RU2584594C1

RU2584594C1 - Inactivated split influenza vaccine and preparation method thereof

Info

Publication number: RU2584594C1
Application number: RU2015126582/15A
Authority: RU
Inventors: Виктор Павлович Трухин; Станислав Викторович Петровский; Сергей Александрович Аракелов; Дмитрий Геннадьевич Быков; Анатолий Эдуардович Евтушенко; Станислав Валентинович Уйба; Виталий Николаевич Грановский; Наталья Николаевна Савина
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2016-05-20
Also published as: NI201700158A; WO2017003322A1

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to a method of producing agent for treating influenza, including influenza virus infection of chicken embryos, incubation of embryos, cooling of embryos, collecting virus-containing allantoic liquid (VAL), processing of VAL for purpose of disaggregation and subsequent inactivation, VAL micro filtration, VAL ultrafiltration and purification of viral concentrate. Group of inventions also concerns agent for treating influenza, which is obtained using said method.

EFFECT: group of inventions provides preparing vaccine, which antigenic activity exceeding such ensured by “Vaksigripp” vaccine.

2 cl, 3 dwg, 8 ex, 6 tbl

Description

Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная и способ ее получения (далее - изобретение) относится к иммунологии, медицине, фармакологии, и касается производства инактивированных гриппозных вакцин, которые могут быть использованы для вакцинации населения России против гриппа.Inactivated split influenza vaccine and method for its preparation (hereinafter referred to as the invention) relates to immunology, medicine, pharmacology, and relates to the production of inactivated influenza vaccines that can be used to vaccinate the Russian population against influenza.

В настоящее время для вакцинации против гриппа используется 2 типа вакцин: инактивированные вакцины и «живые» вакцины. В свою очередь инактивированные вакцины подразделяются на цельновирионные, расщепленные, субъединичные и виросомальные. Значительную часть на мировом рынке инактивированных вакцин занимают расщепленные вакцины. Это обусловлено тем, что эти вакцины обладают высокой иммуногенностью, как и цельновирионные вакцины, однако их реактогенность существенно ниже цельновирионных вакцин. Субъединичные вакцины обладают очень низкой реактогенностью, однако их иммуногенность уступает иммуногенности расщепленных гриппозных вакцин.Currently, 2 types of vaccines are used for influenza vaccination: inactivated vaccines and live vaccines. In turn, inactivated vaccines are divided into whole-virion, split, subunit and virosomal. A significant part of the global market for inactivated vaccines is occupied by split vaccines. This is due to the fact that these vaccines have high immunogenicity, like whole-virion vaccines, but their reactogenicity is significantly lower than whole-virion vaccines. Subunit vaccines have a very low reactogenicity, however, their immunogenicity is inferior to the immunogenicity of split influenza vaccines.

В настоящее время известно несколько средств, предназначенных для лечения гриппа и соответственно способов производства этих средств.Currently, several agents are known for treating influenza and, accordingly, methods for producing these agents.

В патенте РФ №2283139, дата опубликования 10.09.2006 г описывается средство и способ получения расщепленных антигенов. В описании технологического процесса для разрушения очищенных вирионов используется детергент β-октилглюкозид и окончательная очистка антигенов осуществляется методом хроматографии на носителе Сефадекс-50 фирмы «GE» (Швеция). Инактивация вирусной активности проводится на стадии разведения вирусного концентрата методом облучения ультрафиолетом. Согласно этому способу очистка вирионов осуществляется последовательной комбинацией метода сорбции - элюции на формализированных куриных эритроцитов и метода хроматографической очистки. Однако используемая технология очистки вирионов не позволяет воспроизводить параметры очистки из-за нестандартности куриных эритроцитов, а также описанный метод хроматографии не всегда эффективен для очистки вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с большим содержанием разрушенных клеток. Носитель Сефадекс-50, используемый на стадии окончательной очистки антигена не эффективен для разделения гриппозных антигенов и овальбумина, вследствие не оптимального предела отсечения самого носителя. Инактивация с использованием ультрафиолетового облучения не всегда позволяют получить воспроизводимый результат, так как в случае высоко агрегированных вирусных концентратов не все вирусные частицы подвергаются действию облучения. Соответственно средство обладает повышенным риском реактогенности у вакцинированных людей, а также опасностью остаточной инфекционности в готовой лекарственной форме вакцины.In the patent of the Russian Federation No. 2283139, publication date 09/10/2006, describes a tool and method for producing split antigens. In the description of the technological process, β-octylglucoside detergent is used to destroy the purified virions and the final cleaning of antigens is carried out by chromatography on a Sephadex-50 carrier from GE (Sweden). Inactivation of viral activity is carried out at the stage of dilution of the viral concentrate by ultraviolet irradiation. According to this method, virions are purified by a sequential combination of the sorption method — elution on formalized chicken red blood cells and the chromatographic purification method. However, the virion purification technology used does not allow reproducing the purification parameters due to the non-standard nature of chicken red blood cells, and the described chromatography method is not always effective for purification of virus-containing allantoic fluid (IMPORTANT) with a high content of destroyed cells. The Sephadex-50 carrier used at the stage of final antigen purification is not effective for the separation of influenza antigens and ovalbumin, due to the not optimal cutoff limit of the carrier itself. Inactivation using ultraviolet radiation does not always provide a reproducible result, since in the case of highly aggregated viral concentrates, not all viral particles are exposed to radiation. Accordingly, the tool has an increased risk of reactogenicity in vaccinated people, as well as the risk of residual infectivity in the finished dosage form of the vaccine.

В патенте РФ №2535153, дата опубликования 10.12.2014 описывается средство и способ получения высокоочищенного вирусного концентрата с использованием методов обработки вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) полиэлектролитом ПЭГ 6000 для снижения процесса агрегации с последующей микрофильтрацией на 2 каскадах картриджей (диаметр пор 10 мкм и 1 мкм), ультрафильтрацией на кассетах с порогом отсечения 300 КилоДальтон и окончательной очисткой вируса в градиенте плотности сахарозы. Для дальнейшего производства инактивированных гриппозных вакцин из концентратов, полученных данным способом необходимо проводить инактивацию вирусной активности с использованием метода ультрафиолетового облучения, как и в предыдущем способе, что существенно снижает его привлекательность. В качестве электролита в данном изобретении используется раствор полиэтиленгликоля-6000 в достаточно высокой концентрации. Это вещество является безвредным и применяется в медицинской промышленности, однако его стоимость достаточно высока, и с учетом тех количеств, которые используются для обработки ВАЖ в данном изобретении, применение этого реагента существенно увеличивает себестоимость. Кроме того, на основании этого патента можно получить только очищенный вирусный концентрат, а не лекарственную форму вакцины против гриппа. Для получения лекарственной формы вакцины необходим дополнительный блок технологии разрушения, выделения, и очистки вирусных антигенов. При этом получаемое средство обладает опасностью остаточной инфекционности в готовой лекарственной форме вакцины.RF patent No. 2535153, publication date 12/10/2014, describes a tool and method for producing a highly purified viral concentrate using methods for treating virus-containing allantoic fluid (VAL) with PEG 6000 polyelectrolyte to reduce aggregation followed by microfiltration on 2 stages of cartridges (pore diameter 10 μm and 1 microns), by ultrafiltration on cassettes with a cut-off threshold of 300 KiloDalton and final purification of the virus in a sucrose density gradient. For the further production of inactivated influenza vaccines from concentrates obtained by this method, it is necessary to inactivate viral activity using the ultraviolet irradiation method, as in the previous method, which significantly reduces its attractiveness. As an electrolyte in this invention, a solution of polyethylene glycol-6000 in a sufficiently high concentration is used. This substance is harmless and is used in the medical industry, however, its cost is quite high, and taking into account the quantities that are used to process the IMPORTANT in this invention, the use of this reagent significantly increases the cost. In addition, based on this patent, you can get only purified viral concentrate, and not the dosage form of the flu vaccine. To obtain the dosage form of the vaccine, an additional block of technology for the destruction, isolation, and purification of viral antigens is required. Moreover, the resulting product has the risk of residual infectivity in the finished dosage form of the vaccine.

Согласно рекомендациям ВОЗ инактивацию вирусной активности при производстве инактивированных гриппозных вакцин предпочтительно проводить на ранних стадиях технологического процесса, в частности при обработке ВАЖ. Для этих целей используют различные дезактивационные реагенты, и, прежде всего, раствор β-пропиолактона. Согласно данным литературы обработка этим реагентом не приводит к нарушению иммунохимической структуры антигенов гриппа. Соответственно, при этой обработке не меняется набор протективных эпитопов (иммунокомпетентность) в составе поверхностных антигенов (гемагглютинин, нейроминидаза). Кроме того, не нарушаются функциональные свойства гемагглютинина, а именно осуществлять фузию с плазматической мембраной клетки. В свою очередь, путь процессинга антигена гемагглютинина в антиген-представляющей клетке иммунной системы человека соответствует таковому для натурального вируса гриппа, и таким образом позволяет индуцировать клеточный иммунитет при вакцинации препаратом, полученным с использованием β-пропиолактона в качестве инактиватора. (A. Huckrade, 2012). Таким образом, использование β-пропиолактона для инактивации ВАЖ позволяет получать дезактивированный материал на ранних стадиях производства, что резко снижает объем жидких отходов, подлежащих инактивации. Кроме того, полученный таким образом антиген гемагглютинин обладает более высоким протективным потенциалом, чем аналогичные антигены, полученные с использованием формалина или ультрафиолетового облучения. Следует также отметить, что на стадии обработки ВАЖ при правильном подборе компонентов β-пропиолактон гарантированно осуществляет инактивацию вирусной активности в течении нескольких часов, тогда как использование ультрафиолетового облучения на стадии разбавленного ОВК не всегда приводит к 100% инактивации. В настоящее время за рубежом β-пропиолактон уже используется при производстве гриппозных вакцин, однако в России до настоящего времени не было апробированной технологии по применению этого реагента для производства отечественных препаратов против гриппа.According to WHO recommendations, the inactivation of viral activity in the production of inactivated influenza vaccines is preferably carried out in the early stages of the technological process, in particular during the processing of IMPORTANT VALVES. For these purposes, various decontamination reagents are used, and, above all, a solution of β-propiolactone. According to the literature, treatment with this reagent does not violate the immunochemical structure of influenza antigens. Accordingly, during this treatment, the set of protective epitopes (immunocompetence) in the composition of surface antigens (hemagglutinin, neurominidase) does not change. In addition, the functional properties of hemagglutinin are not impaired, namely, to carry out a fusion with the plasma membrane of the cell. In turn, the processing pathway of the hemagglutinin antigen in the antigen-presenting cell of the human immune system corresponds to that for the natural influenza virus, and thus allows inducing cellular immunity during vaccination with a preparation obtained using β-propiolactone as an inactivator. (A. Huckrade, 2012). Thus, the use of β-propiolactone to inactivate the IMPACT allows one to obtain deactivated material in the early stages of production, which drastically reduces the volume of liquid waste to be inactivated. In addition, the hemagglutinin antigen thus obtained has a higher protective potential than similar antigens obtained using formalin or ultraviolet radiation. It should also be noted that at the stage of processing the IMPORTANT, with the correct selection of components, β-propiolactone is guaranteed to inactivate viral activity for several hours, while the use of ultraviolet radiation at the stage of diluted HVA does not always lead to 100% inactivation. Currently, β-propiolactone is already used abroad in the production of influenza vaccines, however, in Russia there has not yet been a proven technology for the use of this reagent for the production of domestic anti-flu drugs.

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются средства и способы описанные в патентах РФ №2493872, дата опубликования 27.09.2013 г; и РФ №2523614 (Вакцина против гриппа и способ ее получения), дата опубликования 20.07.2014, которые мы считаем прототипами предлагаемого изобретения.Closest to the proposed invention are the means and methods described in the patents of the Russian Federation No. 2493872, date of publication September 27, 2013; and the Russian Federation No. 2523614 (Vaccine against influenza and method for its production), publication date 07/20/2014, which we consider to be the prototypes of the invention.

Первый прототип (патент РФ №2493872) описывает средство и способ очистки вирусов гриппа с использованием микрофильтрации и ультрафильтрации (без использования формализированных куриных эритроцитов). Для микрофильтрации используются картриджи с очень маленьким диаметром пор (0,45+0,22 мкм). Ультрафильтрация проводится на кассетах с пределом отсечения 300-500 КилоДальтон. Очищенный таким образом вирус далее дополнительно очищается методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. В данном патенте не описывается способ инактивации вируса гриппа, однако из текста описания изобретения следует, что процесс инактивации будет проводиться уже после стадии получения очищенного вирусного концентрата. Следует отметить, что использование в процессе микрофильтрации картриджей с диаметром пор 0,45+0,22 мкм как правило приводит к быстрому засорению этих картриджей при очистке ВАЖ, так как в результате размножения вирусов и разрушения клеток куриных эмбрионов в ВАЖ присутствует большое количество дебрисных культур различных размеров. Таким образом, из-за неоптимального размера пор срок эксплуатации вышеуказанных картриджей очень незначителен. Кроме того, если засорение картриджей происходит в производственном процессе очистки ВАЖ, то их замена - приводит к нарушению условий стерильности технологического процесса, и создает большие проблемы с логистикой. Поэтому, в мировой литературе описанные картриджи с более крупными размерами пор для микрофильтрации ВАЖ. В частности, в патенте РФ №2535153 описано применение каскада картриджей 10 мкм и 1 мкм, которые позволяют очищать от дебриса значительные объемы ВАЖ.The first prototype (RF patent No. 2493872) describes a means and method of purification of influenza viruses using microfiltration and ultrafiltration (without the use of formalized chicken red blood cells). For microfiltration, cartridges with a very small pore diameter (0.45 + 0.22 μm) are used. Ultrafiltration is carried out on cassettes with a cutoff limit of 300-500 KiloDalton. The virus purified in this way is then further purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient. This patent does not describe a method for inactivating the influenza virus, however, it follows from the text of the description of the invention that the inactivation process will be carried out after the stage of obtaining the purified viral concentrate. It should be noted that the use of cartridges with a pore diameter of 0.45 + 0.22 μm in the microfiltration process usually leads to a fast clogging of these cartridges during the cleaning of the IMPORTANT, since as a result of the multiplication of viruses and destruction of chicken embryonic cells, a large number of debris cultures are present various sizes. Thus, due to the non-optimal pore size, the life of the above cartridges is very short. In addition, if the clogging of the cartridges occurs in the production process of cleaning the IMPORTANT, then replacing them leads to a violation of the sterility conditions of the process, and creates big problems with logistics. Therefore, in the world literature described cartridges with larger pore sizes for microfiltration of IMPORTANT. In particular, the patent of the Russian Federation No. 2535153 describes the use of a cascade of cartridges of 10 μm and 1 μm, which allows you to clean from debris significant volumes of IMPORTANT.

Второй прототип (патент РФ №2523614) описывает средство и способ получения расщепленной вакцины против вируса гриппа с использованием методов осветления (центрифугирования), микрофильтрации, концентрирования, расщепления концентрата вируса гриппа с последующей ультрафильтрацией полученного вирусного лизата. Особенностью данного патента является использование нейтральных или основных аминокислот, а также натрия хлорида в концентрации 0,3-2,0 Моля в качестве стабилизаторов. В данном патенте не указывается на какой стадии и каким способом производится инактивация вирусной активности. В описании к этому патенту указывается, что для расщепления очищенных вирионов используются различные детергенты (катионные, анионные, и неионные). Однако далеко не все детегенты позволяют выделять антигены гемагглютинина и нейроминидазы с полным сохранением их иммунокомпетентности. В частности, наиболее известный и доступный анионный детергент N-лаурилсаркозинат Na у некоторых серотипов вируса гриппа вызывает деструкцию гемагглютинина и резко снижает его антигенную и иммуногенную активность. Другой известный неионный детергент Тритон Х-100 является очень мягким для разрушения вирусов гриппа реагентом, однако он очень плохо отделяется от выделенных антигенов в процессе их очистки. Поэтому выбор оптимального детергента для разрушения вируса является основной частью технологии производства современных гриппозных инактивированных вакцин. Кроме того, в данном патенте описаны способы стабилизации выделенных антигенов с использованием различных аминокислот в конечных концентрациях до 0,5 М, или же детергентом твином 80 до конечной концентрации до 0,2%. Однако известно, что некоторые аминокислоты являются биологически активными веществами и в высоких концентрациях (до 0,5 М) могут быть реактогенными при массовой вакцинации людей. Кроме того, эти реагенты в случае применения на различных стадиях технологического цикла могут существенно увеличить себестоимость технологии. В отношении детергента твин-80 следует отметить, что по данным литературы, этот детергент используется как стабилизатор только в концентрации 1%, и нет оснований предполагать, что это вещество в концентрации 0,2% будет эффективным стабилизатором как в процессе расщепления и очистки антигенов, так и в составе конечной лекарственной формы. Соответственно полученное лекарственное средство обладает опасностью остаточной инфекционности в готовой лекарственной форме вакцины, а также опасностью проявления повышенной реактогенности при вакцинации людей.The second prototype (RF patent No. 2523614) describes a means and method of obtaining a split vaccine against influenza virus using methods of clarification (centrifugation), microfiltration, concentration, cleavage of the influenza virus concentrate, followed by ultrafiltration of the resulting viral lysate. A feature of this patent is the use of neutral or basic amino acids, as well as sodium chloride in a concentration of 0.3-2.0 mol as stabilizers. This patent does not indicate at what stage and in what way the inactivation of viral activity is performed. The description of this patent indicates that various detergents (cationic, anionic, and nonionic) are used to cleave the purified virions. However, far from all detergents make it possible to isolate hemagglutinin and neurominidase antigens with complete preservation of their immunocompetence. In particular, the most well-known and affordable anionic detergent N-lauryl sarcosinate Na in some serotypes of the influenza virus causes destruction of hemagglutinin and sharply reduces its antigenic and immunogenic activity. Another well-known non-ionic detergent Triton X-100 is a very mild reagent for the destruction of influenza viruses, but it is very poorly separated from the released antigens during their cleaning. Therefore, the selection of the optimal detergent for the destruction of the virus is the main part of the technology for the production of modern influenza inactivated vaccines. In addition, this patent describes methods for stabilizing isolated antigens using various amino acids in final concentrations up to 0.5 M, or with Tween 80 detergent to a final concentration up to 0.2%. However, it is known that some amino acids are biologically active substances and in high concentrations (up to 0.5 M) can be reactogenic with mass vaccination of people. In addition, these reagents, if used at different stages of the technological cycle, can significantly increase the cost of the technology. With respect to the tween-80 detergent, it should be noted that according to the literature, this detergent is used as a stabilizer only at a concentration of 1%, and there is no reason to believe that this substance at a concentration of 0.2% will be an effective stabilizer as in the process of splitting and purification of antigens, and as part of the final dosage form. Accordingly, the obtained drug has the danger of residual infectivity in the finished dosage form of the vaccine, as well as the danger of increased reactogenicity when vaccinating people.

В результате многолетних экспериментов проведенных авторами этого изобретения, было установлено, что наиболее оптимальными подходами для получения инактивированной расщепленной вакцины является использование дезинфектанта β-пропиолактона для инактивации вирусной активности на стадии обработки ВАЖ; для предотвращения агрегации вирионов в процессе очистки наиболее оптимальным представляется использование хлористого натрия в конечной концентрации 0,22 М; для хроматографической очистки выделенных антигенов наиболее эффективно использование носителя Bio-bad 40/100/sec, фирмы Bio works (Швеция) и стабилизацию полученных моновакцин, а также стабилизацию тривалентной лекарственной формы вакцины следует проводить с использованием детергента Тритон Х-100 до конечной концентрации 100-300 мкг/мл. Вышеизложенные подходы легли в основу данного изобретения.As a result of many years of experiments conducted by the authors of this invention, it was found that the most optimal approaches for producing an inactivated cleavage vaccine is to use a β-propiolactone disinfectant to inactivate viral activity at the stage of processing IMPORTANT; to prevent aggregation of virions during the cleaning process, the most optimal is the use of sodium chloride in a final concentration of 0.22 M; For chromatographic purification of the isolated antigens, it is most effective to use the Bio-bad 40/100 / sec carrier, Bio works (Sweden) and stabilize the obtained monovaccines, as well as stabilize the trivalent dosage form of the vaccine using the Triton X-100 detergent to a final concentration of 100- 300 mcg / ml. The above approaches formed the basis of this invention.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке новой технологии для производства российской инактивированной расщепленной вакцины, которая позволит производить в нашей стране вакцину с мировым уровнем качества.The problem to which the present invention is directed is to develop a new technology for the production of Russian inactivated split vaccine, which will make it possible to produce a vaccine in our country with a world level of quality.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке промышленного способа получения расщепленной вакцины и средства на ее основе, которую можно будет использовать для массовой вакцинации населения России. Поэтому получаемый результат отличается от вышеизложенных прототипов степенью очистки выделенных антигенов, более высоким уровнем их иммунокомпетентности а также более высокой эффективностью представленной технологииThe technical result of the invention is to develop an industrial method of obtaining a split vaccine and funds based on it, which can be used for mass vaccination of the population of Russia. Therefore, the result obtained differs from the above prototypes in the degree of purification of the isolated antigens, their higher level of immunocompetence, and also the higher efficiency of the presented technology

Объектом изобретения является способ получения расщепленной вакцины и средство на его основе, включающий в себя заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию зараженных эмбрионов, охлаждение инкубированных эмбрионов, сбор ВАЖ, обработку ВАЖ с целью дезагрегации и инактивации, микрофильтрацию ВАЖ на 2 каскадах картриджей, ультрафильтрацию ВАЖ и очистку вирусного концентрата в градиенте плотности сахарозы. Расщепление очищенного инактивированного вирусного концентрата проводится детергентом бета-октил-глюкозидом, удаление недоразрушенных вирионов и значительной части комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком проводится методом ультрацентрифугирования, окончательная очистка выделенных антигенов проводится на хроматографическом носителе, и в полученную моновакцину добавляется стабилизатор.The object of the invention is a method for producing a split vaccine and an agent based on it, which includes infection of chicken embryos with influenza virus, incubation of infected embryos, cooling of incubated embryos, collecting IMPORTANT, processing IMPORTANT for the purpose of disaggregation and inactivation, microfiltration of IMPORTANT on 2 stages of cartridges, ultrafiltration of IMPORTANT and purification of the viral concentrate in a sucrose density gradient. The cleavage of the purified inactivated viral concentrate is carried out with the beta-octyl glucoside detergent, the removal of the undeveloped virions and a significant part of the complexes of ribonucleoproteins with the membrane protein is carried out by ultracentrifugation, the final purification of the isolated antigens is carried out on a chromatographic carrier, and a stabilizer is added to the obtained monovaccine.

Отличие предлагаемого способа от прототипа заключается в том, что инактивацию вирусной активности мы проводим на стадии обработки ВАЖ с использованием дезинфектанта бета-пропиолактона, дезагрегацию вирусов при обработке ВАЖ проводим хлористым натрием в конечной концентрации 0,22 Моля, финальную очистку антигенов проводим на хроматографическом носителе WorkBeads 40/100/sec фирмы Bio Works (Швеция), а стабилизацию моновакцины, а также тривалентной лекарственной формы проводим с использованием детергента Тритон Х-100 в концентрации 100-300 мкг/мл.The difference between the proposed method and the prototype is that we carry out the inactivation of viral activity at the stage of processing the IMPORTANT using a beta-propiolactone disinfectant, disaggregate the viruses during the processing of the IMPORTANT by sodium chloride in a final concentration of 0.22 mol, the final cleaning of antigens is carried out on a WorkBeads chromatographic medium 40/100 / sec from Bio Works (Sweden), and we stabilize the mono-vaccine and the trivalent dosage form using the Triton X-100 detergent at a concentration of 100-300 μg / ml.

Заявляемый способ получения состоит из нескольких технологических этапов:The inventive method of obtaining consists of several technological steps:

1 этап заключается в получении ВАЖ, и состоит из нескольких стадий: получение куриных эмбрионов, их дезинфекцию, предварительную инкубацию, заражение рабочим раствором посевного вируса, инкубация зараженных эмбрионов, охлаждение после инкубации, сбор ВАЖ и очистка ВАЖ.Stage 1 consists in obtaining IMPORTANT, and consists of several stages: obtaining chicken embryos, their disinfection, pre-incubation, infection with a working solution of seed virus, incubation of infected embryos, cooling after incubation, collection of IMPORTANT and purification of IMPORTANT.

1.1. Получение куриных эмбрионов (КЭ)1.1. Obtaining chicken embryos (CE)

Яйцо инкубационное поступает на участок инкубации в соответствии с договором поставки. После проведения входного контроля яйцо, оплодотворенное закладывают в инкубатор, или предварительно прогретый до 37,5°С. Проводят инкубацию в течение 10-11 дней при температуре (37,9±0,2)°С и относительной влажности (54±2)%.The hatching egg enters the incubation site in accordance with the supply contract. After the input control, the fertilized egg is laid in an incubator, or preheated to 37.5 ° C. An incubation is carried out for 10-11 days at a temperature of (37.9 ± 0.2) ° C and relative humidity (54 ± 2)%.

На 10-й день полученные куриные эмбрионы (КЭ) выгружают из инкубатора и проводят контроль жизнеспособности КЭ с помощью специального прибора-овоскопа. Куриные эмбрионы по 36 штук в пластиковых лотках помещают в телеги транспортные стеллажные (ТТС), загружают в транспортное средство и передаю на стадию 1.2.On the 10th day, the obtained chicken embryos (CE) are unloaded from the incubator and the CE viability is monitored using a special ovoscope device. 36 pieces of chicken embryos in plastic trays are placed in transport carts (TTS), loaded into a vehicle and transferred to stage 1.2.

1.2 Дезинфекция КЭ1.2 Disinfection of TBE

Общее время (с выгрузки ТТС до аэрозольной камеры) - около 30 мин. Перед дезинфекцией проводят подготовку аэрозольной камеры: прогревают до температуры 32°С. За один раз в камеру загружают не более 18 телег с КЭ. Дезинфекцию КЭ проводят методом распыления дезинфицирующего раствора 1% раствор дезинфектанта Оксония Актив, производство фирмы «Ecolab», Италия. Распыление осуществляется с помощью 2-х генераторов «холодного тумана». Дезинфицированные КЭ выгружают в термальную камеру для дополнительного инкубирования КЭ.The total time (from unloading the TTS to the aerosol chamber) is about 30 minutes. Before disinfection, an aerosol chamber is prepared: it is heated to a temperature of 32 ° C. At one time, no more than 18 FE carts are loaded into the camera. CE disinfection is carried out by spraying a disinfecting solution with a 1% Oxonium Active disinfectant solution, manufactured by Ecolab, Italy. Spraying is carried out using 2 “cold fog” generators. Disinfected TB cells are discharged into the thermal chamber for additional TB incubation.

1.3. Предварительная инкубация1.3. Pre-incubation

Полученные КЭ, со стадии 1.2, дополнительно инкубируют следующим образом: КЭ помещают в термальную камеру при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности (55±5)%, и выдерживают не менее 12 ч.The obtained CEs, from stage 1.2, are additionally incubated as follows: CEs are placed in a thermal chamber at a temperature of (37.5 ± 0.5) ° С and relative humidity (55 ± 5)%, and incubated for at least 12 hours

1.4 Заражение КЭ1.4 TB infection

Процесс заражения КЭ, проводится в асептических условиях. Емкость с рабочим раствором посевного вируса подсоединяется через фильтрующий элемент Medisart к линии заражения (инокулятору), производства фирмы Rame-Hart, США.The process of TBE infection is carried out under aseptic conditions. The container with the working solution of the seed virus is connected through the Medisart filter element to the infection line (inoculator), manufactured by Rame-Hart, USA.

Для дезинфекции используют 70% этиловый спирт. Этим дезинфектантом проводят обработку скорлупы КЭ и игл во время процесса заражения. На инокуляторе устанавливают платы заражения (иглы с пробойниками, стерилизованные в автоклаве при температуре (126±2)°С и давлении пара (1,5±0,2) кгс/см² в течение (30+2) мин.), устанавливают давление сжатого воздуха (35±5) кПа, после чего происходит проверка/настройка дозы. Производительность автоматической линии заражения - 30000 КЭ в час. Тележки с КЭ из термальной камеры выкатывают к машине инокулятора для предстоящего заражения. В начале работы пластиковые лотки с КЭ устанавливают на конвейер машины. Далее пластиковые лотки передвигаются по конвейеру, проходя дезинфекцию 70% этиловым спиртом, а после чего происходит заражение. В каждый КЭ вводят по (0,20±0,02) мл рабочего разведения посевного вируса. Контроль объема дозы вводимого вируса осуществляют каждые 30-40 мин. Иглы плат заражения автоматически проходят дезинфекцию 70% этиловым спиртом после каждого прокола скорлупы КЭ. После выхода лотков с зараженными КЭ проводится их визуальный выборочный контроль. Проконтролированные КЭ передают на стадию 1.5.70% ethanol is used for disinfection. This disinfectant treats the CE shell and needles during the infection process. Infection boards are installed on the inoculator (needles with punches sterilized in an autoclave at a temperature of (126 ± 2) ° С and steam pressure (1.5 ± 0.2) kgf / cm ² for (30 + 2) min.), Set compressed air pressure (35 ± 5) kPa, after which the dose is checked / adjusted. The productivity of an automatic infection line is 30,000 CE per hour. Carts with FE from the thermal chamber are rolled out to the inoculator machine for the forthcoming infection. At the beginning of the work, plastic trays with FE are installed on the conveyor of the machine. Further, the plastic trays move along the conveyor, undergoing disinfection with 70% ethyl alcohol, and then infection occurs. In each TBE, (0.20 ± 0.02) ml of working dilution of the inoculum virus is administered. The control of the dose volume of the introduced virus is carried out every 30-40 minutes. The needles of the infection cards are automatically disinfected with 70% ethyl alcohol after each puncture of the CE shell. After the release of trays with infected CEs, their visual selective control is carried out. The controlled FEs are passed to stage 1.5.

1.5 Инкубация зараженных КЭ1.5 Incubation of infected TBE

Куриные эмбрионы, зараженные вирусом гриппа, инкубируют в технологическом режиме (температура, относительная влажность) в соответствии с режимами, указанными в паспортах на штамм. Для вирусов гриппа типа А продолжительность инкубации, как правило, составляет от 36 до 46 ч, а для вирусов типа В - от 50 до 62 ч и при относительной влажности от 55 до 65%. После инкубирования зараженные КЭ передают на стадию 1.6.Chicken embryos infected with the influenza virus are incubated in the technological mode (temperature, relative humidity) in accordance with the regimes indicated in the passports for the strain. For type A influenza viruses, the incubation time, as a rule, is from 36 to 46 hours, and for type B viruses, from 50 to 62 hours and at a relative humidity of 55 to 65%. After incubation, infected CEs are passed to step 1.6.

1.6 Охлаждение КЭ после инкубации1.6 Cooling CE after incubation

Охлаждение КЭ осуществляется в холодильной камере в течение от 12 до 20 ч при температурном режиме (4±2)°С. После охлаждения КЭ осуществляют сбор ВАЖ на стадии 1.7.CE is cooled in a refrigerating chamber for 12 to 20 hours at a temperature of (4 ± 2) ° С. After cooling, the CE collects the IMPORTANCE at stage 1.7.

1.7 Сбор ВАЖ1.7 Collection of IMPORTANT

Сбор ВАЖ осуществляется с помощью автоматической линии для сбора аллантоисной жидкости (харвестер) производства фирмы «Rame-Hart», США. На этой линии в автоматическом режиме осуществляют декапитацию КЭ, их визуальную отбраковку (погибшие КЭ, инкубационный брак, бой) и сбор ВАЖ в асептических условиях. Собранную ВАЖ с помощью перистальтических насосов «Watson-Marlow» 720 S перекачивают в реактор вместимостью 800 литров. Перед началом сбора ВАЖ реактор охлаждают с использованием воды и охлаждающего устройства до конечной температуры в реакторе (6±2)°С.The collection of VAZh is carried out using an automatic line for collecting allantoic fluid (harvester) manufactured by Rame-Hart, USA. On this line, CEs are automatically decapitated, their visual rejection (dead CEs, incubation defects, battle) and collection of IMPORTANT under aseptic conditions are performed. The collected IMPORTANT using Watson-Marlow 720 S peristaltic pumps is pumped into a 800 liter reactor. Before starting the collection of the IMPORTANT, the reactor is cooled using water and a cooling device to a final temperature in the reactor of (6 ± 2) ° С.

1.8 Обработка ВАЖ1.8 IMPORTANCE

По окончании сбора ВАЖ включают мешалку со скоростью 40 об/мин, с помощью перистальтического насоса «Watson-Marlow» модель 720 S добавляют стерильный раствор 2,5 М NaCl до конечной концентрации 0,22 М. Перешивают содержимое реактора в течение (30±2) мин при температуре (6±2)°С. Далее в этот же реактор добавляют β-пропиолактон до конечной концентрации 0,1% для инактивации вируса и содержимое еще раз перемешивают в течении 1-2 часов при температуре (6±2)°С. После перемешивания мешалку отключают и содержимое реактора инкубируют в течение (16±2) ч при температуре (6±2)°С.At the end of the collection, the IMPORTANT turn on the stirrer at a speed of 40 rpm, using a Watson-Marlow model 720 S peristaltic pump, add a sterile solution of 2.5 M NaCl to a final concentration of 0.22 M. The contents of the reactor are altered for (30 ± 2 ) min at a temperature of (6 ± 2) ° С. Next, β-propiolactone is added to the same reactor to a final concentration of 0.1% to inactivate the virus, and the contents are again mixed for 1-2 hours at a temperature of (6 ± 2) ° С. After stirring, the mixer is turned off and the contents of the reactor are incubated for (16 ± 2) h at a temperature of (6 ± 2) ° С.

2 этап заключается в очистки ВАЖ методами микро- и ультрафильтрацией и очистке полученного концентрата ВАЖ методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.Stage 2 consists in purifying the IMPORTANT by micro- and ultrafiltration methods and purifying the obtained IMPORTANT concentrate by ultracentrifugation in a sucrose density gradient.

2.1 Очистка и концентрирование ВАЖ микро- и ультрафильтрацией2.1 Purification and concentration of the IMPORTANT by micro- and ultrafiltration

Работу проводят на совмещенной установке микро- и ультрафильтрации с соблюдением правил асептики в зоне ламинарного потока. После обработки и инактивации ВАЖ из реактора с помощью перистальтического насоса «Watson-Marlow» модель 720 S, подают на установку микрофильтрации и пропускают через 2 каскада глубинных фильтров с диаметрами пор 5 мкм и 1 мкм соответственно в стерильную емкость вместимостью 16-20 л. Полученную в результате микрофильтрации осветленную ВАЖ с помощью перистальтического насоса «Watson-Marlow», модель 720 S, подают на установку ультрафильтрации с кассетными модулями Pellicon 2 Biomax-300 с пределом отсечения 300 кДа, для концентрирования ВАЖ. Концентрируют осветленную ВАЖ в 10-15 раз. Допустимое значение давления на в процессе ультрафильтрации не должно превышать 0,5 бар. Процесс микрофильтрации и процесс ультрафильтрации проводят при комнатной температуре. Полученный концентрат в объеме 20-40 литров передают на следующую стадию очистки.The work is carried out on a combined micro and ultrafiltration unit in compliance with aseptic rules in the laminar flow zone. After processing and inactivation of the IMPORTANT from the reactor using a Watson-Marlow peristaltic pump model 720 S, they are fed to a microfiltration unit and passed through 2 stages of depth filters with pore diameters of 5 μm and 1 μm, respectively, into a sterile container with a capacity of 16-20 l. The clarified IVA obtained by microfiltration using a Watson-Marlow model 720 S peristaltic pump is fed to an ultrafiltration unit with Pellicon 2 Biomax-300 cassette modules with a cutoff limit of 300 kDa to concentrate the IMPORTANT. Concentrate clarified IMPORTANT 10-15 times. The permissible pressure value during ultrafiltration should not exceed 0.5 bar. The microfiltration process and the ultrafiltration process are carried out at room temperature. The resulting concentrate in a volume of 20-40 liters is transferred to the next stage of purification.

2.2 Очистка и концентрирование вируса гриппа в градиенте плотности сахарозы2.2 Purification and concentration of influenza virus in sucrose density gradient

В ротор ультрацентрифуги К2, производства фирмы «Альфа-Вассерман» (США) загружают стерильный фосфатный буферный раствор, рН=7,2 (ФБР) и 60% раствор сахарозы при температуре (4±2)°С. После разгона ротора до (34000±1000) об/мин в ротор с помощью перистальтического насоса «Watson-Marlow» модель 520 S со скоростью (10±1) л/мин подают концентрат ВАЖ со стадии 2.1. По окончании прохождения всего объема концентрированной ВАЖ в ротор центрифуги подают ФБР и проводят центрифугирование в течение (2,0±0,5) ч. Весь процесс проводят при температуре охлаждения ротора (4±2)°С. После окончания центрифугирования ультрацентрифугу останавливают и производят разгрузку полученных фракций инактивированного вирусного концентрата (ВК) в стерильном боксе. Далее собирают 20 фракций содержащегося в роторе градиента плотности сахарозы: первые две фракции, объемом по 200 мл, последующие - по 100 мл. Из каждого флакона отбирают пробу объемом 5 мл для контроля гемагглютинирующей активности и % содержания сахарозы. После взятия пробы каждый флакон закрывают силиконовой пробкой и помещают в холодильник на хранение при температуре (5+3)°С до 3 суток.In the rotor of the K2 ultracentrifuge manufactured by Alfa-Wasserman (USA), sterile phosphate buffer solution, pH = 7.2 (FBI) and a 60% sucrose solution are loaded at a temperature of (4 ± 2) ° С. After the rotor is accelerated to (34000 ± 1000) rpm, the WAG concentrate from stage 2.1 is supplied to the rotor using the Watson-Marlow model 520 S peristaltic pump at a speed of (10 ± 1) l / min. At the end of the passage of the entire volume of concentrated IMPORTANT, the FBI is fed into the centrifuge rotor and centrifuged for (2.0 ± 0.5) hours. The whole process is carried out at a rotor cooling temperature of (4 ± 2) ° С. After centrifugation is completed, the ultracentrifuge is stopped and the obtained fractions of the inactivated virus concentrate (VK) are unloaded in a sterile box. Then 20 fractions of the sucrose density gradient contained in the rotor are collected: the first two fractions, with a volume of 200 ml, the subsequent ones with 100 ml each. A 5 ml sample was taken from each vial to control hemagglutinating activity and% sucrose. After sampling, each bottle is closed with a silicone stopper and placed in the refrigerator for storage at a temperature of (5 + 3) ° С for up to 3 days.

Для дальнейшей обработки используются фракции инактивированного ВК, обладающие титром ГА не менее 1:8000 и содержащие (35-48)% сахарозы, которые хранят в фармацевтическом морозильнике при температуре от -10 до -20°С в течении не более 3 месяцев.For further processing, inactivated VK fractions are used that have a GA titer of at least 1: 8000 and contain (35-48)% sucrose, which are stored in a pharmaceutical freezer at a temperature of from -10 to -20 ° C for no more than 3 months.

3 этап включает в себя расщепление инактивированных вирусных концентратов, микро- и ультрафильтрацию полученного лизата, осаждение недоразрушенных вирионов методом ультрацентрифугирования, концентрирование супернатанта, хроматографическая очистка и стерилизующая фильтрация моновакцины.Stage 3 includes the cleavage of inactivated viral concentrates, micro- and ultrafiltration of the obtained lysate, precipitation of the undeveloped virions by ultracentrifugation, concentration of the supernatant, chromatographic purification and sterilizing filtration of monovaccine.

3.1 Расщепление инактивированного вирусного концентрата3.1 Cleavage of inactivated viral concentrate

Фракции инактивированного вирусного концентрата со стадии 2.2 в необходимом количестве за 15-18 ч до работы помещают для размораживания в холодильную камеру при температуре (5±3)°С. Выбранные фракции ВК объединяют в стерильной бутыли вместимостью 16 л, с соблюдением правил асептики. Расщепление инактивированного ВК проводят с использованием детергента Октилглюкозид. Количество добавляемого детергента рассчитывают по содержанию белка в вирусном концентрате.Fractions of the inactivated viral concentrate from stage 2.2 in the required amount 15-18 hours before work are placed for thawing in a refrigerator at a temperature of (5 ± 3) ° С. The selected VK fractions are combined in a sterile bottle with a capacity of 16 l, in compliance with aseptic rules. The cleavage of inactivated VC is carried out using the octyl glucoside detergent. The amount of detergent added is calculated by the protein content of the viral concentrate.

Определение оптимального соотношения детергент/белок проводят для каждого серотипа отдельно при смене производственного штамма или смене партии детергента. Определение осуществляется следующим образом: в полипропиленовые пробирки, объемом 2 мл помещают 1 мл исследуемого объединенного инактивированного ВК, разбавленный до концентрации белка (1±0,2) мг/мл ФБР.The determination of the optimal detergent / protein ratio is carried out for each serotype separately when changing the production strain or changing the lot of detergent. The determination is carried out as follows: in polypropylene tubes, a volume of 2 ml is placed 1 ml of the investigated combined inactivated VC, diluted to a protein concentration of (1 ± 0.2) mg / ml FBI.

В 4 пробирки с раствором разбавленного ВК добавляют по 0,5 мл концентрированного раствора октилглюкозида таким образом, чтобы в смеси содержалось 5 мг детергента, 7 мг детергента, 10 мг детергента и 15 мг детергента (соотношение 5:1, 7:1, 10:1, 15:1). Растворы тщательно перемешивают, и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В 5-ю пробирку вместо детергента добавляют ФБР. После инкубации во всех пробах (включая контрольную без детергента) определяют содержание гемагглютинина. Выбирается минимальное соотношение, при котором количество определенного гемагглютинина было максимальным.0.5 ml of a concentrated solution of octyl glucoside are added to 4 test tubes with a solution of diluted VK so that the mixture contains 5 mg of detergent, 7 mg of detergent, 10 mg of detergent and 15 mg of detergent (ratio 5: 1, 7: 1, 10: 1, 15: 1). The solutions are thoroughly mixed and incubated for 30 minutes at room temperature. Instead of the detergent, the FBI is added to the 5th test tube. After incubation in all samples (including control without detergent), the hemagglutinin content is determined. The minimum ratio is selected at which the amount of specific hemagglutinin is maximum.

Рассчитанную навеску детергента растворяют в ФБР и добавляют полученный раствор β-октилглюкозида в стеклянную бутыль с вместимостью 10-16 л с объединенным инактивированном ВК Затем в горловину бутыли вставляют верхнеприводную электрическую мешалку и проводят расщепление ВК при скорости вращения мешалки (130±10) об/мин в течение (1,0±0,2) ч. Полученный лизат передают на следующую стадию очистки.The calculated weighed portion of the detergent is dissolved in the FBI and the resulting β-octyl glucoside solution is added to a glass bottle with a capacity of 10-16 L with a combined inactivated VC. Then, an overhead electric stirrer is inserted into the neck of the bottle and the VC is split at a stirrer rotation speed (130 ± 10) rpm within (1.0 ± 0.2) hours. The resulting lysate is passed to the next purification step.

3.2 Микро- и ультрафильтрация полученного лизата3.2 Micro and ultrafiltration of the resulting lysate

Лизат фильтруют через установку микрофильтрации с картриджами с размером пор 10 мкм. Остатки материала вытесняют ФБР. Профильтрованный лизат подают на ультрафильтрационную установку с кассетами с пределом отсечения 30 кДа. Проводят технологической процесс (концентрирование материала) при давлении (0,7±0,1) МПа. Конечный объем концентрированного лизата - 5 л.The lysate is filtered through a microfiltration unit with cartridges with a pore size of 10 μm. Residuals displace the FBI. The filtered lysate is fed to an ultrafiltration unit with cartridges with a cutoff limit of 30 kDa. Carry out the technological process (concentration of the material) at a pressure of (0.7 ± 0.1) MPa. The final volume of concentrated lysate is 5 l.

3.3 Осаждение недоразрушенных вирионов3.3 Precipitation of undestructed virions

Недоразрушенные вирионы из вирусного лизата осаждают методом ультрацентрифугирования на оборудовании фирмы «Thermo Fisher Scientific» модель Sorvall Lynx 6000.Undeveloped virus lysate virions are precipitated by ultracentrifugation on Sorvall Lynx 6000 model using Thermo Fisher Scientific equipment.

С помощью перистальтического насоса «Watson Marlow» модель 720 N в ротор центрифуги закачивают 5 л ФБР режиме протока жидкости со скоростью (15±1) л/час. Далее этим же насосом подают в ротор концентрированный лизат со стадии 3.2. и разгоняют ротор до скорости 18000 об/мин. Скорость пропускания материала через ротор - (5±1) л/час, после чего вытесняют материал 5 литрами ФБР. Супернатант и ФБР после вытеснения материала объединяют в 16 литровой бутыли и передают на следующую стадию очистки.Using a Watson Marlow peristaltic pump, model 720 N, a 5 L FBI is pumped into the centrifuge rotor during fluid flow at a speed of (15 ± 1) l / h. Then, the concentrated lysate from step 3.2 is fed into the rotor by the same pump. and accelerate the rotor to a speed of 18000 rpm The speed of transmission of material through the rotor is (5 ± 1) l / h, after which the material is displaced with 5 liters of FBI. The supernatant and the FBI after displacing the material are combined in a 16 liter bottle and transferred to the next stage of purification.

3.4 Ультрафильтрация супернатанта3.4 Ultrafiltration of the supernatant

Ультрафильтрацию супернатанта (концентрирование материала) проводят на установке ультрафильтрации, как это указано в п. 3.2. Концентрирование супернатанта проводят до конечного объема 2,0 л. Полученный продукт переносят в стерильную стеклянную емкость и передают на стадию 3.5 хроматографической очистки.Ultrafiltration of the supernatant (concentration of the material) is carried out at the ultrafiltration unit, as described in paragraph 3.2. Concentration of the supernatant is carried out to a final volume of 2.0 L. The resulting product is transferred into a sterile glass container and transferred to stage 3.5 chromatographic purification.

3.5. Хроматографическая очистка сконцентрированного супернатанта3.5. Chromatographic purification of concentrated supernatant

Для очистки сконцентрированного супернатанта используют хроматографический носитель для эксклюзивной хроматографии (гельфильтрации) «WorkBeads» 40/100, производство фирмы «Bio-Works», Швеция (информация о носителе представлена на сайте компании производителя: . раздел: Life scienses).For purification of the concentrated supernatant, a WorkBeads 40/100 chromatographic carrier for exclusive chromatography (gel filtration) is used, manufactured by Bio-Works, Sweden (information on the carrier is available on the manufacturer's website:. Section: Life scienses).

Гельфильтрацию проводят на производственной колонке из стекла аксиального сжатия (BPG 200/950, 30 л). На колонку объемом 15 л носителя с помощью перистальтического насоса наносят сконцентрированный супернатант в объеме 2 л. Хроматографию ведут со скоростью 10 л/ч буфером ФБР и с применением ультрафиолетового детектора К-200 производства фирмы «Knaur», Германия. Регистрацию данных детектора проводят на персональном компьютере с системой МультиХром. Пик очищенного материала начинает выходить после вытеснения свободного объема, при этом процесс сопровождается резким повышением оптической плотности на 280 нм. Сбор материала останавливают после падения оптической плотности до 30-40 единиц и выхода хроматограммы на фазу плато. Объем концентрата после прохождения через колонку увеличивается на 20-30%.Gel filtration is carried out on an axial compression glass production column (BPG 200/950, 30 L). A concentrated supernatant in a volume of 2 l is applied to a column with a volume of 15 l of the carrier using a peristaltic pump. Chromatography is carried out at a speed of 10 l / h with FBI buffer and using an ultraviolet detector K-200 manufactured by Knaur, Germany. Registration of the detector data is carried out on a personal computer with the MultiChrom system. The peak of the purified material begins to emerge after displacement of the free volume, while the process is accompanied by a sharp increase in optical density by 280 nm. Material collection is stopped after the optical density drops to 30-40 units and the chromatogram reaches the plateau phase. The volume of concentrate after passing through the column increases by 20-30%.

Полученный материал передают на стадию 3.6.The resulting material is passed to stage 3.6.

3.6. Стерилизующая фильтрация моновакцины3.6. Sterilizing Mono-Vaccine Filtration

Очищенный от детергента материал со стадии 3.5 передают на стерилизующую фильтрацию.The material purified from the detergent from step 3.5 is transferred to sterilizing filtration.

В заранее подготовленный к работе реактор объемом 50 л заливают очищенный супернатант, добавляют ФБР до содержания суммарного белка 400-500 мкг/мл; 1% раствор мертиолята в количестве, обеспечивающем его конечную концентрацию 100 мкг/мл. Далее перемешивают со скоростью 200-220 об/мин в течение 15-20 мин при комнатной температуре.The purified supernatant is poured into a 50 L reactor prepared for operation, the FBI is added until the total protein content is 400-500 μg / ml; 1% solution of merthiolate in an amount providing its final concentration of 100 μg / ml. Then stirred at a speed of 200-220 rpm for 15-20 minutes at room temperature.

Далее сведенную моновакцину фильтруют через одноразовый фильтрующий элемент типа «Sartobran» 0,2 мкм, площадь фильтрации 0,2 м² или через капсулу со схожими техническими характеристиками в одноразовый стерильный пластиковый контейнер типа Flexboy (фирма Sartorius, Германия) вместимостью 20 л.Next, the consolidated mono-vaccine is filtered through a 0.2 μm Sartobran type disposable filter element, 0.2 m ² filtration area, or through a capsule with similar technical characteristics into a disposable sterile plastic container of the Flexboy type (Sartorius, Germany) with a capacity of 20 l.

Полученную стерильную моновакцину транспортируют в фармацевтические холодильники и хранят при температуре (5±3)°С не более 6 месяцев. Проводят контроли полученной вакцины по показателям: специфическая активность, содержание белка, подлинность, содержание овальбумина, содержание бактериальных эндотоксинов, стерильность.The obtained sterile monovaccine is transported to pharmaceutical refrigerators and stored at a temperature of (5 ± 3) ° C for no more than 6 months. The vaccine obtained is monitored according to the following indicators: specific activity, protein content, authenticity, ovalbumin content, bacterial endotoxin content, sterility.

Этап 4 - включает в себя сведение компонентов вакцины, стерилизующая фильтрация вакцины, розлив препарата в ампулы, маркировку и упаковку.Stage 4 - includes mixing the components of the vaccine, sterilizing the filtration of the vaccine, filling the drug into ampoules, labeling and packaging.

4.1 Сведение компонентов вакцины4.1 Vaccine Component Mixing

Процесс включает в себя сведение моновакцин 3-х типов вирусов гриппа A(H₁N₁), A(H₃N₂) и В, с 1% раствором детергента Тритон Х-100, 1% раствором мертиолята и ФБР в реакторе вместимостью 200 л.The process involves mixing monovaccines of 3 types of influenza viruses A (H ₁ N ₁ ), A (H ₃ N ₂ ) and B, with a 1% solution of Triton X-100 detergent, 1% solution of merthiolate and FBI in a reactor with a capacity of 200 l

Полуфабрикаты моновакцины трех различных штаммов вируса гриппа: типа A(H₁N₁), типа A(H₃N₂) и типа В, прошедшие все контроли, из стерильных одноразовых контейнеров в асептических условиях загружают в реактор.Semi-finished products of a single vaccine of three different strains of the influenza virus: type A (H ₁ N ₁ ), type A (H ₃ N ₂ ) and type B, having passed all the controls, from sterile disposable containers under aseptic conditions are loaded into the reactor.

Далее в реактор добавляют расчетные количества ФБР, 1% раствора мертиолята до конечной концентрации (85-115) мкг/мл, и 1% раствора детергента Тритона Х-100 до конечной концентрации 100-300 мкг/мл. Содержимое реактора перемешивают в течение 15 мин. Процесс сведения лекарственной формы проводят при комнатной температуре. Далее проводят стерилизующую фильтрацию перемешанного раствора.Then, the calculated amounts of PBS, 1% solution of thiolate to a final concentration of (85-115) μg / ml, and 1% solution of Triton X-100 detergent to a final concentration of 100-300 μg / ml are added to the reactor. The contents of the reactor are stirred for 15 minutes. The process of mixing the dosage form is carried out at room temperature. Next, sterilized filtration of the mixed solution is carried out.

4.2 Стерилизующая фильтрация лекарственной формы вакцины4.2 Sterilizing filtration of the vaccine dosage form

Шланг, монтированный на выходном штуцере реактора в асептических условиях подсоединяют к штуцеру на входе фильтровального элемента. Другой стерильный шланг одним концом подсоединяют к штуцеру на выходе фильтровального элемента, а другим - соединяют с входным портом стерильного пластикового мешка объемом 200 л. Фильтруют через одноразовый фильтрующий элемент типа Sartobran 0,2 мкм, площадь фильтрации 0,45 м². Из заполненного стерильного мешка в асептических условиях отбирают пробу для анализа специфической активности, содержания белка, содержание мертиолята. На каркас с контейнером, содержащим полуфабрикат вакцины, наклеивают этикетку с указанием наименования вакцины, № серии, и даты фильтрации. Контейнер с полуфабрикатом тривакцины транспортируют в цех «Готовые лекарственные формы». Хранение контейнера с полуфабрикатом лекарственной формы препарата проводится в холодильной камере при температуре от 2 до 8°С не более 14 суток. После прохождения контролей контейнер со стерильным полуфабрикатом передается для розлива в ампулы.A hose mounted on the outlet fitting of the reactor under aseptic conditions is connected to the fitting at the inlet of the filter element. The other sterile hose is connected at one end to the fitting at the outlet of the filter element, and the other is connected to the inlet port of a 200 liter sterile plastic bag. Filter through a disposable filter element of the type Sartobran 0.2 μm, the filtration area of 0.45 m ² . A sample is taken from the filled sterile bag under aseptic conditions for analysis of specific activity, protein content, and content of thiolate. On the frame with the container containing the semi-finished vaccine, stick a label indicating the name of the vaccine, series number, and date of filtration. The container with the prefabricated tri-vaccine is transported to the finished dosage forms workshop. Storage of the container with the semi-finished product dosage form of the drug is carried out in a refrigerator at a temperature of 2 to 8 ° C for no more than 14 days. After passing the controls, the container with the sterile semi-finished product is transferred for filling into ampoules.

4.3 Розлив препарата в ампулы4.3 Pouring the drug into ampoules

Розлив препарата осуществляют на машине для заполнения и запайки ампул RSF производства фирмы CO.RI.M.A., Италия. Одноразовый контейнер с препаратом в асептических условиях соединяют через нижний порт к системе дозаторов. Устанавливают заданную дозу. Систему заполняют раствором препарата и прокачивают для удаления пузырей воздуха.The bottling of the drug is carried out on a machine for filling and sealing ampoules RSF manufactured by CO.RI.M.A., Italy. A disposable container with the drug under aseptic conditions is connected through the lower port to the dispenser system. Set the desired dose. The system is filled with a solution of the drug and pumped to remove air bubbles.

Разливают препарат в ампулы вместимостью 1,0 мл типа ИП-1 В 1 или аналогичные. Контроль стерильности процесса розлива проводят в начале и в конце розлива.The drug is poured into ampoules with a capacity of 1.0 ml of type IP-1 In 1 or similar. Sterility control of the bottling process is carried out at the beginning and at the end of the bottling.

Все ампулы с препаратом контролируют на герметичность и передают на просмотр в помещение, которое защищено от прямых солнечных лучей. Контроль вакцины на механические включения проводится инспекционной машиной А-30, производства фирмы «Brevetti», Италия.All ampoules with the drug are monitored for leaks and transmitted for viewing to a room that is protected from direct sunlight. Control of the vaccine for mechanical inclusion is carried out by an inspection machine A-30, manufactured by Brevetti, Italy.

Затем препарат передают на склад карантинного хранения отделения фасовки и хранят при температуре от 2 до 8°С.Then the drug is transferred to the quarantine storage warehouse of the packaging department and stored at a temperature of 2 to 8 ° C.

Со склада карантинного хранения отбираются ампулы с готовой лекарственной формой препарата и проводится контроля качества согласно документации. Основные контроли включают в себя визуальный контроль, определение содержания белка методом Лоури, определение специфической активности методом ОРИД, определение содержания овальбумина и эндотоксинов, определение содержания Тритона Х-100, изучение антигенной активности, стерильность.Ampoules with the finished dosage form of the drug are selected from the quarantine storage warehouse and quality control is carried out according to the documentation. The main controls include visual control, determination of protein content by the Lowry method, determination of specific activity by the ARID method, determination of the content of ovalbumin and endotoxins, determination of the content of Triton X-100, study of antigenic activity, sterility.

4.4 Маркировка и упаковка4.4 Labeling and packaging

Серии ампул с готовой лекарственной формой прошедшие все контроли поступают со склада карантинного хранения в цех фасовки. Перед началом работы маркировочную машину. настраивают, набивают клише, на котором указывают: торговое название препарата, номер серии, дату выпуска, объем препарата в мл, количество доз, срок годности.A series of ampoules with a finished dosage form, having passed all the controls, comes from the quarantine storage warehouse to the packaging workshop. Before starting work marking machine. set up, fill a cliche on which they indicate: the trade name of the drug, series number, release date, volume of the drug in ml, number of doses, shelf life.

Отмаркированные ампулы укладывают в коробки или пачки из картона для потребительской тары (ГОСТ 7933-89, или ТУ ОП 5453-010-04766354-2005, или импортного). На коробку или пачку наклеивают этикетку в соответствии с нормативной документацией.Marked ampoules are placed in boxes or packs of cardboard for consumer packaging (GOST 7933-89, or TU OP 5453-010-04766354-2005, or imported). A label is glued onto the box or bundle in accordance with regulatory documents.

Групповая и транспортная упаковка по ГОСТ 17768-90.Group and transport packaging in accordance with GOST 17768-90.

Упакованную вакцину помещают в холодильную камеру склада готовой продукции и хранят при температуре от 2 до 8°СPackaged vaccine is placed in the refrigerator compartment of the finished product warehouse and stored at a temperature of 2 to 8 ° C.

Возможность осуществления описанного изобретения может быть продемонстрировано следующими ниже представленными примерами:The feasibility of the described invention can be demonstrated by the following examples:

Пример 1. Получение моновакцины серотипа H3N2.Example 1. Obtaining monovaccine serotype H3N2.

Для заражения КЭ в качестве рабочего раствора был выбран 10 пассажный уровень реассортантного вируса A/Switzerland/9715293/2013/H3N2 содержащей инфекционный титр 10^3,3 ИД в 0,2 мл. Реассортантный штамм для производства инактивированных гриппозных вакцин был получен от ВОЗ. КЭ после 11 суток инкубации в количестве 56366 шт после дезинфекции и предварительной инкубации были инфицированы вышеуказанной дозой рабочего раствора посевного вируса. Инкубация после заражения проводилась при температуре 35°С и относительной влажности 60% в течении 43-46 ч. Охлаждение после инкубации проводилось в холодной камере при температуре (4±1)°С в течении 12-18 часов. После охлаждения в течении 6 часов была собрана ВАЖ в объеме 370 л. В реактор с собранной ВАЖ было добавлено 37 л 2,5 М раствора NaCl, с последующим перемешиванием, после чего добавили 0,37 л β-пропиолактона. Инактивация проходила при температуре (4±2)°С в течении 14 часов. На следующей стадии очистки и концентрирования было получено 40 л концентрата ВАЖ, которые были переданы для очистки в градиенте плотности сахарозы методом ультрацентрифугирования. Из градиента были отобраны 600 мл (6 фракций) с оптимальной концентрацией сахарозы и титром РГА. В этом объеме объединенного вирусного концентрата (ОВК) содержалось 14,21 г белка (определение по методу Бредфорда) и 6,12 г ГА (определенного по методу ОРИД). Все количество ОВК (600 мл) было использовано для приготовления одной серии моновакцины. Для проведения разрушения этого ОВК было использовано 200 г детергента октилглюкозида, производства фирмы Ferac Berlin, Германия. В лизате определилось 6,12 г ГА (по методу ОРИД). Объем лизата после микрофильтрации составил 20 л. После чего профильтрованный лизат был сконцентрирован до объема 5 л при помощи метода ультрафильтрации с применением кассет с пределом отсечения 30 кДа. Далее этот объем был очищен от недоразрушенных вирионов методом ультрацентрифугирования в течении 120 минут при скорости протока 5 л/ч при температуре +8°С. Супернатант был сконцентрирован с использованием тех те кассет до объема 2 л, хроматография проводилась при комнатной температуре, с использованием колонки с 16 л носителя. По оптической плотности был собран пик в зоне «свободного» объема, в нем был определен белок по методу Бредфорда после чего буфером ФБР материал был разведен до конечной концентрации по белку до 400 мкг/мл, был добавлен детергент Тритон Х-100 до конечной концентрации 200 мкг/мл, смесь тщательно перемешали, в течении 20 мин, и профильтровали через стерильные картриджи 0,22 мкм в стерильный пластиковый контейнер. Полученную моновакцину переносим в фармацевтический холодильник и храним при температуре (5±3)°С в течении не более 3 месяцев. Из контейнера со стерильной моновакциной отбираются пробы для проведения технологических контролей. Было определено, что из 6,12 г гемагглютинина, обнаруженного в ОВК, в полученной моновакцине определяется 5,41 г гемагглютинина. Таким образом, эффективность технологии по выходу гемагглютинина составляет 88,8%.For TBE infection in the transit layer 10 reassortant virus A / Switzerland / 9715293/2013 / H3N2 was chosen as a working solution comprising a titer of 10 ^3.3 infectious ID in 0.2 ml. A reassortant strain for the production of inactivated influenza vaccines was obtained from WHO. CE after 11 days of incubation in the amount of 56366 pcs. After disinfection and preliminary incubation were infected with the above dose of the working solution of seed virus. Incubation after infection was carried out at a temperature of 35 ° C and relative humidity of 60% for 43-46 hours. Cooling after incubation was carried out in a cold chamber at a temperature of (4 ± 1) ° C for 12-18 hours. After cooling for 6 hours, an IMPORTANT volume of 370 liters was collected. 37 L of a 2.5 M NaCl solution was added to the reactor with the collected IMPORTANT, followed by stirring, after which 0.37 L of β-propiolactone was added. Inactivation took place at a temperature of (4 ± 2) ° C for 14 hours. In the next stage of purification and concentration, 40 L of IMPORTANT concentrate was obtained, which were transferred for purification in the sucrose density gradient by ultracentrifugation. 600 ml (6 fractions) with the optimal sucrose concentration and RGA titer were selected from the gradient. This volume of the combined viral concentrate (HVAC) contained 14.21 g of protein (as determined by the Bradford method) and 6.12 g of GA (determined by the ORID method). The entire amount of HVAC (600 ml) was used to prepare one batch of monovaccine. To carry out the destruction of this HVAC, 200 g of octyl glucoside detergent, manufactured by Ferac Berlin, Germany, were used. In the lysate, 6.12 g of HA were determined (by the ORID method). The volume of the lysate after microfiltration was 20 liters. Then the filtered lysate was concentrated to a volume of 5 l using the ultrafiltration method using cassettes with a cutoff limit of 30 kDa. Further, this volume was cleaned from undeveloped virions by ultracentrifugation for 120 minutes at a flow rate of 5 l / h at a temperature of + 8 ° C. The supernatant was concentrated using those cassettes to a volume of 2 L; chromatography was performed at room temperature using a column with 16 L of support. The peak density in the "free" zone was collected by optical density, the protein was determined in it according to the Bradford method, after which the material was diluted with FBI buffer to a final protein concentration of up to 400 μg / ml, the Triton X-100 detergent was added to a final concentration of 200 μg / ml, the mixture was thoroughly mixed for 20 minutes, and filtered through 0.22 μm sterile cartridges into a sterile plastic container. The resulting monovaccine is transferred to a pharmaceutical refrigerator and stored at a temperature of (5 ± 3) ° C for no more than 3 months. Samples are taken from a container with a sterile mono-vaccine for technological controls. It was determined that out of 6.12 g of hemagglutinin found in HVAC, 5.41 g of hemagglutinin is determined in the resulting monovaccine. Thus, the efficiency of the technology for the release of hemagglutinin is 88.8%.

Был проведен сравнительный анализ полипептидного состава ОВК серотипа H3N2 и полученной моновакцины. Результаты представлены в приложении 1.A comparative analysis of the polypeptide composition of the HVAC serotype H3N2 and the resulting monovaccine was performed. The results are presented in Appendix 1.

Из представленных результатов следует, что в препарате моновакцины присутствуют тримеры гемагглютинина, нерасщепленный гемагглютинин, тяжелая цепь гемагглютинина, следовые количества белка нуклеокапсида и легкая цепь гемагглютинина. В исходном вирусном концентрате, из которого была произведена эта моновакцина присутствуют также полипептид M1 (мембранный белок) и существенные количества белка нуклеокапсида. Это свидетельствует, что полученный препарат моновакцины является расщепленным препаратом и не содержит вирусных частиц.It follows from the presented results that hemogglutinin trimers, undigested hemagglutinin, hemagglutinin heavy chain, trace amounts of nucleocapsid protein and hemagglutinin light chain are present in the monovaccine preparation. M1 polypeptide (membrane protein) and substantial amounts of nucleocapsid protein are also present in the original viral concentrate from which this monovaccine was produced. This indicates that the resulting monovaccine preparation is a split preparation and does not contain viral particles.

Пример 2. Получение моновакцины серотипа В.Example 2. Obtaining monotype vaccine serotype B.

Для получения ОВК были проведены такие же процедуры, как и в примере 1. Отличия состояли в следующем: для заражения применяли 9 пассажный уровень производственного штамма вируса B/Phuket/3073/2013; для заражения использовали 56774 шт. КЭ при температуре 33°С и относительной влажности 60% в течении 60-63 часов. После инкубации и охлаждения при тех же параметрах было собрано 440 л ВАЖ, которые были сконцентрированы по 20 л в 2 бутыли. После ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы были отобраны 600 мл препарата, содержащего 11,36 г общего белка (определенного методом Бредфорда), и 3,35 г ГА (определенно методом ОРИД). После проведения разрушения, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования и хроматографии, и стерилизующей фильтрации, как указано в примере 1, было получено 14,6 л моновакцины. В этом объеме содержалось 5,76 г общего белка и 1,96 ГА (методом ОРИД). Таким образом эффективность технологии по выходу ГА составила 58,3%.To obtain HVAC, the same procedures were carried out as in Example 1. The differences were as follows: for infection, the 9th passage level of the production strain of the B / Phuket / 3073/2013 virus was used; 56774 pcs were used for infection. CE at a temperature of 33 ° C and a relative humidity of 60% for 60-63 hours. After incubation and cooling, the same parameters were collected 440 l of IMPORTANT, which were concentrated 20 l in 2 bottles. After ultracentrifugation in a sucrose density gradient, 600 ml of the preparation containing 11.36 g of total protein (determined by the Bradford method) and 3.35 g of HA (determined by the ORID method) were selected. After degradation, ultrafiltration, ultracentrifugation and chromatography, and sterilizing filtration were carried out, as described in Example 1, 14.6 L of monovaccine was obtained. This volume contained 5.76 g of total protein and 1.96 GA (by the ARID method). Thus, the efficiency of the technology for GA output was 58.3%.

Был проведен сравнительный анализ полипептидов в моновакцинах, полученных в 2014 и 2015 гг. и ОВК. Результаты представлены в приложении 2.A comparative analysis of polypeptides in monovaccines obtained in 2014 and 2015 was carried out. and HVAC. The results are presented in Appendix 2.

Было показано, что полипептидный состав моновакцины существенно отличается от полипептидного состава исходного вирусного концентрата, из которого производилась представленная моновакцина. Представляется очевидным, что полученная моновакцина является расщепленным вакцинным препаратом против гриппа серотипа В.It was shown that the polypeptide composition of a monovaccine is significantly different from the polypeptide composition of the original viral concentrate from which the presented monovaccine was produced. It seems obvious that the resulting mono-vaccine is a split-type vaccine against influenza serotype B.

Пример 3. Получение моновакцины серотипа H1N1.Example 3. Obtaining monovaccine serotype H1N1.

Все технологические стадии соответствовали таковым в примерах №1 и №2. Однако были отличия: в заражение было взято 52571 шт. КЭ, для их заражения использовался посевной вирус A/California/07/2009/H1N1 с пассажным уровнем 12. После заражения КЭ инкубировались при 35°С и относительной влажности 60% в течении 43-46 ч. Из этого количества КЭ было собрано 436 л ВАЖ, после очистки и концентрирования было получено 500 мл ОВК. В этом объеме ОВК содержалось 6,75 г общего белка (определенного по методу Лоури) и 2,587 г ГА (определенного по методу ОРИД). Из данной серии ОВК была получена серия моновакцины в объеме 11,6 л, в которой содержалось 4 г общего белка (определенного методом Лоури) и 2,55 г ГА (определенного по методу ОРИД). Таким образом, выход по ГА по данной технологии составил 98,6%. Полипептидный состав полученной моновакцины представлен в приложении 3.All technological stages corresponded to those in examples No. 1 and No. 2. However, there were differences: 52571 pieces were taken for infection. CE, for their infection, the inoculum virus A / California / 07/2009 / H1N1 was used with a passage level of 12. After infection, CE were incubated at 35 ° C and 60% relative humidity for 43-46 hours. 436 L were collected from this amount of CE IMPORTANT, after purification and concentration, 500 ml of HVAC was obtained. This HVAC volume contained 6.75 g of total protein (determined by the Lowry method) and 2.587 g of HA (determined by the ORID method). From this series of HVAC, a 11.6 L mono-vaccine series was obtained containing 4 g of total protein (determined by the Lowry method) and 2.55 g of HA (determined by the ORID method). Thus, the GA yield for this technology was 98.6%. The polypeptide composition of the obtained monovaccine is presented in Appendix 3.

Из представленных данных следует, что в исходном вирусном концентрате основными полипептидами является димер НА0, нерасщепленный гемагглютинин (НА0), агрегат нейроминидазы и белка нуклеокапсида (NA+NP); белок нуклеокапсида (NP), тяжелая цепь гемагглютинина (НА1) и мембранный белок (M1). В препарате после разрушения детергентом присутствуют те же самые полипептиды, а в препарате моновакцины - остаются только димер НА0, сам НА0, агрегат (NA+NP), легкая цепь гемагглютинина (НА1) и следовые количества белка нуклеокапсида. На основании этих результатов мы считаем, что данный препарат моновакцины расщепленным вакцинным препаратом против гриппа серотипа H1N1.From the data presented it follows that in the initial viral concentrate, the main polypeptides are HA0 dimer, undigested hemagglutinin (HA0), an aggregate of neurominidase and nucleocapsid protein (NA + NP); nucleocapsid protein (NP), hemagglutinin heavy chain (HA1) and membrane protein (M1). The same polypeptides are present in the preparation after detergent destruction, and in the monovaccine preparation, only HA0 dimer, HA0 aggregate, aggregate (NA + NP), hemagglutinin light chain (HA1) and trace amounts of nucleocapsid protein remain. Based on these results, we believe that this mono-vaccine preparation is a split-type vaccine against influenza serotype H1N1.

Пример 4. Приготовление лекарственной формы вакцины.Example 4. Preparation of a dosage form of a vaccine.

Для приготовления серии тривакцины (лекарственная форма) из полученных моновалентов серотипов H1N1; H3N2 и В мы отобрали стерильные растворы моновакцин таким образом, что в каждом образце моновакцины содержалось количество гемагглютинина (определение методом ОРИД) равное 1,87 г. Далее в асептических условиях в реактор добавляют три образца моновакцин; раствор ФБР; 1% раствор мертиолята (консервант), 1% раствор детергента Тритона Х-100, таким образом, чтобы в конечном растворе была конечная концентрация всех серотипов равная (15±2,2) мкг/дозе, конечная концентрация мертиолята должна быть в пределах 85-115 мкг/мл, а Тритона Х-100 - до конечной концентрации 200-300 мкг/мл (с учетом концентрации Тритона Х-100 в моновакцинах). Объем жидкости в реакции после добавления всех компонентов достиг 68 л. Далее, содержимое реактора перемешивают в течении 15-20 мин со скоростью 400 об/мин и фильтруют через одноразовую стерильную фильтрующую капсулу с диаметром пор 0,22 мкм в стерильный пластиковый контейнер. Получаем объем стерильной тривакцины 67 л. В течении 10 суток были получены удовлетворительные результаты по специфической активности, содержанию белка, бактериальным эндотоксинам и овальбумину, после чего контейнер с тривакциной передают для розлива в ампулы. Препарат был разлит в ампулы вместимостью 1 мл по 0,6 мл тривакцины в каждую ампулу. После розлива было получено 110000 ампул, которые были проконтролированы на наличие механических включений. В результате по этому показателю было отбраковано 1100 ампул. Остальные ампулы были отправлены на склад временного хранения с температурой (6±2)°С. Часть ампул была отобрана для проведения контролей согласно нормативной документации.For the preparation of a series of tri-vaccines (dosage form) from the monovalent obtained serotypes H1N1; H3N2 and B, we selected sterile solutions of monovaccines in such a way that each sample of the monovaccine contained an amount of hemagglutinin (determined by the ARID method) equal to 1.87 g. Then, under aseptic conditions, three samples of monovaccines were added to the reactor; FBI solution; 1% solution of merthiolate (preservative), 1% solution of Triton X-100 detergent, so that the final solution had a final concentration of all serotypes equal to (15 ± 2.2) μg / dose, the final concentration of merthiolate should be within 85- 115 μg / ml, and Triton X-100 - to a final concentration of 200-300 μg / ml (taking into account the concentration of Triton X-100 in monovaccines). The volume of liquid in the reaction after adding all the components reached 68 l. Next, the contents of the reactor are mixed for 15-20 minutes at a speed of 400 rpm and filtered through a disposable sterile filter capsule with a pore diameter of 0.22 μm into a sterile plastic container. We get the volume of sterile vaccine 67 l. Within 10 days, satisfactory results were obtained on the specific activity, protein content, bacterial endotoxins and ovalbumin, after which the container with the tri-vaccine was transferred for filling into ampoules. The drug was poured into ampoules with a capacity of 1 ml of 0.6 ml of trivacine in each ampoule. After bottling, 110,000 ampoules were obtained, which were checked for mechanical impurities. As a result, 1,100 ampoules were rejected for this indicator. The remaining ampoules were sent to a temporary storage warehouse with a temperature of (6 ± 2) ° С. Part of the ampoules was selected for the controls according to regulatory documentation.

Антигенная активность, специфическая безопасность, токсичность, и стерильность соответствовали требованиям ВОЗ.Antigenic activity, specific safety, toxicity, and sterility were in accordance with WHO requirements.

Пример 5. Изучение влияния добавки стабилизатора детергента Тритон Х-100 на % выхода гемагглютинина (ГА) в составе моновакцине, от гемагглютинина, содержащегося в ОВК.Example 5. The study of the effect of the additive stabilizer of the detergent Triton X-100 on the% yield of hemagglutinin (HA) in the monovaccine, from hemagglutinin contained in HVAC.

Сохранение стабильности специфической активности гемагглютинина (определяемого по методу ОРИД) как в процессе выделения моновакцины, так и в процессе ее последующего хранения является чрезвычайно важной технологической задачей. В результате длительных экспериментов из нескольких стабилизирующих добавок выбрали для целей стабилизации представленной вакцины добавку детергента Тритон Х-100 до конечной концентрации 200 мкг/мл. С применением этой добавки мы получили несколько серий моновакцин разных серотипов, которые были исследованы с целью определения стабильности сохранения специфической активности (содержание ГА). Результаты представлены в таблице №1.Preserving the stability of the specific activity of hemagglutinin (determined by the ARID method) both in the process of isolating a single vaccine and in the process of its subsequent storage is an extremely important technological task. As a result of lengthy experiments, from a number of stabilizing additives, for the purpose of stabilizing the presented vaccine, the additive of the Triton X-100 detergent was selected to a final concentration of 200 μg / ml. Using this additive, we obtained several series of monovaccines of different serotypes, which were investigated in order to determine the stability of preservation of specific activity (HA content). The results are presented in table No. 1.

Из представленных данных следует, что с применением стабилизирующей добавки удается существенно увеличить эффективность технологии на конечной стадии, а именно при добавке Тритона Х-100 перед стерилизующей фильтрацией моновакцины. Полученные данные позволяют предположить, что стабилизирующая добавка этого детергента эффективна не только на стадии получения моновакцины, но и на стадии хранения тривалентной лекарственной формы, разлитая в ампулы.From the presented data it follows that with the use of a stabilizing additive, it is possible to significantly increase the effectiveness of the technology at the final stage, namely, with the addition of Triton X-100 before sterilizing filtration of a monovaccine. The data obtained suggest that the stabilizing additive of this detergent is effective not only at the stage of obtaining a monovaccine, but also at the stage of storage of the trivalent dosage form, poured into ampoules.

Пример 6. Сравнение биохимических показателей предлагаемой вакцины и вакцины «Ваксигрипп».Example 6. Comparison of biochemical parameters of the proposed vaccine and vaccine "Vaksigripp."

Полученная стабилизированная лекарственная форма предлагаемой вакцины была проанализирована в рамках международных испытаний по некоторым биохимическим показателям в сравнении с расщепленной вакциной «Ваксигрипп», которая производится по лицензии в институте «Бутантан», Бразилия. В качестве основных показателей сравнения были выбраны критерии содержания белка; титр гемагглютинации, специфической активности, содержание овальбумина и содержание бактериальных эндотоксинов. Данные представлены в таблице №2.The obtained stabilized dosage form of the proposed vaccine was analyzed in international trials for some biochemical parameters in comparison with the split vaccine “Vaxigripp”, which is produced under license at the Butantan Institute, Brazil. As the main indicators of comparison were selected criteria for protein content; titer of hemagglutination, specific activity, ovalbumin content and bacterial endotoxin content. The data are presented in table No. 2.

Из представленных данных видно, что по показателям «Содержание овальбумина» и «содержание бактериальных эндотоксинов» в представленной вакцине существенно отличаются от вакцины «Ваксигрипп», произведенной по лицензии фирмы «Санофи», в институте Бутантан, Бразилия. Очевидно, что существенно сниженные количества реактогенных примесей в представленной вакцине обусловлено тем, что в процессе очистки моновакцин была использована промышленная гель-хроматография. Следует отметить, что содержание овальбумина и бактериальных эндотоксинов является главными показателями для оценки потенциальной реактогенности вакцины. Согласно требованиям ВОЗ эти показатели регламентированы. В частности, в современных вакцинах, предназначенных для иммунизации детей, содержание овальбумина не должно превышать 0,1 мг/мл.From the presented data it can be seen that according to the indicators “Ovalbumin content” and “bacterial endotoxin content” in the presented vaccine, they significantly differ from the vaccine “Vaxigripp”, produced under the license of Sanofi company, at the Butantan Institute, Brazil. Obviously, the significantly reduced amounts of reactogenic impurities in the presented vaccine are due to the fact that industrial gel chromatography was used in the process of purifying monovaccines. It should be noted that the content of ovalbumin and bacterial endotoxins are the main indicators for assessing the potential reactogenicity of the vaccine. According to WHO requirements, these indicators are regulated. In particular, in modern vaccines intended for immunization of children, the content of ovalbumin should not exceed 0.1 mg / ml.

Пример 7. Изучение антигенной активности полученной тривакцины.Example 7. The study of the antigenic activity of the obtained tri-vaccine.

В эксперименте были использованы самки белых мышей линии BALB/c, 6-8 недель, весом 18-20 г. Было сформировано 3 группы животных (по 30 животных в группе): 2 экспериментальные группы и 1 контрольная.In the experiment, female BALB / c mice were used, 6-8 weeks old, weighing 18-20 g. 3 groups of animals were formed (30 animals per group): 2 experimental groups and 1 control.

В 0-й день эксперимента осуществлялся тотальный забор крови у неиммунных животных (по 10 животных из каждой группы, включая контрольную) с целью оценки наличия антител к вакцинным штаммам в сыворотках крови экспериментальных животных. После этого осуществляли первичное введение, VI (праймирование) трехвалентных гриппозных вакцин экспериментальным животным (полученная нами вакцина и вакцина «Ваксигрипп») внутримышечно, в дозе 0,5 мл препарата на животное. Контрольной группе животных вводили 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 0,5 мл на животное.On day 0 of the experiment, total blood sampling was performed in non-immune animals (10 animals from each group, including the control) in order to assess the presence of antibodies to vaccine strains in the blood serum of experimental animals. After that, the primary administration, VI (priming) of trivalent influenza vaccines was carried out to experimental animals (the vaccine we received and the vaccine “Vaksigripp”) intramuscularly, at a dose of 0.5 ml of the drug per animal. The control group of animals was injected with 0.9% sodium chloride in a volume of 0.5 ml per animal.

На 21-й день эксперимента осуществлялся тотальный забор крови у животных (по 10 животных из каждой группы, включая контрольную) с целью оценки уровня специфических антител к вакцинным штаммам после первичного введения вакцин. Поскольку считается, что мыши не подвержены гриппозной инфекции и являются «наивными» по гриппозным антигенам, однократного введения гриппозной вакцины недостаточно для выработки полноценного иммунного ответа. Вследствие этого осуществляли повторное введение вакцин, V2 (собственно иммунизация) экспериментальным животным по той же схеме, как и при первичном введении вакцин. Контрольной группе животных вводили 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 0,5 мл на животное.On the 21st day of the experiment, total blood sampling was performed in animals (10 animals from each group, including control) in order to assess the level of specific antibodies to vaccine strains after the initial injection of vaccines. Since it is believed that mice are not susceptible to influenza infection and are “naive” for influenza antigens, a single injection of influenza vaccine is not enough to produce a full-fledged immune response. As a result, the vaccines were re-introduced, V2 (immunization proper) to the experimental animals according to the same scheme as for the initial vaccine administration. The control group of animals was injected with 0.9% sodium chloride in a volume of 0.5 ml per animal.

На 42-й день эксперимента (21-й день после V2) осуществляли тотальный забор крови у всех животных.On the 42nd day of the experiment (21st day after V2), total blood sampling was performed in all animals.

Оценку антиген-специфического гуморального иммунитета проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции микронейтрализации (РМН) в культуре клеток MDCK со штаммами вируса гриппа. Постановку реакций осуществляли согласно методикам, рекомендованным ВОЗ. Положительными считали сыворотки, имеющие титр антител 1:40 и выше.Evaluation of antigen-specific humoral immunity was carried out in the hemagglutination inhibition reaction (RTGA) and microneutralization reaction (RMN) in an MDCK cell culture with influenza virus strains. The reactions were carried out according to the methods recommended by WHO. Serums having an antibody titer of 1:40 and higher were considered positive.

Результаты представлены в таблицах 3-5.The results are presented in tables 3-5.

Из данных можем сделать вывод, что антигенная активность представленной вакцины превышает таковую вакцины «Ваксигрипп» (производства фирмы «Санофи, Франция»), в частности по титрам в РМН после первичной иммунизации по серотипу В и по серотипу H1N1. После вторичной иммунизации показатель антигенной активности выравнивается между обоими исследуемыми препаратами, так как для иммунизации мышей использовались дозировки, предназначенные для вакцинации человека. Следует подчеркнуть, что разница по проценту серопозитивных животных после первичной вакцинации свидетельствует о том, что представленная вакцина лучше индуцирует иммунный ответ у «наивных» животных. Вероятно, что это происходит за счет того, что в представленной вакцине присутствуют виросомальные компоненты, которые были обнаружены в процессе морфологического анализа методом электронной микроскопии.From the data we can conclude that the antigenic activity of the presented vaccine exceeds that of the vaccine "Vaksigripp" (manufactured by Sanofi, France), in particular by titers in the Russian Medical Library after primary immunization with serotype B and serotype H1N1. After secondary immunization, the indicator of antigenic activity is leveled between the two studied drugs, since the doses intended for human vaccination were used to immunize mice. It should be emphasized that the difference in the percentage of seropositive animals after primary vaccination indicates that the vaccine presented better induces an immune response in “naive” animals. It is likely that this is due to the fact that the presented vaccine contains virosomal components that were detected during morphological analysis by electron microscopy.

Пример 8. Изучение сравнительной иммуногенности представленной вакцины и вакцины «Ваксигрипп» в ходе клинического исследования на добровольцах.Example 8. The study of the comparative immunogenicity of the presented vaccines and vaccines "Vaksigripp" in a clinical trial on volunteers.

Исследование проводилось как открытое в двух параллельных группах участников. Использовались вакцины для профилактики гриппа: представленная вакцина и Ваксигрипп^®, Франция. По протоколу исследования вакцины вводились однократно. Вакцинация проведена 120 добровольцам в возрасте от 18 до 60 лет. В исследование включено 65 женщин (54%) и 55 мужчин (46%), средний возраст которых составил 32,9±1,5 и 30,5±1,6 лет, соответственно. Прививка представленной вакциной проведена 61 добровольцу, вакциной Ваксигрипп - 59 человекам, из них обследование на 21-28 день наблюдения проведено 58 и 59 участникам соответственно.The study was conducted as open in two parallel groups of participants. Vaccines for influenza prevention were used: vaccine presented and Vaxigripp ^® , France. According to the study protocol, vaccines were administered once. Vaccination was carried out to 120 volunteers aged 18 to 60 years. The study included 65 women (54%) and 55 men (46%), whose average age was 32.9 ± 1.5 and 30.5 ± 1.6 years, respectively. Vaccination with the presented vaccine was carried out to 61 volunteers, Vaxigripp vaccine - to 59 people, of which 58 and 59 participants respectively were examined on 21-28 days of observation.

Оценку показателей иммуногенности, исследуемых вакцин, проводили по критериям эффективности развития иммунного ответа ВОЗ:Evaluation of immunogenicity indicators of the studied vaccines was carried out according to the criteria for the effectiveness of the development of the WHO immune response:

1. кратность нарастания титра антител после вакцинации: >2,5 у лиц в возрасте от 18 до 60 лет (>2 у лиц в возрасте старше 60 лет);1. the rate of increase in antibody titer after vaccination:> 2.5 in people aged 18 to 60 years (> 2 in people over the age of 60 years);

2. уровень сероконверсии (увеличение титра антител к ГА не менее, чем в 4 раза): >40% для лиц в возрасте от 18 до 60 лет (>30% для лиц в возрасте старше 60 лет);2. seroconversion level (increase in titer of antibodies to GA not less than 4 times):> 40% for people aged 18 to 60 years (> 30% for people over 60 years old);

3. уровень серопротекции (число лиц с защитным титром >=40): >70% для лиц в возрасте от 18 до 60 лет (>60% для лиц в возрасте старше 60 лет).3. level of seroprotection (the number of people with a protective titer> = 40):> 70% for people aged 18 to 60 years (> 60% for people over the age of 60).

Результаты исследований статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента и при отсутствии признаков нормального распределения - с помощью непараметрических критериев (Вилкоксона и Мана-Уитни). Различия считали достоверными при p<0,05The research results were statistically processed using Student's t-test and, in the absence of signs of a normal distribution, using nonparametric criteria (Wilcoxon and Mana-Whitney). The differences were considered significant at p <0.05

Иммунный ответ у всех привитых, принявших участие в исследовании, представлены в таблице 6.The immune response in all vaccines who participated in the study are presented in table 6.

Показано, что в обеих группах коэффициент сероконверсии, а также показатели сероконверсии и серопротекции к вирусам гриппа H1N1, H3N2 и В, соответствовали критериям ВОЗ по развитию иммунного ответа. Статистически достоверных различий между группами выявлено не было.It was shown that in both groups the seroconversion coefficient, as well as the indicators of seroconversion and seroprotection to influenza viruses H1N1, H3N2 and B, met the WHO criteria for the development of the immune response. There were no statistically significant differences between the groups.

Список литературыBibliography

1. Патент РФ №2283139 «Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа».1. RF patent No. 2283139 "Method for producing antigens for vaccines against influenza viruses."

Дата начала срока действия: 21.03.2005 г.Start date: March 21, 2005

Авторы: Гельфанд Александр Семенович,Authors: Gelfand Alexander Semenovich,

Брызгалова Светлана Ивановна,Bryzgalova Svetlana Ivanovna,

Мельников Сергей Яковлевич,Melnikov Sergey Yakovlevich,

Гусарова Наталья Анатольевна,Gusarova Natalia Anatolyevna,

Ярославцев Иван Васильевич.Yaroslavtsev Ivan Vasilievich.

2. Патент РФ №2493872 «Способ очистки вируса гриппа».2. RF patent No. 2493872 "Method for cleaning the influenza virus."

Дата начала срока действия: 08.08.2012 г.Start date: 08.08.2012

Авторы: Загидулин Наиль Виленович,Authors: Zagidulin Nail Vilenovich,

Кызин Андрей Александрович,Kyzin Andrey Alexandrovich,

Исрафилов Азамат Габдельахатович,Israfilov Azamat Gabdelahatovich,

Гелич Людмила Вячеславовна,Gelich Lyudmila Vyacheslavovna,

Катаева Валентина Васильевна.Kataeva Valentina Vasilievna.

3. Патент РФ №2523614 от 09.04.2013 г. «Вакцина против гриппа и способ ее получения».3. RF patent No. 2523614 dated 04/09/2013, "Flu vaccine and method for its production."

Дата начала срока действия: 09.04.2013 г.Validity start date: 04/09/2013

Кызин Андрей Александрович,Kyzin Andrey Alexandrovich,

Ерастова Наталья Павловна.Erastova Natalya Pavlovna.

4. Патент РФ №2535153 «Способ получения высокоочищенных вирионных концентратов». Дата начала срока действия: 04.09.2013 г.4. RF patent No. 2535153 "Method for the production of highly purified virion concentrates." Start date: September 4, 2013.

Авторы: Трухин Виктор Павлович,Authors: Trukhin Viktor Pavlovich,

Петровский Станислав Викторович,Petrovsky Stanislav Viktorovich,

Иванова Наталья Евгеньевна,Ivanova Natalia Evgenievna,

Лобзин Юрий Владимирович.Lobzin Yuri Vladimirovich.

5. Natalija Budimir, 1 Anke Huckriede, 1 Tjarko Meijerhof, 1 Louis Boon, 2 Emma Gostick, 3 David A. Price, 3 Jan Wilschut, 1 and Aalzen de Haan. Induction of Heterosubtypic Cross-Protection against Influenza by a Whole inactivated Virus Vaccine: The Role of Viral Membrane Fusion Activity.5. Natalija Budimir, 1 Anke Huckriede, 1 Tjarko Meijerhof, 1 Louis Boon, 2 Emma Gostick, 3 David A. Price, 3 Jan Wilschut, 1 and Aalzen de Haan. Induction of Heterosubtypic Cross-Protection against Influenza by a Whole inactivated Virus Vaccine: The Role of Viral Membrane Fusion Activity.

PLoS One. 2012; 7(1): e30898.Plos one. 2012; 7 (1): e30898.

Published online 2012 Jan 27. doi: 10.1371/journal.pone.0030898.Published online 2012 Jan 27. doi: 10.1371 / journal.pone.0030898.

Claims

1. The method of obtaining funds intended for the treatment of influenza, including infection of chicken embryos with influenza virus, incubation of infected embryos, cooling incubated embryos, collection of virus-containing allantoic fluid (IMPORTANT), processing of IMPORTANT for the purpose of disaggregation and subsequent inactivation, microfiltration of IMPORTANT on 2 stages of cartridges, ultrafiltration of the IMPORTANT and purification of the viral concentrate in a sucrose density gradient, cleavage of the purified inactivated viral concentrate is carried out with beta-octyl-gluco detergent zidomide, the removal of the undeveloped virions and complexes of ribonucleoproteins with a membrane protein is carried out by ultracentrifugation, the final purification of the isolated antigens is carried out on a chromatographic carrier, after which a stabilizer is added to the obtained antigens, characterized in that the inactivation of viral activity is carried out at the stage of the IMPORTANCE treatment using beta-propiolactone disinfectant , virus disaggregation during the processing of IMPORTANCE is carried out with sodium chloride in a final concentration of 0.22 mol, and finally nuyu antigen purification is carried out on the chromatographic medium WorkBeads, 40/100 / sec firm «Bio-works» (Sweden) and stabilized by a detergent Triton X-100 at a concentration of 100-300 ug / ml.

2. The tool intended for the treatment of influenza, which is obtained by the method according to p. 1.