RU2576535C1 - Method of octa-galact-uronide production - Google Patents
Method of octa-galact-uronide production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2576535C1 RU2576535C1 RU2014146446/13A RU2014146446A RU2576535C1 RU 2576535 C1 RU2576535 C1 RU 2576535C1 RU 2014146446/13 A RU2014146446/13 A RU 2014146446/13A RU 2014146446 A RU2014146446 A RU 2014146446A RU 2576535 C1 RU2576535 C1 RU 2576535C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pectin
- octagalacturonide
- liquid phase
- oligogalacturonides
- concentration
- Prior art date
Links
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам получения индивидуальных олигогалактуронидов - низкомолекулярных производных полигалактуроновой кислоты и может быть использовано в различных отраслях промышленности, науки и медицины, в частности в фармацевтической промышленности для создания низкомолекулярных сорбентов, противоопухолевых препаратов и систем адресной доставки лекарственных веществ, а также для стандартизации образцов поли- и олигоуронидов.The invention relates to methods for producing individual oligogalacturonides - low molecular weight derivatives of polygalacturonic acid and can be used in various industries, science and medicine, in particular in the pharmaceutical industry to create low molecular weight sorbents, antitumor drugs and targeted drug delivery systems, as well as to standardize poly samples - and oligouronides.
Полигалактуроновая кислота является основой молекул пектинов - высокомолекулярных природных полимеров, входящих в состав первичных клеточных стенок и срединных пластинок всех высших цветковых растений. Часть остатков полигалактуроновой кислоты в пектине находится в форме метиловых эфиров. Если доля таких остатков составляет менее 50%, то такой пектин считается низкоэтерифицированным. Полностью деэтерифицированный, то есть не содержащий метиловых эфиров или содержащий незначительное их количество пектин называется также пектовой кислотой.Polygalacturonic acid is the basis of the molecules of pectins - high molecular weight natural polymers that make up the primary cell walls and middle plates of all higher flowering plants. Part of the residues of polygalacturonic acid in pectin is in the form of methyl esters. If the proportion of such residues is less than 50%, then such pectin is considered to be low esterified. Fully deesterified, that is, containing no methyl esters or containing a small amount of them, pectin is also called pectic acid.
Получение индивидуальных олигогалактуронидов включает два этапа. В начале получают смесь олигогалактуронидов путем деполимеризации пектинов или деполимеризацией чистой полигалактуроновой кислоты, предварительно выделенной из пектинов. Для этого может применяться ряд известных методов, из которых наиболее распространенными являются ферментативный и кислотный гидролиз пектиновых веществ. На втором этапе осуществляют сепарацию полученной смеси олигогалактуронидов с выделением индивидуальных олигомеров. В настоящее время практически единственных известным способом получения индивидуальных олигогалактуронидов является метод препаративной жидкостной хроматографии.Obtaining individual oligogalacturonides involves two stages. First, a mixture of oligogalacturonides is obtained by depolymerizing pectins or by depolymerizing pure polygalacturonic acid previously isolated from pectins. For this, a number of known methods can be applied, of which the most common are enzymatic and acid hydrolysis of pectin substances. At the second stage, the obtained mixture of oligogalacturonides is separated with the isolation of individual oligomers. Currently, almost the only known method for producing individual oligogalacturonides is the method of preparative liquid chromatography.
Так, известен метод получения олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 2 до 7 с использованием автоматизированного комплекса препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖЭХ) (Hotchkiss A., Hicks K., Doner L., Irwin P. Isolation of oligogalacturonic acids in gram quantities by preparative h.p.l.c. // Carbohydrate Research. 1991. Vol. 215. P. 81-90). Согласно этому методу полигалактуроновую кислоту в виде 1% раствора в начале гидролизуют до олигогалактуронидов с помощью пектинолитических ферментов - полигалактуроназы и пектат-лиазы в 11,5 мМ Трис-буфере с рН 8,5 при 30°С и непрерывном перемешивании. Полученный гидролизат нейтрализуют, затем упаривают при 35°С под вакуумом до минимального объема и сушат в лиофильной сушилке. Затем полученную смесь олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 2 до 12 разделяют на препаративной ионообменной колонке Dynamax - 60 A NH2 (21,4*250 мм) в изократическом режиме: элюент - 0,85-0,9 М ацетатный буфер с рН 5, скорость мобильной фазы - 10 мл/мин. При работе хроматографического комплекса в непрерывном (повторно-циклическом) режиме его производительность составляла 10,9 мг/ч по высшему разделяемому олигомеру - гептагалактурониду (степень полимеризации - 7). Чистота получаемого гептагалактуронида составляла около 98%, выход - 1,9% от общего содержания олигогалактуронидов.Thus, a method is known for producing oligogalacturonides with a degree of polymerization from 2 to 7 using an automated preparative high performance liquid chromatography (HPLC) complex (Hotchkiss A., Hicks K., Doner L., Irwin P. Isolation of oligogalacturonic acids in gram quantities by preparative hplc // Carbohydrate Research. 1991. Vol. 215. P. 81-90). According to this method, polygalacturonic acid in the form of a 1% solution is first hydrolyzed to oligogalacturonides using pectinolytic enzymes - polygalacturonase and pectate lyase in 11.5 mm Tris buffer with a pH of 8.5 at 30 ° C with continuous stirring. The resulting hydrolyzate is neutralized, then evaporated at 35 ° C under vacuum to a minimum volume and dried in a freeze dryer. Then the resulting mixture of oligogalacturonides with a degree of polymerization from 2 to 12 is separated on a Dynamax preparative ion-exchange column - 60 A NH 2 (21.4 * 250 mm) in isocratic mode: eluent - 0.85-0.9 M acetate buffer with pH 5, the speed of the mobile phase is 10 ml / min. When the chromatographic complex was operating in a continuous (recycle) mode, its productivity was 10.9 mg / h in terms of the highest separable oligomer - heptagalacturonide (polymerization degree - 7). The purity of the obtained heptagalacturonide was about 98%, the yield was 1.9% of the total content of oligogalacturonides.
Недостатком данного метода является низкий выход высших олигогалактуронидов. Данный недостаток является общим для методов, использующих ферментативный способ гидролиза полигалактуроновой кислоты, так как в силу специфики действия большинства пектинолитических ферментных препаратов в продуктах гидролиза преобладают олигогалактурониды со степенью полимеризации меньше 7.The disadvantage of this method is the low yield of higher oligogalacturonides. This disadvantage is common for methods using the enzymatic method of hydrolysis of polygalacturonic acid, since due to the specificity of the action of most pectinolytic enzyme preparations, oligogalacturonides with a degree of polymerization of less than 7 prevail in the hydrolysis products.
Другим, более существенным недостатком данного метода является то, что с его помощью не удается добиться получения октагалактуронида. Сами авторы метода на основе анализа литературных данных объясняют эту неудачу тем, что разделение олигогалактуронидов со степенью полимеризации больше 7 методами препаративной жидкостной хроматографии является достаточно проблематичным. Another, more significant drawback of this method is that with its help it is not possible to obtain octagalacturonide. The authors of the method themselves, based on the analysis of published data, explain this failure by the fact that the separation of oligogalacturonides with a degree of polymerization of more than 7 by preparative liquid chromatography methods is quite problematic.
К недостаткам данного метода следует отнести также низкую производительность использованной хроматографической системы при получении высших олигогалактуронидов - 10,9 мг/ч по гептагалактурониду, при том, что авторы позиционируют данный автоматизированный комплекс препаративной ВЖЭХ как один из самых высокопроизводительных. С учетом высокой стоимости данного комплекса и высоких затрат на его эксплуатацию такая низкая производительность по высшим олигогалактуронидам может сделать их производство на указанном комплексе нерентабельным.The disadvantages of this method include the low productivity of the chromatographic system used to obtain higher oligogalacturonides - 10.9 mg / h on heptagalacturonide, despite the fact that the authors position this automated complex preparative HPLC as one of the highest performing. Given the high cost of this complex and the high costs of its operation, such a low productivity for higher oligogalacturonides can make their production in this complex unprofitable.
Известен способ получения олигогалактуронидов путем кислотного гидролиза пектина (патент РФ № 2441025, МПК C08B 37/06, опубл. 27.01.2012 г.). Согласно этому способу в качестве исходного сырья используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%, нерастворимый в кислой среде, что позволяет проводить процесс гидролиза пектина в гетерофазной системе (суспензии). Это позволяет повысить концентрацию пектина до 5-15% и, соответственно, увеличить содержание олигогалактуронидов в гидролизате. Гидролиз низкоэтерифицированного пектина ведут в 0,1-2,0 М растворе минеральной кислоты и температуре 70-100°С, время процесса рассчитывается по специальной формуле. Жидкий гидролизат отделяют от остатка пектина (который затем может использоваться для следующего цикла гидролиза) фильтрацией или центрифугированием и нейтрализуют до рН не менее 4,0 М раствором гидроксида натрия. Олигогалактурониды осаждают из гидролизата добавлением органического растворителя (этанола, изопропанола или ацетона) до концентрации 70%, осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием и сушат при 80°С. A known method of producing oligogalacturonides by acid hydrolysis of pectin (RF patent No. 2441025, IPC C08B 37/06, publ. January 27, 2012). According to this method, low-esterified pectin with an esterification degree of not more than 30%, insoluble in an acidic medium is used as feedstock, which allows the process of hydrolysis of pectin in a heterophasic system (suspension). This allows you to increase the concentration of pectin to 5-15% and, accordingly, increase the content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. Hydrolysis of low esterified pectin is carried out in a 0.1-2.0 M solution of mineral acid and a temperature of 70-100 ° C, the process time is calculated by a special formula. The liquid hydrolyzate is separated from the pectin residue (which can then be used for the next hydrolysis cycle) by filtration or centrifugation and neutralized to a pH of at least 4.0 M sodium hydroxide solution. Oligogalacturonides are precipitated from the hydrolyzate by adding an organic solvent (ethanol, isopropanol or acetone) to a concentration of 70%, the precipitate of oligogalacturonides is separated by centrifugation and dried at 80 ° C.
Недостатком данного способа является то, что способ не позволяет выделить индивидуальный октагалактуронид из получаемой смеси олигогалактуронидов.The disadvantage of this method is that the method does not allow you to select individual octagalacturonide from the resulting mixture of oligogalacturonides.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ получения олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 6 до 16 путем кислотного гидролиза цитрусового пектина и последующего разделения олигогалактуронидов с использованием препаративной хроматографии низкого давления (Lo V.-M., Hahn M., Halbeek H. Preparation, purification, and structural characterization of linear oligogalacturonides. An FAB-mass spectrometric and NMR spectroscopic study // Carbohydrate Research. 1994. Vol. 255. P. 271-284). Согласно этому способу цитрусовый пектин общей массой 10 г гидролизуют в 2 М трифторуксусной кислоте при 85°С и концентрации пектина 1% в течение 4 часов при периодическом перемешивании, затем охлаждают и фильтруют. Полученный фильтрат сушат до пастообразного состояния под вакуумом при 35°С, промывают метанолом - 4 раза по 10 мл, сушат, затем суспендируют в 100 мл деионизированной воды и доводят рН смеси до 7 с помощью 5 М раствора имидазола. Смесь оставляют на ночь при 4°С и перемешивании, затем последовательно фильтруют через фильтры Whatman GF/A, Millipore HA 0,45 мкм, Millipore GS 0,22 мкм и конечный фильтрат лиофилизируют. В результате получают 3,5 грамма сухого гидролизата пектина, который по расчетам представляет собой смесь примерно равных количеств имидазола, нейтральных сахаров и олигогалактоуронидов. Полученный гидролизат пектина подвергают предварительному разделению на ионообменной хроматографической колонке (3*12 см) с QAE-Сефадексом. Для этого колонку уравновешивают 125 мМ имидазольным буфером с рН 7. 1 г сухого гидролизата пектина растворяют в 100 мл воды, доводят проводимость раствора до 6,7 мОм-1 имидазольным буфером и загружают в колонку. Затем колонку последовательно элюируют имидазольным буфером (рН 7) с возрастающей концентрацией: 400 мл/125 мМ, 400 мл/550 мМ и 200 мл/750 мМ. Фракцию элюата, полученную с последней промывки (200 мл/750 мМ), концентрируют в роторном испарителе до объема 5 мл и обессоливают на колонке (3*18 см) с Сефадексом G-10. Затем обессоленную фракцию, содержащую олигогалактурониды со степенью полимеризации 6-16, разделяют на индивидуальные олигогалактурониды с помощью ионообменной хроматографии высокого разрешения на препаративной колонке (3,5*40 см) с Q-Сефарозой. Для этого на колонку, уравновешенную 450 мМ имидазольным буфером с рН 7, загружают 160 мг обессоленной фракции, растворенной в 40 мл того же буфера, и элюируют линейным градиентом имидазольного буфера концентрацией от 450 мМ (2,6 л) до 750 мМ (2,6 л). Собирают фракции по 10 мл, в которых определяют содержание уроновых кислот колориметрическим методом и объединяют фракции, соответствующие выходу (пику) определенного олигогалактуронида. Объединенные фракции обессоливают на колонке с Сефадексом G-10 или диализом. Чистота полученного данным способом октагалактуронида составляет около 90%. Количество октагалактуронида, полученного за один цикл разделения исходной смеси олигогалактуронидов, составляет 11-14 мг, что соответствует расчетной величине выхода - 2,8-3,5% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате.The closest in technical essence and the achieved result to the claimed method is a method for producing oligogalacturonides with a polymerization degree from 6 to 16 by acid hydrolysis of citrus pectin and subsequent separation of oligogalacturonides using preparative low-pressure chromatography (Lo V.-M., M. Hahn, Halbeek H. Preparation, purification, and structural characterization of linear oligogalacturonides. An FAB-mass spectrometric and NMR spectroscopic study // Carbohydrate Research. 1994. Vol. 255. P. 271-284). According to this method, citrus pectin with a total weight of 10 g is hydrolyzed in 2 M trifluoroacetic acid at 85 ° C and a pectin concentration of 1% for 4 hours with periodic stirring, then cooled and filtered. The obtained filtrate is dried to a paste-like state under vacuum at 35 ° C, washed with methanol 4 times in 10 ml, dried, then suspended in 100 ml of deionized water and the mixture is adjusted to pH 7 with a 5 M imidazole solution. The mixture was left overnight at 4 ° C. with stirring, then filtered successively through Whatman GF / A, Millipore HA 0.45 μm, Millipore GS 0.22 μm filters and the final filtrate was lyophilized. The result is 3.5 grams of dry pectin hydrolyzate, which is estimated to be a mixture of approximately equal amounts of imidazole, neutral sugars, and oligogalacturonides. The obtained pectin hydrolyzate is subjected to preliminary separation on an ion exchange chromatographic column (3 * 12 cm) with QAE-Sephadex. For this, the column is equilibrated with 125 mM imidazole buffer with pH 7. 1 g of dry pectin hydrolyzate is dissolved in 100 ml of water, the solution conductivity is adjusted to 6.7 mOhm -1 with imidazole buffer and loaded into the column. The column is then subsequently eluted with imidazole buffer (pH 7) with increasing concentration: 400 ml / 125 mm, 400 ml / 550 mm and 200 ml / 750 mm. The eluate fraction obtained from the last wash (200 ml / 750 mmol) was concentrated in a rotary evaporator to a volume of 5 ml and desalted on a column (3 * 18 cm) with Sephadex G-10. Then, the desalted fraction containing oligogalacturonides with a polymerization degree of 6–16 is separated into individual oligogalacturonides by high-resolution ion exchange chromatography on a preparative column (3.5 * 40 cm) with Q-Sepharose. To do this, 160 mg of the desalted fraction dissolved in 40 ml of the same buffer are loaded onto a column equilibrated with 450 mM imidazole buffer with pH 7 and eluted with a linear gradient of imidazole buffer with a concentration of 450 mM (2.6 L) to 750 mM (2, 6 l). Fractions of 10 ml are collected, in which the content of uronic acids is determined by the colorimetric method and the fractions corresponding to the yield (peak) of a specific oligogalacturonide are combined. The combined fractions were desalted on a Sephadex G-10 column or dialysis. The purity of octagalacturonide obtained by this method is about 90%. The amount of octagalacturonide obtained in one cycle of separation of the initial mixture of oligogalacturonides is 11-14 mg, which corresponds to a calculated yield of 2.8-3.5% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate.
Существенным недостатком данного способа является его сложность и многостадийность. Как видно из описания способа, перед осуществлением хроматографического разделения образцов требуется их длительная подготовка, связанная с проведением достаточно большого числа манипуляций с образцами и использование для этого различного, в том числе достаточно сложного и дорогостоящего оборудования. При этом сам процесс хроматографического разделения при низком давлении является относительно долгим и трудоемким. Соотношение количества октагалактуронида, получаемого за один цикл двухстадийной хроматографической очистки (11-14 мг), и стоимости задействованного хроматографического и вспомогательного оборудования вызывает, так же как и в предыдущем примере, определенные сомнения в рентабельности данного метода. При этом известным недостатком хроматографического метода фракционирования веществ является сложность его масштабирования, так как при увеличении размеров хроматографической колонки нарушается равномерность движения мобильной фазы и, соответственно, ухудшается разделение веществ, а увеличение количества колонок требует соответствующего увеличения дорогостоящего хроматографического оборудования. Причем стоимость самих колонок обычно составляет не более 5-10% от стоимости всей хроматографической установки. A significant disadvantage of this method is its complexity and multi-stage. As can be seen from the description of the method, before carrying out chromatographic separation of the samples, their lengthy preparation is required, associated with a sufficiently large number of manipulations with the samples and the use of various, including rather complicated and expensive equipment for this. Moreover, the process of chromatographic separation at low pressure is relatively long and laborious. The ratio of the amount of octagalacturonide obtained in one cycle of two-stage chromatographic purification (11-14 mg), and the cost of the chromatographic and auxiliary equipment involved, causes, as in the previous example, certain doubts about the profitability of this method. At the same time, a known drawback of the chromatographic method of fractionation of substances is the difficulty of scaling it, since with an increase in the size of the chromatographic column, the uniformity of the movement of the mobile phase is violated and, accordingly, the separation of substances deteriorates, and an increase in the number of columns requires a corresponding increase in expensive chromatographic equipment. Moreover, the cost of the columns themselves is usually not more than 5-10% of the cost of the entire chromatographic installation.
Другим недостатком данного способа является низкая исходная концентрация пектина в растворе - 1%. Результатом этого является низкая скорость гидролиза (так как она при неизменной константе гидролиза пропорциональна концентрации пектина в растворе) и соответственно низкая концентрация олигогалактуронидов в готовом гидролизате (расчетная концентрация олигогалактуронидов 1-1,5 мг/мл, октагалактуронида - 0,031-0,047 мг/мл). Это, в свою очередь, приводит к более высоким удельным затратам на производство единицы массы продукта. В данном случае это, например, затраты, связанные с термостатированием всего объема гидролизата при 85°С и расходом кислоты на гидролиз.Another disadvantage of this method is the low initial concentration of pectin in solution - 1%. The result is a low rate of hydrolysis (since at a constant hydrolysis constant it is proportional to the concentration of pectin in the solution) and, accordingly, a low concentration of oligogalacturonides in the finished hydrolyzate (calculated concentration of oligogalacturonides 1-1.5 mg / ml, octagalacturonide - 0.031-0.047 mg / ml) . This, in turn, leads to higher unit costs for the production of a unit mass of the product. In this case, this is, for example, the costs associated with thermostating the entire volume of the hydrolyzate at 85 ° C and the acid consumption for hydrolysis.
Препятствием для существенного повышения концентрации пектина в растворе является то обстоятельство, что высокомолекулярные пектины уже при концентрации около 1% образуют достаточно вязкие растворы и использование более концентрированных растворов пектинов может создать определенные технологические трудности. Высоковязкие растворы при низких концентрациях образуют практически все коммерческие пектины, так как именно с этой способностью связано одно из главных направлений их использования - в качестве загустителей и структурирующих агентов в пищевой промышленности. Так, например, вязкость 1,5% раствора коммерческого цитрусового пектина (производитель - Herbstreith & Fox KG, Германия) в 25-30 раз превышает вязкость воды.An obstacle to a significant increase in the concentration of pectin in the solution is the fact that high molecular weight pectins even at a concentration of about 1% form fairly viscous solutions and the use of more concentrated pectin solutions can create certain technological difficulties. Highly viscous solutions at low concentrations form almost all commercial pectins, since this ability is associated with one of the main directions of their use - as thickeners and structuring agents in the food industry. For example, the viscosity of a 1.5% solution of commercial citrus pectin (manufacturer - Herbstreith & Fox KG, Germany) is 25-30 times higher than the viscosity of water.
Еще одним недостатком данного способа является использование для гидролиза пектина дорогостоящего и токсичного реагента - трифторуксусной кислоты. Another disadvantage of this method is the use for the hydrolysis of pectin, an expensive and toxic reagent - trifluoroacetic acid.
Задачей, поставленной перед изобретением, является упрощение и удешевление способа получения октагалактуронида и повышение чистоты целевого продукта. The task of the invention is to simplify and reduce the cost of the method for producing octagalacturonide and increase the purity of the target product.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения октагалактуронида, включающем кислотный гидролиз пектина с последующим отделением жидкой фазы от нерастворившегося остатка пектина и выделением целевого продукта, согласно изобретению, в качестве исходного сырья для гидролиза используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%. Кислотный гидролиз ведут в 0,1-2,0 М растворе минеральной кислоты при температуре 70-100°С до достижения концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе не менее 0,25 мг/мл. Жидкую фазу после отделения от нерастворившегося остатка пектина нейтрализуют до рН не менее 4,0 и добавляют соль кальция до концентрации 0,06-0,12 моль/л, выпавший осадок октагалактуронида отделяют от жидкой фазы, промывают водой и сушат. This goal is achieved by the fact that in the known method for producing octagalacturonide, including acid hydrolysis of pectin, followed by separation of the liquid phase from the insoluble pectin residue and isolation of the target product according to the invention, low-esterified pectin with an esterification degree of not more than 30% is used as a feedstock for hydrolysis. Acid hydrolysis is carried out in a 0.1-2.0 M solution of mineral acid at a temperature of 70-100 ° C until the concentration of oligogalacturonides in the liquid phase reaches at least 0.25 mg / ml. The liquid phase after separation from the insoluble pectin residue is neutralized to a pH of at least 4.0 and a calcium salt is added to a concentration of 0.06-0.12 mol / L, the precipitated precipitate of octagalacturonide is separated from the liquid phase, washed with water and dried.
Полученный октагалактуронид находится в форме кальциевой соли, которая обладает рядом преимуществ: при нейтральный и щелочных значениях рН она не растворима в воде и может быть использована в виде легко разделяемой суспензии для проведения химических модификаций или исследования сорбционных взаимодействий. Данная соль не гигроскопична, удобна для хранения и проведения процессов влажного гранулирования при получении медицинских композиций. При этом, в случае необходимости, данная соль может быть легко переведена в раствор путем простого подкисления среды до рН ниже 4,0 или добавлением веществ, связывающих кальций, например лимонной кислоты или Трилона Б. The obtained octagalacturonide is in the form of a calcium salt, which has several advantages: at neutral and alkaline pH values, it is insoluble in water and can be used as an easily separable suspension for chemical modifications or studies of sorption interactions. This salt is not hygroscopic, convenient for storage and carrying out wet granulation processes in the preparation of medical compositions. At the same time, if necessary, this salt can be easily converted into a solution by simply acidifying the medium to a pH below 4.0 or by adding calcium binders, such as citric acid or Trilon B.
Чистота полученного октагалактуронида, установленная спектрофотометрическим методом, в пересчете на кальциевую соль составляет не менее 99,5%. Чистота октагалактуронида как индивидуального олигогалактуронида по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляет 98,3-99,5% - то есть содержание примеси других олигогалактуронидов по отношению к октагалактурониду не превышает 0,5-1,7%. The purity of the obtained octagalacturonide, established by spectrophotometric method, in terms of calcium salt, is at least 99.5%. The purity of octagalacturonide as an individual oligogalacturonide according to exclusion HPLC is 98.3-99.5% - that is, the impurity content of other oligogalacturonides with respect to octagalacturonide does not exceed 0.5-1.7%.
Использование в качестве исходного сырья для гидролиза низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации не более 30%, имеющего ограниченную набухаемость в кислой среде, позволяет проводить процесс кислотного гидролиза в гетерофазной системе − суспензии: гель низкоэтерифицированного пектина (твердая фаза) - раствор минеральной кислоты (жидкая фаза), что позволяет на практике повысить концентрацию пектина в суспензии до 5-15%. Использование таких высоких, по сравнению с прототипом, концентраций пектина при прочих равных условиях (при одинаковой степени гидролиза пектина) позволяет получать гидролизаты с соответственно большим процентным содержанием конечного продукта - октагалактуронида, что значительно уменьшает удельные затраты на производство единицы массы продукта, и, таким образом, ведет к упрощению и удешевлению процесса. С другой стороны, использование высоких концентраций пектина позволяет достигать желаемой концентрации октагалактуронида за более короткое время гидролиза. При этом, как установлено авторами в ходе экспериментов, с уменьшением времени гидролиза происходит увеличение выхода целевого продукта - то есть увеличение доли октагалактуронида в продуктах гидролиза - олигогалактуронидах. Это, возможно, связано с уменьшением гидролиза октагалактуронида в жидкой фазе при сокращении общего времени гидролиза.The use of low-esterified pectin with a degree of esterification of not more than 30% as a raw material for hydrolysis, with limited swelling in an acidic medium, allows the acid hydrolysis process in a heterophasic system - suspension: low-esterified pectin gel (solid phase) - mineral acid solution (liquid phase) , which allows in practice to increase the concentration of pectin in suspension to 5-15%. The use of such high, in comparison with the prototype, concentrations of pectin, ceteris paribus (with the same degree of hydrolysis of pectin) allows to obtain hydrolysates with a correspondingly high percentage of the final product - octagalacturonide, which significantly reduces the unit cost of producing a unit mass of the product, and thus , leads to a simplification and cheaper process. On the other hand, the use of high concentrations of pectin allows you to achieve the desired concentration of octagalacturonide in a shorter hydrolysis time. Moreover, as established by the authors during the experiments, with a decrease in the hydrolysis time, an increase in the yield of the target product occurs - that is, an increase in the proportion of octagalacturonide in the hydrolysis products — oligogalacturonides. This is possibly due to a decrease in the hydrolysis of octagalacturonide in the liquid phase while reducing the total hydrolysis time.
При увеличении степени этерификации более 30% происходит резкое увеличение объема набухшего геля пектина и значительное снижение его механической прочности, что существенно осложняет последующее отделение геля пектина от жидкой фазы, также возможен частичный переход высокомолекулярного пектина в жидкую фазу.With an increase in the degree of esterification of more than 30%, there is a sharp increase in the volume of the swollen pectin gel and a significant decrease in its mechanical strength, which greatly complicates the subsequent separation of pectin gel from the liquid phase, and partial transition of high molecular weight pectin to the liquid phase is also possible.
Для осуществления заявленного способа может быть использован практически любой коммерческий пектин. Для этого предварительно проводят снижение его степени этерификации до необходимой величины в пределах 0-30%, используя любой из известных методов деэтерификации: щелочной, кислотный или ферментативный. Наиболее удобным и экономичным, по мнению авторов, может считаться метод щелочной деэтерификации пектина в среде органического растворителя, например этанола или изопропанола. Данный метод приводится ниже, в описании осуществления заявляемого способа.Almost any commercial pectin can be used to carry out the claimed method. For this, a reduction in its degree of esterification to the required value in the range of 0-30% is preliminarily carried out using any of the known methods of deesterification: alkaline, acidic or enzymatic. The most convenient and economical, according to the authors, can be considered the method of alkaline deesterification of pectin in an organic solvent, for example ethanol or isopropanol. This method is given below in the description of the implementation of the proposed method.
Указанные ограничения температуры и концентрации кислоты связаны, в первую очередь, с экономическими и технологическими причинами. Так при температуре среды ниже 70°С и концентрации кислоты ниже 0,1 моль/л происходит существенное снижение скорости гидролиза пектина и значительное увеличение времени процесса, это ведет к повышению затрат на производство целевого продукта. При концентрации кислоты ниже 0,1 моль/л в получаемом октагалактурониде наблюдается появление олигогалактуронидов с более высокой молекулярной массой, то есть ухудшается чистота целевого продукта. The indicated limitations of temperature and acid concentration are associated primarily with economic and technological reasons. So at an ambient temperature below 70 ° C and an acid concentration below 0.1 mol / L, there is a significant decrease in the rate of pectin hydrolysis and a significant increase in process time, this leads to an increase in the cost of producing the target product. When the acid concentration is below 0.1 mol / L in the obtained octagalacturonide, the appearance of oligogalacturonides with a higher molecular weight is observed, that is, the purity of the target product deteriorates.
При температуре более 100°С резко ускоряются процессы термического разложения олигогалактуронидов - разрывы пиранозного цикла, окисление, декарбоксилирование, образование фурфурола и его производных. Это сопровождается снижением выхода олигогалактуронидов и загрязнением гидролизата продуктами их разложения. Увеличение концентрации кислоты более 2,0 моль/л не дает значительного увеличения скорости гидролиза, но приводит к существенному перерасходу кислоты и дополнительным затратам на ее последующую нейтрализацию и освобождение продукта от образовавшихся солей, что, в конечном результате, ведет к усложнению процесса получения целевого продукта. Кроме того, при концентрации кислоты более 2,0 моль/л может происходить снижение растворимости октагалактуронида и уменьшение его содержания в жидкой фазе.At temperatures above 100 ° C, the processes of thermal decomposition of oligogalacturonides are sharply accelerated - breaks in the pyranose cycle, oxidation, decarboxylation, formation of furfural and its derivatives. This is accompanied by a decrease in the yield of oligogalacturonides and contamination of the hydrolyzate with their decomposition products. An increase in the acid concentration of more than 2.0 mol / L does not give a significant increase in the rate of hydrolysis, but leads to a significant overspending of the acid and additional costs for its subsequent neutralization and release of the product from the formed salts, which, in the final result, complicates the process of obtaining the target product . In addition, at an acid concentration of more than 2.0 mol / L, a decrease in the solubility of octagalacturonide and a decrease in its content in the liquid phase may occur.
Нижнее ограничение концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе величиной 0,25 мг/мл связано с тем, что при более низких концентрациях олигогалактуронидов не удается осуществить в дальнейшем выделение (осаждение) из жидкой фазы индивидуального октагалактуронида с помощью соли кальция.The lower limitation of the concentration of oligogalacturonides in the liquid phase to 0.25 mg / ml is due to the fact that, at lower concentrations of oligogalacturonides, it is not possible to further isolate (precipitate) individual octagalacturonide from the liquid phase using a calcium salt.
Для определения содержания олигогалактуронидов в жидкой фазе может быть использован любой из известных методов, например фотометрический (Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. Vol. 54. P. 484-489).To determine the content of oligogalacturonides in the liquid phase, any of the known methods can be used, for example, photometric (Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. Vol. 54. P. 484 -489).
Нейтрализация жидкой среды до рН не менее 4,0 перед добавлением соли кальция обеспечивает необходимые условия для нормального формирования осадка октагалактуронида. При рН ниже 4,0 осадок октагалактуронида не образуется совсем или происходит его частичное образование в виде не осаждающейся коллоидной взвеси. The neutralization of the liquid medium to a pH of not less than 4.0 before adding calcium salts provides the necessary conditions for the normal formation of an octagalacturonide precipitate. At a pH below 4.0, an octagalacturonide precipitate does not form at all, or it partially forms in the form of a non-precipitating colloidal suspension.
Верхняя и нижняя границы концентрации соли кальция при осаждении октагалактуронида также обеспечивают необходимые условия формирования осадка октагалактуронида. При концентрации соли кальция менее 0,06 моль/л осадок октагалактуронида не образуется совсем или происходит его частичное образование в виде не осаждающейся коллоидной взвеси. При концентрации соли кальция более 0,12 моль/л может начаться осаждение других олигогалактуронидов (гептагалактуронида) и, соответственно, загрязнение осадка октагалактуронида. The upper and lower limits of the concentration of calcium salt during the precipitation of octagalacturonide also provide the necessary conditions for the formation of a precipitate of octagalacturonide. When the concentration of calcium salt is less than 0.06 mol / L, the precipitate of octagalacturonide does not form at all or it partially forms in the form of a non-precipitating colloidal suspension. With a calcium salt concentration of more than 0.12 mol / L, precipitation of other oligogalacturonides (heptagalacturonide) and, accordingly, contamination of the precipitate of octagalacturonide may begin.
При осаждении октагалактуронида процесс добавления соли кальция к жидкой фазе целесообразно вести при постоянном перемешивании, для того, чтобы избежать локального превышения концентрации соли кальция, при котором может произойти осаждение низших олигогалактуронидов и, соответственно, загрязнение ими осадка октагалактуронида. При этом соль кальция может добавляться к жидкой фазе в виде раствора или в сухом виде. When octagalacturonide is precipitated, it is advisable to add the calcium salt to the liquid phase with constant stirring in order to avoid a local excess of the calcium salt concentration, at which precipitation of lower oligogalacturonides can occur and, accordingly, contamination of the precipitate of octagalacturonide. In this case, the calcium salt can be added to the liquid phase in the form of a solution or in dry form.
В качестве соли кальция используют растворимую соль кальция, например хлористую, азотнокислую или уксуснокислую. As the calcium salt, a soluble calcium salt is used, for example, chloride, nitric acid or acetic acid.
В качестве минеральной кислоты могут быть использованы, в частности, соляная, серная, азотная кислоты.As a mineral acid, in particular, hydrochloric, sulfuric, and nitric acids can be used.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Пример 1. Example 1
30,0 г пектовой кислоты (Serva, № 31680) с содержанием галактуроновой кислоты - 82,2% и степенью этерификации - менее 1% смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л. Полученную 15% суспензию нагревают до 100°С на кипящей водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,5 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390 (артикул №3.103.150). Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. Объем полученного фильтрата составляет 230 мл, содержание олигогалактуронидов - 15,45 мг/мл.30.0 g of pectic acid (Serva, No. 31680) with a galacturonic acid content of 82.2% and an esterification degree of less than 1% are mixed with 200 ml of a 0.1 mol / L hydrochloric acid solution. The resulting 15% suspension is heated to 100 ° C in a boiling water bath and kept at this temperature with constant stirring for 2.5 hours. Then the suspension is cooled and filtered, to filter the suspension using a polypropylene filter cloth PL-30 (LOSMA, Italy) or a paper filter brand Sartorius 390 (article No. 3.103.150). The remaining pectin on the filter is washed with 150 ml of hydrochloric acid at a concentration of 0.1 mol / l for a more complete separation of oligogalacturonides. The volume of the obtained filtrate is 230 ml, the content of oligogalacturonides is 15.45 mg / ml.
Фильтрат нейтрализуют до рН 6,0 5,0 М раствором гидроокиси натрия. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 234 мл. Для осаждения октагалактуронида к фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 2,84 мл раствора хлорида кальция концентрацией 5 моль/л. Конечная концентрация хлорида кальция в смеси составляет 0,06 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием при относительном центробежном ускорении (ОЦУ) - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 250 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 290 мг. Содержание в продукте октагалактуронида, установленное спектрофотометрическим методом, составляет не менее 99,5% (более точное определение ограничено возможностями спектрофотометрического метода), что соответствует выходу октагалактуронида - 7,3% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате.The filtrate was neutralized to pH 6.0 with a 5.0 M sodium hydroxide solution. The volume of the filtrate after neutralization is 234 ml. To precipitate octagalacturonide, 2.84 ml of a 5 mol / L calcium chloride solution are added to the filtrate with constant stirring. The final concentration of calcium chloride in the mixture is 0.06 mol / L. The precipitated octagalacturonide precipitate is separated by centrifugation at a relative centrifugal acceleration (BCC) of 1500-2000 g for 15-20 minutes. After centrifugation and removal of the liquid phase, the obtained octagalacturonide precipitate was suspended in 250 ml of water for 5-10 minutes, then centrifuged at 2000 g of BCC for 20 minutes and the liquid phase was removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 290 mg. The content of octagalacturonide in the product, determined by spectrophotometric method, is at least 99.5% (more accurate determination is limited by the capabilities of the spectrophotometric method), which corresponds to the yield of octagalacturonide - 7.3% of the total oligogalacturonide content in the hydrolyzate.
Хроматографическая чистота полученного октагалактуронида составляет 99,0%. Оценку хроматографической чистоты продукта проводили методом эксклюзионной ВЖЭХ на колонке Shim Pack SCR-101P (Shimadzu) с использованием в качестве стандарта сравнения образца октагалактуронида, чистота которого была подтверждена методами масс-спектрометрии.The chromatographic purity of the obtained octagalacturonide is 99.0%. The chromatographic purity of the product was evaluated by size exclusion HPLC on a Shim Pack SCR-101P column (Shimadzu) using an octagalacturonide sample as a reference standard, the purity of which was confirmed by mass spectrometry.
Пример 2.Example 2
Получают низкоэтерифицированный пектин путем контролируемой щелочной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина. Для этого в 0,5 л 50% этанола растворяют 20,0 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100,0 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 50 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40,0 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 93,3 г, содержание галактуроновой кислоты - 76,5%, степень этерификации - 0%.Low esterified pectin is obtained by controlled alkaline deesterification of highly esterified pectin. To do this, 20.0 g of sodium hydroxide is dissolved in 0.5 l of 50% ethanol, then 100.0 g of highly esterified citrus pectin is added with stirring (Herbstreith & Fox KG, Germany). The mixture is stirred for 50 minutes, then 40.0 ml of concentrated hydrochloric acid are added in small portions, the pectin is filtered off, washed with 300 ml of 50% ethanol and dried at 80 ° C. The yield of low esterified pectin is 93.3 g, the content of galacturonic acid is 76.5%, the degree of esterification is 0%.
30,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 2,0 моль/л. Полученную 15% суспензию нагревают до 90°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,5 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтрткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390. Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. Объем полученного фильтрата составляет 242 мл, содержание олигогалактуронидов - 17,6 мг/мл.30.0 g of the obtained low esterified pectin are mixed with 200 ml of a 2.0 mol / L hydrochloric acid solution. The resulting 15% suspension is heated to 90 ° C in a water bath and kept at this temperature with constant stirring for 2.5 hours. Then the suspension is cooled and filtered, to filter the suspension, use a PL-30 polypropylene filter cloth (LOSMA, Italy) or a Sartorius 390 paper filter. The remaining pectin on the filter is washed with 150 ml of hydrochloric acid at a concentration of 0.1 mol / L to more completely separate oligogalacturonides. The volume of the obtained filtrate is 242 ml, the content of oligogalacturonides is 17.6 mg / ml.
Фильтрат нейтрализуют: в начале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 4,0. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 260 мл. Для осаждения октагалактуронида к фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 16,6 мл раствора ацетата кальция концентрацией 1 моль/л. Конечная концентрация ацетата кальция в смеси составляет 0,06 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием ОЦУ - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 400 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 445 мг, содержание октагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу октагалактуронида - 9,4% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота октагалактуронида - 98,3%. The filtrate is neutralized: in the beginning, with dry sodium hydroxide to pH 1-2, then with a 5.0 M sodium hydroxide solution to pH 4.0. The volume of the filtrate after neutralization is 260 ml. To precipitate octagalacturonide, 16.6 ml of a 1 mol / L calcium acetate solution was added to the filtrate with constant stirring. The final concentration of calcium acetate in the mixture is 0.06 mol / L. The precipitated precipitate of octagalacturonide is separated by centrifugation of BCC - 1500-2000 g for 15-20 minutes. After centrifugation and removal of the liquid phase, the obtained octagalacturonide precipitate was suspended for 5-10 minutes in 400 ml of water, then centrifuged at 2000 g of BCC for 20 minutes and the liquid phase was removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 445 mg, the content of octagalacturonide is not less than 99.5%, which corresponds to the yield of octagalacturonide - 9.4% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. The chromatographic purity of octagalacturonide is 98.3%.
Пример 3.Example 3
Получают низкоэтерифицированный пектин.Get low esterified pectin.
В 0,4 л 50% об. изопропанола растворяют 20 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100 г высокоэтерифицированного яблочного пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 10 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% изопропанола и сушат при 80-100°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 94,5 г, содержание галактуроновой кислоты - 78,4%, степень этерификации - 13,8%.In 0.4 l, 50% vol. 20 g of sodium hydroxide is dissolved in isopropanol, then 100 g of highly esterified apple pectin is added with stirring (Herbstreith & Fox KG, Germany). The mixture is stirred for 10 minutes, then gradually 40 ml of concentrated hydrochloric acid are added in small portions, the pectin is filtered off, washed with 300 ml of 50% isopropanol and dried at 80-100 ° C. The yield of low esterified pectin is 94.5 g, the content of galacturonic acid is 78.4%, the degree of esterification is 13.8%.
20,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора азотной кислоты концентрацией 1,0 моль/л. Полученную 10% суспензию нагревают до 70°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 1 часа. Затем суспензию охлаждают и центрифугируют 30 минут при ОЦУ 3000 g. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 122 мл, содержание олигогалактуронидов - 3,48 мг/мл.20.0 g of the obtained low esterified pectin are mixed with 200 ml of a 1.0 mol / L nitric acid solution. The resulting 10% suspension is heated to 70 ° C in a water bath and kept at this temperature with constant stirring for 1 hour. Then the suspension is cooled and centrifuged for 30 minutes at a BCC of 3000 g. The volume of the obtained centrate — the liquid phase — is 122 ml, the oligogalacturonide content is 3.48 mg / ml.
Жидкую фазу нейтрализуют: в начале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 6,0. Объем жидкой фазы после нейтрализации составляет 127 мл. Для осаждения октагалактуронида к фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 3,92 мл раствора нитрата кальция концентрацией 3 моль/л. Конечная концентрация нитрата кальция в смеси составляет 0,09 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 100 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 68,5 мг, содержание октагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу октагалактуронида - 14,5% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота октагалактуронида - 99,5%. The liquid phase is neutralized: in the beginning, with dry sodium hydroxide to pH 1-2, then with a 5.0 M sodium hydroxide solution to pH 6.0. The volume of the liquid phase after neutralization is 127 ml. To precipitate octagalacturonide, 3.92 ml of a 3 mol / L calcium nitrate solution is added to the filtrate with constant stirring. The final concentration of calcium nitrate in the mixture is 0.09 mol / L. The precipitated precipitate of octagalacturonide is separated by centrifugation at BCC - 1500-2000 g for 15-20 minutes. After centrifugation and removal of the liquid phase, the obtained octagalacturonide precipitate was suspended in 100 ml of water for 5-10 minutes, then centrifuged at 2000 g of BCC for 20 minutes and the liquid phase was removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 68.5 mg, the content of octagalacturonide is not less than 99.5%, which corresponds to the yield of octagalacturonide - 14.5% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. The chromatographic purity of octagalacturonide is 99.5%.
Пример 4.Example 4
Получают низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации 30% путем контролируемой щелочной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина.A low esterified pectin with an esterification degree of 30% is obtained by controlled alkaline deesterification of a highly esterified pectin.
Берут 50 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия) суспендируют в 0,5 л 60% об. этанола и постепенно, порциями добавляют 5,0 М раствор гидроокиси натрия, контролируя величину степени этерификации пектина в пробах, взятых после добавления каждой порции гидроокиси натрия. После достижения величины степени этерификации 30% к суспензии добавляют 20 мл концентрированной соляной кислоты (плотность - d=1,19 г/см3), пектин отделяют фильтрованием, промывают 150 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 47 г, содержание галактуроновой кислоты - 74,8%, степень этерификации - 30,0%.Take 50 g of highly esterified citrus pectin (Herbstreith & Fox KG, Germany), suspended in 0.5 l of 60% vol. ethanol and gradually, in portions, add a 5.0 M sodium hydroxide solution, controlling the degree of pectin esterification in samples taken after adding each portion of sodium hydroxide. After reaching an esterification degree of 30%, 20 ml of concentrated hydrochloric acid (density d = 1.19 g / cm 3 ) was added to the suspension, the pectin was filtered off, washed with 150 ml of 50% ethanol and dried at 80 ° C. The yield of low esterified pectin is 47 g, the content of galacturonic acid is 74.8%, the degree of esterification is 30.0%.
10,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. Полученную 5% суспензию нагревают до 80°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 1,5 часа. Затем суспензию охлаждают и центрифугируют 30 минут при ОЦУ 3000 g. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 115 мл, содержание олигогалактуронидов - 5,22 мг/мл.10.0 g of the obtained low esterified pectin are mixed with 200 ml of a 0.5 mol / L hydrochloric acid solution. The resulting 5% suspension is heated to 80 ° C in a water bath and maintained at this temperature with constant stirring for 1.5 hours. Then the suspension is cooled and centrifuged for 30 minutes at a BCC of 3000 g. The volume of the obtained centrate — the liquid phase — is 115 ml; the content of oligogalacturonides is 5.22 mg / ml.
Жидкую фазу нейтрализуют: в начале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 7,0. Объем жидкой фазы после нейтрализации составляет 118 мл. Для осаждения октагалактуронида к фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 3,65 мл раствора нитрата кальция концентрацией 3 моль/л. Конечная концентрация нитрата кальция в смеси составляет 0,09 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 100 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 83,0 мг, содержание октагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу октагалактуронида - 12,4% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота октагалактуронида - 99,3%. The liquid phase is neutralized: in the beginning, with dry sodium hydroxide to pH 1-2, then with a 5.0 M sodium hydroxide solution to pH 7.0. The volume of the liquid phase after neutralization is 118 ml. To precipitate octagalacturonide, 3.65 ml of a 3 mol / L calcium nitrate solution is added to the filtrate with constant stirring. The final concentration of calcium nitrate in the mixture is 0.09 mol / L. The precipitated precipitate of octagalacturonide is separated by centrifugation at BCC - 1500-2000 g for 15-20 minutes. After centrifugation and removal of the liquid phase, the obtained octagalacturonide precipitate was suspended in 100 ml of water for 5-10 minutes, then centrifuged at 2000 g of BCC for 20 minutes and the liquid phase was removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 83.0 mg, the content of octagalacturonide is not less than 99.5%, which corresponds to the yield of octagalacturonide - 12.4% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. The chromatographic purity of octagalacturonide is 99.3%.
Пример 5.Example 5
Проводят гидролиз низкоэтерифицированного цитрусового пектина и отделение жидкого гидролизата от остатка пектина, как было описано в предыдущем примере. Полученный жидкий гидролизат - жидкую фазу после центрифугирования разводят 0,5 М соляной кислотой до конечной концентрации олигогалактуронидов - 0,25 мг/мл и нейтрализуют: в начале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Для осаждения октагалактуронида к 800 мл нейтрализованной жидкой фазы при перемешивании добавляют 15,4 г сухого ацетата кальция. Конечная концентрация ацетата кальция в смеси составляет 0,12 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 25 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 19,6 мг, содержание октагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу октагалактуронида - 8,8% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота октагалактуронида - 98,8%. Hydrolysis of low esterified citrus pectin is carried out and liquid hydrolyzate is separated from the pectin residue, as described in the previous example. The resulting liquid hydrolyzate - the liquid phase after centrifugation is diluted with 0.5 M hydrochloric acid to a final concentration of oligogalacturonides - 0.25 mg / ml and neutralized: in the beginning - with dry sodium hydroxide to pH 1-2, then - 5.0 M sodium hydroxide solution to pH 8.0. To precipitate octagalacturonide, 15.4 g of dry calcium acetate are added to 800 ml of the neutralized liquid phase with stirring. The final concentration of calcium acetate in the mixture is 0.12 mol / L. The precipitated precipitate of octagalacturonide is separated by centrifugation at BCC - 1500-2000 g for 15-20 minutes. The obtained octagalacturonide precipitate, after centrifugation and removal of the liquid phase, is suspended in 25 ml of water for 5-10 minutes, then centrifuged at 2000 g of BCC for 20 minutes and the liquid phase is removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 19.6 mg, the content of octagalacturonide is not less than 99.5%, which corresponds to the yield of octagalacturonide - 8.8% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. The chromatographic purity of octagalacturonide is 98.8%.
Пример 6. Example 6
20,0 г пектовой кислоты (Serva, № 31680) с содержанием галактуроновой кислоты - 82,2% и степенью этерификации - менее 1% смешивают с 200 мл раствора серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. Полученную 10% суспензию нагревают до 90°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,0 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390. Остаток пектина на фильтре промывают 100 мл серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. К остатку пектина добавляют раствор серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л - до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - 2 часа при 90°С. Всего проводят 5 циклов гидролиза, каждый раз отделяя и промывая остаток пектина, как было описано выше. Общий объем полученного фильтрата составляет 1190 мл, содержание олигогалактуронидов - 12,4 мг/мл.20.0 g of pectic acid (Serva, No. 31680) with a galacturonic acid content of 82.2% and an esterification degree of less than 1% are mixed with 200 ml of a 0.5 mol / L sulfuric acid solution. The resulting 10% suspension is heated to 90 ° C in a water bath and kept at this temperature with constant stirring for 2.0 hours. Then the suspension is cooled and filtered, a PL-30 polypropylene filter cloth (LOSMA, Italy) or a Sartorius 390 brand paper filter is used to filter the suspension. The remaining pectin on the filter is washed with 100 ml of sulfuric acid at a concentration of 0.5 mol / L to more completely separate oligogalacturonides . A solution of sulfuric acid with a concentration of 0.5 mol / L is added to the pectin residue until the initial volume of the suspension is restored. The rest of the pectin is resuspended in the liquid phase and the next hydrolysis cycle is carried out under the previous conditions - 2 hours at 90 ° C. A total of 5 cycles of hydrolysis are carried out, each time separating and washing the remainder of the pectin, as described above. The total volume of the obtained filtrate is 1190 ml, the content of oligogalacturonides is 12.4 mg / ml.
Фильтрат нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 1235 мл. Для осаждения октагалактуронида к фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 16,5 г сухого хлорида кальция. Конечная концентрация хлорида кальция в смеси составляет 0,12 моль/л. Выпавший осадок октагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000 g в течение 15-20 минут. Полученный осадок октагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 1200 мл воды, затем центрифугируют при ОЦУ 2000 g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 1880 мг, содержание октагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу октагалактуронида - 11,5% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота октагалактуронида - 99,2%. The filtrate is neutralized: first, with dry sodium hydroxide to pH 1-2, then with a 5.0 M sodium hydroxide solution to pH 8.0. The volume of the filtrate after neutralization is 1235 ml. To precipitate octagalacturonide, 16.5 g of dry calcium chloride was added to the filtrate with constant stirring. The final concentration of calcium chloride in the mixture is 0.12 mol / L. The precipitated precipitate of octagalacturonide is separated by centrifugation at BCC - 1500-2000 g for 15-20 minutes. The obtained precipitate of octagalacturonide after centrifugation and removal of the liquid phase is suspended for 5-10 minutes in 1200 ml of water, then centrifuged at a BCC of 2000 g for 20 minutes and the liquid phase is removed. The remaining precipitate is dried at 80-100 ° C. The yield of dry product is 1880 mg, the content of octagalacturonide is not less than 99.5%, which corresponds to the yield of octagalacturonide - 11.5% of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate. The chromatographic purity of octagalacturonide is 99.2%.
Как видно из приведенных примеров, использование в заявляемом способе низкоэтерифицированного пектина в качестве исходного сырья для гидролиза позволяет повысить скорость процесса и, соответственно, концентрацию олигогалактуронидов в гидролизате в 2,32-11,7 раз, а концентрацию целевого продукта - октагалактуронида в гидролизате - в 11,7-35,1 раза по сравнению с прототипом и благодаря этому добиться соответствующего снижения удельных производственных затрат и времени на выпуск продукта. При этом в заявляемом способе выход октагалактуронида (в процентах от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате) повышен в 2,1-4,1 раз по сравнению с прототипом. As can be seen from the above examples, the use of low esterified pectin in the inventive method as a feedstock for hydrolysis allows to increase the speed of the process and, accordingly, the concentration of oligogalacturonides in the hydrolyzate by 2.32-11.7 times, and the concentration of the target product, octagalacturonide in the hydrolyzate, by 11.7-35.1 times in comparison with the prototype and due to this to achieve a corresponding reduction in specific production costs and time for the release of the product. Moreover, in the inventive method, the yield of octagalacturonide (as a percentage of the total content of oligogalacturonides in the hydrolyzate) is increased by 2.1-4.1 times in comparison with the prototype.
Кроме того, в заявляемом способе в отличие от известного способа, перед выделением октагалактуронида не требуется проведение сложной и длительной обработки жидкого гидролизата пектина - вся предварительная обработка сводится к нейтрализации гидролизата до рН не ниже 4,0. In addition, in the inventive method, in contrast to the known method, before the isolation of octagalacturonide, complex and lengthy treatment of the liquid pectin hydrolyzate is not required - all the preliminary processing is reduced to neutralizing the hydrolyzate to a pH of not lower than 4.0.
Одним из главный преимуществ заявляемого способа, по сравнению с известным способом, является то, что он позволяет заменить сложный и трудоемкий метод хроматографического выделения октагалактуронида на простой и дешевый метод его осаждения в виде кальциевой соли. При этом для выделения октагалактуронида по заявляемому способу вместо дорогостоящего хроматографического и вспомогательного оборудования требуется только мешалка и центрифуга.One of the main advantages of the proposed method, compared with the known method, is that it allows you to replace the complex and time-consuming method for the chromatographic separation of octagalacturonide by a simple and cheap method of precipitation in the form of calcium salt. In this case, to isolate octagalacturonide according to the claimed method, instead of expensive chromatographic and auxiliary equipment, only a stirrer and a centrifuge are required.
Более того, процесс получения октагалактуронида по заявляемому способу, в отличие от прототипа, легко поддается масштабированию, так как в нем для выделения октагалактуронида используется две простые технологические операции - осаждение солью кальция и центрифугирование, которые в отличие от методов колоночной хроматографии не имеют принципиальных ограничений для масштабирования.Moreover, the process of producing octagalacturonide according to the claimed method, unlike the prototype, can be easily scaled, since it uses two simple technological operations for precipitation of octagalacturonide - precipitation with calcium salt and centrifugation, which, unlike column chromatography methods, have no fundamental limitations for scaling.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014146446/13A RU2576535C1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method of octa-galact-uronide production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014146446/13A RU2576535C1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method of octa-galact-uronide production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2576535C1 true RU2576535C1 (en) | 2016-03-10 |
Family
ID=55654008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014146446/13A RU2576535C1 (en) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Method of octa-galact-uronide production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2576535C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7576070B2 (en) * | 2000-11-22 | 2009-08-18 | N.V. Nutricia | Method for producing pectin hydrolysis products |
| RU2441025C1 (en) * | 2010-07-21 | 2012-01-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им.А.В.Жирмунского Дальневосточного отделения РАН | Method of producing low-molecular pectin |
| RU2478650C1 (en) * | 2011-09-01 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "Востокфарм" | Method for preparing low-molecular pectin |
-
2014
- 2014-11-20 RU RU2014146446/13A patent/RU2576535C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7576070B2 (en) * | 2000-11-22 | 2009-08-18 | N.V. Nutricia | Method for producing pectin hydrolysis products |
| RU2441025C1 (en) * | 2010-07-21 | 2012-01-27 | Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им.А.В.Жирмунского Дальневосточного отделения РАН | Method of producing low-molecular pectin |
| RU2478650C1 (en) * | 2011-09-01 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "Востокфарм" | Method for preparing low-molecular pectin |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LO V.-M., HAHN M., HALBEEK H. "Preparatoin, purification and structural characterization of linear oligogalacturonides. An FAB-mass spectrometric and NMR spectroscopic study" - Carbohydrate Research, 1994, Vol.255, p.271-284. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020239805B2 (en) | Oligosaccharide compositions for use in nutritional compositions, and methods of producing thereof | |
| US10870711B2 (en) | Process for the preparation of polysaccharides | |
| Zhou et al. | An arabinogalactan from fruits of Lycium barbarum L. inhibits production and aggregation of Aβ42 | |
| CN104086674B (en) | A kind of technique preparing Enoxaparin Sodium | |
| CN104844732A (en) | Preparation method for sugammadex sodium | |
| Kazami et al. | A simple procedure for preparing chitin oligomers through acetone precipitation after hydrolysis in concentrated hydrochloric acid | |
| WO2012114349A1 (en) | An improved process for the preparation of pentosan polysulfate sodium | |
| KR101476381B1 (en) | Compositions for enhancing activity of cells, and face or skin filler comprising the polynucleotide fragments complex separated from fish's semen or egg | |
| CN103554303B (en) | A kind of method of purifying cm-chitosan | |
| CN105399867A (en) | Preparation method for heparin sodium | |
| RU2570708C1 (en) | Method for obtaining octagalacturonide | |
| RU2670767C1 (en) | Method for producing low molecular weight heparin | |
| Muhitdinov et al. | Homogenous synthesis of sodium cellulose sulfates with regulable low and high degree of substitutions with SO3/Py in N, N-dimethylacetamide/LiCl | |
| RU2576535C1 (en) | Method of octa-galact-uronide production | |
| Chen et al. | Effect of molecular size and charge state of reducing sugars on nonenzymatic glycation of β-lactoglobulin | |
| US20110319608A1 (en) | Process for preparing a mixed salt of glucosamine sulfate and an alkali metal chloride | |
| RU2570709C1 (en) | Method for obtaining heptagalacturonide | |
| AU2002365302B2 (en) | Method for sulphonation of compounds comprising free hydroxyl (OH) groups or primary or secondary amines | |
| RU2441025C1 (en) | Method of producing low-molecular pectin | |
| CN107082796B (en) | Method for purifying small molecular polypeptide in protein zymolyte | |
| Siebe et al. | Formation of substituted dioxanes in the oxidation of gum arabic with periodate | |
| CN106749497B (en) | Chemical total synthesis of lasso polypeptide | |
| JP2023516330A (en) | Method for direct sulfation of polysaccharides in ecologically acceptable solvents | |
| RU2441024C1 (en) | Method of producing low-molecular pectin | |
| Taradeiko et al. | Alkylation of alginic acid with acrylamide |