
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000107956 Microcystis aeruginosa FACHB-978 Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000192497 Oscillatoria Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
- C02F1/50—Treatment of water, waste water, or sewage by addition or application of a germicide or by oligodynamic treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт полипептид миметика антитела с функцией распознавания и связывания с цианобактериями, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO. 3. Также раскрыт ген, кодирующий полипептид миметика антитела. Описан полипептид с функцией анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный путем соединения указанного полипептида миметика антитела с функцией распознавания и связывания с цианобактериями с С-концом полипептида колицина, где указанный колицин выбирают из колицина Е1, Ia, Ib, А, В или N. Также описаны соответствующий ген и рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий такой ген. Описано применение данного полипептида с эвтрофикацией воды. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к использованию биотехнологии в защите окружающей среды, в частности к полипептиду анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его гену и способу его получения.
Известный уровень техники
Размножение цианобактерий и загрязнение воды, вызываемое эвтрофикацией воды, наносит наибольший вред водной среде во всем мире, приводя к большим экономическим убыткам и непоправимому ущербу биосфере Земли. Вместе с ускоренной индустриализацией и урбанизацией в результате экономического развития Китая загрязнение и деградация окружающей среды приобретают все более и более серьезный характер, и биономический контроль водной окружающей среды стал критической проблемой, требующей внимания и решения.
Современные антибактериальные агенты являются практически неэффективными против цианобактерий - прокариот (prokaryocyte), принадлежащих к типу (Phylum) X цианобактерий, домен Бактерии. В настоящее время существуют только химические реагенты на основе тяжелых металлов, например сульфат меди и т.д., позволяющие бороться с цианобактериями. Однако при практическом использовании против цианобактерий передозировка и повторное использование препаратов вследствие их ограниченного эффекта уничтожает другие полезные водоросли, водные растения, организмы и вызывает необратимое и постоянное разрушение окружающей среды, а также увеличение содержания остатков агента на основе тяжелого металла как в окружающей среде, так и в сельскохозяйственных продуктах. Поэтому существует большая потребность в разработке высокоэффективных и безопасных анти-цианобактериальных препаратов.
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гены, рекомбинантные плазмиды и полипептиды нового полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела; указанные полипептиды способны специфически уничтожать клетки цианобактерий без повреждения других клеток водорослей, растений и животных. Другой аспект настоящего изобретения заключается в создании способов получения указанных полипептидов анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.
Предусматривается гибридома с депозитарным номером CGMCC (Китайский центр общей коллекции микробиологических культур, China General Microbiological Culture Collection Center) 4783.
Также предусматривается моноклональное антитело, секретируемое указанной гибридомой.
Также предусматриваются полипептид мимика антитела с функцией распознавания и связывания цианобактерий, представляющий собой антигенсвязывающий фрагмент указанного моноклонального антитела, или малый молекулярный полипептид, сконструированный на основе функциональных участков указанного антигенсвязывающего фрагмента указанного моноклонального антитела.
Указанный полипептид мимика антитела, его аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO. 3.
Также предусматривается ген, кодирующий любой из указанных полипептидов мимиков антител.
Указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 2.
Также предусматривается полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный путем функционального и линейного соединения указанного полипептида мимика антитела, способного распознавать и связывать цианобактерии с С-концом полипептида колицина, и указанный колицин выбирают из колицина Е1, Ia, Ib, A, В или N.
Указанный полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 7.
Также предусматривается ген, кодирующий любой из указанных полипептидов анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.
Указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO. 6.
Также предусматривается рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген, кодирующий указанный полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела.
Также предусматривается способ получения указанного анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида со следующими стадиями: трансдукции гена, кодирующего полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, в систему экспрессии Е. coli, культивации подвергнутого трансдукции E. coli и выделения полипептида, экспрессируемого Е. coli.
Также предусматривается использование указанного полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела для контроль эвтрофикации воды.
Изобретение предусматривает полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный из полипептида колицина и полипептида мимика антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерии. В указанной молекуле полипептида, миметики антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерии распознают и связываются с цианобактериями, в результате чего колицин молекулы атакует распознанную клетку цианобактерии. При специфическом распознавании миметиком антитела антигена клеточной поверхности цианобактерии полипептид по изобретению атакует клетки цианобактерий без вреда для других водных организмов и без загрязнения воды, тем самым обеспечивая защиту окружающей среды и безопасную борьбу с загрязнением воды цианобактериями. Миметик антитела в полипептиде анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по изобретению представляет собой миметик антитела, способный распознавать цианобактерии и связываться с ними и сконструирован на основе аминокислотных последовательностей и нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепей антигенсвязывающего фрагмента (Fab) моноклонального антитела, секретируемого гибридомой CGMCC No. 4783, такой как антитела-мимики, хорошо известны специалистам, например одноцепочечное антитело и миметики антитела, представляющие собой малые молекулы и т.д. В соответствии с изобретением сконструированные миметики антитела должны только быть способны распознавать антиген, поскольку единственная задача миметиков антитела заключается в нацеливании рекомбинантной молекулы полипептида на клеточную поверхность мишени и создании ионного туннеля в клеточной оболочке колицином рекомбинантного полипептида, что приводит к гибели клетки-мишени вследствие вытекания внутриклеточного вещества. Таким образом, любые рекомбинантные полипептиды, сконструированные путем присоединения колицина к миметику антитела, который сконструирован на основе указанного моноклонального антитела и может распознавать антиген-мишень, будут входить в объем заявляемого изобретения.
В варианте исполнения изобретения миметик антитела представляет собой 28-пептидные миметики антитела, сконструированные путем сцепления доменов VHCDR1, VHFR2 и VLCDR3 моноклонального антитела против поверхностного антигена протопласта цианобактерий (секретируемого гибридомой CGMCC No. 4783) в порядке VHCDR1-VHFR2-VLCDR3. Эксперименты внутри и вне помещений показали, что анти-цианобактериальный полипептид, сконструированный указанными миметиками антителами, обладает биологической активностью, позволяющей ему перемещаться и автоматически искать антиген клеточной поверхности цианобактерий в воде. Пептидные миметики антитела имеют те преимущества, что их легко клонировать, экспрессировать, и обладают способностью распознавать исходное антитело; они могут уничтожать цианобактерии путем нацеливания колицина рекомбинантного полипептида на мембрану клетки-мишени для создания ионного туннеля. Указанный рекомбинантный полипептид имеет большую экологическую безопасность и безвредность для окружающей среды по сравнению с современными препаратами для борьбы с загрязнением воды (например, сульфатом меди).
В соответствии с изобретением колицин для конструирования полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела может быть выбран из колицинов Е1, Ia, Ib, А, В или N, которые могут формировать ионный канал. Рекомбинантный полипептид, сконструированный из анти-цианобактериальных миметиков антитела и колицина Ia, тестируют в примерах изобретения. Однако, обладая способностью к образованию ионного канала в клеточной оболочке цианобактерий, любой из этих колицинов, соответствующих идее изобретения, может быть линейно присоединен к анти-цианобактериальным миметикам антитела для конструирования рекомбинантного полипептида для осуществления изобретения, то есть для получения рекомбинантных полипептидов, уничтожающих цианобактерии.
Изобретение также предусматривает способ получения рекомбинантной плазмиды, содержащей ген рекомбинантного полипептида, где нуклеотидная последовательность, кодирующая миметики антитела, вставляется в С-конец колицина путем сайт-направленного мутагенеза двухцепочечных олигонуклеотидов, с образованием рекомбинантной плазмиды по изобретению. Если взять колицин Ia в качестве примера, рекомбинантная плазмида по изобретению конструируется путем вставки нуклеотидной последовательности, кодирующей миметики антитела, в сайт после аминокислоты 626 гена колицина Ia (С-конец). Исходный вектор pSELECT-1, который был приобретен у фирмы Promega Corp., содержит гены колицина Ia и иммунный белок. В Примере 1 настоящего изобретение были сконструированы несколько пар праймерных последовательностей для генов миметиков антитела. Рекомбинантную плазмиду, например pCHCcyanoMA1, готовят в соответствии с инструкцией к набору фирмы Strategene Corp. путем сайт-направленного мутагенеза двухцепочечных олигонуклеотидов.
В другом аспект изобретения, предусматривается способ получения указанного анти-цианобактериального полипептида по изобретению, где рекомбинантную плазмиду, содержащую ген, кодирующий полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, получают путем функционального сцепления гена, кодирующего миметики антитела, с геном колицина и полученную рекомбинантную плазмиду трансфицируют в подвергаемые генетическому модицированию бактерии Е. coli для получения генно-модифицированных бактериальных клеток, которые могут продуцировать полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела. Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению затем получают в результате разделения и очистки с помощью ионообменной колонки.
Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению может быть использован для борьбы с загрязнением воды. Экологически пригодные комбинации препаратов могут быть приготовлены путем прибавления векторов, эксципиентов или других альтернативных компонентов в полипептид по изобретению по следующему механизму: миметики антитела в полипептиде, которые распознают антиген клеточной поверхности цианобактерии, нацеливают колицин на клеточную оболочку цианобактерий со вставкой в нее гидрофобного фрагмента домена ионного канала колицина, с образованием ионного канала, что вызывает гибель клетки цианобактерии вследствии вытекания внутриклеточного вещества.
Указанный анти-цианобактериальный полипептид по изобретению обладает преимуществом специфичности по отношению к мишени по сравнению с традиционными анти-цианобактериальными препаратами, таким образом, он не атакует другие водорослевые, растительные и животные клетки; токсичностью и нежелательными эффектами зничительно более низкими, чем у традиционных анти-цианобактериальных препаратов. Кроме того, поскольку ионный канал формируется непосредственно в клеточной оболочке цианобактерий, приводя к гибели клеток цианобактерий, клеткам цианобактерий трудно починить геометрические повреждения клеточной оболочки путем генной мутации и экспрессии белка за короткое время, в течение которого внутриклеточное вещество вытекает через ионный канал анти-цианобактериального полипептида, вызывая гибель клетки цианобактерии. Таким образом, существует низкая вероятность того, что клетки цианобактерий выработают резистентность к препарату анти-цианобактериального полипептида по изобретению, что указывает на перспективность применения указанного анти-цианобактериального полипептида по изобретению.
Информация о депонировании гибридомы:
Номер депонирования: CGMCC No. 4783
Название при депонировании: Гибридома моноклонального антитела против антигена клеточной поверхности цианобактерий
Дата депонирования: 4 апреля 2011 г.
Депозитарная организация: Китайский центр общей коллекции микробиологических культур (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)
Адрес: No. 3, Courtyard No. 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing
Описание чертежей
Фиг. 1 - схематическое изображение структуры рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA1, содержащей гены миметиков антитела и колицина Ia.
Фиг. 2 - схематическое изображение структуры анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по настоящему изобретению.
Фиг. 3 - схематическое изображение структуры рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA2, содержащей гены миметиков антитела и колицина Ia с частично обратным порядком в направлении N-C.
Фиг. 4 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению Microcystis aeruginosa, культивируемых в жидкой среде,
где А - холостой контрольный опыт; В - 50 мкг/мл ампициллина; С - 50 мкг/мл феромона широкого спектра действия (Ph-NM); D - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (2).
Фиг. 5 - экспериментальные результаты по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Microcystis aeruginosa, культивируемых в жидкой среде,
где А - результаты обработки в течение 48 часов; В - результаты обработки в течение 72 часов; С - результаты обработки в теченеие 96 часов,
где в каждом ряду (колонка), слева направо 6 колб в следующем порядке: 1 - контроль; 2 - 0,1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 3 - 0,5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 4 - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 5 - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 6 - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1).
Фиг. 6 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде.
где в каждом ряду по 6 колб, которые подвергают обработке в течение 10 дней, слева направо, в следующем порядке: 1 - контроль; 2 - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 3 - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 4 - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 5 - 15 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); 6 - 20 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1).
Фиг. 7 - результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом (1) по изобретению Microcystis aeruginosa и Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде. Результаты для Microcystis aeruginosa представлены в верхней части, а для Scenedesmus - в нижней части.
Фиг. 8 результаты экспериментов по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus, культивируемых в жидкой среде,
где левая колба предоставляет собой контроль, а правая - 35 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1). A: Microcystis aeruginosa; В: Anabaena; С: Chlorella; D: Scenedesmus.
Фиг. 9 - результат эксперимента по ингибированию анти-цианобактериальным полипептидом по изобретению для природной воды, загрязненной цианобактериями,
где А - холостой контрольный опыт; В - 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); С - 5 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); D - 10 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 0,7 мкг/мл сульфата меди.
Фиг. 10 - некоторые результаты эксперимента по ингибированию, приведенного на Фиг. 9,
где А - изменения оптической плотности воды; В - изменения хлорофилла А в воде; С - изменения рН воды; D - изменения популяции доминирующих водорослей в воде, где D-1 - контрольная группа; D-2 - группа, обработанная 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); D-3 - группа, обработанная 0,7 мкг/мл сульфата меди.
Фиг. 11 - исследования под микроскопом (400-кратное увеличение) ингибирования анти-цианобактериальным полипептидом природной воды, загрязненной цианобактериями, на Фиг. 9,
где представлены изменения водорослей (Anabaena), обработанных контролем, 1 мкг/мл анти-цианобактериальным полипептидом (1) и 0,7 мкг/мл сульфата меди в воде в первый день (А), на второй день (В), на третий день (С), на четвертый день (D) и на пятый день (Е), соответственно.
Детальное описание
Пример 1. Конструирование плазмиды, экспрессирующей анти-цианобактериальный полипептид, и получение анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида
Материал: Гибридома CGMCC No. 4783.
Стадия 1. Получение нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности миметиков антитела: моноклональное антитело, секретируемое гибридомой, собирают и секвенируют с использованием обычных способов для получения последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи антигенсвязывающего фрагмента Fab; аминокислотная последовательность миметиков антитела была сконструирована на основе аминокислотной последовательности участков, определяющих комплементарность, как представлено в SEQ ID NO. 3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая указанные миметики антитела, приведена в SEQ ID NO. 2.
Стадия 2. Исходный вектор представляет собой плазмиду pSELECT-1 (приобретена у фирмы Promega Corp.), которая нессет гены колицина Ia и иммунный белок (указанные гены были загружены в лаборатории, где проводились эксперименты данного изобретения). Ген, кодирующий миметики анти-цианобактериального антитела (нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO. 2 в перечне последовательностей), был вставлен после сайта I626 гена колицина Ia с использованием технологии сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида (набор QuickChange™, Strategene Corp.) с получением рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA1 (представленной на Фиг. 1). Рекомбинантную плазмиду затем трансфицировали в генно-модифицированные бактерии Е. coli В834 (DE3) для получения полипептида. Был получен указанный анти-цианобактериальный полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 7 (тут и далее называемый "анти-цианобактериальный полипептид (1)") и молекулярным весом примерно 70000.
Прооцесс сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида проводили в соответствии с руководством к набору для сайт-направленного мутагенеза Strategene QuickChange (№ по каталогу 200518).
1. Приготовление реагентов для сайт-направленного мутагенеза:
5 мкл 10× буфера,
2 мкл (10 нг) плазмиды колицина Ia дикого типа,
1 мкл (125 нг) 5′-3′ сконструированных олигонуклеотидных праймеров,
1 мкл (125 нг) 5′-3′ сконструированных олигонуклеотидных праймеров,
1 мкл dNTP,
Бидистиллированная вода, 50 мкл,
1 мкл pfu (бляшкообразующая единица)
(все компоненты входят в состав набора, за исключением плазмиды, праймеров и бидистиллированной воды).
2. ПЦР-амплификация, условия амплификации: 20 циклов денатурации при 95°С в течение 35 секунд, отжиг при 53°С в течение 70 секунд и удлинение при 68°С в течение 17 минут.
3. 1 мкл эндонуклеазы Dpn 1 прибавляют к гидролизованной ДНК-цепи (37°С, 1 час); 1 мкл реагента и 50 мкл HMS174 компетентных клеток инкубируют вместе на льду в течение 30 минут и затем инкубируют на льду в течение 2 минут после теплового шока при 42°С в течение 45 секунд.
4. Прибавляют 0,5 мл культуральной среды NZY и культивируют со встряхиванием при 37°С, 220 об/мин в течение 1 часа. Наносят 50-100 мкл реагента на пластинку среды LB плюс 1% агара и 50 мкг/мл ампициллина для культивации в течение ночи при 37°С.
5. Колонии собирают после культивации в течение 18 часов. Плазмиду экстрагируют с использованием набора для экстракции фирмы Qiagene Corp. или Gibco Corp. и затем секвенируют для подтверждения успешности мутации.
6. Инкубируют 50 нг рекомбинантной плазмиды с 50 мкл приготовленных компетентных клеток Е. coli B834 (DE3) на льду в течение 30 минут и подвергают действию теплового шока при 42°С в течение 30 секунд. Прибавляют 50-100 мкл реагента с 0,5 мл культуральной среды SOC, культивируют со встряхиванием при 37°С, 220 об/мин в течение 1 часа и наносят на пластинку среды LB плюс 1% агара и 50 мкг/мл ампициллина для инкубации при 37°С в течение 12-16 часов. После этого выбирают отдельную колонию.
7. Бактерии амплифицируют в 8-16 литрах среды LB при 250 об/мин, 37°С в течение 6-8 часов. Бактерий осаждают центрифугированием при 6000×g, 4°С в течение 20 минут, ресуспендируют с 50-80 мл 50 мМ бората, 2 мМ ЭДТА (рН 9,0) при 4°С; прибавляют 250 микролитров 0,2 М PMSF (фенилметилсульфонилфторида) и обрабатывают ультразвуком при 4°С, 400 Вт в течение 2 минут. Обломки бактерий удаляют высокоскоростным ультрацентрифугированием при 4°С, 75000×g в течение 1,5 часов. Прибавляют к супернатанту стрептомицин сульфат для осаждения ДНК, диализируют в течение ночи в мешке для диаализа с молекулярным весом 15000, а также с 10 л буфера 50 мМ боратаа, 2 мМ ЭДТА, рН 9,0 при 4°С, и затем загружают на колонку СМ (Amersham Biosciences). Колонку элюируют буфером 50 мМ бората, 0,3 М NaCl, 2 мМ ЭДТА, рН 9,0 для получения анти-цианобактериального рекомбинантного полипептида (1) (см. Фиг. 2).
Использовали следующие последовательности двухцепочечных олигонуклеотидов, сконструированные для получения генов миметиков антитела в плазмиде pCHCcyanoMA1:
pCHCcyanoMA1
Пример 2. Конструирование контрольной плазмиды, экспрессирующей анти-цианобактериальный полипептид и получение контрольного анти-цианобактериального полипептида
Исходным вектором являлась плазмида pSELECT-1 (приобретенная у фирмы Promega Corp.), которая несет гены колицина Ia и иммунный белок (указанные гены загружают в лаборатории, в которой проводились эксперименты данного изобретения). Ген, кодирующий миметики анти-цианобактериального антитела (нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO. 4 в перечне последовательностей), вставляют после сайта I626 гена колицина Ia с помощью технологии сайт-направленного мутагенеза двухцепочечного олигонуклеотида (набор QuickChange™, Strategene Corp.) для получения рекомбинантной плазмиды pCHCcyanoMA2 (как представлено на Фиг. 3). Рекомбинантную плазмиду трансфицируют в генно-модифицированные бактерии Е. coli В834 (DE3) для получения полипептида. Был получен указанный анти-цианобактериальный полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO. 9 (тут и далее называемый "анти-цианобактериальный полипептид (2)") и молекулярный вес равен примерно 70000.
Последовательности двухцепочечных олигонуклеотидов для получения генов миметиков антитела в плазмиде pCHCcyanoMA2 были сконструированы и приготовлены в соответствии со способом, описанным в Примере 1.
Пример 3. Результаты экспериментов по ингибированию Microcystis aeruginosa анти-цианобактериальным полипептидом
Эксперимент (1)
Стадия 1. Получение водорослей для эксперимента: Microcystis aeruginosa FACHB-978 были приобретены в Институте гидробиологии Акадамии наук Китая.
Способ культивации водорослей: семена водорослей инокулируют с начальной плотностью клеток 5×104/мл в коническую колбу на 500 мл, содержащую 250 мл среды BG11 и помещают в освещаемый инкубатор, в котором коническую колбу закрывают газопроницаемой пленкой для предотвращения загрязнения. Водоросли культивируют при 25°С при интенсивности освещения (2500±10%) люкс и соотношении свет/тьма 12 ч/12 ч. Конические колбы встряхивают и меняют их положение через каждые 2-3 часа. Отбирают образцы и проводят тестирование через каждые 24 часа, начиная с 5-го дня после инокуляции. Следующая стадия должна быть проведена до того, как плотность клеток достигнет примерно 106/мл.
Стадия 2. Прибавляют 1 мл жидкости с приготовленными цианобактериями, соответственно, в 5 пробирок, а именно А, В, С, D и Е, и затем прибавляют следующие ингибиторы: А - холостой контрольный опыт; В - 50 мкг/мл ампициллина; С - 50 мкг/мл феромона широкого спектра действия (Ph-AM1, раскрытый в патентной заявке № CN 200910092128.4); D - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1); Е - 50 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (2). После культивации со встряхиванием с низкой скоростью в течение 12 часов в инкубаторе в 5 пробирок соответственно прибавляют акридиновый оранжевый (50 нМ) и пропидий йодид (600 нМ) для инкубации в течение 30 мин; отбирают несколько микролитров образца на слайд для наблюдения живых окрашенных цианобактерий с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon 90i с фильтром DM505 и DM565).
Результаты представлены на Фиг. 4. Результаты свидетельствуют, что только анти-цианобактериальный полипептид (1) уничтожает культивируемых Microcystis aeruginosa, в то время как ни один из анти-цианобактериального полипептида (2), ампициллина и Ph-NM не оказывает влияния на культивируемых Microcystis aeruginosa.
Эксперимент (2)
Стадия 1. Аналогична Стадии 1 Эксперимента (1).
Стадия 2. Прибавляют анти-цианобактериальные полипептиды с градиентом концентрации в 6 конических колб по 500 мл, заполненных водорослями. Прибавляют анти-цианобактериальный полипептид к Microcystis aeruginosa в дозах 0, 0,1, 0,5, 1, 5 и 10 мкг/мл. Результаты ингибирования цианобактерий наблюдают каждый день.
Результаты представлены на Фиг. 5. Поскольку концентрации анти-цианобактериального полипептида (1) в каждой группе были разными, время изменения окраски жидкости с Microcystis aeruginosa с зеленой до светло-желтой в каждой конической колбе было пропорциональным концентрации анти-цианобактериального полипептида (1). Однако визуально было определено, что Microcystis aeruginosa при всех режимах обработки может быть эффективно уничтожена за 72 часа.
Вышеописанные результаты показывают, что анти-цианобактериальный полипептид (1) способен целенаправленно уничтожать культивируемые Microcystis aeruginosa, в то время как анти-цианобактериальный полипептид (2) не демонстрирует практически никакого эффекта.
Эксперимент (3)
Материал: Scenedesmus obliqnus FACHB-417 были приобретены в Институте гидробиологии Академии наук Китая и культивировались в соответствии со способом Стадии 1 Эксперимента (1).
Стадия 2. Анти-цианобактериальный полипептид (1) прибавляют в 6 конических колб на 500 мл с водорослями с градиентом концентрации 0, 1, 5, 10, 15 и 20 мкг/мл соответственно. Наблюдения ингибирования Scenedesmus проводят каждый день.
Результаты представлены на Фиг. 6. Хотя доза анти-цианобактериального полипептида (1) была в 10 раз выше, чем при добавлении к Microcystis aeruginosa, не наблюдалось визуального эффекта уничтожения Scenedesmus анти-цианобактериальным полипептидом (1) на протяжении эксперимента (190 часов).
Эксперимент (4)
Отбирают 0,1 мл культуральной жидкости из каждой колбы экспериментов (1)-(3) и помещают в камеру для подсчета кровяных клеток для наблюдения и подсчета под микроскопом. Результаты подсчета числа клеток водорослей, приведенные на Фиг. 7, показывают, что, по сравнению с контролем, 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) может уничтожить Microcystis aeruginosa за 72 часа, в то время как 1 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) не демонстрирует практически никакого эффекта против Scenedesmus.
Пример 4. Эксперимент по применению анти-цианобактериального полипептида против Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus в жидкой культуральной среде.
Microcystis aeruginosa, Anabaena, Chlorella и Scenedesmus были приобретены в Институте гидробиологии Академии наук Китая и культивировались в соответствии со способами, описанными в Стадии 1 Эксперимента (1) Примера 3.
40 мл жидкости с водорослями с плотностью клеток 106/мл распределяют в две конические колбы на 300 мл и прибавляют соответственно А: жидкость для холостого контрольного опыта в таком же количестве, В: 35 мкг/мл анти-цианобактериального полипептида (1) и культивируют в течение 4 дней. Проводят наблюдения за ростом.
Результаты представлены на Фиг. 8. Через 24 часа окраска жидкости с водорослями Microcystis aeruginosa и Anabaena светлела, и она становилась прозрачной на четвертый день, в то время как окраска и мутность жидкости с Chlorella и Scenedesmus оставалась неизменной. Результаты показывают, что анти-цианобактериальный полипептид 1 ингибирует рост Microcystis aeruginosa и Anabaena, но не ингибирует рост Chlorella и Scenedesmus.
Вышеописанные результаты подтверждают, что анти-цианобактериальный полипептид (1) способен целенаправленно уничтожать цианобактерии.
Пример 5 Эксперимент по уничтожению цианобактерий в природной воде с помощью анти-цианобактериального полипептида
Природная вода, серьезно загрязненная цианобактериями, была взята из пруда для разведения креветок в озере Suzhou Yangcheng. Разливали по 25-35 л воды в пластиковые резервуары для разведения размером 60×40×30 см, с подачей воздуха путем продувания по 10 минут через каждые 20 мин и автоматическим поддержанием температуры 27°С, интенсивность освещения (2500±10%) люкс и соотношение свет/тьма 12 ч/12 ч. Образцы воды отбироали каждый день для определения рН, поглощения при 650 нм, и поглощения хлорофилла А (см. Фиг. 9).
Поглощение при 650 нм определяли путем помещения образца жидкости в спектрофотометр для видимой области (см. Фиг. 10).
Содержание хлорофилла А определяли спектрофотометрически с помощью метода замораживания-оттаивания горячим этанолом (hot ethanol-freeze thawing) (см. Фиг. 10). Поглощение при 650 и 700 нм определяли с помощью спектрофотометра, с расчетом концентрации хлорофилла A ([Chla]) по формуле:
[Chla]=[12,12(D664-D750)-1,58(D647-D750)-0,08(D630-D750)]VE/VS·d
Значения рН, поглощения при 650 нм и поглощения хлорофилла А в воде для контрольной группы оставались высокими на протяжении эксперимента, тогда как показатели для группы анти-цианобактериального полипептида (1) и группы сульфата меди резко снижались со второго дня.
Отбирали каждый день 30 мл образца воды, фиксировали формалином и затем концентрировали 10-кратно центрифугированием. Отбирали 0,1 мл в камеру для подсчета кровяных клеток для проведения наблюдений и подсчета под микроскопом (см. Фиг. 11). Микроскопические исследования показали, что в первый день наблюдалось большое количество цветущих Anabaena в контрольной группе, группе анти-цианобактериального полипептида (1) и группе сульфата меди; тогда как со второго дня количество Anabaena в группе анти-цианобактериального полипептида (1) и в группе сульфата меди уменьшалось и они в значительной степени фрагментировались в воде; и Anabaena не наблюдались в группе анти-цианобактериального полипептида (1) и группе сульфата меди на пятый день, но большое количество Anabaena в контрольной группе оставались живыми.
Изменения формы водорослей наблюдали под микроскопом, и подсчитывали количество различных водорослей для определения динамических изменений доминирующей популяции плавающих растений в воде (см. Фиг. 10). В контрольной группе, Anabaena и Microcystis aeruginosa были доминирующими водорослями все время; в группе анти-цианобактериального полипептида (1) количество Anabaena и Microcystis aeruginosa постепенно уменьшалось и доминирующими становились Chlorella; в группе сульфата меди количество Anabaena и Microcystis aeruginosa постепенно уменьшалось и доминирующим становились другие цианобактерии - Oscillatoria.
Таблица 1. | |
Число и изменение формы плавающих растений, обработанных анти-цианобактериальным полипептидом (/л) | |
Результаты представлены на Фиг. 9-11 и в таблице 1. Результаты показывают, что 0,7 ppm (млн-1) сульфата меди неизбирательно уничтожает все виды водорослей. Однако анти-цианобактериальный полипептид (1) целенаправленно ингибирует рост цианобактерий (Anabaena, Microcystis aeruginosa) в воде, но лишь незначительно влияет на рост другого фитопланктона.
Claims (10)
1. Полипептид миметика антитела с функцией распознавания и связывания с цианобактериями, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 3.
2. Ген, кодирующий полипептид миметика антитела по п. 1.
3. Ген по п. 2, нуклеотидная последовательность которого приведена в SEQ ID NO:2.
4. Полипептид с функцией анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, сконструированный путем соединения указанного полипептида миметика антитела с функцией распознавания и связывания с цианобактериями по п. 1, с С-концом полипептида колицина, где указанный колицин выбирают из колицина Е1, Ia, Ib, А, В или N.
5. Полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 4, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 7.
6. Ген, кодирующий полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 4 или 5.
7. Ген по п. 6, нуклеотидная последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 6.
8. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий ген, кодирующий полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 4 или 5.
9. Способ получения полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 4 или 5, включающий стадии: трансформации гена, кодирующего полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 6 или 7, в систему экспрессии Е. coli, культивации трансформированных Е. coli, и выделения полипептида по п. 4 или 5, экспрессируемого Е. coli.
10. Применение указанного полипептида анти-цианобактериального рекомбинантного антитела по п. 4 или 5 для борьбы с эвтрофикацией воды.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110100775.2 | 2011-04-21 | ||
CN201110100775 | 2011-04-21 | ||
CN201110155221.2A CN102747041B (zh) | 2011-04-21 | 2011-06-10 | 抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法 |
CN201110155221.2 | 2011-06-10 | ||
PCT/CN2012/073120 WO2012142899A1 (zh) | 2011-04-21 | 2012-03-27 | 抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013146600A RU2013146600A (ru) | 2015-05-27 |
RU2586482C2 true RU2586482C2 (ru) | 2016-06-10 |
Family
ID=47027533
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013146600/10A RU2586482C2 (ru) | 2011-04-21 | 2012-03-27 | Полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его ген и способ его получения |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9359429B2 (ru) |
EP (1) | EP2700710A4 (ru) |
JP (1) | JP6082729B2 (ru) |
KR (1) | KR101628867B1 (ru) |
CN (1) | CN102747041B (ru) |
AU (1) | AU2012244925B2 (ru) |
BR (1) | BR112013026999A2 (ru) |
CA (1) | CA2833793C (ru) |
PE (1) | PE20140607A1 (ru) |
RU (1) | RU2586482C2 (ru) |
SG (1) | SG194220A1 (ru) |
WO (1) | WO2012142899A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201307784B (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9200251B1 (en) | 2011-03-31 | 2015-12-01 | David Gordon Bermudes | Bacterial methionine analogue and methionine synthesis inhibitor anticancer, antiinfective and coronary heart disease protective microcins and methods of treatment therewith |
CN103159856B (zh) | 2011-12-08 | 2015-02-25 | 畿晋庆三联(北京)生物技术有限公司 | 一种制备新型抗生素的方法及依据该方法的平台系统 |
CN111165492B (zh) * | 2020-01-10 | 2021-05-28 | 南京大学 | 乙酰丙酮在抑制蓝藻生长中的应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0789998A (ja) | 1993-09-27 | 1995-04-04 | Mitsubishi Kagaku B C L:Kk | 抗ミクロシスチンモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ |
JPH1057055A (ja) * | 1996-08-21 | 1998-03-03 | Shin Nippon Kishiyou Kaiyo Kk | アオコ原因微生物のミクロキスティス(Microcystis)属をモノクローナル抗体で識別する方法 |
KR20040097406A (ko) * | 2003-05-12 | 2004-11-18 | 바디텍메드 주식회사 | 현장검사용 마이크로시스틴 바이오센서 및 측정장치 |
CN1256589C (zh) * | 2004-07-15 | 2006-05-17 | 上海交通大学 | 定量检测赤潮异弯藻的间接酶联免疫吸附试验方法 |
JP2008220255A (ja) * | 2007-03-12 | 2008-09-25 | ▲復▼旦大学 | 藻類毒素の防除方法 |
CN101429507A (zh) * | 2008-12-18 | 2009-05-13 | 中国农业科学院原子能利用研究所 | 一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用 |
CN101633699B (zh) * | 2009-09-02 | 2012-02-15 | 畿晋庆堂国际生物技术有限公司 | 一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用 |
CN103159856B (zh) * | 2011-12-08 | 2015-02-25 | 畿晋庆三联(北京)生物技术有限公司 | 一种制备新型抗生素的方法及依据该方法的平台系统 |
-
2011
- 2011-06-10 CN CN201110155221.2A patent/CN102747041B/zh active Active
-
2012
- 2012-03-27 SG SG2013078100A patent/SG194220A1/en unknown
- 2012-03-27 CA CA2833793A patent/CA2833793C/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-27 US US14/113,188 patent/US9359429B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-27 EP EP12773570.2A patent/EP2700710A4/en not_active Withdrawn
- 2012-03-27 WO PCT/CN2012/073120 patent/WO2012142899A1/zh active Application Filing
- 2012-03-27 KR KR1020137030940A patent/KR101628867B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-03-27 JP JP2014505491A patent/JP6082729B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-27 BR BR112013026999A patent/BR112013026999A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-03-27 PE PE2013002363A patent/PE20140607A1/es not_active Application Discontinuation
- 2012-03-27 RU RU2013146600/10A patent/RU2586482C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-03-27 AU AU2012244925A patent/AU2012244925B2/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-10-18 ZA ZA2013/07784A patent/ZA201307784B/en unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAGATA et al., "Novel monoclonal antibodies against microcystin and their protective activity for hepatotoxicity", Nat. Toxins, 1995, 3 (2), 78-86, реферат. CASCALES et al., "Colicin Biology", Microbiology and molecular biology reviews, 2007, 158-229. РОЙТ и др, "Иммунология", Пер с англ.- М.: Мир, 2000, 592 с., стр.110-111. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101628867B1 (ko) | 2016-06-09 |
CA2833793C (en) | 2016-08-16 |
WO2012142899A1 (zh) | 2012-10-26 |
EP2700710A4 (en) | 2014-10-08 |
AU2012244925B2 (en) | 2016-04-21 |
US20140170170A1 (en) | 2014-06-19 |
EP2700710A9 (en) | 2014-11-26 |
EP2700710A1 (en) | 2014-02-26 |
AU2012244925A1 (en) | 2013-11-07 |
US9359429B2 (en) | 2016-06-07 |
JP6082729B2 (ja) | 2017-02-15 |
RU2013146600A (ru) | 2015-05-27 |
CN102747041B (zh) | 2014-07-16 |
BR112013026999A2 (pt) | 2016-11-29 |
KR20140145951A (ko) | 2014-12-24 |
JP2014513939A (ja) | 2014-06-19 |
ZA201307784B (en) | 2015-05-27 |
SG194220A1 (en) | 2013-11-29 |
CA2833793A1 (en) | 2012-10-26 |
PE20140607A1 (es) | 2014-05-07 |
CN102747041A (zh) | 2012-10-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Romanowska-Duda et al. | The effect of toxic cyanobacteria (blue-green algae) on water plants and animal cells | |
Harding et al. | Cyanobacteria in South Africa: a review | |
US8586830B2 (en) | Ioslated TT1 polynucleotide, encoded proteins and vectors for increasing tolerance of plants and microbes to abiotic stresses and the use thereof | |
RU2586482C2 (ru) | Полипептид анти-цианобактериального рекомбинантного антитела, его ген и способ его получения | |
Parrow et al. | The Sexual Life Cycles of Pfiesteria Piscicida and Cryptoperidiniopsoids (DINOPHYCEAE) 1 | |
Jimel et al. | Annual Cycle of Mat‐Forming Filamentous Alga Tribonema cf. minus (Stramenopiles, Xanthophyceae) in Hydro‐Terrestrial Habitats in the High Arctic Revealed By Multiparameter Fluorescent Staining | |
Aray-Andrade et al. | Short-term deleterious effects of standard isolation and cultivation methods on new tropical freshwater microalgae strains | |
Kurtović et al. | Rediscovering Chara as a model organism for molecular and evo-devo studies | |
TWI551685B (zh) | Anti - cyanobacteria recombinant antibody polypeptide and its gene and preparation method | |
Telfer | A survey of Phytophthora in a beech forest in Norway | |
Tracy | Development and validation of gene delivery methods for Crassostrea virginica | |
Greeff-Laubscher et al. | Development of an eDNA Approach as a Novel Technique for the Early Detection of Aquatic Fungal Diseases-Causing Agents in the Environment | |
Park et al. | Detection of fish killing dinoflagellates Cochlodinium polykrikoides and Karlodinium veneficum (Dinophyceae) in the East China Sea by real-time PCR | |
Lawson | Development of eDNA techniques for the detection of Trachemys scripta in aquatic samples and detection of prey items (Danio rerio) in Trachemys scripta fecal samples | |
Khatiwada | Prevalence and distribution of marine Phytophthora and Halophytophthora in seagrass habitats in Victoria, Australia” | |
Emtyazjoo et al. | Diagnosis toxogenic Saxitoxin Cyanobacteria by molecular method in Amir Kalayeh Lagoon–Iran | |
Carnicer Castaño | Spatio-temporal distribution, physiological characterization and toxicity of the marine dinoflagellate Ostreopsis (Schmidt) from a temperate area, the Ebre Delta. Phylogenetic variability in comparison with a tropical area, Reunion Island | |
Hameed et al. | Detection of some cytotoxin genes in local isolate of Oscillatoria (Cyanophyta) | |
Noronha | Characterization of Microalgal Viruses from Aquatic Systems | |
Ngeiywa et al. | Isolation of Antibiotic Vibrionaceae Bacteria from a Community Marine Silvo-Fishery Farm along Mtwapa Creek, Kenya | |
McArthur | Identification of an Unknown Intracellular Organism in Karenia brevis | |
Dryden | Predation of cyanobacteria by acanthamoeba spp | |
Gray | Detection And Quantification Of Karenia Brevis By Carbon Fixation Gene Expression Analysis | |
Boneillo et al. | Competition for organic resources: bacteria versus Aureococcus anophagefferens | |
Ball | A Morphological and Molecular Approach to the Study of Planktonic Protist Phylogenetics with a Focus on Taxa from Old Woman Creek National Estuarine Research Reserve |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HE9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
HE9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190328 |