RU2578526C1

RU2578526C1 - Method of producing organ culture choroidal-pigment complex from adult cadaver donor's eye

Info

Publication number: RU2578526C1
Application number: RU2014152576/13A
Authority: RU
Inventors: Сергей Анатольевич Борзенок; Ирина Николаевна Сабурина; Илья Андреевич Попов; Патимат Магомедовна Арбуханова; Дмитрий Сергеевич Островский; Елена Борисовна Прытова
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2016-03-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: after removal of eyeball adult cadaver donor's corneal-scleral disk eyeball with no through damages of iris, ciliary body and visible part of choroid (SSO) and vitreous body outlet beyond vitreal cavity is fully submerged into a sterile container with sterile phosphate-saline buffer with pH 7.4. Complete separation of sclera from choroid by dissecting sclera meridional cuts backwards on 2, 3 or 4 "petals". On side of suprachoroidal space vorticose veins are transected and intrascleral part of optic nerve. Producing three-section choroidal pigment complex (CPC), consisting of SSO and retinal pigment epithelium (RPE). First circular incision is performed at a distance of 1 mm from a dentate line, one meridian incision in any meridian in direction from first incision backwards to an optic disk stump and second circular incision at a distance of 1 mm from optic disk stump. Further CPC carefully separated from neural retinal forceps and placed on bottom of sterile petri dishes at a position upward RPE cells. Nutrient medium is added with following composition: Dulbecco modified Eagle's medium with ham's medium F12 (DMEM/F12) - 89%, foetal calf serum - 10%, mixed antibiotics, including penicillin 10000 IU/ml, streptomycin 10000 mcg/ml, amphotericin 25 mcg/ml - 1%. Culture is incubated at 37°C and at 5% concentration CO₂, nutrient medium is replaced 2 times a day.

EFFECT: invention reduces degree of contamination of product.

1 cl, 2 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, патофизиологии и экспериментальной трансплантологии, и может быть использовано для получения ткани хороидально-пигментного комплекса (ХПК) донора-трупа при снижении уровня загрязнения получаемой органной культуры ХПК фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. Собственно сосудистая оболочка (ССО) глаза и располагающийся с ее внутренней стороны слой ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вместе составляют ХПК и выполняют функцию двусторонней доставки многочисленных метаболитов из кровотока к слою фоторецепторов сетчатки и обратно, обеспечивая нормальную фототрансдуктивную функцию сетчатки. Патология РПЭ считается патогенетическим звеном дистрофических заболеваний сетчатки - возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита, наследственных дистрофий сетчатки. При экспериментальной разработке способов лазерного и хирургического лечения указанных состояний традиционно используют модели экспериментальных животных, чаще всего кроликов. Данный подход имеет недостатки - по многим параметрам глаз животного отличается от глаза человека, эксперименты на животных относительно дороги и трудозатратны, требуют специально оборудованного вивария. В качестве альтернативы может быть использован метод органных культур, который позволяет получить небольшой жизнеспособный фрагмент интересующей ткани от трупного донора и поддерживать его жизнеспособность в течение некоторого срока. В частности, для изучения вариантов лазерного и хирургического воздействия на нативный слой РПЭ в ряде случаев можно использовать органную культуру ХПК.The invention relates to medicine, namely to ophthalmology, pathophysiology and experimental transplantology, and can be used to produce tissue of the choroid-pigment complex (COD) of a corpse donor while reducing the level of contamination of the resulting organ culture of COD with retinal fragments and vitreous cavity contents. The choroid proper (CCO) of the eye and the layer of retinal pigment epithelium (RPE) located on its inner side together constitute COD and perform the function of bilateral delivery of numerous metabolites from the bloodstream to the layer of retinal photoreceptors and vice versa, providing normal phototransductive function of the retina. Pathology of RPE is considered a pathogenetic link of degenerative diseases of the retina - age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, hereditary retinal degeneration. In the experimental development of methods for laser and surgical treatment of these conditions, models of experimental animals, most often rabbits, are traditionally used. This approach has drawbacks - in many respects, the animal’s eye is different from the human eye, animal experiments are relatively expensive and labor-intensive, require a specially equipped vivarium. As an alternative, the organ culture method can be used, which allows you to get a small viable fragment of the tissue of interest from a cadaveric donor and maintain its viability for some time. In particular, in some cases, it is possible to use the organ culture of COD to study the options for laser and surgical effects on the native RPE layer.

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры ХПК глаза взрослого человека, описанный в научной статье: Sun K, Cai Н, Tezel ТН, Paik D, Gaillard ER, Del Priore LV. Bruch′s membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol Vis. 2007 Dec 21; 13: 2310-9. Согласно статье выделение ХПК является промежуточным звеном в процессе выделения мембраны Бруха (часть ССО, располагающаяся у основания клеток РПЭ) и осуществляется следующим образом. Производят один круговой (параллельно лимбу в 3 мм от него) и 4 меридиональных (вдоль переднезадней оси глаза) разреза склеры, пересекают зрительный нерв, полностью отделяют склеру от ССО. Последовательно удаляют передний сегмент глаза вместе со стекловидным телом и сетчатую оболочку, получая таким образом хороидально-пигментный комплекс (ХПК).The closest analogue is a method for producing an organ culture of COD of an adult's eye, described in a scientific article: Sun K, Cai H, Tezel TH, Paik D, Gaillard ER, Del Priore LV. Bruch's membrane aging decreasing phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol Vis. 2007 Dec 21; 13: 2310-9. According to the article, the isolation of COD is an intermediate in the process of isolation of the Bruch membrane (the part of the CCO located at the base of RPE cells) and is carried out as follows. They make one circular (parallel to the limb 3 mm from it) and 4 meridional (along the anteroposterior axis of the eye) incisions of the sclera, cross the optic nerve, completely separate the sclera from the MTR. Consistently remove the anterior segment of the eye along with the vitreous body and the retina, thus obtaining a choroid-pigment complex (COD).

Способ имеет недостаток: при обработке глазного яблока таким способом неизбежно повреждается сетчатая оболочка глаза и стекловидное тело, что может приводить к попаданию на поверхность ХПК способных к пролиферации клеток сетчатки (глиальных клеток Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитов), что может осложнять выполнение ряда экспериментальных задач.The method has a drawback: when processing the eyeball in this way, the retina and the vitreous are inevitably damaged, which can lead to proliferation of retinal cells (glial Muller cells) and the vitreous (hyalocytes) that can complicate the implementation of a number of experimental tasks.

Задачей изобретения является получение органной культуры ХПК глаза взрослого донора-трупа in vitro при снижении уровня загрязнения выделяемой ткани фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.The objective of the invention is to obtain an organ culture of the COD of the eyes of an adult corpse donor in vitro while reducing the level of contamination of the secreted tissue by retinal fragments and the contents of the vitreous cavity.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой органной культуры ХПК.The technical result is to reduce the degree of contamination by extraneous cellular elements of the resulting organ culture of COD.

Технический результат достигается тем, что в способе получения органной культуры ХПК из глаза взрослого донора-трупа, включающем удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, согласно изобретению при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ, - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом, укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх и в нее добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.The technical result is achieved by the fact that in the method for producing an organ culture of COD from the eyes of an adult corpse donor, including removing a corneal scleral disc from an eyeball of a corpse-donor corpse according to the invention in the absence of end-to-end injuries of the iris, ciliary body and visible part of the CCO and vitreous bodies outside the vitreous cavity the eyeball without a corneal scleral disk is completely immersed in a container with phosphate-saline buffer with a pH of 7.4, the sclera is completely separated from the MTR by dissecting the sclera is measured by meridional sections from front to back on 2, 3 or 4 “petals” and the intersection of the suprachoroidal space of the vortical veins and the intrascleral part of the optic nerve; make three sections of the COD, consisting of MTR and RPE, - the first circular section - at a distance of 1 mm from the dentate line, one meridional - in any meridian in the direction from the first section from front to back to the cult of the optic disc and the second circular section at a distance of 1 mm from the stump of the optic nerve; Further, COD is carefully separated from the neural retina with tweezers, placed on the bottom of the sterile Petri dish in the position of RPE cells upwards, and the following nutrient medium is added to it: Dulbecco medium with Ham F12 medium - 89%, fetal calf serum - 10%, mixture antibiotics, including penicillin 10,000 IU / ml, streptomycin 10,000 μg / ml, amphotericin 25 μg / ml - 1%, while the culture is incubated at 37 ° C and at 5% concentration of CO ₂ , the nutrient medium is replaced 2 times a day.

При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, витреальная полость остается невскрытой, радужная оболочка, цилиарное тело, хрусталик, сетчатка и стекловидное тело отделяются единым неповрежденным замкнутым блоком, таким образом исключаются возможные источники клеточного загрязнения органной культуры ХПК.With this method of processing the eyeball, the retina is not damaged, the vitreous cavity remains unopened, the iris, ciliary body, crystalline lens, retina and vitreous body are separated by a single intact closed block, thus eliminating possible sources of cell contamination of the organ culture of COD.

Изобретение поясняется рисунками 1 и 2.The invention is illustrated in figures 1 and 2.

На рис. 1 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно ближайшему аналогу. На рис. 2 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно предложенному изобретению. На обоих рисунках позицией 1 обозначена сетчатая оболочка, позицией 2 - ХПК, позицией 3 - склера, позицией 4 - зрительный нерв. На рис. 1 позицией 5 обозначены места рассечения сетчатой оболочки по ближайшему аналогу - вокруг зрительного нерва и возле зубчатой линии, при этом полость стекловидного тела неизбежно вскрывают, сетчатка повреждена. На рис. 2 позицией 6 обозначена линия рассечения зрительного нерва на уровне его внутрисклеральной части, согласно настоящему изобретению полость стекловидного тела не вскрыта, сетчатка не повреждена.In fig. 1 shows a diagram of the intersection of tissues of the posterior segment of the eye during the selection of COD according to the closest analogue. In fig. 2 shows a diagram of the intersection of tissues of the posterior segment of the eye during the selection of COD according to the proposed invention. In both figures, position 1 denotes the retina, position 2 - COD, position 3 - sclera, position 4 - optic nerve. In fig. 1, position 5 indicates the sites of dissection of the retina according to the closest analogue - around the optic nerve and near the dentate line, while the vitreous cavity is inevitably opened, the retina is damaged. In fig. 2, reference numeral 6 denotes an optic nerve dissection line at the level of its intrascleral part; according to the present invention, the vitreous cavity is not opened, the retina is not damaged.

Способ осуществляется следующим образом: глазное яблоко донора-трупа после удаления роговично-склерального диска при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости и при отсутствии перечисленных признаков погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4. Склеру рассекают спереди назад двумя, тремя или четырьмя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляют из операционного поля. Далее производят три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх» и добавляют в нее питательную среду следующего состава: DMEM/F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ХПК инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.The method is as follows: the eyeball of a corpse donor after removal of the corneal scleral disk in the absence of end-to-end injuries of the iris, ciliary body and visible part of the CCO and the vitreous body beyond the vitreous cavity and in the absence of these symptoms are immersed in a sterile container with sterile phosphate saline buffer with pH = 7.4. The sclera is dissected from front to back by two, three or four meridional sections 2/3 of the length of the eyeball parallel to the anteroposterior axis of the eye at regular intervals to obtain two, three or four “petals” of the sclera. The “petals” of the sclera bend one by one and from the suprachoroidal space the vortical veins and the intrascleral part of the optic nerve cross, and then the sclera is removed from the surgical field. Next, three sections of the COD are made - the first circular section - at a distance of 1 mm from the dentate line, one meridional section - in any meridian in the direction from the first section from front to back to the optic disc stump and the second circular section at a distance of 1 mm from the optic nerve stump; further, COD is carefully separated from the neural retina with tweezers and laid on the bottom of the sterile Petri dish in the “RPE cells up” position and nutrient medium of the following composition is added to it: DMEM / F12 - 89%, fetal calf serum - 10%, antibiotic mixture including penicillin 10000 IU / ml, streptomycin 10000 μg / ml, amphotericin 25 μg / ml - 1%; while the organ culture of COD is incubated at 37 ° C and at 5% concentration of CO ₂ , the nutrient medium is replaced 2 times a day.

Способ поясняется примером.The method is illustrated by an example.

Пример. Глазное яблоко донора-трупа, мужчины 56 лет, после удаления роговично-склерального диска (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет выявления сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, глазное яблоко полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4 (ПанЭко, Россия), склеру рассекают спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склера удаляется из операционного поля. Далее производится три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри (60*15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея) в положении «клетками РПЭ вверх». В чашку Петри добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 (БиолоТ, Россия) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США) - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл (MP Biomedicals, LLC, США) - 1%, получая таким образом органную культуру ХПК; при этом культуру инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ (инкубатор NU-5510, NuAire, США), питательную среду заменяют 2 раза в день.Example. Eyeball of a corpse donor, male, 56 years old, after removal of the corneal-scleral disk (Permission to use the new medical technology FS No. 2010/243 of June 24, 2010 “Algorithm for harvesting human corpse corneas for transplantation”) is examined for end-to-end lesions of the rainbow shell, ciliary body and the visible part of the MTR. After making sure of the integrity of the indicated structures and the absence of the vitreous body beyond the vitreous cavity, the eyeball is completely immersed in a sterile container with a sterile phosphate-saline buffer with pH = 7.4 (PanEco, Russia), the sclera is dissected from front to back with three 2 / 3 from the length of the eyeball parallel to the anteroposterior axis of the eye at regular intervals to obtain three sclera “petals”. The "petals" of the sclera bend one by one and from the suprachoroidal space the vortical veins and the intrascleral part of the optic nerve cross, and then the sclera is removed from the surgical field. Next, three sections of the COD are made - the first circular section - at a distance of 1 mm from the dentate line, one meridional section in the direction from the first section from front to back to the stump of the optic disc and the second circular section at a distance of 1 mm from the stump of the optic nerve; Further, COD is carefully separated from the neural retina with tweezers and laid on the bottom of a sterile Petri dish (60 * 15 mm, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Korea) in the position “RPE cells up”. The following medium is added to a Petri dish: DMEM / F12 (BioloT, Russia) - 89%, fetal calf serum (HyClone, USA) - 10%, a mixture of antibiotics, including penicillin 10,000 IU / ml, streptomycin 10,000 μg / ml, amphotericin 25 μg / ml (MP Biomedicals, LLC, USA) - 1%, thus obtaining an organ culture of COD; while the culture is incubated at 37 ° C and 5% concentration of CO ₂ (incubator NU-5510, NuAire, USA), the nutrient medium is replaced 2 times a day.

Claims

A method for producing an organ culture of a choroid-pigment complex (COD) from the eyes of an adult corpse donor, including removing a corneal-scleral disk from the corpse-donor corpse donor eyeball, characterized in that in the absence of through injuries of the iris, ciliary body and the visible part of the choroid itself (CCO) and the vitreous beyond the vitreous cavity, the eyeball without a corneal scleral disk is completely immersed in a container with phosphate-buffered saline with a pH of 7.4, and the cells are completely separated ry from MTR by dissection of the sclera meridian section from front to back to 2, 3 or 4 "petals" and intersection side suprachoroidal space vortikoznyh veins and vnutriskleralnoy portion of the optic nerve; produce three sections of COD, consisting of MTR and retinal pigment epithelium (RPE), - the first circular section - at a distance of 1 mm from the dentate line, one meridional section - in any meridian in the direction from the first section from front to back to the cult of the optic disc and the second circular incision at a distance of 1 mm from the stump of the optic nerve; Further, COD is carefully separated from the neural retina with tweezers, placed on the bottom of the sterile Petri dish in the position of RPE cells upwards, and the following nutrient medium is added to it: Dulbecco medium with Ham F12 medium - 89%, fetal calf serum - 10%, mixture antibiotics, including penicillin 10,000 IU / ml, streptomycin 10,000 μg / ml, amphotericin 25 μg / ml - 1%, while the culture is incubated at 37 ° C and at 5% concentration of CO ₂ , the nutrient medium is replaced 2 times a day.