RU2575828C2 - Method for identifying compounds for treating cancer - Google Patents
Method for identifying compounds for treating cancer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575828C2 RU2575828C2 RU2012103902/15A RU2012103902A RU2575828C2 RU 2575828 C2 RU2575828 C2 RU 2575828C2 RU 2012103902/15 A RU2012103902/15 A RU 2012103902/15A RU 2012103902 A RU2012103902 A RU 2012103902A RU 2575828 C2 RU2575828 C2 RU 2575828C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- melanoma
- treatment
- pic
- pei
- Prior art date
Links
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 43
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 143
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 134
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims abstract description 74
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 266
- 230000006877 autophagy Effects 0.000 claims description 68
- 108009000409 Autophagy Proteins 0.000 claims description 67
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000003932 Urinary Bladder Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000002752 Melanocytes Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000481 Breast Anatomy 0.000 claims description 10
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 7
- 102200082402 CAD M33R Human genes 0.000 claims description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- VSIGMWSIMODNPX-SCAQGMLASA-N (Z)-N-[(7aR)-9-methoxy-3-methyl-7-oxo-2,4,5,6,7a,13-hexahydro-1H-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a-yl]-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enamide Chemical compound O=C([C@H]1C23CCN(C)C4CC5=CC=C(C(O1)=C52)OC)CCC43NC(=O)\C=C/C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIGMWSIMODNPX-SCAQGMLASA-N 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 102220460541 SVBP T47D Human genes 0.000 claims description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- 101700082776 IFIH1 Proteins 0.000 description 67
- 102100018940 IFIH1 Human genes 0.000 description 67
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 49
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 44
- 108060006306 PMAIP1 Proteins 0.000 description 43
- 102100017827 PMAIP1 Human genes 0.000 description 41
- RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 2-naphthyloxyacetic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(OCC(=O)O)=CC=C21 RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 36
- 210000004957 Autophagosomes Anatomy 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 32
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 30
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 101700073419 LC3 Proteins 0.000 description 23
- 102100005467 MAP1LC3A Human genes 0.000 description 23
- 101710036017 MAP1LC3A Proteins 0.000 description 23
- 101700003240 MLE3 Proteins 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N Bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 19
- 210000003712 Lysosomes Anatomy 0.000 description 19
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 19
- 230000001868 lysosomic Effects 0.000 description 19
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 15
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N Chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960003677 Chloroquine Drugs 0.000 description 15
- 101700046422 IFNA Proteins 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 15
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 15
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 13
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 13
- 102100019730 TP53 Human genes 0.000 description 13
- 101710026335 TP53 Proteins 0.000 description 13
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 12
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 11
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 10
- 101700057458 Drice Proteins 0.000 description 10
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 10
- 101700030467 Pol Proteins 0.000 description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 10
- 230000002132 lysosomal Effects 0.000 description 10
- 101710004466 rgy Proteins 0.000 description 10
- 101710030364 rgy1 Proteins 0.000 description 10
- 101710030359 rgy2 Proteins 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 210000004961 Autolysosomes Anatomy 0.000 description 9
- 210000001163 Endosomes Anatomy 0.000 description 9
- 101700031439 MCL1 Proteins 0.000 description 9
- 102100002383 MCL1 Human genes 0.000 description 9
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N Pepstatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 9
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 9
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 9
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 9
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000033243 CDKN2A Human genes 0.000 description 8
- 101710022338 CDKN2A Proteins 0.000 description 8
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 8
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 8
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 102100008990 CASP8 Human genes 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 7
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 230000003127 anti-melanomic Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 7
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N ADRIAMYCIN Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 6
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 6
- 210000000172 Cytosol Anatomy 0.000 description 6
- 229960004679 Doxorubicin Drugs 0.000 description 6
- 210000003953 Foreskin Anatomy 0.000 description 6
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 6
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 6
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 238000011068 load Methods 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 7,12-dimethyltetraphene Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(C=CC=C1)C1=C2C ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 5
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 5
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 5
- 102100015655 BCL2L1 Human genes 0.000 description 5
- 101710032374 BCL2L1 Proteins 0.000 description 5
- 102000024678 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 5
- 108091011726 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 5
- 101700075287 CASP8 Proteins 0.000 description 5
- 102000004039 Caspase 9 Human genes 0.000 description 5
- 108090000566 Caspase 9 Proteins 0.000 description 5
- DYYUXMKNXUZBMO-UHFFFAOYSA-N DND-99 dye Chemical compound C1=CC(CCC(=O)NCCN(C)C)=[N+]([B-](N23)(F)F)C1=CC2=CC=C3C1=CC=CN1 DYYUXMKNXUZBMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100018939 IFIT1 Human genes 0.000 description 5
- 101700084153 IFIT1 Proteins 0.000 description 5
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 description 5
- 229950000964 Pepstatin Drugs 0.000 description 5
- 101700028967 RAB7A Proteins 0.000 description 5
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 5
- 230000001447 compensatory Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 5
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 5
- 229940121354 immunomodulators Drugs 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000000861 pro-apoptotic Effects 0.000 description 5
- KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N (6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c]chromene-3,4,6a,9,10-pentol;2',4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2.O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N 0.000 description 4
- 101700003360 ARF1 Proteins 0.000 description 4
- 101700004551 BRAF Proteins 0.000 description 4
- 102100004328 BRAF Human genes 0.000 description 4
- 206010061289 Metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000003470 Mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N Sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229940046009 Vitamin E Drugs 0.000 description 4
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 4
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N Xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic Effects 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 4
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 4
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 4
- 150000003712 vitamin E derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 3
- 101700076894 DHX58 Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 3
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N Etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 3
- 229960005420 Etoposide Drugs 0.000 description 3
- 208000005017 Glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 101700011451 IFNB1 Proteins 0.000 description 3
- 102100015720 IFNB1 Human genes 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 102100001119 NRAS Human genes 0.000 description 3
- 101710033916 NRAS Proteins 0.000 description 3
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000003934 Vacuoles Anatomy 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 3
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004142 macroautophagy Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000000242 pagocytic Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000010246 ultrastructural analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- -1 uranyl acetate Chemical compound 0.000 description 3
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 3
- OMJKFYKNWZZKTK-UXBLZVDNSA-N (5E)-5-(dimethylaminohydrazinylidene)imidazole-4-carboxamide Chemical compound CN(C)N\N=C1\N=CN=C1C(N)=O OMJKFYKNWZZKTK-UXBLZVDNSA-N 0.000 description 2
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 2-deoxy-2-((18)F)fluoro-α-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H]([18F])[C@@H](O)[C@@H]1O ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 0.000 description 2
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 2
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 2
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 2
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- 108050009503 CARD domain Proteins 0.000 description 2
- 102000002164 CARD domain Human genes 0.000 description 2
- 108090000538 Caspase 8 Proteins 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 102100000756 DHX58 Human genes 0.000 description 2
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 2
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 2
- 210000002216 Heart Anatomy 0.000 description 2
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N Isocytosine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N Isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101700083887 MAPK1 Proteins 0.000 description 2
- 210000002264 Mammary Glands, Animal Anatomy 0.000 description 2
- 210000004293 Mammary Glands, Human Anatomy 0.000 description 2
- 230000036091 Metabolic activity Effects 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102200124923 NRAS Q61K Human genes 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 2
- 229920002224 Peptide nucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000008230 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010060885 Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 2
- 230000000869 mutational Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- UFZNZKGKBWOSJG-UHFFFAOYSA-N purin-2-one Chemical compound O=C1N=CC2=NC=NC2=N1 UFZNZKGKBWOSJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 102000002689 toll-like receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 toll-like receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 2
- ZCXUVYAZINUVJD-LLSCIWEVSA-N (3R,4S,5S)-3-fluoranyl-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(O)[C@H]([18F])[C@@H](O)[C@@H]1O ZCXUVYAZINUVJD-LLSCIWEVSA-N 0.000 description 1
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040005185 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 289-95-2 Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 63597-44-4 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-LQLWEASQSA-N 0.000 description 1
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7H-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009456 Adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 108010089941 Apoptosomes Proteins 0.000 description 1
- 101710041927 Arf102F Proteins 0.000 description 1
- 102000016614 Autophagy-Related Protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010092776 Autophagy-Related Protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 210000003050 Axons Anatomy 0.000 description 1
- XDHNQDDQEHDUTM-JQWOJBOSSA-N Bafilomycin Chemical compound CO[C@H]1\C=C\C=C(C)\C[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)\C=C(/C)\C=C(OC)\C(=O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)[C@]1(O)O[C@H](C(C)C)[C@@H](C)[C@H](O)C1 XDHNQDDQEHDUTM-JQWOJBOSSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N Bisbenzimide Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100003814 CASP3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004041 Caspase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 210000003483 Chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101700064525 DDX58 Proteins 0.000 description 1
- 102100013885 DDX58 Human genes 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000007989 Effector Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010089510 Effector Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000408223 Eggplant mottled crinkle virus Species 0.000 description 1
- 210000004907 Glands Anatomy 0.000 description 1
- 102100009498 HMGB1 Human genes 0.000 description 1
- 108010014739 HMGB1 Protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 1
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102220369554 KRT26 Q16K Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101700067074 MAPK Proteins 0.000 description 1
- 101710041325 MAPKAPK2 Proteins 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 1
- 206010054107 Nodule Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 210000000633 Nuclear Envelope Anatomy 0.000 description 1
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108060005895 PCNA Proteins 0.000 description 1
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N PUROMYCIN Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 1
- 229950010131 PUROMYCIN Drugs 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 229920001709 Polysilazane Polymers 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229940024999 Proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 240000002799 Prunus avium Species 0.000 description 1
- 102200001142 RAB7A T22N Human genes 0.000 description 1
- 102000004409 RNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000944 RNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 230000025458 RNA interference Effects 0.000 description 1
- 102100005287 SLC44A4 Human genes 0.000 description 1
- 101710036792 SLC44A4 Proteins 0.000 description 1
- 210000002356 Skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 1
- 229920001891 Small hairpin RNA Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100012088 TLR3 Human genes 0.000 description 1
- 101700023131 TLR3 Proteins 0.000 description 1
- 102200108201 TP53 P72R Human genes 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 1
- 102000011731 Vacuolar Proton-Translocating ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010037026 Vacuolar Proton-Translocating ATPases Proteins 0.000 description 1
- 229940099039 Velcade Drugs 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002886 autophagic Effects 0.000 description 1
- 230000009789 autophagic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000000546 effect on cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108091005938 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 1
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 101700067316 lnt Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent Effects 0.000 description 1
- 238000009523 phase IV clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 101710024887 rl Proteins 0.000 description 1
- 230000002987 rna-interference Effects 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 101700045897 spk-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- LXZZYRPGZAFOLE-UHFFFAOYSA-L transplatin Chemical compound [H][N]([H])([H])[Pt](Cl)(Cl)[N]([H])([H])[H] LXZZYRPGZAFOLE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogens Species 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области онкологии, и оно главным образом направлено на идентификацию соединений, которые можно использовать для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, глиомы, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.The present invention relates to the field of oncology, and it is mainly directed to the identification of compounds that can be used to treat various types of cancer, for example: melanoma, cancer of the pancreas, colon, bladder, glioma, breast, prostate, lung and ovary .
Кроме того, настоящее изобретение также охватывает соединения, определенные таким способом, например, соединение BO-110 (см. ниже), которое способно вызывать отчетливую гибель опухолевых клеток во всех указанных выше видах рака.In addition, the present invention also encompasses compounds defined in this manner, for example, compound BO-110 (see below), which is capable of causing distinct tumor cell death in all of the above types of cancer.
Уровень техникиState of the art
Меланома остается прототипом солидных видов рака с ростом числа заболеваний и крайне неблагоприятным прогнозом на поздних стадиях (Jemal et al., 2008). Значительные усилия были посвящены идентификации молекулярных детерминант, лежащих в основе химической и иммунной резистентности меланомы. Единственными средствами, одобренными Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения метастатической меланомы, являются алкилирующий агент дакарбазин (DTIC) и иммуномодулятор IL-2 (Tawbi and Kirkwood, 2007). Тем не менее, надежный и полный ответ на лечение при метастатической меланоме редко встречается более чем у 5% пациентов, и вторичная токсичность может быть очень серьезной. В результате, в настоящее время средняя продолжительность жизни больных с метастатической меланомой составляет от 6 до 10 месяцев и, следовательно, разработка более совершенных способов лечения является приоритетной при данном заболевании (Jemal et al., 2007).Melanoma remains the prototype of solid cancers with an increasing number of diseases and an extremely poor prognosis in the later stages (Jemal et al., 2008). Significant efforts have been devoted to identifying the molecular determinants that underlie the chemical and immune resistance of melanoma. The only products approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of metastatic melanoma are the dacarbazine alkylating agent (DTIC) and the immunomodulator IL-2 (Tawbi and Kirkwood, 2007). However, a reliable and complete response to treatment with metastatic melanoma is rarely found in more than 5% of patients, and secondary toxicity can be very serious. As a result, currently the average life expectancy of patients with metastatic melanoma is from 6 to 10 months and, therefore, the development of more advanced treatment methods is a priority for this disease (Jemal et al., 2007).
Первоначально, синтетический аналог вирусной дсРНК, называемый pIC (полиинозин-полицитидиловая кислота), соединение, которое используется уже более четырех десятилетий для стимуляции иммунной системы независимо от интерферона (IFN) (Field et al., 1967), считался перспективным терапевтическим средством против меланомы. К сожалению, клинические исследования с «голой» pIC выявили ее низкую стабильность, низкую степень индукции интерферона и отсутствие противоопухолевого эффекта при меланоме (Robinson et al., 1976). Таким образом, в качестве монотерапии pIC считается малоэффективным лекарственным средством против меланомы.Initially, a synthetic viral dsRNA analogue called pIC (polyinosine-polycytidylic acid), a compound that has been used for more than four decades to stimulate the immune system independently of interferon (IFN) (Field et al., 1967), was considered a promising therapeutic agent against melanoma. Unfortunately, clinical studies with naked pIC revealed its low stability, low degree of induction of interferon, and the absence of an antitumor effect in melanoma (Robinson et al., 1976). Thus, as a monotherapy, pIC is considered an ineffective anti-melanoma drug.
Высокопроизводительный гистогенетический анализ и систематические функциональные исследования значительно расширили наше понимание возникновения и прогрессирования меланомы и сложных механизмов, связанных с неэффективностью лечения (Fecher et al., 2007; Gray-Schopfer et al., 2007). Были идентифицированы соответствующие дефекты и изменения в сигнальных каскадах реакций BRAF/MAPK; PI3K/AKT, NF-κB или NOTCH, составившие многообещающую платформу для рациональной разработки лекарственных средств (Gray-Schopfer et al., 2007). Однако направленная терапия до сих пор не доказала свою эффективность в испытаниях на меланоме (Flaherty, 2006). Программы клеточной гибели, контролируемые митохондриями и/или эндоплазматическим ретикулумом, также проходят апробацию, хотя неизменно являются неэффективными in vivo (Hersey and Zhang, 2008). Следовательно, используемые в настоящее время противораковые лекарственные средства либо не достигают своей цели(лей) продуктивно, либо должны быть введены в дозировках, которые приводят к непереносимой токсичности для нормальных клеточных компартментов (Tawbi and Kirkwood, 2007). Важно отметить, что в процессе лечения могут активизироваться компенсаторные механизмы, приводящие к отбору клеточных популяций с еще большей устойчивостью к химическим препаратам (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007).High-performance histogenetic analysis and systematic functional studies have greatly expanded our understanding of the occurrence and progression of melanoma and the complex mechanisms associated with treatment failure (Fecher et al., 2007; Gray-Schopfer et al., 2007). Corresponding defects and changes in the signal cascades of BRAF / MAPK reactions were identified; PI3K / AKT, NF-κB, or NOTCH, constituting a promising platform for rational drug development (Gray-Schopfer et al., 2007). However, targeted therapy has not yet been proven effective in trials of melanoma (Flaherty, 2006). Cell death programs controlled by mitochondria and / or the endoplasmic reticulum also undergo testing, although they are invariably ineffective in vivo (Hersey and Zhang, 2008). Therefore, the currently used anticancer drugs either do not achieve their goal (s) productively, or must be administered in dosages that lead to intolerant toxicity for normal cell compartments (Tawbi and Kirkwood, 2007). It is important to note that during treatment, compensatory mechanisms can be activated, leading to the selection of cell populations with even greater resistance to chemicals (Lev et al., 2004; Shatton et al., 2008; Wolter et al., 2007).
В сущности, считается, что меланома обладает сильной способностью избегать апоптоза через различные пути, что дает меланоме возможность прогрессировать, образовывать метастазы и не поддаваться лечению различными терапевтическими методами (обзор Ivanov et al., 2003).In fact, it is believed that melanoma has a strong ability to avoid apoptosis through various pathways, which gives the melanoma the ability to progress, form metastases and not respond to treatment with various therapeutic methods (review by Ivanov et al., 2003).
В отличие от стандартной химиотерапии, направленной на уничтожение опухолевых клеток в основном «изнутри» (то есть, путем активации внутренней программы клеточной гибели), в иммунотерапии традиционно задействованы непрямые каскады межклеточных взаимодействий. При меланоме основные усилия были сосредоточены на повышении содержания или функциональной эффективности двух составляющих: антиген-презентирующих клеток и цитотоксических Т-клеток (Wilcox and Markovic, 2007). Вакцины, а также антитела, направленные против ингибиторных иммуномодуляторов (например, CTL4), также проходят испытания, хотя и с разочаровывающими результатами в фазе IV клинических испытаний (Kirkwood et al., 2008). В последнее время проводятся исследования стимуляции иммунной системы посредством активации Toll-подобных рецепторов (TLR)-3, -4, -7 и -9 для обеспечения цитотоксического разрушения клеток меланомы при помощи натуральных киллеров (NK), дендритных клеток (DC) и Т-клеток (Kirkwood et al., 2008, и Tormo et al., 2007). Тем не менее, многочисленные исследования, включая исследования авторов изобретения, продемонстрировали присущую клеткам способность обходить иммунологическую терапию путем понижающей регуляции (корректировки) иммунореактивных поверхностных маркеров. Меланомы также могут оказывать подавляющее действие на хозяина (например, ингибирование созревания антиген-презентирующих клеток или блокада полной активации Т-клеток) (Tormo et al., 2006; Ilkovitch and Lopez, 2008; Verma et al., 2008). Таким образом, меланомы демонстрируют присущую им способность избегать противоопухолевого эффекта иммуномодуляторов.Unlike standard chemotherapy aimed at destroying tumor cells mainly “from the inside” (that is, by activating the internal program of cell death), indirect cascades of intercellular interactions are traditionally involved in immunotherapy. In melanoma, the main efforts were focused on increasing the content or functional effectiveness of two components: antigen-presenting cells and cytotoxic T cells (Wilcox and Markovic, 2007). Vaccines, as well as antibodies directed against inhibitory immunomodulators (e.g. CTL4), are also being tested, albeit with disappointing results in phase IV clinical trials (Kirkwood et al., 2008). Recently, studies have been conducted on stimulation of the immune system by activating Toll-like receptors (TLRs) -3, -4, -7 and -9 to provide cytotoxic destruction of melanoma cells using natural killer cells (NK), dendritic cells (DC) and T- cells (Kirkwood et al., 2008, and Tormo et al., 2007). However, numerous studies, including those of the inventors, have demonstrated the inherent ability of cells to bypass immunological therapy by downregulating (adjusting) immunoreactive surface markers. Melanomas can also have an inhibitory effect on the host (e.g., inhibiting the maturation of antigen presenting cells or blocking the complete activation of T cells) (Tormo et al., 2006; Ilkovitch and Lopez, 2008; Verma et al., 2008). Thus, melanomas demonstrate their inherent ability to avoid the antitumor effect of immunomodulators.
В области иммунотерапии одной из молекул, увеличение числа которых изучается как потенциальный положительный фактор для лечения меланомы, является MDA-5 (ассоциированный с дифференциацией меланомы ген 5), продукт, изначально описанный как ген, связанный с дифференциацией меланомы (Kang et al., 2002). MDA-5 представляет собой геликазу, которая узнает и активируется длинной двухцепочечной РНК (дсРНК) (Yoneyama et al., 2005). Другими РНК геликазами являются RIG-1 (индуцируемый ретиноевой кислотой белок 1, также называемый Dsx58), который узнает голые 3-фосфаты короткой дсРНК, и LGP2 (также называемый Dhx58), являющийся отрицательным регулятором при опознавании дсРНК.In the field of immunotherapy, one of the molecules whose increase is being studied as a potential positive factor for treating melanoma is MDA-5 (
До тех пор, пока дсРНК могут создаваться в результате и в процессе вирусных инфекций, MDA-5 выступает в качестве первой линии врожденного иммунитета против вирусных патогенов (Akira et al., 2006). Кроме того, MDA-5 имеет домены рекрутинга активации каспазы (CARD). Геликаза и домены CARD совместно активируют NF-κB и другие факторы транскрипции, вовлеченные в регуляцию цитокинов (Kawai et al., 2005). Таким образом, наиболее известной функцией MDA-5 является иммунная стимуляция.As long as dsRNA can be created as a result of and during viral infections, MDA-5 acts as the first line of innate immunity against viral pathogens (Akira et al. , 2006). In addition, MDA-5 has caspase activation recruitment domains (CARDs). Helicase and CARD domains co-activate NF-κB and other transcription factors involved in the regulation of cytokines (Kawai et al., 2005). Thus, the most famous function of MDA-5 is immune stimulation.
С терапевтической точки зрения известно, что как IFN-β, так и дсРНК индуцируют транскрипцию гена Mda-5. Вследствие этого, было высказано предположение, что дсРНК играет роль в увеличении экспрессии Mda-5 при индуцированном IFN ингибировании роста. Кроме того, показано (Kang et al., 2002), что индукция эндогенной MDA-5 с помощью IFN-β является цитостатической (другими словами, останавливает клеточный цикл). Таким образом, для активации гибели опухолевых клеток MDA-5 должна быть избыточно экспрессирована эктопически на высоких уровнях (Kovacsovics et al., 2002). Более того, данная проапоптотическая активность эктопической экспрессии MDA-5 не эффективна в опухолевых клетках с гиперактивным путем RAS/MEK/ERK (Lin et al., 2006), как в случае с меланомами (Chin et al., 2006). Таким образом, нерешенным вопросом в этой области было то, как активировать эндогенную MDA-5 с помощью химиотерапевтических средств исключительно применительно к области опухоли (не вызывая вторичную токсичность в нормальных клетках).From a therapeutic point of view, it is known that both IFN-β and dsRNA induce transcription of the Mda-5 gene. As a result, it has been suggested that dsRNA plays a role in increasing the expression of Mda-5 in IFN-induced growth inhibition. In addition, it was shown (Kang et al., 2002) that the induction of endogenous MDA-5 using IFN-β is cytostatic (in other words, it stops the cell cycle). Thus, to activate the death of tumor cells, MDA-5 must be overexpressed ectopically at high levels (Kovacsovics et al., 2002). Moreover, this pro-apoptotic activity of ectopic expression of MDA-5 is not effective in tumor cells with the hyperactive RAS / MEK / ERK pathway (Lin et al., 2006), as is the case with melanomas (Chin et al., 2006). Thus, an unresolved issue in this area was how to activate endogenous MDA-5 with chemotherapeutic agents exclusively for the tumor area (without causing secondary toxicity in normal cells).
В патентной заявке US 2007/0259372 предложена идентификация агонистов или антагонистов IFN-β, IFN-α или IFN-γ с помощью соединений, способных усиливать экспрессию MDA-5. В этом патенте также высказано предположение, что индукторы экспрессии гена Mda-5 (с помощью его промотора) можно рассматривать как соединения-кандидаты для индукции терминальной дифференциации опухолевых клеток. Также там высказано предположение о возможной роли MDA-5 в генерации апоптотических сигналов через ее домен CARD. Однако до настоящего времени не было известно, какие мишени MDA-5 способны запускать апоптоз, и как активировать ее отслеживаемым и избирательным для опухолевых клеток образом. Кроме того, поскольку клетки меланомы имеют активный путь RAS/MEK/ERK (который ингибирует MDA-5), а также выраженную способность избегать апоптотической клеточной гибели, не было очевидно, что апоптотические сигналы, опосредованные MDA-5, могут быть действующим механизмом для терапии против меланомы. Вследствие этого, на основании предыдущей информации о регуляции и функции MDA-5 данный белок не считался убедительной целью для методов по идентификации кандидатов в терапевтические средства против меланомы.US 2007/0259372 proposes the identification of IFN-β, IFN-α or IFN-γ agonists or antagonists using compounds capable of enhancing MDA-5 expression. This patent also suggested that Mda-5 gene expression inducers (using its promoter) can be considered candidate compounds for inducing terminal differentiation of tumor cells. It also suggested that MDA-5 could play a role in generating apoptotic signals through its CARD domain. However, until now it was not known which MDA-5 targets are capable of triggering apoptosis, and how to activate it in a manner that is monitored and selective for tumor cells. In addition, since melanoma cells have an active RAS / MEK / ERK pathway (which inhibits MDA-5), as well as a pronounced ability to avoid apoptotic cell death, it was not clear that apoptotic signals mediated by MDA-5 may be an effective mechanism for therapy against melanoma. Consequently, based on previous information on the regulation and function of MDA-5, this protein was not considered a convincing target for methods to identify candidates for therapeutic agents against melanoma.
Аутофагия становится альтернативной стратегией для активизации эндогенного механизма гибели раковых клеток.Autophagy is becoming an alternative strategy to activate the endogenous mechanism of cancer cell death.
Этот процесс включает сложный каскад событий, которые в конечном итоге приводят к секвестрации цитозольных компонентов для последующей деградации лизосомами (Xie and Klionsky, 2007). В зависимости от механизма поглощения и природы груза, доставляемого в аутолизосомы, описано множество механизмов аутофагии. В контексте противоракового лечения, макроаутофагия или массовая деградация клеточных органелл и белковых агрегатов, вызывает интерес из-за ее способности ставить под угрозу жизнеспособность клеток за счет дисфункции или избыточного истощения основных органелл (например, эндоплазматического ретикулума или митохондрий) (Hoyer-Hansen, 2008).This process involves a complex cascade of events that ultimately lead to sequestration of cytosolic components for subsequent degradation of lysosomes (Xie and Klionsky, 2007). Many mechanisms of autophagy are described depending on the mechanism of absorption and the nature of the cargo delivered to autolysosomes. In the context of anti-cancer treatment, macroautophagy or mass degradation of cellular organelles and protein aggregates is of interest because of its ability to jeopardize cell viability due to dysfunction or excessive depletion of major organelles (e.g., endoplasmic reticulum or mitochondria) (Hoyer-Hansen, 2008) .
Однако неизвестно, каким образом регулируется аутофагия, и ее терапевтический потенциал не является ясным и простым (Hippert et al., 2006). С другой стороны, макроаутофагия (которая далее в данном документе будет называться просто «аутофагией») продемонстрировала значительный потенциал для защиты клеток от различных агрессивных внутриклеточных и внеклеточных сигналов, включая противораковые лекарственные средства. За счет этой активности аутофагия может стимулировать развитие опухоли (Mizushima et al., 2008; Kroemer and Levine, 2008).However, it is not known how autophagy is regulated, and its therapeutic potential is not clear and simple (Hippert et al., 2006). On the other hand, macroautophagy (which will be referred to simply as “autophagy” later in this document) has demonstrated significant potential for protecting cells from various aggressive intracellular and extracellular signals, including anti-cancer drugs. Due to this activity, autophagy can stimulate tumor development (Mizushima et al., 2008; Kroemer and Levine, 2008).
Как ни парадоксально, аутофагия также связана с гибелью клеток (Kromer et al., 2009). Таким образом, чрезмерная или постоянная аутофагия может способствовать гибели клеток вследствие истощения основных органелл (то есть, эндоплазматического ретикулума или митохондрий), изменения сигналов выживания, дерегулирования лизосомальных ферментов, и/или активации зависимых от каспаз программ апоптоза (Xie and Klionsky, 2007).Paradoxically, autophagy is also associated with cell death (Kromer et al., 2009). Thus, excessive or persistent autophagy can contribute to cell death due to depletion of major organelles (i.e., endoplasmic reticulum or mitochondria), changes in survival signals, deregulation of lysosomal enzymes, and / or activation of caspase-dependent apoptosis programs (Xie and Klionsky, 2007).
Следовательно, неясно, будет ли аутофагия усиливать химическую и иммунную резистентность меланомы вместо улучшения результатов лечения. Кроме того, ни один из более чем 20 генов аутофагии, описанных в настоящее время в клетках млекопитающих, не был охарактеризован подробно в случае меланомы. Вследствие этого, неизвестно, регулируется ли аутофагия различным образом в клетках меланомы и нормальных клетках, что могло бы обеспечить возможность для терапевтического вмешательства. Аналогичная ситуация имеет место в случае агрессивных видов рака, таких как те, что затрагивают поджелудочную железу, мочевой пузырь, предстательную железу и мозг.Therefore, it is unclear whether autophagy will enhance the chemical and immune resistance of melanoma instead of improving treatment outcomes. In addition, none of the more than 20 autophagy genes currently described in mammalian cells has been characterized in detail in the case of melanoma. As a result of this, it is not known whether autophagy is regulated in various ways in melanoma cells and normal cells, which could provide an opportunity for therapeutic intervention. A similar situation occurs in the case of aggressive cancers, such as those affecting the pancreas, bladder, prostate gland and brain.
В данной ситуации сохраняется потребность в выявлении терапевтических средств для лечения рака, альтернативных тем, которые уже официально применяются, и, в частности тех, которые подходят для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом. Также остается необходимость в обнаружении возможных новых терапевтических мишеней для разработки методов идентификации терапевтических средств-кандидатов для лечения рака среди соединений, способных воздействовать на эти мишени.In this situation, there remains a need to identify therapeutic agents for the treatment of cancer, alternative to those that are already officially used, and in particular those that are suitable for the treatment of immunocompromised patients. There remains also the need to discover possible new therapeutic targets for the development of methods for identifying candidate therapeutic agents for cancer among compounds that can target these targets.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает решение для обеих проблем.Thus, the present invention provides a solution to both problems.
Описание изобретенияDescription of the invention
Как указано выше, настоящее изобретение прежде всего направлено на идентификацию терапевтических мишеней, маркеров или параметров, которые создают основу для разработки способа, полезного для идентификации соединений (среди тех, которые способны воздействовать на эти терапевтические мишени, маркеры или параметры), способных лечить рак.As indicated above, the present invention is primarily directed to the identification of therapeutic targets, markers or parameters that provide the basis for developing a method useful for identifying compounds (among those that are capable of acting on these therapeutic targets, markers or parameters) capable of treating cancer.
Одним из маркеров, определенных в настоящем изобретении, который полезен для идентификации соединений, способных лечить рак, является уровень активации геликазы семейства MDA-5. Этот параметр можно определять, проверяя наличие протеолитического расщепления белка, которое приводит к разделению геликазных и каспазных доменов: для того, чтобы быть терапевтическим средством для лечения рака, соединение-кандидат должно приводить к протеолитическому расщеплению, что является свидетельством того, что оно может вызывать активацию аутофагии и механизмов апоптоза, приводящих к гибели раковых клеток. Возможной методикой данного теста является иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) белковых экстрактов культуры клеток и проверка сигнальных полос, соответствующих целому белку и фрагментам, соответствующим геликазным доменам и каспазным доменам. В частности, как показано в примере 3, появление полосы 30 кДа свидетельствует о наличии протеолитического расщепления. Альтернативно, это может также указывать на активацию других геликаз семейства MDA-5, таких как RIG-I или LGP2.One of the markers defined in the present invention, which is useful for identifying compounds that can treat cancer, is the level of activation of the helicase of the MDA-5 family. This parameter can be determined by checking the presence of proteolytic cleavage of the protein, which leads to the separation of helicase and caspase domains: in order to be a therapeutic agent for cancer, the candidate compound must lead to proteolytic cleavage, which indicates that it can cause activation autophagy and apoptosis mechanisms leading to the death of cancer cells. A possible methodology for this test is immunoblotting (Western blotting) of protein extracts of cell culture and verification of signal bands corresponding to the whole protein and fragments corresponding to helicase domains and caspase domains. In particular, as shown in Example 3, the appearance of a 30 kDa band indicates the presence of proteolytic cleavage. Alternatively, this may also indicate activation of other helicases of the MDA-5 family, such as RIG-I or LGP2.
Другим маркером, определенным в настоящем изобретении, также полезным для идентификации соединений, способных лечить рак, является уровень экспрессии NOXA. Обоснованием является увеличение уровней экспрессии соответствующих генов, когда механизмы аутофагии и апоптоз активированы. Определение уровней экспрессии этих белков можно проводить, например, определяя концентрацию соответствующей матричной РНК (это можно осуществлять, например, методами нозерн-блоттинга или ОТ-ПЦР) или концентрацию самого белка в белковом экстракте соответствующей культуры клеток (например, посредством переноса, подобного вестерн-блоттингу). Кроме того, NOXA можно определять in situ (в образцах тканей) иммуногистохимическими методами.Another marker defined in the present invention also useful for identifying compounds capable of treating cancer is the level of NOXA expression. The rationale is to increase the expression levels of the corresponding genes when the mechanisms of autophagy and apoptosis are activated. Determination of the expression levels of these proteins can be carried out, for example, by determining the concentration of the corresponding messenger RNA (this can be done, for example, by Northern blotting or RT-PCR) or the concentration of the protein itself in the protein extract of the corresponding cell culture (for example, by transfer, similar to Western blotting). In addition, NOXA can be determined in situ (in tissue samples) by immunohistochemical methods.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определяют и MDA-5 и NOXA, как подтверждение того, что механизмы аутофагии и апоптоза активированы, поскольку MDA-5 считается связующим звеном между ними.In a preferred embodiment of the present invention, both MDA-5 and NOXA are determined as confirmation that the mechanisms of autophagy and apoptosis are activated, since MDA-5 is considered to be a link between them.
Кроме того, изобретение может включать стадию определения индукции аутофагии соединением-кандидатом, предназначенным для применения против рака. Индукцию аутофагии можно определять несколькими методами, которые включают:In addition, the invention may include the step of determining the induction of autophagy by a candidate compound for use against cancer. Autophagy induction can be determined by several methods, which include:
• Мониторинг посттрансляционной модификации белка, экспрессированного геном 8 аутофагии (называемым ATG8 или LC3). Белок LC3 процессируется и липидируется при включении в аутофагосомы, которые представляют собой мембранные структуры, в которые клеточные компоненты захватываются в процессе аутофагии. Вследствие того, что конформация и электрофоретическая подвижность этого белка меняется при липидировании, одним из возможных методов для проверки индукции аутофагии является использование метода иммуноблоттинга с антителами, направленными против этого белка. Этот метод позволяет убедиться, что после проведения электрофореза полоса, соответствующая белку, отличается в контрольных образцах по сравнению с образцами, в которых, предположительно, соединение индуцировало аутофагию. Альтернативно, если антитело специфически узнает форму аутофагосом, связывание антитела подтвердит индукцию аутофагии в образце, обработанном соединением-кандидатом.• Monitoring post-translational modification of a protein expressed by autophagy gene 8 (called ATG8 or LC3). The LC3 protein is processed and lipidated upon incorporation into autophagosomes, which are membrane structures into which cellular components are captured during autophagy. Due to the fact that the conformation and electrophoretic mobility of this protein changes upon lipidation, one of the possible methods for checking the induction of autophagy is the use of immunoblotting with antibodies directed against this protein. This method makes it possible to verify that after electrophoresis, the band corresponding to the protein differs in the control samples compared to samples in which, presumably, the compound induced autophagy. Alternatively, if the antibody specifically recognizes the shape of the autophagosomes, binding of the antibody will confirm the induction of autophagy in the sample treated with the candidate compound.
• Мониторинг изменений во внутриклеточном распределении белка LC3, поскольку другой отличительной чертой аутофагии является перемещение LC3 из цитозоля во вновь образованные аутофагосомы (Xie and Klionsky, 2007). Таким образом, образование белковых очагов можно считать показателем образования аутофагосом, особенно на ранних стадиях. Обнаружение можно проводить, контролируя эндогенный LC3 методами иммунофлуоресценции или иммунохимии на фиксированных клетках или фиксированных тканях. Альтернативно, аутофагию можно визуализировать в живых клетках, определяя клеточную локализацию флуоресцентного производного LC3. В качестве флуоресцентного белка принято использовать GFP (зеленый флуоресцентный белок) или RFP (красный флуоресцентный белок), которые позволяют отслеживать аутофагию с помощью флуоресцентной микроскопии: изменения клеточного распределения флуоресценции от диффузной картины к очаговому окрашиванию свидетельствуют об индукции аутофагии. В настоящем изобретении данная методика предполагает использование либо клеток, которые были трансфицированы вектором, делающим возможной временную экспрессию слитого белка (таким, как плазмида или рекомбинантный вирус), либо клеток, в которые фрагмент ДНК, способный экспрессировать слитый белок, образованный репортерным белком и LC3, интегрирован в геном стабильно. Пример такой стратегии приведен ниже в примере 1, когда клетки предварительно трансфицировали рекомбинантным ретровирусом. Это привело к вставке в клеточный геном фрагмента ДНК, содержащего вместе кодирующие части белков GFP и LC3, таким образом, что это приводит к образованию слитого белка в клеточной геномной ДНК. Таким образом, можно проводить тесты на изменения внутриклеточного распределения со стабильно трансфицированными клетками.• Monitoring changes in the intracellular distribution of the LC3 protein, since another distinguishing feature of autophagy is the movement of LC3 from the cytosol to newly formed autophagosomes (Xie and Klionsky, 2007). Thus, the formation of protein foci can be considered an indicator of the formation of autophagosomes, especially in the early stages. Detection can be carried out by monitoring endogenous LC3 by immunofluorescence or immunochemistry methods on fixed cells or fixed tissues. Alternatively, autophagy can be visualized in living cells by determining the cellular localization of the fluorescent derivative of LC3. As a fluorescent protein, it is customary to use GFP (green fluorescent protein) or RFP (red fluorescent protein), which can monitor autophagy using fluorescence microscopy: changes in the cell distribution of fluorescence from diffuse to focal staining indicate the induction of autophagy. In the present invention, this technique involves the use of either cells that have been transfected with a vector that allows the transient expression of a fusion protein (such as a plasmid or recombinant virus), or cells into which a DNA fragment capable of expressing a fusion protein formed by a reporter protein and LC3, integrated into the genome stably. An example of such a strategy is shown below in example 1, when the cells were pre-transfected with recombinant retrovirus. This led to the insertion into the cellular genome of a DNA fragment containing together the coding parts of the GFP and LC3 proteins, so that this leads to the formation of a fusion protein in the cellular genomic DNA. Thus, it is possible to conduct tests for changes in the intracellular distribution with stably transfected cells.
• Использование трансмиссионной электронной микроскопии для обнаружения проникновения соединения-кандидата в клетку. Эта ситуация управляет образованием аутофагосом на более поздних стадиях процесса аутофагии. Визуализации накопления плотных структур (связанных с мембраной) считается характерной особенностью образования аутофагосом. Процесс аутофагии можно подтверждать на более поздних стадиях процесса (то есть, через 24 или 30 часов после обработки тестируемым соединением), во время которых в электронный микроскоп можно увидеть образование крупных фагоцитарных вакуолей, свидетельствующих о гибели клеток.• Use of transmission electron microscopy to detect penetration of a candidate compound into a cell. This situation controls the formation of autophagosomes in the later stages of the autophagy process. Visualization of the accumulation of dense structures (associated with the membrane) is considered a characteristic feature of the formation of autophagosomes. The process of autophagy can be confirmed at later stages of the process (that is, 24 or 30 hours after treatment with the test compound), during which the formation of large phagocytic vacuoles, indicating cell death, can be seen with an electron microscope.
Учитывая изложенное выше, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу (далее в данном документе называемому способом по изобретению) идентификации соединений, используемых для лечения рака, включающему стадии:In view of the foregoing, a first embodiment of the present invention relates to a method (hereinafter referred to as the method of the invention) for identifying compounds used to treat cancer, comprising the steps of:
a) приведения соединения-кандидата в контакт с культурой раковых клеток или линией раковых клеток, происходящей из раковых клеток;a) bringing the candidate compound into contact with a cancer cell culture or a cancer cell line derived from cancer cells;
b) определения, по меньшей мере, одного из следующих параметров:b) determining at least one of the following parameters:
i. уровня активации геликазы семейства MDA-5;i. the level of activation of the helicase family MDA-5;
ii. уровня экспрессии NOXA;ii. NOXA expression level;
iii. либо их сочетание;iii. or a combination thereof;
c) сравнения данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;c) comparing the data obtained in step b) with the data observed in the control from the same cells treated in the same way, but in the absence of the candidate compound;
d) выбора соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.d) the choice of compounds that led to a significant increase in the parameter or parameters defined in paragraph b), compared with the control.
Следует отметить, что разница между данными, полученными от клеточной культуры, обработанной соединением-кандидатом, и от необработанного контроля, будет считаться статистически значимой, если при анализе получена величина p<0,05.It should be noted that the difference between the data obtained from the cell culture treated with the candidate compound and from the untreated control will be considered statistically significant if p <0.05 is obtained in the analysis.
В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению также определяет, индуцирует ли соединение-кандидат аутофагию в раковых клетках, в клеточной линии, происходящей из раковых клеток, или на мышиной модели рака. Как объяснялось выше, определение индукции аутофагии можно проводить путем проверки уровня экспрессии, наличия посттрансляционной модификации или внутриклеточной локализации белка аутофагии. Более конкретно, индукцию аутофагии определяют методом, выбранным из: изменения электрофоретической подвижности белка LC3 или обнаружения образования очагов белка LC3. Альтернативно, индукцию аутофагии определяют путем проверки наличия аутофагосом с помощью микроскопического исследования, например, используя трансмиссионную электронную микроскопию.In a preferred embodiment, the method of the invention also determines whether the candidate compound induces autophagy in cancer cells, in a cell line derived from cancer cells, or in a murine model of cancer. As explained above, the determination of autophagy induction can be carried out by checking the expression level, the presence of a post-translational modification, or the intracellular localization of the autophagy protein. More specifically, autophagy induction is determined by a method selected from: changing the electrophoretic mobility of the LC3 protein or detecting the formation of foci of the LC3 protein. Alternatively, the induction of autophagy is determined by checking the presence of autophagosomes using microscopic examination, for example, using transmission electron microscopy.
В следующем предпочтительном варианте осуществления вышеописанный способ по изобретению включает три стадии: определение уровня активации MDA-5, уровня экспрессии NOXA и индукции аутофагии.In a further preferred embodiment, the method of the invention described above comprises three steps: determining the level of activation of MDA-5, the level of expression of NOXA, and the induction of autophagy.
Способ по изобретению можно использовать для идентификации соединений, используемых в качестве терапевтических средств для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.The method according to the invention can be used to identify compounds used as therapeutic agents for treating various types of cancer, for example: melanoma, cancer of the pancreas, colon, bladder, breast, prostate, lung and ovary.
Вследствие этого, если настоящее изобретение направлено на идентификацию соединений для применения в качестве терапевтических средств для лечения меланомы, то она будет включать следующие стадии:Therefore, if the present invention is directed to the identification of compounds for use as therapeutic agents for the treatment of melanoma, then it will include the following steps:
a) приведение соединения-кандидата в контакт с культурой клеток меланомы или клеточной линией, полученной из клеток меланомы;a) bringing the candidate compound into contact with a melanoma cell culture or a cell line derived from melanoma cells;
b) определение, по меньшей мере, одного из следующих параметров:b) determining at least one of the following parameters:
i. уровень активации геликазы семейства MDA-5;i. MDA-5 family helicase activation level;
ii. уровень экспрессии NOXA;ii. NOXA expression level;
iii. либо их сочетание;iii. or a combination thereof;
c) сравнение данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;c) comparing the data obtained in step b) with the data observed in the control from the same cells treated in the same way, but in the absence of the candidate compound;
d) выбор соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.d) the choice of compounds that led to a significant increase in the parameter or parameters defined in paragraph b), compared with the control.
Что касается подходящих клеточных линий, то можно использовать любую линию клеток меланомы, предпочтительно человеческую. Примерами подходящих клеточных линий, используемых в примерах по изобретению, являются человеческие клеточные линии SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 и SK-Mel-147, а также мышиные клетки B16. Нормальными контрольными клетками являются меланоциты или другие клетки кожи, а также клетки иммунной системы, которые, как правило, представляют собой центры вторичной токсичности при лечении рака.As for suitable cell lines, any melanoma cell line, preferably human, can be used. Examples of suitable cell lines used in the examples of the invention are human cell lines SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 and SK-Mel-147, as well as murine B16 cells. Normal control cells are melanocytes or other skin cells, as well as cells of the immune system, which, as a rule, are centers of secondary toxicity in the treatment of cancer.
Альтернативно, способ по изобретению может быть направлен на идентификацию соединений для применения в качестве терапевтических средств для лечения, по меньшей мере, одного из следующих видов рака: карциномы поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника. В этом случае способ по изобретению будет включать следующие стадии:Alternatively, the method of the invention can be directed to identifying compounds for use as therapeutic agents for treating at least one of the following cancers: carcinomas of the pancreas, colon, bladder, breast, prostate, lung, and ovary. In this case, the method according to the invention will include the following steps:
a) приведение соединения-кандидата в контакт с культурой раковых клеток, по меньшей мере, одного из перечисленных выше видов рака, или клеточной линией, полученной из клеток, по меньшей мере, одного из перечисленных выше видов рака;a) bringing the candidate compound into contact with a cancer cell culture of at least one of the above types of cancer, or a cell line derived from cells of at least one of the above types of cancer;
b) определение, по меньшей мере, одного из следующих параметров:b) determining at least one of the following parameters:
i. уровень активации геликазы семейства MDA-5;i. MDA-5 family helicase activation level;
ii. уровень экспрессии NOXA;ii. NOXA expression level;
iii. либо их сочетание;iii. or a combination thereof;
c) сравнение данных, полученных на стадии b), с данными, наблюдаемыми в контроле из тех же клеток, обработанных аналогичным образом, но в отсутствие соединения-кандидата;c) comparing the data obtained in step b) with the data observed in the control from the same cells treated in the same way, but in the absence of the candidate compound;
d) выбор соединений, которые привели к значительному увеличению параметра или параметров, определенных в пункте b), по сравнению с контролем.d) the choice of compounds that led to a significant increase in the parameter or parameters defined in paragraph b), compared with the control.
В этом случае клеточную линию будут выбирать из группы линий клеток рака поджелудочной железы: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 и Panc-1; или из группы линий клеток рака толстой кишки: CACO, SW480 и SW1222; или из группы линий клеток рака мочевого пузыря: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170; или из группы линий клеток глиомы: U87MG, U251 и T98G; или из группы линий клеток рака молочной железы: MDA231, MCF7 и T47D; или из группы линий клеток рака предстательной железы: LNCaP, PC3 и DU145; или из группы линий клеток рака легкого: H1299 и NCI H460; или из группы линий клеток рака яичника: NCI H23, CHQK1 и SK-OV-3.In this case, the cell line will be selected from the group of pancreatic cancer cell lines: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 and Panc-1; or from the group of colon cancer cell lines: CACO, SW480 and SW1222; or from a group of bladder cancer cell lines: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 and SW1170; or from a group of glioma cell lines: U87MG, U251 and T98G; or from a group of breast cancer cell lines: MDA231, MCF7, and T47D; or from a group of prostate cancer cell lines: LNCaP, PC3, and DU145; or from a group of lung cancer cell lines: H1299 and NCI H460; or from the group of ovarian cancer cell lines: NCI H23, CHQK1 and SK-OV-3.
Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению описан ниже в примерах изобретения. В таком случае способ по изобретению осуществляют, используя сочетание определения активации MDA-5, анализа генной экспрессии (наблюдение увеличения экспрессии NOXA) и подтверждения активации аутофагии тремя возможными методами, описанными ранее: мониторингом посттрансляционных модификаций белка LC3 при помощи иммуноблоттинга, отслеживанием изменений в клеточном распределении LC3 путем детекции флуоресценции за счет флуоресцентного белка GFP (с клетками, предварительно трансфицированными рекомбинантным ретровирусом, содержащим структуру, способную экспрессировать слитый белок GFP-LC3), подтверждением образования аутофагосом методом электронной трансмиссионной микроскопии через 5 часов обработки соединением-кандидатом и подтверждением наличия фагоцитарных вакуолей через 30 часов обработки.A preferred embodiment of the method of the invention is described below in the examples of the invention. In this case, the method according to the invention is carried out using a combination of determining the activation of MDA-5, analysis of gene expression (observing an increase in NOXA expression) and confirming the activation of autophagy by the three possible methods described previously: monitoring post-translational modifications of the LC3 protein by immunoblotting, tracking changes in cell distribution LC3 by fluorescence detection by fluorescent GFP protein (with cells previously transfected with a recombinant retrovirus containing the structure, capable of expressing the GFP-LC3 fusion protein) by confirming the formation of autophagosomes by electron transmission microscopy after 5 hours of treatment with the candidate compound and confirming the presence of phagocytic vacuoles after 30 hours of treatment.
Следует отметить, что описанный выше способ по изобретению позволяет идентифицировать новое соединение, представляющее собой сочетание двухцепочечной РНК (дсРНК) или ее аналога и поликатиона. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное соединение представляет собой BO-110 (pICPEI), являющееся сочетанием полиинозин-полицитидиловой кислоты (pIC) и полиэтиленимина (PEI).It should be noted that the above method according to the invention allows to identify a new compound, which is a combination of double-stranded RNA (dsRNA) or its analogue and polycation. In a preferred embodiment of the invention, said compound is BO-110 (pIC PEI ), which is a combination of polyinosine-polycytidylic acid (pIC) and polyethyleneimine (PEI).
Как показано ниже в примерах и фигурах по настоящему изобретению, BO-110 можно эффективно применять для лечения различных видов рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.As shown in the examples and figures of the present invention below, BO-110 can be effectively used to treat various types of cancer, for example: melanoma, cancer of the pancreas, colon, bladder, breast, prostate, lung and ovary.
Вследствие этого, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей BO-110, для применения в лечении рака, например: меланомы, рака поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника. Эта фармацевтическая композиция также полезна для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом.Therefore, the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing BO-110, for use in the treatment of cancer, for example: melanoma, cancer of the pancreas, colon, bladder, breast, prostate, lung and ovary. This pharmaceutical composition is also useful for treating immunocompromised patients.
Удивительно, но при функциональном взаимодействии pIC и PEI достигается синергетический технический эффект, в результате которого улучшается и изменяется сумма технических эффектов отдельных составляющих. Таким образом, BO-110 проникает в клетки и действует иным образом, чем его компоненты PEI и pIC. В частности, в то время как PEI не имеет заметного клеточного эффекта, а сигналы выделенной pIC временно вызывают иммунные ответы, которые в конечном счете не оказывают биологического воздействия in vivo, BO-110 обладает способностью избирательно уничтожать опухолевые клетки. Вследствие этого, BO-110 иллюстрирует концепцию синтетической летальности, описанной для генов или соединений, которые в виде отдельных веществ не имеют активности, однако в сочетании обладают отличающимся и терапевтически применимым противораковым эффектом.Surprisingly, with the functional interaction of pIC and PEI, a synergistic technical effect is achieved, as a result of which the sum of the technical effects of the individual components improves and changes. Thus, BO-110 penetrates the cells and acts in a different way than its components PEI and pIC. In particular, while PEI has no noticeable cellular effect, and isolated pIC signals temporarily elicit immune responses that ultimately have no biological effect in vivo , BO-110 has the ability to selectively kill tumor cells. As a result, BO-110 illustrates the concept of synthetic lethality described for genes or compounds that, as separate substances, have no activity, but when combined, have a different and therapeutically applicable anti-cancer effect.
Поэтому одним из наиболее важных пунктов настоящего изобретения является неожиданное открытие, что миметик вирусной дсРНК полиинозин-полицитидиловая кислота (pIC) меняет свой маршрут проникновения и доставки в опухолевые клетки. От стандартного узнавания TLR-3 (Toll-подобным рецептором 3), pIC может быть направлена на семейство сенсоров дсРНК (отличных от TLR3), если эта дсРНК объединена с семейством носителей, которые специфически делают возможной доставку в цитозоль. Такая активность изменяет механизм действия дсРНК от несущественного иммуномодулятора до масштабного убийцы опухолевых клеток. Противораковая активность была продемонстрирована с полиэтиленимином (PEI), а также с липофектамином, полифектом или суперфектом. Хотя эти носители сами по себе не были биологически активными в качестве терапевтических средств, в настоящем изобретении показано, что они способны защищать молекулу pIC, поддерживая ее в стабильной форме, что позволяет активировать аутофагию. Таким образом, сочетание дсРНК/поликатион, примером которого является BO-110, представляет собой новое молекулярное образование с противораковой активностью. Более того, механизм действия BO-110 оказался неожиданным. Это соединение способствует двойной индукции апоптоза и аутофагии, ведущих к скоординированному и избирательному уничтожению опухолевых клеток, в частности, но не исключительно, клеток меланомы, не влияя на жизнеспособность нормальных компартментов. Механизм апоптоза запускался при помощи белка NOXA. В отличие от других NOXA-индуцирующих химиотерапевтических средств, BO-110 не требует белка-супрессора опухолевого роста p53. Это является важным преимуществом, так как р53 мутирован, отсутствует или инактивирован в подавляющем большинстве раковых опухолей человека. Эффект явно превосходит классические ответы на «голую» вирусную РНК, что объясняет плохие результаты клинических исследований «голой» pIC в лечении меланомы.Therefore, one of the most important points of the present invention is the unexpected discovery that the polyinosine-polycytidylic acid (pIC) viral dsRNA mimetic changes its route of entry and delivery to tumor cells. From standard recognition of TLR-3 (Toll-like receptor 3), pIC can be targeted to a family of dsRNA sensors (other than TLR3) if this dsRNA is combined with a family of carriers that specifically allow delivery to the cytosol. Such activity changes the mechanism of action of dsRNA from a non-essential immunomodulator to a large-scale killer of tumor cells. Anticancer activity has been demonstrated with polyethyleneimine (PEI), as well as with lipofectamine, polyfect, or superfect. Although these carriers themselves were not biologically active as therapeutic agents, the present invention shows that they are able to protect the pIC molecule by maintaining it in a stable form, which allows activation of autophagy. Thus, the dsRNA / polycation combination, exemplified by BO-110, represents a new molecular formation with anticancer activity. Moreover, the mechanism of action of BO-110 was unexpected. This compound promotes the double induction of apoptosis and autophagy, leading to the coordinated and selective destruction of tumor cells, in particular, but not exclusively, melanoma cells, without affecting the viability of normal compartments. The apoptosis mechanism was triggered by the NOXA protein. Unlike other NOXA-inducing chemotherapeutic agents, BO-110 does not require a p53 tumor suppressor protein. This is an important advantage, since p53 is mutated, absent, or inactivated in the vast majority of human cancers. The effect is clearly superior to classical responses to naked viral RNA, which explains the poor results of clinical studies of naked pIC in the treatment of melanoma.
Таким образом, BO-110, но не одиночная дсРНК, обладал способностью стимулировать саморазрушение раковых клеток и блокировать раковый метастаз in vivo, даже у мышей с ослабленным иммунитетом. Генетический, функциональный и ультраструктурный анализ, описанный далее в данном изобретении, показывает, что индукция аутофагии запускается pIC не для защиты клеток, а для избирательного уничтожения опухолевых клеток. В качестве дальнейшего подтверждения данных результатов, хотя pIC рассматривалась как индуктор иммунитета, контролируемого IFN, наблюдаемый эффект не зависит от активации пути для продукции и секреции IFN-α. В соответствии с этим наблюдением, активация пути аутофагии имеет место даже у животных с ослабленным иммунитетом. В совокупности, эти данные показывают, что BO-110 намечает и определяет новые точки приложения усилий для клинического использования собственных программ узнавания патогена, аутофагии и гибели опухолевых клеток.Thus, BO-110, but not a single dsRNA, was able to stimulate self-destruction of cancer cells and block cancer metastasis in vivo , even in mice with weakened immune systems. The genetic, functional and ultrastructural analysis described later in this invention shows that the induction of autophagy is triggered by pIC not to protect cells, but to selectively kill tumor cells. As further confirmation of these results, although pIC was considered as an inducer of immunity controlled by IFN, the observed effect does not depend on the activation of the pathway for production and secretion of IFN-α. According to this observation, the activation of the autophagy pathway occurs even in animals with weakened immunity. Together, these data show that BO-110 targets and identifies new points of application of effort for the clinical use of its own pathogen recognition programs, autophagy and tumor cell death.
Генетические и функциональные исследования определили эндогенную MDA-5 как связующее звено между путями аутофагии и апоптоза, обусловленными BO-110. Это также отличается от предыдущего раскрытия информации в отношении MDA-5, которое было ограничено апоптозной гибелью клеток, вызванной экзогенными компонентами. Также новым оказалось взаимодействие MDA-5/NOXA.Genetic and functional studies have identified endogenous MDA-5 as a link between autophagy and apoptosis pathways due to BO-110. This also differs from the previous disclosure regarding MDA-5, which was limited to apoptotic cell death caused by exogenous components. Also new was the interaction of MDA-5 / NOXA.
Таким образом, MDA-5 представлена в качестве подходящей терапевтической мишени для скрининга веществ для лечения рака с особенностью запуска самоуничтожения опухоли при помощи ауто/лизосомальных и характерных для апоптоза протеаз. Как упоминалось ранее, эта стратегия имеет преимущества по сравнению со стандартными терапевтическими средствами, которые задействуют любой из этих механизмов независимо.Thus, MDA-5 is presented as a suitable therapeutic target for screening substances for treating cancer with the peculiarity of triggering self-destruction of a tumor using auto / lysosomal and apoptotic proteases. As mentioned earlier, this strategy has advantages over standard therapeutic agents that use any of these mechanisms independently.
Аналогично, образование, позволившее открыть данный путь, поскольку способно его активировать, представляет собой комплекс BO-110 или другие сочетания аналога дсРНК и катионного носителя. Вследствие этого, данные вещества являются хорошими кандидатами для применения в производстве лекарственных средств для лечения рака.Similarly, the formation that allowed this pathway to be opened, since it is capable of activating it, is a BO-110 complex or other combinations of a dsRNA analog and a cationic carrier. As a result, these substances are good candidates for use in the manufacture of drugs for the treatment of cancer.
В данном изобретении термин «длинный фрагмент двухцепочечной РНК» используют в противоположность фрагментам РНК, известным как короткие РНК или интерферирующие РНК (киРНК). Вследствие этого, считается, что двухцепочечная РНК (дуплекс) является «длинной», если фрагмент двухцепочечной РНК содержит, по меньшей мере, 25 нуклеотидов в цепи. Предпочтительно, если используемый фрагмент равен по длине промежуточным продуктам двухцепочечной РНК, появляющимся в клетках в процессе клеточного цикла большинства РНК вирусов, которые, очевидно, являются естественным субстратом MDA-5 семейства геликаз, так что двухцепочечная РНК по изобретению считается «длинной», особенно, если она содержит, по меньшей мере, 100 нуклеотидов в цепи и, более конкретно, если она содержит, по меньшей мере, 1000 нуклеотидов в цепи.In the present invention, the term “long double-stranded RNA fragment” is used in contrast to RNA fragments known as short RNAs or interfering RNAs (siRNAs). Because of this, double-stranded RNA (duplex) is considered to be “long” if the double-stranded RNA fragment contains at least 25 nucleotides in the chain. Preferably, if the fragment used is equal in length to the intermediate products of double-stranded RNA appearing in the cells during the cell cycle of most RNA viruses, which are obviously a natural substrate of the MDA-5 helicase family, so the double-stranded RNA according to the invention is considered to be "long", especially if it contains at least 100 nucleotides in a chain and, more specifically, if it contains at least 1000 nucleotides in a chain.
Фрагменты двухцепочечной РНК, которые встречаются в природе и могут быть полезными для применения по изобретению, могут представлять собой промежуточные продукты двухцепочечной РНК, образующиеся в процессе клеточного цикла парамиксовируса (такого, как вирус болезни Ньюкасла, NDV, вирус Сендай (SDV)), рабдовируса (вирус везикулярного стоматита (VSV)); флавовируса (вирус гепатита C (HCV)), ортомиксовируса (вирус гриппа) и пикорнавируса (вирус миокардита мозга (EMCV).Fragments of double-stranded RNA that are naturally occurring and may be useful for use according to the invention can be intermediate products of double-stranded RNA formed during the cell cycle of paramyxovirus (such as Newcastle disease virus, NDV, Sendai virus (SDV)), rhabdovirus ( vesicular stomatitis virus (VSV)); flavovirus (hepatitis C virus (HCV)), orthomyxovirus (influenza virus) and picornavirus (brain myocarditis virus (EMCV).
Что же касается аналогов двухцепочечной РНК, помимо полиинозин-полицитидиловой кислоты (pIC), для изобретения могут быть полезными другие мимики дсРНК: a) те, скелет которых образован соединением, похожим на рибозу, например, те, которые основаны на LNA (закрытая нуклеиновая кислота: устойчивость к гидролизу), морфолино и ПНК (пептидная нуклеиновая кислота), b) те, в которых, по меньшей мере, одно из типичных азотистых оснований нуклеотидов РНК заменено аналогами, что также может приводить к отличающимся от естественных вариантам спаривания, таким как диаминопурин (который образует пару с урацилом за счет трех водородных связей), пара ксантин/диаминпиримидин (в которой форма кето/кето пурина, ксантин, образует три водородные связи с формой амин/амин пиримидина), или пара изогуанин/изоцитозин (в которой форма амин/кето пурина, изогуанин, образует три водородные связи с формой кето/амин пиримидина, изоцитозином).As for the double-stranded RNA analogues, besides polyinosine-polycytidylic acid (pIC), other dsRNA mimics may be useful for the invention: a) those whose skeleton is formed by a ribose-like compound, for example, those based on LNA (closed nucleic acid) : resistance to hydrolysis), morpholino and PNA (peptide nucleic acid), b) those in which at least one of the typical nitrogen bases of RNA nucleotides is replaced by analogues, which can also lead to different pairing variants, m like diaminopurin (which forms a pair with uracil through three hydrogen bonds), a xanthine / diaminpyrimidine pair (in which the form of keto / keto purine, xanthine, forms three hydrogen bonds with the form of amine / amine pyrimidine), or an isoguanine / isocytosine pair (in which the amine / keto purine form, isoguanine, forms three hydrogen bonds with the keto / amine pyrimidine form, isocytosine).
Что касается поликатионного носителя, для целей изобретения подходящими являются все те, которые способны изменять проницаемость плазменной мембраны и/или индуцировать эндоцитоз, стимулируя проникновение в клетку двухцепочечной РНК или ее аналогов и высвобождая их в цитозоль, тем самым повышая активацию цитозольных сенсоров двухцепочечной РНК, таких как геликаза MDA-5. Помимо полиэтиленимина (PEI) и липофектамина, под это определение попадают поли-L-лизин, полисилазан, полидигидроимидазолиний, полиалиламин и этоксилированный полиэтиленимин (ePEI).As for the polycationic carrier, all those that are capable of modifying the permeability of the plasma membrane and / or inducing endocytosis, stimulating the penetration of double-stranded RNA or its analogues into the cell and releasing them into the cytosol, thereby increasing the activation of cytosolic sensors of double-stranded RNA, are suitable like helicase MDA-5. In addition to polyethyleneimine (PEI) and lipofectamine, poly-L-lysine, polysilazane, polydihydroimidazolinium, polyalylamine and ethoxylated polyethyleneimine (ePEI) fall under this definition.
Далее изобретение иллюстрируется более подробно посредством примеров и фигур.The invention is further illustrated in more detail by way of examples and figures.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Фигура 1. Индукция макроаутофагии с помощью BO-110 приводит к гибели клеток меланомыFigure 1. Induction of macroautophagy using BO-110 leads to the death of melanoma cells
На панели A представлена визуализация с помощью эпифлуоресценции аутофагосома-подобного очагового окрашивания eGFP-LC3 в клетках меланомы SK-Mel-103, обработанных в течение 12 ч 1 мкг/мл pIC в комплексе с PEI (BO-110). Клетки, обработанные только PEI, приведены в качестве контроля.Panel A presents visualization using epifluorescence of autophagosome-like focal staining of eGFP-LC3 in SK-Mel-103 melanoma cells treated for 12 h with 1 μg / ml pIC in complex with PEI (BO-110). Cells treated only with PEI are shown as controls.
На панели B представлено зависящее от времени накопление клеток SK-Mel-103, демонстрирующих точечную флуоресцентную эмиссию eGFP-LC3 при обработке BO-110 или контрольным плацебо. Рапамицин использовали в качестве классического индуктора аутофагии.Panel B depicts time-dependent accumulation of SK-Mel-103 cells demonstrating spot fluorescence emission of eGFP-LC3 when treated with BO-110 or a control placebo. Rapamycin was used as a classic autophagy inducer.
На панели C представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из клеток SK-Mel-103, обработанных, как указано. Способы обработки указаны над каждой полосой: контроль (без обработки: клеточные популяции инкубировали только в присутствии растворителя), обработанные pIC или BO-110 клетки. Проанализированные белки указаны в левой части панели: немодифицированный ATG8 (LC3 I), липидированный ATG8 (LC3 II) и контроль нагрузки (β-актин). В правой стороне панели указаны молекулярные веса, в кДа.Panel C shows immunoblots of the total cell extracts isolated from SK-Mel-103 cells treated as indicated. Processing methods are indicated above each lane: control (without treatment: cell populations were incubated only in the presence of a solvent), pIC or BO-110 treated cells. The analyzed proteins are indicated on the left side of the panel: unmodified ATG8 (LC3 I), lipidated ATG8 (LC3 II) and load control (β-actin). On the right side of the panel are molecular weights, in kDa.
На панели D представлены электронные микрофотографии клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 или контролем PEI. Стрелки указывают на связанные с мембранами аутофагосомы и аутолизосомы.Panel D shows electron micrographs of SK-Mel-103 cells treated with BO-110 or PEI control. Arrows indicate autophagosomes and autolysosomes associated with membranes.
На панели E представлены микрофотографии при сильном (верх) и слабом (низ) увеличении клеток SK-Mel-103 через 5 часов после инкубации с растворителем (левая колонка) или BO-110 (правая колонка).Panel E shows micrographs with strong (top) and weak (bottom) magnification of SK-Mel-103
На панели F представлены типичные микрофотографии в светлом поле (слева и в центре) и под электронным микроскопом (справа) клеточных колоний после 30 часов обработки, как показано на снимках.Panel F presents typical micrographs in a bright field (left and center) and under an electron microscope (right) of cell colonies after 30 hours of processing, as shown in the pictures.
Фигура 2. Микроскопия через временные интервалы индукции аутофагии с помощью BO-110 в клетках меланомыFigure 2. Microscopy at time intervals of autophagy induction using BO-110 in melanoma cells
Последовательность микрофотографий, полученных через указанные интервалы времени после обработки PEI (контроль) или BO-110 экспрессирующих eGFP-LC3 клеток меланомы SK-Mel-103. Очаговые агрегаты свидетельствуют об образовании аутофагосом. Стрелками отмечены разрушающиеся и открепляющиеся клетки (гибнущие клетки) в процессе обработки.The sequence of micrographs obtained at the indicated time intervals after processing PEI (control) or BO-110 expressing eGFP-LC3 melanoma cells SK-Mel-103. Focal aggregates indicate the formation of autophagosomes. Arrows indicate destructive and detaching cells (dying cells) during processing.
Фигура 3. Доставка в цитозоль pIC благодаря присутствию PEI избирательно вызывает гибель клеток меланомыFigure 3. Delivery to the cytosol pIC due to the presence of PEI selectively causes death of melanoma cells
На панели A приведена диаграмма, на которой гибель клеток в процентном выражении, определенная в тесте на исключение трипанового синего, представлена через 24 и 48 часов обработки, как указано (NT: белые столбики, обработка PEI: темно-серые столбики, обработка pIC: светло-серые столбики, BO-110: черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ± SEM из трех независимых экспериментов с различными клеточными линиями, указанными сверху над диаграммой. Как видно, только популяции клеток меланомы, обработанные BO-110, гибнут эффективно.Panel A shows a graph in which cell death as a percentage determined in the trypan blue exclusion test is presented after 24 and 48 hours of treatment, as indicated (NT: white bars, PEI processing: dark gray bars, pIC processing: light gray bars, BO-110: black bars). Data are presented as mean values ± SEM from three independent experiments with different cell lines indicated above the diagram. As can be seen, only melanoma cell populations treated with BO-110 die efficiently.
Панель B: микрофотографии под электронным микроскопом клеток SK-Mel-28 и SK-Mel-103, обработанных растворителем (контр.), PEI, pIC или BO-110, и визуализированные через 12 ч после обработки. Для каждой клеточной линии приведены фотографии, полученные при двух различных увеличениях. Стрелками отмечены аутолизосомы, наблюдаемые только в клетках, обработанных BO-110.Panel B: electron micrographs of SK-Mel-28 and SK-Mel-103 cells treated with a solvent (control), PEI, pIC or BO-110 and visualized 12 hours after treatment. For each cell line, photographs are taken at two different magnifications. Arrows indicate autolysosomes observed only in cells treated with BO-110.
Фигура 4. Избирательная цитотоксическая активность BO-110 в отношении опухолевых клетокFigure 4. Selective cytotoxic activity of BO-110 against tumor cells
На панели A представлены типичные изображения в светлом поле меланоцитов, выделенных из крайней плоти человека (верхний ряд), клеток меланомы человека SK-Mel-103 (средний ряд) и линии мышиной меланомы B16 (нижний ряд) после обработки растворителем, PEI, pIC или BO-110, как указано.Panel A shows typical images in the bright field of melanocytes isolated from the human foreskin (upper row), human melanoma cells SK-Mel-103 (middle row), and murine melanoma B16 line (lower row) after treatment with solvent, PEI, pIC or BO-110 as indicated.
На панели B представлены графики зависимости доза-эффект для обработок PEI и pIC в отдельности или в сочетании (BO-110) (группы столбиков справа на каждом графике) клеток FM (меланоциты крайней плоти) и SK-Mel-103. Эффект выражен в виде процента погибших клеток через 24 часа после обработки.Panel B presents dose-response curves for the PEI and pIC treatments individually or in combination (BO-110) (group of columns on the right of each graph) of FM cells (foreskin melanocytes) and SK-Mel-103. The effect is expressed as the percentage of
График на панели C представляет гибель клеток в процентном выражении, определенную в тесте на исключение трипанового синего, через 24 часа после проведения обработок (контр.: без обработки; PEI, pIC и BO-110). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов, проведенных с указанными клеточными линиями (SK-Mel-103 или фибробласты крайней плоти). Как и на панели A, только популяции клеток меланомы, обработанные BO-110, гибнут эффективно.The graph in panel C represents the cell death in percentage terms determined in the trypan
Фигура 5. MDA-5 является сенсором и движущей силой цитотоксичности BO-110 в клетках меланомыFigure 5. MDA-5 is the sensor and driving force of the cytotoxicity of BO-110 in melanoma cells.
На панели A представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из SK-Mel-28 (верхняя фотография), SK-Mel-147 (низ), необработанных (NT) или обработанных PEI, pIC, BO-110 или бортезомибом (Bor), как указано для различных линий. Звездочка соответствует неспецифической полосе. Стрелкой указано место, где должна наблюдаться полоса 30 кДа, свидетельствующая о расщеплении MDA-5.Panel A shows immunoblots of total cell extracts isolated from SK-Mel-28 (top photo), SK-Mel-147 (bottom), untreated (NT) or processed with PEI, pIC, BO-110 or bortezomib (Bor), as indicated for different lines. The asterisk corresponds to a non-specific strip. The arrow indicates the place where the 30 kDa band should be observed, indicating the cleavage of MDA-5.
Панель B: Процессинг MDA-5 в клетках SK-Mel-147, не инфицированных или инфицированных лентивирусом, экспрессирующим рандомизированную или соответствующую MDA-5 кшРНК, визуализированный с помощью иммуноблоттинга клеточных экстрактов после обработки pIC, BO-110 или растворителем, как указано. Как показано на панели A, звездочкой отмечена неспецифическая полоса и стрелки указывают положение полосы 30 кДа, свидетельствующей о расщеплении MDA-5.Panel B: Processing of MDA-5 in SK-Mel-147 cells not infected or infected with lentivirus expressing randomized or corresponding MDA-5 kshRNA visualized by immunoblotting of cell extracts after treatment with pIC, BO-110 or solvent, as indicated. As shown in panel A, an asterisk indicates a non-specific band and the arrows indicate the position of the 30 kDa band, indicative of MDA-5 cleavage.
На панели C показан ингибиторный эффект кшРНК MDA-5 на целевую токсичность, индуцированную BO-110, при определении в тесте с исключением трипанового синего через 24 часа после обработки только pIC (серые столбики, ▒), комплексом BO-110 (черные столбики, █) или без обработки клеток (незаштрихованные столбики). Также приведены результаты инфицирования контрольной кшРНК («кш контроль»). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.Panel C shows the inhibitory effect of MDA-5 cshRNA on target toxicity induced by BO-110, as determined in the test with the exception of trypan blue 24 hours after treatment with only pIC (gray bars, ▒), complex BO-110 (black bars, █ ) or without treatment of cells (unshaded bars). The results of infection of the control kshRNA ("ksh control") are also presented. Data are presented as mean ± SEM from three independent experiments.
Фигура 6. Эффект фармакологических ингибиторов аутофагии на цитотоксическую активность BO-110Figure 6. Effect of pharmacological autophagy inhibitors on the cytotoxic activity of BO-110
На панели A представлен эффект 3-метиладенина (3-MA) и хлорохина (Chlor) на перемещение EGFP-LC3 в аутофагосомы, оцененный, исходя из процента клеток SK-Mel-103, имеющих очаги флуоресценции из-за GFP-LC3 через 12 ч после обработки BO-110 (черные заштрихованные столбики) или буферным контролем (незаштрихованные столбики).Panel A shows the effect of 3-methyladenine (3-MA) and chloroquine (Chlor) on the movement of EGFP-LC3 into autophagosomes, estimated based on the percentage of SK-Mel-103 cells having foci of fluorescence due to GFP-LC3 after 12 hours after processing BO-110 (black hatched bars) or buffer control (unshaded bars).
На панели B представлен ингибиторный эффект хлорохина (Chlor), пепстатина A (PEP) или E64d на гибель клеток, оцененный на основании исключения трипанового синего, через 20 часов после обработки растворителем (белые столбики) или BO-110 (черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.Panel B shows the inhibitory effect of chloroquine (Chlor), pepstatin A (PEP), or E64d on cell death, assessed by exclusion of trypan blue, 20 hours after treatment with solvent (white bars) or BO-110 (black bars). Data are presented as mean ± SEM from three independent experiments.
На панели C представлены флуоресцентные конфокальные микрофотографии клеток SK-Mel-103, трансфицированных Cherry-GFP-LC3 для обнаружения образования аутофагосом (35 красных и зеленых очагов) и аутолизосом (просто красные очаги) после обработки BO-110 или 25 нМ рапамицином.Panel C shows fluorescence confocal micrographs of SK-Mel-103 cells transfected with Cherry-GFP-LC3 to detect the formation of autophagosomes (35 red and green lesions) and autolysosomes (simply red lesions) after treatment with BO-110 or 25 nM rapamycin.
На панели D представлен ингибиторный эффект 100 мкМ 100 бафиломицина (Bafil), 20 мкМ хлорохина (Chlor) или 10 мкг/мл пепстатина (PEP) на гибель клеток, оцененную на основании исключения трипанового синего, через 20 часов после обработки растворителем (белые столбики) или BO-110 (черные столбики). Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов.Panel D shows the inhibitory effect of 100
На панели E представлены флуоресцентные конфокальные изображения клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 (верхние фото) или BO-110 в присутствии хлорохина (нижний ряд фотографий) и стабильно трансфицированных EGFP-Rab5 дикого типа (на фигуре колонка слева), либо инкубированных с BO-110, меченным красным флуоресцирующим агентом (фотографии средней колонки). Интернализацию BO-110 в клетках меланомы можно наблюдать в отсутствие или в присутствии хлорохина.Panel E shows fluorescence confocal images of SK-Mel-103 cells treated with BO-110 (top photo) or BO-110 in the presence of chloroquine (bottom row of photos) and stably transfected with wild-type EGFP-Rab5 (left column in the figure), or incubated with BO-110 labeled with a red fluorescent agent (middle column photographs). The internalization of BO-110 in melanoma cells can be observed in the absence or presence of chloroquine.
На панели F представлены флуоресцентные конфокальные изображения для просмотра зависимого от лизосом протеолиза за счет наличия расщепления и высвобождения флуоресцентного DQ-БСА (что приводит к зеленой флуоресценции в клетках SK-Mel-103, обработанных как растворителем (контроль), так и BO-110). В присутствии хлорохина (Chlor: средний ряд фотографий), не наблюдается флуоресцентный сигнал в колонке DQ-БСА (средняя колонка). Одновременное изображение клеток в присутствии Lysotracker-Red (LTR-Red: левая колонка фотографий) для демонстрации лизосомального компартмента, который создает сигнал во всех трех рядах фотографий.Panel F presents fluorescence confocal images for viewing lysosome-dependent proteolysis due to the cleavage and release of fluorescence DQ-BSA (resulting in green fluorescence in SK-Mel-103 cells treated with both solvent (control) and BO-110) . In the presence of chloroquine (Chlor: middle row of photographs), no fluorescence signal was observed in the DQ-BSA column (middle column). Simultaneous image of cells in the presence of Lysotracker-Red (LTR-Red: left column of photographs) to demonstrate the lysosomal compartment, which creates a signal in all three rows of photographs.
На панели G приведена столбчатая диаграмма, представляющая совместную локализацию соответствующих DQ-БСА и Red-Lysotracker сигналов в тестируемых клетках панели F (контр.: контроль, черные заштрихованные столбики, █; Chl: хлорохин, незаштрихованные столбики; BO-110, серые заштрихованные столбики, ▒). Совместную локализацию оценивали, по меньшей мере, в 150 клетках в двух независимых экспериментах и выражали относительно значения, полученного в контрольных клетках (у.е.: условные единицы флуоресценции).Panel G shows a bar graph representing the joint localization of the corresponding DQ-BSA and Red-Lysotracker signals in the test cells of panel F (control: control, black shaded bars, █; Chl: chloroquine, unshaded bars; BO-110, gray shaded bars , ▒). Joint localization was evaluated in at least 150 cells in two independent experiments and expressed relative to the value obtained in control cells (cu: conventional units of fluorescence).
На панели H представлены иммунофлуоресцентные конфокальные изображения очагов флуоресценции за счет GFP-LC3 (зеленые в оригинальном сигнале, что указывает на расположение аутофагосом) и Lysotracker (красные в оригинальном сигнале, что указывает на присутствие лизосом) в клетках SK-Mel-103 после обработки BO-110 или буферным контролем, как указано на изображениях. Ядра окрашивали красителем хехст (верхние фото, с синим сигналом в оригинале). В нижнем ряду показано совмещение трех предыдущих изображений, что дает желтый или оранжевый цвет в областях, которые имели зеленый и красный сигналы изображений, соответствующие GFP-LC3 и Lysotracker, соответственно, что указывает на то, что сигналы, соответствующие GFP-LC3 и Lysotracker, расположены в одних и тех же областях.Panel H shows immunofluorescence confocal images of the foci of fluorescence due to GFP-LC3 (green in the original signal, which indicates the location of autophagosomes) and Lysotracker (red in the original signal, indicating the presence of lysosomes) in SK-Mel-103 cells after BO treatment -110 or buffer control as indicated in the images. The cores were stained with Hoechst dye (top photo, with a blue signal in the original). The bottom row shows the combination of the three previous images, which gives a yellow or orange color in areas that had green and red image signals corresponding to GFP-LC3 and Lysotracker, respectively, which indicates that the signals corresponding to GFP-LC3 and Lysotracker, located in the same areas.
На панели I представлены изображения с конфокального микроскопа, полученные в реальном времени от клеток SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-LC3 (зеленый сигнал в оригинале), обработанных либо буферным контролем с pIC («контроль») либо BO-110, и инкубированных в присутствии Lysotracker (красный сигнал в оригинале) или красителя хехст (синий сигнал в оригинале), как показано на изображениях. Совмещение трех изображений (внизу справа для каждого способа обработки, контроль или BO-110), выявило устойчивую совместную локализацию (желтый сигнал) GFP-LC3 и лизосом (как и ожидалось вследствие образования аутолизосом) после обработки BO-110, но не после обработки «голой» pIC. В третьем ряду панели, под результатами перекрывающихся изображений, показаны диаграммы, полученные путем количественного определения общей клеточной интенсивности флуоресценции в зеленом канале в данной плоскости (диаграмма, помеченная «GFP» для EGFP-LC3) и красном (диаграмма, помеченная как «LYSO» для Lysotracker). В случае диаграмм, полученных с клетками, обработанными BO-110, аналогичное распределение обоих сигналов, eGFPLC3 и Lysotracker, является указанием на совместную локализацию и, следовательно, слияние аутофагосом и лизосом.Panel I presents confocal microscope images obtained in real time from SK-Mel-103 cells expressing EGFP-LC3 (green signal in the original), processed either with buffer control with pIC (“control”) or BO-110, and incubated in the presence of a Lysotracker (red signal in the original) or dye hechst (blue signal in the original), as shown in the images. The combination of three images (bottom right for each processing method, control or BO-110) revealed a stable joint localization (yellow signal) of GFP-LC3 and lysosomes (as expected due to the formation of autolysosomes) after processing BO-110, but not after processing " naked "pIC. In the third row of the panel, under the results of overlapping images, diagrams are shown obtained by quantifying the total cellular fluorescence intensity in the green channel in this plane (diagram labeled “GFP” for EGFP-LC3) and red (diagram labeled “LYSO” for Lysotracker). In the case of diagrams obtained with cells treated with BO-110, a similar distribution of both signals, eGFPLC3 and Lysotracker, is indicative of joint localization and, therefore, fusion of autophagosomes and lysosomes.
На панели J приведено изображение популяционного анализа клеток SK-Mel-103, обработанных pIC (контроль) или BO-110, которое представляет интенсивность сигнала EGFP-LC3 (зеленая флуоресценция, ось X) и Lysotracker (красный сигнал, ось Y). В квадраты заключены клетки с двойным окрашиванием обоих маркеров.Panel J shows a population analysis of SK-Mel-103 cells treated with pIC (control) or BO-110, which represents the signal strength of EGFP-LC3 (green fluorescence, X axis) and Lysotracker (red signal, Y axis). Cells with double staining of both markers are enclosed in squares.
Фигура 7. Эндосомальный трафик и образование и распад амфисом при обработке BO-110Figure 7. Endosomal traffic and the formation and decay of amphisomes during processing of BO-110
На панели A представлены последовательные изображения клеток меланомы SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-Rab7, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии в реальном времени в указанные моменты времени после обработки BO-110 или контрольным растворителем. Следует отметить, что BO-110 вызывал появление большого количества везикул. Звездочками отмечены слияния эндосома-эндосома (для ясности показаны только несколько примеров).Panel A shows successive images of SK-Mel-103 melanoma cells expressing EGFP-Rab7 obtained by real-time fluorescence microscopy at indicated times after treatment with BO-110 or a control solvent. It should be noted that BO-110 caused the appearance of a large number of vesicles. Asterisks indicate fusion of the endosome-endosome (for clarity, only a few examples are shown).
На панели B представлены фотографии с конфокального микроскопа клеток SK-Mel-103, стабильно трансфицированных ретровирусом, что приводило к экспрессии зеленой флуоресценции за счет слитого белка EGFP-Rab7 wt (Rab7 дикого типа) (первая и третья колонки фотографий слева, во втором случае фотографии получали в присутствии Lysotracker-Red, как указано на колонке) или слитого продукта EGFP-Rab7 T22N при инкубации в присутствии Lysotracker (правая колонка фотографий). Клетки обрабатывали дополнительно BO-110 (нижний ряд панели) или контрольным растворителем (верхняя панель). Изображения получали через 10 часов после обработки BO-110. Две колонки фотографий, расположенных справа, содержат значения, соответствующие средней площади, заключенной в окрашенных Rab7 везикулах.Panel B presents photographs from a confocal microscope of SK-Mel-103 cells stably transfected with retrovirus, which led to the expression of green fluorescence due to the EGFP-Rab7 wt fusion protein (wild-type Rab7) (the first and third column of photographs on the left, in the second case, photographs were obtained in the presence of Lysotracker-Red, as indicated on the column) or the EGFP-Rab7 T22N fusion product by incubation in the presence of Lysotracker (right column of photographs). Cells were further treated with BO-110 (bottom row of the panel) or control solvent (top panel). Images were obtained 10 hours after treatment with BO-110. The two columns of photographs on the right contain values corresponding to the average area contained in Rab7-stained vesicles.
На панели C приведена последовательность конфокальных микрофотографий, полученных в указанные интервалы времени (в секундах), показанные на фотографиях, которые иллюстрируют слияние и включение лизосом в Rab7-положительные везикулы после обработки BO-110.Panel C shows the sequence of confocal micrographs taken at the indicated time intervals (in seconds) shown in the photographs, which illustrate the fusion and incorporation of lysosomes into Rab7-positive vesicles after treatment with BO-110.
На панели D представлены полученные в реальном времени изображения с флуоресцентного микроскопа клеток SK-Mel-103, обработанных BO-110 и стабильно трансфицированных ретровирусом, что вызывает зеленую или красную флуоресценцию за счет GFP-Rab7wt (GFP-Rab7 на фотографиях), Cherry-LC3 (Ch-LC3 на фотографиях), или синюю флуоресценцию за счет Lysotracker-Blue (LTR-Blue на фигуре). Изображения получали в указанные моменты времени (минуты) через 1 час после обработки. Стрелками отмечена первая последовательность, в которой каждый указанный маркер мог быть визуализирован.Panel D presents real-time images from a fluorescence microscope of SK-Mel-103 cells treated with BO-110 and stably transfected with retrovirus, which causes green or red fluorescence due to GFP-Rab7wt (GFP-Rab7 in photographs), Cherry-LC3 (Ch-LC3 in the photographs), or blue fluorescence due to Lysotracker-Blue (LTR-Blue in the figure). Images were obtained at the indicated time points (minutes) 1 hour after processing. The arrows indicate the first sequence in which each indicated marker could be visualized.
На панели E показано включение LC3 на поверхности везикул с эндосомальным Rab7 до его интернализации и последующей деградации. Эти гибридные структуры эндосомы/LC3 (амфисомы) были визуализированы флуоресцентной микроскопией в реальном времени клеток SK-Mel-103, экспрессирующих EGFP-Rab7 или Cherry-LC3 (Ch-LC3 на фотографиях).Panel E shows the incorporation of LC3 on the surface of vesicles with endosomal Rab7 prior to its internalization and subsequent degradation. These hybrid endosome / LC3 structures (amphisomes) were visualized by real-time fluorescence microscopy of SK-Mel-103 cells expressing EGFP-Rab7 or Cherry-LC3 (Ch-LC3 in photographs).
Фигура 8. Цитотоксичность BO-110 зависит от активации эффекторной и регуляторной каспазFigure 8. The cytotoxicity of BO-110 depends on the activation of effector and regulatory caspases.
На панели A показан процент клеточной гибели, вызванной обработкой клеток SK-Mel-147 с PEI в качестве буферного контроля (контр., представлено незаштрихованными столбиками), pIC (серые заштрихованные столбики) или комплексом BO-110 (черные заштрихованные столбики) в присутствии соединений, перечисленных под каждой из диаграмм: растворитель (контрольный буфер без PEI) (левая диаграмма), витамин E (+ Vite, средняя диаграмма) или ингибитор каспазы ZVAD-fmk (+ ZVAD, правая диаграмма). Процент измеряли во всех случаях методом исключения трипанового синего.Panel A shows the percentage of cell death caused by treating SK-Mel-147 cells with PEI as a buffer control (control, represented by open hatches), pIC (gray hatched columns), or the BO-110 complex (black hatched columns) in the presence of compounds listed under each chart: solvent (control buffer without PEI) (left chart), vitamin E (+ Vite, middle chart) or caspase inhibitor ZVAD-fmk (+ ZVAD, right chart). Percentage was measured in all cases by trypan blue exclusion.
На панели B представлены результаты иммуноблоттинга экстрактов линий клеток метастатической меланомы (указаны слева). Их получали, собирая клетки в указанные моменты времени после обработки (в часах, на каждой дорожке). Способы обработки указаны над временными точками: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией приведен белковый анализ: casp-9 (каспаза 9), casp-8 (каспаза 8) или тубулин (контроль нагрузки). Цифры справа показывают относительную массу в кДа, соответствующую белковой полосе, присутствующей на этой высоте.Panel B presents the results of immunoblotting of extracts of metastatic melanoma cell lines (indicated on the left). They were obtained by collecting cells at the indicated time points after treatment (in hours, on each lane). Processing methods are indicated above time points: NT (without treatment: control cell populations incubated in the presence of buffer), PEI, pIC, BO-110 complex or Bor (
На панели C представлены результаты иммуноблоттинга экстрактов линии клеток SK-Mel-103, полученные путем сбора клеток после обработки, указанной в часах (24 и 48 часов). Способы обработки указаны под временными точками, отделенными горизонтальной чертой: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии только буфера), PEI, pIC и комплекс BO-110. Рядом с каждой фотографией показаны проанализированные белки: casp-9 (каспаза 9), casp-8 (каспаза 8), casp-7 (каспаза 7), Casp-3 (каспаза 3) или тубулин (контроль нагрузки).Panel C presents the results of immunoblotting of SK-Mel-103 cell line extracts obtained by collecting the cells after the treatment indicated in hours (24 and 48 hours). Processing methods are indicated under time points separated by a horizontal line: NT (without treatment: control cell populations incubated in the presence of only buffer), PEI, pIC, and BO-110 complex. The analyzed proteins are shown next to each photograph: casp-9 (caspase 9), casp-8 (caspase 8), casp-7 (caspase 7), Casp-3 (caspase 3), or tubulin (load control).
Фигура 9. BO-110 вызывает апоптоз через NOXA независимо от статуса p53 и без индукции компенсаторной активации MCL-1Figure 9. BO-110 induces apoptosis through NOXA regardless of p53 status and without induction of compensatory activation of MCL-1
На панели A представлены фотографии иммуноблотов клеток SK-Mel-28 (сверху) или SK-Mel-147 (снизу), полученные путем сбора клеток в моменты времени, указанные после обработки (в часах). Способы обработки указаны над временными точками: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией показан белок, уровень которого проанализирован: NOXA, Mcl-1 или тубулин (контроль нагрузки).Panel A presents photographs of immunoblots of SK-Mel-28 cells (top) or SK-Mel-147 (bottom) obtained by collecting cells at time points indicated after treatment (in hours). Processing methods are indicated above time points: NT (without treatment: control cell populations incubated in the presence of buffer), PEI, pIC, BO-110 complex or Bor (
На панели B приведены два отдельных графика, представляющие относительные уровни Mcl-1 (верх) и NOXA (нижний график), рассчитанные с помощью денситометрии после иммуноблоттинга, проведенного на клетках SK-Mel-28, в зависимости от указанного времени после обработки, выраженные в виде процентов относительно соответствующего значения, полученного для необработанных контрольных клеток. Рядом с каждой кривой указан соответствующий способ обработки.Panel B shows two separate graphs representing the relative levels of Mcl-1 (upper) and NOXA (lower graph) calculated by densitometry after immunoblotting performed on SK-Mel-28 cells, depending on the indicated time after treatment, expressed in as a percentage relative to the corresponding value obtained for untreated control cells. Next to each curve is the corresponding processing method.
На панели C представлены фотографии, полученные после иммуноблоттинга суммарных экстрактов клеток SK-Mel-103, проведенного путем сбора клеток после обработки (время указано в часах) для каждой группы обработки. Способы обработки указаны над каждой полосой: NT (без обработки: контрольные клеточные популяции, инкубированные в присутствии буфера), PEI, pIC, комплекс BO-110 или Bor (бортезомиб 25 мМ). Рядом с каждой фотографией показан белок, уровень которого проанализирован: NOXA, Bcl-xL, Bcl-2 или тубулин (контроль нагрузки). Внизу панели указан процент клеточной гибели, наблюдаемый после обработки.Panel C presents photographs obtained after immunoblotting of the total SK-Mel-103 cell extracts carried out by collecting the cells after treatment (time is indicated in hours) for each treatment group. Processing methods are indicated above each lane: NT (without treatment: control cell populations incubated in the presence of buffer), PEI, pIC, BO-110 complex or Bor (
На панели D представлены фотографии иммуноблотов, полученных для оценки экспрессии белка NOXA. Экстракты получали из клеток меланомы SK-Mel-103, обработанных в течение 24 ч pIC или BO-110 через два дня после инфицирования лентивирусным вектором, экспрессирующим неактивную кшРНК (кш контроль) или кшРНК, направленную против NOXA.Panel D shows photographs of immunoblots obtained to evaluate NOXA protein expression. Extracts were obtained from SK-Mel-103 melanoma cells treated with pIC or BO-110 for 24 hours two days after infection with a lentiviral vector expressing inactive kshRNA (ksh control) or kshRNA directed against NOXA.
На панели E приведена диаграмма, представляющая степень клеточной гибели (выраженную в виде процента погибших клеток) клеток меланомы SK-Mel-103, трансдуцированных либо контрольной кшРНК (серые заштрихованные столбики, ▒), либо кшРНК, направленной против NOXA (черные заштрихованные столбики, █), и инкубированных с pIC или BO-110 в течение 24 ч (NT: без обработки, клетки инкубированы с растворителем для введения.)Panel E shows a graph representing the degree of cell death (expressed as the percentage of dead cells) of SK-Mel-103 melanoma cells transduced with either control kshRNA (gray shaded bars, ▒) or kshRNA directed against NOXA (black shaded bars, █ ), and incubated with pIC or BO-110 for 24 hours (NT: without treatment, cells were incubated with a solvent for administration.)
На панели F показан ингибиторный эффект понижающей регуляции MDA-5 на индукцию NOXA, вызванную BO-110, представленный уровнями NOXA (выраженными в условных единицах, у.е.) в клетках SK-Mel-103,трансдуцированных контрольной кшРНК или кшРНК, направленной против MDA-5. Уровни NOXA измерены денситометрически и представлены относительно необработанных контролей (неинфицир.: без интерференции, уровни, которые соответствуют величине 1 в случае обработки «голой» pIC и 100 в случае обработки BO-110).Panel F shows the inhibitory effect of downregulation of MDA-5 on NOXA induction induced by BO-110, represented by NOXA levels (expressed in units of units, cu) in SK-Mel-103 cells transduced against control kshRNA or kshRNA directed against MDA-5. NOXA levels were measured densitometrically and presented relative to the untreated controls (non-infected: no interference, levels that correspond to a value of 1 in the case of naked pIC treatment and 100 in the case of BO-110 treatment).
Фигура 10. Противомеланомная активность BO-110 у иммунокомпетентных мышейFigure 10. Anti-melanoma activity of BO-110 in immunocompetent mice
Панель A.Panel A.
Верхняя панель. Схема экспериментального подхода для получения п/к ксенотрансплантатов клеток меланомы B16 у сингенных мышей C57BL/6. Также указано время лечения для перитуморальных инъекций 50 мкг (в 100 мкл) (2 нг/кг) «голой» и в комплексе с PEI pIC. Контрольные группы получали 100 мкл 5% глюкозы или только PEI.Top panel. Scheme of an experimental approach for obtaining sc xenografts of B16 melanoma cells in syngenic C57BL / 6 mice. Also indicated is the treatment time for peritumoral injections of 50 μg (in 100 μl) (2 ng / kg) “naked” and in combination with PEI pIC. Control groups received 100 μl of 5% glucose or only PEI.
Нижняя панель. Представлен рост опухолей, оцененный путем измерений штангенциркулем в указанные моменты времени. Анализировали по 10 опухолей на экспериментальную группу. Как правило, мышей умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1000 мм3. Эксперимент повторяли дважды с аналогичными результатами.The bottom panel. Tumor growth, estimated by measuring with a caliper at the indicated times, is presented. 10 tumors were analyzed per experimental group. Typically, mice were euthanized when the tumor volume exceeded 1000 mm 3 . The experiment was repeated twice with similar results.
На панели B показана внутривенная имплантация клеток меланомы B16-EGFP у сингенных мышей C57BL/6 для последующего внутривенного лечения с помощью 10 мкг (в 100 мкл) (1 нг/кг массы тела) pIC или BO-110 в указанные моменты времени. Контрольные группы получали PEI в 5% глюкозе. Через 14 дней после введения клеток мышей подвергали эвтаназии и легкие обрабатывали для получения флуоресцентных изображений.Panel B shows the intravenous implantation of B16-EGFP melanoma cells in C57BL / 6 syngeneic mice for subsequent intravenous treatment with 10 μg (per 100 μl) (1 ng / kg body weight) pIC or BO-110 at indicated times. Control groups received PEI in 5% glucose. 14 days after the introduction of the cells, the mice were euthanized and the lungs were treated to obtain fluorescence images.
На панели C приведена столбчатая диаграмма, представляющая число легочных метастазов, наблюдаемых в каждой группе лечения, полученное в результате подсчета вручную внешних метастазов (C). (P*<0,01 между NT/PEI и BO-110; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).Panel C shows a bar graph representing the number of pulmonary metastases observed in each treatment group, obtained by manually counting the external metastases (C). ( P * <0.01 between NT / PEI and BO-110; n = 5; generalized Mann-Whitney test).
Фигура 11. IFN-α индуцируется благодаря BO-110, но не является достаточным для способствования гибели клеток меланомыFigure 11. IFN-α is induced due to BO-110, but is not sufficient to promote melanoma cell death
На панели A представлены клетки меланомы B16 и макрофаги из костного мозга, обработанные pIC или BO-110; РНК выделяли и проводили количественную ПЦР для мишени IFN IFIT-1. Показаны относительные уровни мРНК IFIT-1, оцененные относительно контрольных необработанных клеток.Panel A shows B16 melanoma cells and bone marrow macrophages treated with pIC or BO-110; RNA was isolated and quantified by PCR for the IFN IFIT-1 target. Relative IFIT-1 mRNA levels evaluated relative to untreated control cells are shown.
На панели B представлены клетки меланомы SK-Mel-103, обработанные человеческим рекомбинантным IFN-α в указанных концентрациях, начиная с 10 пг/мл, что уже выше секретируемого количества IFN-α в клетках, обработанных BO-110, по данным ELISA). Гибель клеток определяли через 24 ч после обработки. В качестве контроля, клетки параллельно обрабатывали BO-110 (24 ч). Обратите внимание, что высокие уровни IFN-α не являются цитотоксическими для клеток меланомы и не могут воспроизвести эффективный лизис в результате воздействия BO-110.Panel B shows SK-Mel-103 melanoma cells treated with human recombinant IFN-α at indicated concentrations starting from 10 pg / ml, which is already higher than the secreted amount of IFN-α in BO-110 treated cells according to ELISA). Cell death was determined 24 hours after treatment. As a control, cells were simultaneously treated with BO-110 (24 h). Please note that high levels of IFN-α are not cytotoxic for melanoma cells and cannot reproduce effective lysis as a result of exposure to BO-110.
Фигура 12. Иммуносупрессия не нарушает способность BO-110 блокировать распространение метастазов меланомыFigure 12. Immunosuppression does not impair the ability of BO-110 to block the spread of melanoma metastases.
На панели A показано получение и лечение вызванных меланомой B16 легочных метастазов у мышей линии SCID Beige (тяжелый иммунодефицит в отношении NK, B и T-клеток). Изображения соответствуют фотографиям под видимым или флуоресцентным светом типичных легких мышей, инокулированных в/в клетками меланомы B16 и подвергавшихся лечению PEI, pIC или BO-110. Изображения получены через 14 после инъекции клеток.Panel A shows the preparation and treatment of B16 melanoma-induced pulmonary metastases in SCID Beige mice (severe immunodeficiency against NK, B, and T cells). Images correspond to photographs under visible or fluorescent light of typical lungs of mice inoculated with iv B16 melanoma cells and treated with PEI, pIC or BO-110. Images were obtained 14 after cell injection.
На панели B представлено среднее число метастазов, вызванных B16, как указано на панели A (P*<0,01 между группами лечения PEI, pIC и BO-110; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).Panel B presents the average number of metastases caused by B16 as indicated in panel A ( P * <0.01 between treatment groups PEI, pIC and BO-110; n = 5; generalized Mann-Whitney test).
На панели C приведен гистологический анализ легких после введения клеток B16 у мышей, получавших PEI, pIC или BO-110. Показаны типичные окрашенные H&E срезы легких из указанных групп лечения, визуализированные при двух различных увеличениях (10× и 40×).Panel C shows a histological analysis of the lungs after administration of B16 cells in mice treated with PEI, pIC or BO-110. Typical H&E stained sections of the lungs from these treatment groups are shown, visualized at two different magnifications (10x and 40x).
На панели D показано получение и лечение вызванных меланомой SK-Mel-103 легочных метастазов у мышей линии SCID Beige (тяжелый иммунодефицит в отношении NK, B и T-клеток). Изображения соответствуют фотографиям под флуоресцентным светом или под видимым светом окрашенных H&E (нижняя линия) типичных легких мышей, инокулированных в/в клетками меланомы SK-Mel-103 и подвергавшихся лечению PEI, pIC или BO-110.Panel D shows the preparation and treatment of SK-Mel-103 melanoma-induced pulmonary metastases in SCID Beige mice (severe immunodeficiency against NK, B, and T cells). Images correspond to photographs under fluorescent light or visible light stained with H&E (lower line) typical lungs of mice inoculated with SK-Mel-103 melanoma cells and treated with PEI, pIC or BO-110.
На панели E представлено среднее число метастазов, вызванных SK-Mel-103, как указано на панели D. (P*<0,01; n=5; обобщенный критерий Манна-Уитни).Panel E presents the average number of metastases caused by SK-Mel-103, as indicated in panel D. ( P * <0.01; n = 5; generalized Mann-Whitney test).
Фигура 13. Ингибирование BO-110 распространения метастазов у мышей Tyr::NRAS Q61K ×INK4a/ARF -/- Figure 13. Inhibition of BO-110 spread of metastases in Tyr mice :: NRAS Q61K ×INK4a / ARF - / -
На панели A представлен график Каплана-Мейера для выживаемости без прогрессирования метастазов для мышей Tyr:: Tyr::RasQ16K×INK4a/ARF-/-, на которых воздействовали ДМБА, чтобы вызвать пигментированные очаги, а затем подвергали лечению PEI в 5% глюкозе (контроль: контр.), pIC или BO-110.Panel A presents a Kaplan-Meyer graph for progression-free metastases for Tyr :: Tyr :: Ras Q16K × INK4a / ARF - / - mice that were exposed to DMBA to cause pigmented lesions and then treated with PEI in 5% glucose (control: control), pIC or BO-110.
На панели B представлены столбчатые диаграммы для кумулятивного среднего числа кожных меланоцитарных новообразований, появившихся в каждой из экспериментальных групп панели A. Подсчет проводили каждые 5 дней и опухоли группировали по диапазонам размеров, как указано на диаграммах.Panel B presents bar graphs for the cumulative average number of cutaneous melanocytic neoplasms appearing in each of the experimental groups of panel A. Counting was performed every 5 days and the tumors were grouped according to size ranges, as indicated in the diagrams.
На панели C представлены типичные изображения поперечных срезов (левая колонка) и коронарных срезов (правая колонка), полученных с помощью PET/CT с целью тестирования метаболической активности (включение 18F-FDG), типичных примеров мышей, получавших PEI в 5% глюкозе (контроль), «голую» pIC или BO-110. Опухоли окружены пунктирными белыми линиями. Звездочки указывают на положение сердца животного.Panel C shows typical images of cross sections (left column) and coronary sections (right column) obtained with PET / CT to test metabolic activity (inclusion of 18F-FDG), typical examples of mice that received PEI in 5% glucose (control ), Naked pIC or BO-110. Tumors are surrounded by dashed white lines. Asterisks indicate the position of the animal’s heart.
На панели D представлено окрашивание гематоксилином-эозином образцов меланоцитарных очагов, полученных от каждой группы лечения, описанной в панели A.Panel D shows hematoxylin-eosin staining of samples of melanocytic lesions obtained from each treatment group described in panel A.
На панели E представлено окрашивание гематоксилином-эозином образцов тканей кожи, сердца, печени или легких (как указано в левой части фотографии) мышей, получавших растворитель из 5% глюкозы (контроль) или BO-110, что демонстрирует отсутствие токсичности, связанной с лечением BO-110, в компартментах нормальных клеток.Panel E shows hematoxylin-eosin staining of skin, heart, liver, or lung tissue samples (as indicated on the left side of the photograph) in mice treated with 5% glucose diluent (control) or BO-110, which demonstrates the absence of toxicity associated with BO treatment -110, in the compartments of normal cells.
Фигура 14. Цитотоксическая активность BO-110 в отношении различных опухолевых клетокFigure 14. Cytotoxic activity of BO-110 against various tumor cells
На панели A представлен процент клеточной гибели в различных линиях опухолевых клеток: рак поджелудочной железы (Pa), толстой кишки (C), мочевого пузыря (Bl), глиома (G), рак молочной железы (Br), меланома (M), рак предстательной железы (Pr), легкого (L) и яичника (O), по оценке в тесте с исключением трипанового синего, проводимом через 18 часов (левый столбик) и 30 часов (правый столбик) после воздействия BO-110. Данные представлены в виде средних величин ±SEM из трех независимых экспериментов, проводимых на указанных линиях.Panel A shows the percentage of cell death in various tumor cell lines: pancreatic cancer (Pa), colon (C), bladder (Bl), glioma (G), breast cancer (Br), melanoma (M), cancer prostate gland (Pr), lung (L), and ovary (O), as evaluated in the test with the exception of trypan blue, performed 18 hours (left column) and 30 hours (right column) after exposure to BO-110. Data are presented as mean values ± SEM from three independent experiments conducted on these lines.
На панели B представлены типичные изображения в светлом поле следующих линий опухолевых клеток: MiaPaCa (поджелудочная железа), BT549 (молочная железа), 639V (мочевой пузырь) и T98G (глиобластома) через 24 часа обработки растворителем или BO-110, как указано. Хотя исходно линия BT549 была устойчива к BO-110, в конечном итоге она погибала в долгосрочных тестах на жизнеспособность (см. панель B). Линии 639V и T98G были очень чувствительны к цитотоксическому эффекту BO-110.Panel B shows typical bright field images of the following tumor cell lines: MiaPaCa (pancreas), BT549 (mammary gland), 639V (bladder) and T98G (glioblastoma) after 24 hours with solvent or BO-110, as indicated. Although the BT549 line was initially resistant to BO-110, it eventually died in long-term viability tests (see panel B).
На панели C приведены тесты на жизнеспособность указанных линий опухолевых клеток через 24 ч обработки растворителем или BO-110. Для краткосрочного теста на жизнеспособность обработанные клетки фиксировали через 24 часа после обработки и окрашивали кристаллическим фиолетовым для визуализации образования клеточных колоний. Для долгосрочного теста на жизнеспособность одну десятую часть клеток, обработанных в течение 24 часов, высевали, фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым через 48 ч.Panel C shows the viability tests of these tumor cell lines after 24 hours of treatment with solvent or BO-110. For a short-term viability test, the treated cells were fixed 24 hours after treatment and stained with crystal violet to visualize the formation of cell colonies. For a long-term viability test, one tenth of the cells treated for 24 hours were seeded, fixed and stained with crystal violet after 48 hours.
Фигура 15. Индуцированная BO-110 гибель клеток зависит от активации MDA-5, Noxa и аутофагии в линиях опухолевых клетокFigure 15. Induced BO-110 cell death depends on activation of MDA-5, Noxa, and autophagy in tumor cell lines.
На данной фигуре представлены иммуноблоты суммарных клеточных экстрактов, выделенных из следующих линий опухолевых клеток: BT549 (молочная железа), 639V (мочевой пузырь) и T98G (глиобластома) через 24 часа обработки растворителем (обозначение «-») или BO-110 (обозначение «+»). Проанализированными белками являлись: MDA-5FL (полноразмерный MDA-5), MDA-5C (продукт расщепления MDA-5), NOXA, каспаза-9 или тубулин (контроль нагрузки). Обратите внимание, что более высокая индукция NOXA и MDA-5FL, а также расщепление каспазы-9 и MDA-5c имеет место в более восприимчивых к BO-110 опухолевых клетках.This figure shows the immunoblots of the total cell extracts isolated from the following tumor cell lines: BT549 (mammary gland), 639V (bladder) and T98G (glioblastoma) after 24 hours with solvent treatment (designation “-”) or BO-110 (designation “ + "). Proteins analyzed were: MDA-5 FL (full-length MDA-5), MDA-5 C (a cleavage product of MDA-5), NOXA, caspase-9, or tubulin (load control). Note that higher induction of NOXA and MDA-5 FL , as well as cleavage of caspase-9 and MDA-5 c, occurs in more susceptible tumor cells to BO-110.
ПримерыExamples
Анализы из примеров, описанных ниже, проводили с использованием следующих материалов и методов:Analyzes from the examples described below were performed using the following materials and methods:
Клетки и клеточные культурыCells and cell cultures
Линии клеток метастатической меланомы человека SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 и SK-Mel-147 и мышиные клетки B16 описаны ранее (Soengas et al., 2001). Эти клетки культивировали в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (Life Technologies, Rockville, MD, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).The human metastatic melanoma cell lines SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 and SK-Mel-147 and murine B16 cells have been described previously (Soengas et al., 2001). These cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Life Technologies, Rockville, MD, USA) supplemented with 10% fetal calf serum (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).
Человеческие меланоциты выделяли из крайней плоти новорожденного, как описано (Fernandez et al., 2005), и культивировали в среде 254 с добавлением факторов роста меланоцитов (HMG-1), содержащей 10 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетат (Cascade Biologies, Portland, OR, USA).Human melanocytes were isolated from the foreskin of a newborn as described (Fernandez et al., 2005) and cultured in 254 medium supplemented with melanocyte growth factors (HMG-1) containing 10 ng / ml phorbol-12-myristate-13-acetate ( Cascade Biologies, Portland, OR, USA).
Человеческие фибробласты выделяли из крайней плоти новорожденного и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.Human fibroblasts were isolated from the foreskin of the newborn and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
Кроме того, клетки других типов опухолей получали из панели 60 линий опухолевых клеток человека, представляющих девять типов опухолевых тканей, используемых в программе скрининга противораковых лекарственных средств Национального института рака (NCI). Для опухоли поджелудочной железы выбранными линиями клеток являлись: IMIMPC2, MiaPaCa, Aspc1, A6L, SKPC-1 и Panc-1; для рака толстой кишки: CACO, SW480 и SW1222; для рака мочевого пузыря: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170; для глиомы и глиобластомы: U87MG, U251 и T98G; для рака молочной железы: MDA-231, MCF7 и T47D; для рака предстательной железы: LNCaP, PC3 и DU145; для рака легкого: H1299 и NCIH460; и для рака яичника: NCI H23 и SK-OV-3.In addition, cells of other types of tumors were obtained from a panel of 60 human tumor cell lines representing nine types of tumor tissue used in the National Cancer Institute (NCI) anticancer drug screening program. For a pancreatic tumor, the selected cell lines were: IMIMPC2, MiaPaCa, Aspc1, A6L, SKPC-1 and Panc-1; for colon cancer: CACO, SW480 and SW1222; for bladder cancer: RT112, MGHU4, 639V, 253J, MGHu3 and SW1170; for gliomas and glioblastomas: U87MG, U251 and T98G; for breast cancer: MDA-231, MCF7 and T47D; for prostate cancer: LNCaP, PC3 and DU145; for lung cancer: H1299 and NCIH460; and for ovarian cancer: NCI H23 and SK-OV-3.
Все клетки культивировали в модифицированной способом Дульбекко среде Игла (Life Technologies, Rockville, MD, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).All cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Life Technologies, Rockville, MD, USA) supplemented with 10% fetal calf serum (Nova-Tech Inc., Grand Island, NY, USA).
Получение pIC в комплексе с PEI (BO-110)Obtaining pIC in complex with PEI (BO-110)
Синтетический аналог дсРНК, pIC, приобретали у InvivoGen (San Diego, CA). Реактивы jetPEI™, jetPEI-Fluor™ и invivo-jetPEI™ приобретали у Polyplus-transfection (Ikirch, Francia). Данные продукты, содержащие линейное производное полиэтиленимина, использовали для образования комплекса с pIC с соотношением N/P (остатки азота JetPEI на фосфат РНК), составляющим 1 к 5 in vitro и in vivo, в соответствии с протоколом производителя.A synthetic dsRNA analog, pIC, was purchased from InvivoGen (San Diego, CA). The reagents jetPEI ™, jetPEI-Fluor ™ and invivo-jetPEI ™ were purchased from Polyplus-transfection (Ikirch, Francia). These products containing a linear derivative of polyethyleneimine were used to complex with a pIC with an N / P ratio (JetPEI nitrogen residues per RNA phosphate) of 1 to 5 in vitro and in vivo , according to the manufacturer's protocol.
Если не указано иное, использованные концентрации pIC составляли 1 мкг/мл в культивированных клетках и 1-2 нг/кг массы тела у мышей.Unless otherwise indicated, pIC concentrations used were 1 μg / ml in cultured cells and 1-2 ng / kg body weight in mice.
Обработки лекарственным средством и анализы клеточной гибелиDrug treatments and cell death analyzes
Бортезомиб (Velcade, прежде PS-341) получали от Millenium Pharmaceuticals Inc. (Cambridge, MA); адриамицин (доксорубицин) от Sigma Chemical (St. Louis, MO) и этопозид от Bristol-Myers Squibb (New York, NY). Антиоксидант тирон и витамин E приобретали у Sigma (St. Louis, MO), а панкаспазный ингибитор ZVAD приобретали у R&D System (Minneapolis, MN). 3-метиладенин (3-MA) получали от Sigma Chemical (St. Louis, MO). Хлорохин получали от Sigma Chemical (St Louis, MO, USA).Bortezomib (Velcade, formerly PS-341) was obtained from Millenium Pharmaceuticals Inc. (Cambridge, MA); adriamycin (doxorubicin) from Sigma Chemical (St. Louis, MO); and etoposide from Bristol-Myers Squibb (New York, NY). The antioxidant tyrone and vitamin E were purchased from Sigma (St. Louis, MO), and the pan-caspase ZVAD inhibitor was purchased from the R&D System (Minneapolis, MN). 3-methyladenine (3-MA) was obtained from Sigma Chemical (St. Louis, MO). Chloroquine was obtained from Sigma Chemical (St Louis, MO, USA).
Анализы жизнеспособности клеток в ответ на обработку лекарственным средством проводили после высевания меланоцитов и клеток меланомы, по меньшей мере, за 12 часов до обработки лекарственным средством. Процент гибели клеток в указанные моменты времени и концентрации, используемые для обработки, оценивали стандартными тестами на исключение трипанового синего, как описано ранее (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2005).Cell viability assays in response to drug treatment were performed after plating melanocytes and melanoma cells at least 12 hours before drug treatment. The percentage of cell death at the indicated time points and concentrations used for treatment were evaluated by standard trypan blue exclusion tests as previously described (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2005).
Анализы пролиферации клеток в ответ на обработку лекарственным средством проводили после высевания опухолевых клеток, по меньшей мере, за 12 часов до обработки лекарственным средством. Рост клеток в указанные моменты времени и концентрации, используемые для обработки, оценивали в тесте на окрашивание кристаллическим фиолетовым.Cell proliferation assays in response to drug treatment were performed after tumor cells were seeded at least 12 hours before drug treatment. Cell growth at the indicated times and concentrations used for processing were evaluated in a crystal violet stain test.
Иммуноблоттинг белковProtein immunoblotting
Для определения изменений в уровне белков, 2×106 клеток обрабатывали, как указано, и собирали в разное время после обработки. Суммарные клеточные лизаты подвергали электрофорезу в 10, 12 или градиентном 4-15% гелях с SDS в восстанавливающих условиях, а затем переносили на мембраны Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, USA).To determine changes in protein levels, 2 × 10 6 cells were treated as indicated and harvested at different times after treatment. Total cell lysates were subjected to electrophoresis in 10, 12 or 4-15% gradient gels with SDS under reducing conditions, and then transferred to Immobilon-P membranes (Millipore, Bedford, MA, USA).
Белковые полосы обнаруживали с помощью системы ECL (GE Healthcare, Buckighamshire, UK).Protein bands were detected using the ECL system (GE Healthcare, Buckighamshire, UK).
Первичные антитела включали антитела к: casp-9 и -3 от Novus Biological (Littleton, CO, USA); casp-8 (Ab-3) от Oncogene Research Products (San Diego, CA, USA); casp-7 от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); Bcl-xL от BD Transduction Laboratories (Franklin Lakes, NJ, USA); Blc-2 от Dako Diagnostics (Glostrup, Denmark); NOXA от Calbiochem (San Diego, CA, USA); MDAp53 от Novocastra Laboratories (Newcastle, UK); и к тубулину (клон AC-74) от Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). Антитело к MDA-5 описано ранее.Primary antibodies included antibodies to: casp-9 and -3 from Novus Biological (Littleton, CO, USA); casp-8 (Ab-3) from Oncogene Research Products (San Diego, CA, USA); casp-7 from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); Bcl-xL from BD Transduction Laboratories (Franklin Lakes, NJ, USA); Blc-2 from Dako Diagnostics (Glostrup, Denmark); NOXA from Calbiochem (San Diego, CA, USA); MDAp53 from Novocastra Laboratories (Newcastle, UK); and tubulin (clone AC-74) from Sigma Chemical (St Louis, MO, USA). Antibody to MDA-5 described previously.
Вторичные антитела представляли собой антитела против иммуноглобулинов либо мыши, либо кролика, от GE Healthcare. Image J использовали для количественного определения изменений в уровнях белков, вызванных различными способами обработки, рассматривая необработанные контроли в качестве эталона базовой экспрессии.The secondary antibodies were anti-mouse or rabbit immunoglobulin antibodies from GE Healthcare. Image J was used to quantify changes in protein levels caused by various processing methods, treating untreated controls as a baseline expression standard.
РНК-интерференцияRNA interference
О кшРНК лентивирусном векторе, использованном для понижающей регуляции NOXA, сообщалось ранее (Fernandez et al., 2005). Лентивирусный вектор plko, использованный для понижающей регуляции MDA-5 (целевая последовательность, SEQ ID №: 1), приобретали у OpenBiosystems (Huntsville, AL). Были также разработаны рандомизированные олигонуклеотиды для создания контрольной кшРНК. Вирусы получали из клеток 293FT, как описано, и использовали в условиях, обеспечивающих >80% эффективности инфекции (Denoyelle et al., 2006). Понижающую регуляцию MDA-5 подтверждали иммуноблоттингом и ОТ-ПЦР (прямой праймер с SEQ ID №: 2 и обратный праймер с SEQ ID №: 3). Если это указано, обработку с использованием pIC или BO-110 начинали через 3 дня после инфицирования соответствующими экспрессирующими кшРНК вирусами.The ksRNA lentiviral vector used to downregulate NOXA has been reported previously (Fernandez et al., 2005). The lentiviral vector plko used to downregulate MDA-5 (target sequence, SEQ ID NO: 1) was purchased from OpenBiosystems (Huntsville, AL). Randomized oligonucleotides have also been developed to create control kshRNA. Viruses were obtained from 293FT cells as described and used under conditions providing> 80% infection rate (Denoyelle et al., 2006). The downregulation of MDA-5 was confirmed by immunoblotting and RT-PCR (forward primer with SEQ ID No: 2 and reverse primer with SEQ ID No: 3). If indicated, treatment using pIC or BO-110 was started 3 days after infection with the corresponding cshRNA expressing viruses.
Микрочипы для определения профиля экспрессииMicrochips for determining the expression profile
Суммарную РНК выделяли в, по меньшей мере, двух независимых экспериментах и очищали при помощи набора RNeasy (Quiagen). Образцы, обработанные BO-110, метили 2,5 мг Cy5-UTP и использовали в качестве эталона в реакциях гибридизации с 2,5 г РНК, меченой Cy3-dUTP, получающейся в результате инкубации с PIC или PEI. Меченую РНК гибридизовали с двухцветными олигонуклеотидами из микрочипа полного человеческого генома (4×44K) от Agilent (Santa Clara, CA, USA), следуя инструкциям производителя. После промывания слайды сканировали при помощи Scanarray 105000 XL (GSI Lumonics Kanata, Ontario, Canada) и изображения анализировали, используя программу GenePix 4.0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA), как описано ранее (Alonso et al., 2007). При измерениях интенсивности флуоресценции автоматически вычитали фоновые значения. Отношения Cy3:Cy5 нормировали к величине срединного соотношения всех точек. После нормирования точки со значениями интенсивности для обоих каналов (сумма средних), более низкими, чем местный фон, отбрасывали. Отношения остальных точек подвергали логарифмическому преобразованию (основание 2), и массивы повторяющихся точек корректировали к среднему. Группировку не существенных пар (UPGMA: группа несущественных пар) генов, экспрессированных по-разному в контрольных и тестируемых образцах, проводили при помощи набора для анализа паттерна экспрессии генов (Gene Expression Pattern Analysis Suite) (GEPAS).Total RNA was isolated in at least two independent experiments and purified using the RNeasy kit (Quiagen). Samples treated with BO-110 were labeled with 2.5 mg of Cy5-UTP and used as a reference in hybridization reactions with 2.5 g of RNA labeled with Cy3-dUTP resulting from incubation with PIC or PEI. Labeled RNA was hybridized with two-color oligonucleotides from a microchip of the complete human genome (4 × 44K) from Agilent (Santa Clara, CA, USA), following the manufacturer's instructions. After washing, the slides were scanned using Scanarray 105000 XL (GSI Lumonics Kanata, Ontario, Canada) and images were analyzed using GenePix 4.0 software (Axon Instruments Inc., Union City, CA) as previously described (Alonso et al., 2007). When measuring the fluorescence intensity, the background values were automatically subtracted. The Cy3: Cy5 ratios were normalized to the value of the median ratio of all points. After normalization, points with intensity values for both channels (the sum of the averages) lower than the local background were discarded. The relations of the remaining points were subjected to a logarithmic transformation (base 2), and the arrays of repeating points were adjusted to the average. Grouping of non-essential pairs (UPGMA: a group of non-essential pairs) of genes expressed differently in control and test samples was performed using the Gene Expression Pattern Analysis Suite (GEPAS).
Реакция на лечение in vivo In vivo treatment response
Самок мышей C57BL/6 приобретали у NIH (Bethesda, MA). Самок мышей SCID Beige с нарушенной функцией NK, T и B-лимфоцитов приобретали у Charles Rivers (Wilmington, MA). Все животные в начале экспериментов были в возрасте 6-12 недель. Уход за животными осуществляли в соответствии с утвержденными методами университета Мичиганского ракового центра.Female C57BL / 6 mice were purchased from NIH (Bethesda, MA). Female SCID Beige mice with impaired NK, T, and B lymphocyte function were purchased from Charles Rivers (Wilmington, MA). All animals at the beginning of the experiments were 6-12 weeks old. Animal care was carried out in accordance with the approved methods of the University of Michigan Cancer Center.
Приживление трансплантатов в коже проводили путем внутрикожной инъекции 105 клеток меланомы B16. 2 нг/кг массы тела pIC самостоятельно или в комплексе с invivoJetPEI вводили перитуморальными инъекциями в дни 7, 11, 15 и 21 после имплантации опухоли. Дополнительные группы лечения включали введение JetPEI в качестве отдельного вещества и плацебо контроли. Объем опухоли оценивали по результатам измерений штангенциркулем и рассчитывали как V=L×W 2 /2, где L и W соответствуют длине и ширине опухоли, соответственно.Skin grafts were implanted by intradermal injection of 10 5 melanoma B16 cells. 2 ng / kg pIC body weight alone or in combination with invivoJetPEI was administered by peritumoral injection on
Суррогатные модели метастазов в легких получали путем в/в инъекции клеток меланомы 4×105 B16-eGFP или 5×105 SK-Mel-103-eGFP. Лечение проводили в дни 3, 6 и 9 путем в/в инъекции 1 нг/кг массы тела pIC отдельно или в комплексе с invivoJetPEI. Легкие извлекали через 14 дней после заражения, и внешние метастазы подсчитывали вручную и классифицировали по количеству и размеру. Альтернативно, использовали систему флуоресцентного света Illumatool TLS LT-9500 (Lightools Research, Encinitas, CA, USA) и флуоресценцию, исходящую от опухолевых клеток, снимали на камеру Hamamatsu Orca 100 CCD. Метастатическое поражение контролировали независимо путем анализа окрашенных гематоксилином-эозином парафиновых срезов. Эксперименты проводили на группах из пяти мышей и повторяли от двух до четырех раз. Мышей подвергали эвтаназии, когда животные в контрольных группах проявляли признаки дискомфорта и проблем с дыханием.Surrogate models of lung metastases were obtained by iv injection of 4 × 10 5 B16-eGFP or 5 × 10 5 SK-Mel-103-eGFP melanoma cells. Treatment was carried out on
Аутохтонные меланомы получали путем скрещивания мышей Tyr:: N-RasQ61K с нокаутными мышами Ink4a/Arf на генетической основе C57BL/6 (Ackermann et al., 2005). Для индукции меланомы в коже мышам на кожу наносили один раз в возрасте 8-10 недель 220 мг 7,12-диметилбенз[а]антрацена (ДМБА). После развития ранних меланоцитарных новообразований (очагов, имеющих, по меньшей мере, 1 мм в диаметре), мышам вводили дважды в неделю внутрибрюшинными инъекциями 1 нг/кг массы тела pIC в виде отдельного вещества или в комплексе с invivoJetPEI. Меланому и родинки (невусы) подсчитывали, и ее размеры измеряли в двух диаметрах с помощью штангенциркуля, выражая средний объем опухоли в мм3.Autochthonous melanomas were obtained by crossing Tyr :: N-RasQ61K mice with C57BL / 6 genetic knockout mice Ink4a / Arf (Ackermann et al., 2005). To induce melanoma in the skin, 220 mg of 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) was applied to mice once per day at the age of 8-10 weeks. After the development of early melanocytic neoplasms (foci having at least 1 mm in diameter), mice were injected twice weekly with intraperitoneal injections of 1 ng / kg pIC body weight as a separate substance or in combination with invivoJetPEI. Melanoma and moles (nevi) were counted, and its dimensions were measured in two diameters using a caliper, expressing the average tumor volume in mm 3 .
Размер опухолей также оценивали с помощью PET-CT (Позитронно-эмиссионной томографии - компьютерной томографии). Обследование и получение изображений PET-CT проводили, используя систему PET-CT для мелких животных View Explore General Electrics (Fairfield, CT, USA). 15 мБк 18F-FDG (2-фтор-2-дезокси-D-глюкозы) вводили инъекцией для визуализации и получения изображений PET и реконструировали с помощью алгоритма 3DOSEM. Изображения CT получали в 16 кадрах с энергией 35 кэВ и 200 мкА, и изображения реконструировали при помощи алгоритма FDK. Меланомы, метастазы и другие органы проверяли независимо, анализируя парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином-эозином.Tumor size was also evaluated using PET-CT (Positron Emission Tomography - Computed Tomography). Inspection and acquisition of PET-CT images was performed using the PET-CT system for small animals View Explore General Electrics (Fairfield, CT, USA). 15 mBq of 18F-FDG (2-fluoro-2-deoxy-D-glucose) was injected to visualize and obtain PET images and reconstructed using the 3DOSEM algorithm. CT images were acquired in 16 frames with energies of 35 keV and 200 μA, and images were reconstructed using the FDK algorithm. Melanomas, metastases, and other organs were independently checked by analyzing paraffin sections stained with hematoxylin-eosin.
Трансмиссионная электронная микроскопияTransmission Electron Microscopy
Для трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) указанные клеточные популяции промывали 0,1 М буфером Соренсена, pH 7,5 и фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде в течение 1,5 ч, а затем обезвоживали и помещали в смолу Спурра. Затем блок нарезали на 60-100 нм ультратонкие срезы и монтировали на медные сетки. Для рутинного анализа ультратонкие срезы окрашивали 2% уранилацетатом и цитратом свинца. Электронные микрофотографии получали на трансмиссионном электронном микроскопе Philips CM-100 (FEI, Hillsbrough, OR) с помощью цифровой камеры Kodak 1.6 Megaplus.For transmission electron microscopy (TEM), these cell populations were washed with 0.1 M Sorensen buffer, pH 7.5, and fixed in 2.5% glutaraldehyde for 1.5 hours, then dehydrated and placed in Spurra resin. Then the block was cut into 60-100 nm ultrathin sections and mounted on copper grids. For routine analysis, ultra-thin sections were stained with 2% uranyl acetate and lead citrate. Electron micrographs were obtained on a Philips CM-100 transmission electron microscope (FEI, Hillsbrough, OR) using a Kodak 1.6 Megaplus digital camera.
Конфокальная и флуоресцентная микроскопия: количественная оценка точечных пятен GFP-LC3Confocal and fluorescence microscopy: quantification of spot spots GFP-LC3
Слитый продукт eGFP-LC3, клонированный в pCNA экспрессионный вектор, был предоставлен Gabriel Nunez (University of Michigan Cancer Center). eGFP-LC3 и фрагменты eGFP-Rab7wt, eGFP-Rab7T22N, eGFP-Rab5wt, eGFP-Cherry-LC3 и Cherry-LC3 клонировали в лентивирусный вектор pLVO-puro для стабильного переноса генов. Клетки, происходящие из меланомы (то есть, SK-Mel-103), инфицировали pLVO-eGFP-LC3 и отбирали с помощью пуромицина. Связанную с GFP-LC3 эмиссию флуоресценции визуализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica AF6000 и изображения анализировали, используя LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany). Для конфокальной микроскопии в реальном времени авторы изобретения использовали ультра-спектральный микроскоп Leica TCS-SP2-AOBS-UV, совмещенный с инкубационной камерой с контролируемым содержанием CO2 и температурой. Изображения анализировали при помощи LCS (Leica, Solms, Germany). Для экспериментов по совместной локализации Lysotracker™ красный или синий (Invitrogen, Carlsbrad, CA) в концентрации 50 нМ или 200 нМ и краситель хехст 33342 (Invitrogen, Carlsbrad, CA) добавляли за 10 минут до визуализации в концентрации 5 мкг/мл. Изображения совместной локализации анализировали при помощи LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany).An eGFP-LC3 fusion product cloned into a pCNA expression vector was provided by Gabriel Nunez (University of Michigan Cancer Center). eGFP-LC3 and fragments of eGFP-Rab7wt, eGFP-Rab7T22N, eGFP-Rab5wt, eGFP-Cherry-LC3 and Cherry-LC3 were cloned into the pLVO-puro lentiviral vector for stable gene transfer. Cells originating from melanoma (i.e., SK-Mel-103) were infected with pLVO-eGFP-LC3 and selected with puromycin. GFP-LC3-associated fluorescence emission was visualized using a Leica AF6000 fluorescence microscope and images were analyzed using LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany). For real-time confocal microscopy, the inventors used a Leica TCS-SP2-AOBS-UV ultra-spectral microscope, combined with an incubation chamber with a controlled CO 2 content and temperature. Images were analyzed using LCS (Leica, Solms, Germany). For Lysotracker ™ co-localization experiments, red or blue (Invitrogen, Carlsbrad, CA) at a concentration of 50 nM or 200 nM and Hoechst 33342 dye (Invitrogen, Carlsbrad, CA) were added 10 minutes before imaging at a concentration of 5 μg / ml. Co-localization images were analyzed using LAS AF V1.9 (Leica, Solms, Germany).
Экспрессия цитокиновCytokine expression
Человеческий интерферон альфа измеряли в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа (ELISA). Набор для ELISA человеческого IFN-α и рекомбинантный hIFN-α приобретали у PBL Interferon Source (Piscataway, NY) и использовали в соответствии с протоколом производителя. Уровень экспрессии IFN-α измеряли для макрофагов из костного мозга (BMDM) и клеток меланомы B16 методом ПЦР в реальном времени. Клетки BMDM получали, высевали и обрабатывали, как описано ранее (Celada et al., 1984). Количественный ПЦР-анализ в реальном времени транскриптов РНК IFIT-1 проводили, используя праймер TaqMan и зонды, полученные от Applied Biosystems, на детекторе последовательности Applied Biosystems 7700 после нормирования по β-актину.Human interferon alpha was measured in culture supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The human IFN-α ELISA kit and recombinant hIFN-α were purchased from PBL Interferon Source (Piscataway, NY) and used in accordance with the manufacturer's protocol. The expression level of IFN-α was measured for macrophages from bone marrow (BMDM) and melanoma B16 cells by real-time PCR. BMDM cells were obtained, seeded and processed as previously described (Celada et al., 1984). Real-time quantitative PCR analysis of IFIT-1 RNA transcripts was performed using TaqMan primer and probes obtained from Applied Biosystems on an Applied Biosystems 7700 sequence detector after normalization with β-actin.
Статистический анализStatistical analysis
Данные по жизнеспособности выражали в виде средних величин ±SEM, и статистический анализ различий проводили при помощи двустороннего критерия Стьюдента. Величину P<0,05 считали значимой. Для статистической оценки роста опухоли и метастазов in vivo, обобщенный критерий Манна-Уитни-Уилкоксона использовали при сравнении значений непрерывных переменных между двумя группами. Величины P<0,05 считали значимыми.Viability data were expressed as mean values ± SEM, and statistical analysis of differences was performed using the two-tailed student criterion. A value of P <0.05 was considered significant. For a statistical assessment of tumor growth and in vivo metastases, the generalized Mann-Whitney-Wilcoxon test was used when comparing the values of continuous variables between two groups. Values of P <0.05 were considered significant.
Пример 1. Идентификация индукторов аутофагии в клетках меланомы с помощью дискриминационного анализа, основанного на флуоресценции LC3. Подтверждение аутофагической гибели клеток, индуцированной BO-110, методом ультраструктурного анализаExample 1. Identification of autophagy inducers in melanoma cells using discriminatory analysis based on LC3 fluorescence. Verification of autophagic cell death induced by BO-110 by ultrastructural analysis
Как обсуждалось ранее, отличительной чертой аутофагии (как для индукции клеточной гибели, так и для выживания) является перемещение гена 8 белка аутофагии (ATG8)/LC3 из цитозоля в новообразованные аутофагосомы. Основываясь на этом наблюдении, изменения в клеточном распределении слитого белка GFP-LC3 (то есть, от диффузной картины к очаговому окрашиванию) используют в качестве маркера для ранних стадий аутофагии. Наличие аутофагосом также может быть подтверждено с помощью электронной микроскопии или световой микроскопии.As discussed previously, a hallmark of autophagy (both for the induction of cell death and for survival) is the movement of
1.1. Флуоресцентный анализ, основанный на LC31.1. LC3 Based Fluorescence Analysis
Чтобы изучить роль аутофагии в ответной реакции меланомы на лекарственные средства, дискриминационный анализ, основанный на GFP-LC3, использовали для проведения скрининга коммерчески доступных химиотерапевтических препаратов и иммуномодуляторов. Клетки меланомы стабильно трансфицировали лентивирусными векторами, экспрессирующими производные аутофагосомального маркера LC3 с GFP, такие как pLVO-eGFP-LC3.To study the role of autophagy in drug response of melanoma, a GFP-LC3 based discriminatory assay was used to screen for commercially available chemotherapeutic agents and immunomodulators. Melanoma cells were stably transfected with lentiviral vectors expressing derivatives of the autophagosomal marker LC3 with GFP, such as pLVO-eGFP-LC3.
Человеческую линию клеток SK-Mel-103 выбрали в качестве модельной системы для первичного скрининга на основании ее высокометастатического и химиорезистентного фенотипа (Soengas et al., 2001). Последующие валидационные исследования проводили на панели человеческих клеточных линий различного генетического фона (см. ниже).The human SK-Mel-103 cell line was chosen as a model system for primary screening based on its highly metastatic and chemoresistant phenotype (Soengas et al., 2001). Subsequent validation studies were performed on a panel of human cell lines of various genetic backgrounds (see below).
Было установлено, что различные противораковые лекарственные средства индуцируют очаговую эмиссию флуоресценции GFP-LC3 без существенного влияния на жизнеспособность клеток. Однако было обнаружено, что среди индукторов клеточной гибели комплекс PEI и миметика дсРНК полиинозин-полицитидиловой кислоты (BO-110) является особенно эффективным для образования очагов GFP-LC3. Примерно в 50% клеток наблюдали заметное точечное окрашивание GFP-LC3 в течение 4-6 ч инкубации при низких дозах (0,5-1 мкг/мл) BO-110 (см. репрезентативные микрофотографии и количественные данные на фигуре 1A и фигуре 1B). Действительно, кинетический анализ свидетельствовал о более быстром образовании очагов GFP-LC3 при использовании BO-110, чем при использовании рапамицина (фигура 1B), классическом положительном контроле индукции аутофагии (Klionsky et al., 2008).It has been found that various anti-cancer drugs induce focal GFP-LC3 fluorescence emission without a significant effect on cell viability. However, it was found that, among cell death inducers, the complex of PEI and the polyinosine-polycytidylic acid dsRNA mimetic (BO-110) is particularly effective for the formation of GFP-LC3 foci. In approximately 50% of the cells, a noticeable spot staining of GFP-LC3 was observed during 4-6 hours of incubation at low doses (0.5-1 μg / ml) of BO-110 (see representative micrographs and quantitative data in Figure 1A and Figure 1B ) . Indeed, kinetic analysis indicated faster formation of GFP-LC3 foci when using BO-110 than using rapamycin ( Figure 1B ), the classic positive control of autophagy induction (Klionsky et al., 2008).
Интересно, что в более поздние моменты времени обработка BO-110 была способна вызывать гибель клеток, даже в линиях клеток меланомы, которые по своей природе устойчивы к стандартным повреждающим ДНК агентам, таким как доксорубицин или этопозид, как в случае с SK-Mel-103.Interestingly, at later times, BO-110 treatment was able to cause cell death, even in melanoma cell lines, which are inherently resistant to standard DNA damaging agents such as doxorubicin or etoposide, as is the case with SK-Mel-103 .
Анализ эндогенного LC3 показал изменения в электрофоретической подвижности (фигура 1C), соответствующие характерному липидированию этого белка в процессе образования аутофагосом, и необходимость ATG5 для генерации образования очагов GFL-LC3.Analysis of endogenous LC3 showed changes in electrophoretic mobility ( Figure 1C ), corresponding to the characteristic lipidation of this protein during the formation of autophagosomes, and the need for ATG5 to generate focal formation of GFL-LC3.
Авторам изобретения не известно ни о каких предыдущих сообщениях, которые связывали бы pIC с аутофагией в раковых клетках. Вследствие этого, следующие тесты были сфокусированы на данном соединении, поскольку оно может выявить новые элементы, позволяющие лучше понять потенциальные внутриклеточные сенсоры дсРНК для индукции аутофагии и гибели опухолевых клеток.The inventors are not aware of any previous reports that would associate pIC with autophagy in cancer cells. As a result, the following tests have focused on this compound, as it may reveal new elements that better understand potential intracellular dsRNA sensors for inducing autophagy and death of tumor cells.
1.2. Ультраструктурный анализ эффекта BO-110 на клетки1.2. Ultrastructural analysis of the effect of BO-110 on cells
Очаговое окрашивание GFP-LC3 в клетках, обработанных BO-110, описанное в предыдущем параграфе, согласуется с образованием аутофагосом. Тем не менее, чтобы исключить возможные неспецифические агрегаты эктопически экспрессированного GFP-LC3 (Klionsky et al., 2008), ответную реакцию независимо анализировали с помощью электронной микроскопии (фигура 1D).Focal staining of GFP-LC3 in cells treated with BO-110, described in the previous paragraph, is consistent with the formation of autophagosomes. However, in order to rule out possible nonspecific aggregates of ectopically expressed GFP-LC3 (Klionsky et al., 2008), the response was independently analyzed by electron microscopy ( Figure 1D ).
Ранние ответные реакции (5 ч) на BO-110 включали заметное накопление связанных с мембраной электронно-плотных структур, изолирующих продукты распада клеток (фигура 1D), отличительную особенность аутофагосом. Размеры и количество этих структур можно было видеть как внутриклеточные гранулы даже под оптическим микроскопом (фигура 1E).Early responses (5 h) to BO-110 included a marked accumulation of membrane-bound electron-dense structures that isolate cell breakdown products ( Figure 1D ), a distinctive feature of autophagosomes. The size and number of these structures could be seen as intracellular granules even under an optical microscope ( Figure 1E ).
В более поздние моменты времени обработка BO-110 вызывала клеточную гибель (фигура 1F, средняя панель), что, как обнаружено при помощи электронной микроскопии, было связано с образованием крупных фагоцитарных вакуолей диаметром более чем 500 нм (фигура 1F, правая панель).At later times, BO-110 treatment caused cell death ( Figure 1F , middle panel), which, as detected by electron microscopy, was associated with the formation of large phagocytic vacuoles with a diameter of more than 500 nm ( Figure 1F, right panel).
На фигуре 2 посредством избранных фотографий флуоресценции, полученных в различные моменты времени, представлены обобщенные результаты развития во времени индукции аутофагии, о чем можно судить по микрофотографиям перераспределения EGFP с течением времени: от диффузного окрашивания до очаговых агрегатов, указывающих на образование аутофагосом, процесс, который завершается полным разрушением клеток. В контрольных клетках наблюдали диффузное окрашивание на протяжении всего периода тестирования, являющееся признаком базальных уровней аккумуляции LC3.Figure 2, using selected fluorescence photographs taken at various points in time, presents the generalized results of the development of autophagy induction over time, as can be seen from the micrographs of the redistribution of EGFP over time: from diffuse staining to focal aggregates indicating the formation of autophagosomes, a process that culminates in the complete destruction of cells. Diffuse staining was observed in control cells throughout the entire testing period, which is a sign of basal levels of LC3 accumulation.
Интересно, что целостность плазматической и ядерной мембран сохранялась, и клетки, обработанные BO-110, демонстрировали конденсацию хроматина, характерную для программ апоптоза. Индукция аутофагии была зависимой от BO-110, поскольку PEI (контроль) оказывал минимальное влияние на количество или размер аутофагосом (фигура 1D-F). В совокупности эти данные подтверждают цитотоксический эффект BO-110, предполагающий образование аутофагосом, за которым следует гибель клеток с характерными для апоптоза особенностями.Interestingly, the integrity of the plasma and nuclear membranes was maintained, and cells treated with BO-110 showed chromatin condensation characteristic of apoptosis programs. Autophagy induction was BO-110 dependent, since PEI (control) had minimal effect on the number or size of autophagosomes ( Figure 1D-F ). Together, these data confirm the cytotoxic effect of BO-110, suggesting the formation of autophagosomes, followed by cell death with characteristics characteristic of apoptosis.
Пример 2. Анализ чувствительности различных человеческих и мышиных линий клеток меланомы с использованием pIC, конъюгированной с катионными молекулами, и избирательность в отношении меланоцитовExample 2. Sensitivity analysis of various human and mouse melanoma cell lines using pIC conjugated to cationic molecules and selectivity for melanocytes
Для определения того, является ли про-аутофагическая активность BO-110, обнаруженная в первоначальном исследовании, проводимом с клетками SK-Mel-103, отражением более широкой противомеланомной активности, тестировали дополнительный набор клеточных линий.An additional set of cell lines was tested to determine whether the pro-autophagic activity of BO-110, detected in an initial study conducted with SK-Mel-103 cells, was a reflection of broader anti-melanoma activity.
Клетки меланомы выбирали по принципу корреляции с частыми связанными с меланомой событиями, такими как мутации в BRAF или NRAS, делеция локусов INK4a/ARF или PTEN или повышенная регуляция различных антиапоптотических членов семейства Bcl-2, которые, как известно, вносят вклад в прогрессирование и химиорезистентность меланомы.Melanoma cells were selected based on the principle of correlation with frequent events associated with melanoma, such as mutations in BRAF or NRAS , deletion of INK4a / ARF or PTEN loci, or increased regulation of various antiapoptotic members of the Bcl-2 family, which are known to contribute to progression and chemoresistance melanomas.
При меланоме мутации P53 являются редкими (Soengas and Lowe, 2003). Однако, поскольку p53 может играть ключевую роль в активации программ апоптоза и аутофагии, авторы изобретения также проводили тесты на клеточной линии SK-Mel-28, которая экспрессирует мутантный p53, чтобы определить, является ли этот опухолевый супрессор крайне необходимым для противомеланомной активности BO-110. Кроме того, клетки линии B16 мышиной метастатической меланомы также были включены в анализ в качестве примера модели, широко используемой в иммунотерапии меланомы (Wenzel et al., 2008), для оценки различий в ответной реакции на лечение, предположительно связанной с различиями между видами. Параллельно с этим авторы изобретения также проанализировали меланоциты, выделенные из крайней плоти человека.In melanoma, P53 mutations are rare (Soengas and Lowe, 2003). However, since p53 can play a key role in activating apoptosis and autophagy programs, the inventors also tested on the SK-Mel-28 cell line, which expresses mutant p53, to determine whether this tumor suppressor is essential for the anti-melanoma activity of BO-110 . In addition, murine metastatic melanoma B16 cell lines were also included in the analysis as an example of a model widely used in melanoma immunotherapy (Wenzel et al., 2008) to evaluate differences in treatment response, presumably related to differences between species. In parallel with this, the inventors also analyzed melanocytes isolated from the human foreskin.
В таблице 1 приведен генетический фон линий клеток человеческой метастатической меланомы:Table 1 shows the genetic background of cell lines of human metastatic melanoma:
Мутационный статус p53 определяли прямым секвенированием экзонов 2-10 методом ОТ-ПЦР.The mutation status of p53 was determined by direct sequencing of exons 2-10 by RT-PCR.
Образцы с полиморфизмом P72R обозначены как R. Индуцируемость p53 определяли иммуноблоттингом экстрактов, обработанных доксорубицином (0,5 мг/мл, 12 ч). Линии с высокими эндогенными уровнями p53 отмечены звездочкой. Уровни PTEN, Apaf-1, Casp-8, Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1 определяли иммуноблоттингом и нормировали к контрольным меланоцитам. Мутационный статус BRAF и NRAS определяли прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных геномных фрагментов экзонов 15 и 3, соответственно. Ответные реакции на доксорубицин (DOX; 0,5 мкг/мл, 30 ч) относили к категориям ++, +, -/+, -, соответствующим процентам клеточной гибели, равным 100-70, 70-50, 50-30 и <30%, соответственно. Ответные реакции на BO-110 (1 мкг/мл, 30 ч) относили к категориям +++, ++, +, соответствующим процентам клеточной гибели, равным 100-90, 90-60 и 60-40%, соответственно. Линии с высокими эндогенными уровнями p53 отмечены звездочкой.Samples with P72R polymorphism are designated as R. P53 inducibility was determined by immunoblotting of extracts treated with doxorubicin (0.5 mg / ml, 12 h). Lines with high endogenous p53 levels are marked with an asterisk. The levels of PTEN, Apaf-1, Casp-8, Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1 were determined by immunoblotting and normalized to control melanocytes. The mutational status of BRAF and NRAS was determined by direct sequencing of PCR amplified genomic fragments of
С данными клеточными линиями проводили тесты, аналогичные тем, которые описаны в примере 1 для линии клеток SK-Mel-103, чтобы проверить чувствительность каждой из этих линий клеток к pIC и PEI в виде отдельных веществ, либо используемым в сочетании. Результаты приведены на фигуре 3.With these cell lines, tests similar to those described in Example 1 for the SK-Mel-103 cell line were performed to test the sensitivity of each of these cell lines to pIC and PEI as separate substances, or used in combination. The results are shown in figure 3 .
Пять протестированных линий клеток меланомы (SK-Mel-19, -28, -103, -147 и B16) были уничтожены со сходной кинетикой и эффективностью после обработки BO-110 (фигура 3A). Важно отметить, что во всех тестируемых линиях клеток меланомы ранняя активация аутофагии с помощью BO-110 неизбежно сопровождалась гибелью клеток.Five tested melanoma cell lines (SK-Mel-19, -28, -103, -147 and B16) were destroyed with similar kinetics and efficacy after treatment with BO-110 ( Figure 3A ). It is important to note that in all tested melanoma cell lines, early autophagy activation with BO-110 was inevitably accompanied by cell death.
Электронная микроскопия четко показала аутофагосомы также и в случае линии с мутантным p53, SK-Mel-28 (фигура 3B). Как показано на фигуре 3A и кривых доза-эффект, приведенных на фигуре 4B (которые представляют репрезентативные данные для линий, соответствующие четырем независимым изолятам), важно отметить, что в условиях, которые приводили к гибели 70% клеток меланомы SK-Mel-103 через 24 часа после обработки, нормальные меланоциты оставались жизнеспособными и не демонстрировали признаков аутофагии.Electron microscopy clearly showed autophagosomes also in the case of the line with the mutant p53, SK-Mel-28 ( Figure 3B ). As shown in FIG. 3A and the dose response curves shown in FIG. 4B (which represent representative data for lines corresponding to four independent isolates), it is important to note that under conditions that led to the death of 70% of SK-Mel-103 melanoma cells through 24 hours after treatment, normal melanocytes remained viable and showed no signs of autophagy.
Более того, как показано на фигуре 4A, не наблюдали никаких значительных изменений в морфологии, грануляции или цитозольном распределении GFP-LC3 в меланоцитах в пределах широкого диапазона концентраций BO-110. Фигура 4C также демонстрирует, что нормальные фибробласты кожи человека тоже были более устойчивы к BO-110, чем клетки меланомы.Moreover, as shown in FIG. 4A , no significant changes were observed in the morphology, granulation, or cytosolic distribution of GFP-LC3 in melanocytes over a wide range of BO-110 concentrations. Figure 4C also demonstrates that normal human skin fibroblasts were also more resistant to BO-110 than melanoma cells.
Интересно, что PEI имеет решающее значение в избирательности для опухолевых клеток. Так, антимеланомная активность pIC снижалась на 70-80%, если обработку проводили без PEI (фигура 3A). В отсутствии PEI, «голая» pIC была почти такой же неэффективной в клетках меланомы, как и в меланоцитах, и демонстрировала минимальную активность в качестве индуктора аутофагии (фигура 3B).Interestingly, PEI is crucial in the selectivity for tumor cells. So, anti-melanoma pIC activity decreased by 70-80% if the treatment was carried out without PEI ( Figure 3A ). In the absence of PEI, the naked pIC was almost as ineffective in melanoma cells as in melanocytes, and showed minimal activity as an autophagy inducer ( Figure 3B ).
PEI является классическим растворителем в генной терапии из-за его способности стимулировать поглощение молекул ДНК и РНК посредством эндоцитоза (обзор в Payne, 2007). Многослойные структуры, обнаруженные в клетках меланомы, обработанных BO-110 (см. фотографии ниже на фигуре 2B), действительно согласуются со множественными событиями слияния, включающими поступление гибридов эндосома-лизосома (амфисом) в аутофагосомы (Maiuri et al., 2007).PEI is a classic solvent in gene therapy because of its ability to stimulate the uptake of DNA and RNA molecules through endocytosis (reviewed in Payne, 2007). The multilayer structures found in melanoma cells treated with BO-110 (see photos below in Figure 2B ) are indeed consistent with multiple fusion events involving the entry of endosome-lysosome hybrids (amphisomes) into autophagosomes (Maiuri et al., 2007).
Пример 3. Количественно различающаяся активация MDA-5 под воздействием pIC в отсутствие и в присутствии PEIExample 3. Quantitatively different activation of MDA-5 under the influence of pIC in the absence and presence of PEI
В дополнение к содействию эндоцитозу молекул ДНК или РНК, PEI может способствовать набуханию эндосом и делать возможной эффективную доставку генетического материала в цитозоль (обзор в Payne, 2007). Вследствие этого, PEI может способствовать доступу pIC к внутрицитозольным сенсорам. Ассоциированный с дифференциацией меланомы ген-5 (MDA-5) является одним из таких сенсоров (Akira, 2006), и вследствие этого, авторы изобретения протестировали, является ли этот белок движущей силой опосредованного BO-110 уничтожения клеток меланомы.In addition to promoting the endocytosis of DNA or RNA molecules, PEI can promote endosome swelling and enable efficient delivery of genetic material to the cytosol (review by Payne, 2007). As a consequence, PEI may facilitate access of pIC to intracytosolic sensors. Gene-5 associated with differentiation of melanoma (MDA-5) is one of these sensors (Akira, 2006), and as a result, the inventors tested whether this protein is the driving force behind BO-110 mediated killing of melanoma cells.
Активацию MDA-5 анализировали, контролируя протеолитическое расщепление, которое приводит к разъединению его доменов рекрутинга активации геликазы и каспазы (CARD) в процессе клеточной гибели, как описано (Kovasovics et al., 2002; Barral et al., 2007).MDA-5 activation was analyzed by monitoring proteolytic cleavage, which leads to the separation of its helicase and caspase activation recruitment domains (CARD) during cell death, as described (Kovasovics et al., 2002; Barral et al., 2007).
Данный анализ проводили методом иммуноблоттинга экстрактов из клеток SK-Mel-28 и SK-Mel-147, обработанных PEI, pIC или BO-110, после электрофореза этих экстрактов. В качестве положительного контроля для эффективной индукции клеточной гибели использовали бортезомиб. Результаты представлены на фигуре 5.This analysis was carried out by immunoblotting of extracts from SK-Mel-28 and SK-Mel-147 cells treated with PEI, pIC or BO-110, after electrophoresis of these extracts. Bortezomib was used as a positive control for effective induction of cell death. The results are presented in figure 5 .
Интересно, что иммуноблоттинг белков продемонстрировал сильную и устойчивую способность комплекса PEI-pIC, BO-110, индуцировать процессинг MDA-5 (фигура 3A). «Голая» pIC была способна индуцировать такой процессинг, хотя и на значительно более низком уровне и не во всех тестируемых клетках (ни одна из дорожек, соответствующих клеткам SK-Mel-28, не содержала полосы 30 кДа, характерной для наличия протеолитического расщепления, которая должна появляться на высоте, отмеченной стрелкой, на панелях A и B фигуры 5) или не постоянно (см. фигуру 5A, на которой интенсивность полосы 30 кДа уменьшается с течением времени при обработке pIC в клетках SK-Mel-147).Interestingly, protein immunoblotting demonstrated the strong and robust ability of the PEI-pIC complex, BO-110, to induce MDA-5 processing ( Figure 3A ). The naked pIC was able to induce such processing, albeit at a much lower level and not in all test cells (none of the paths corresponding to SK-Mel-28 cells contained a 30 kDa band characteristic of proteolytic cleavage, which should appear at the height indicated by the arrow in panels A and B of figure 5 ) or not constantly (see figure 5A , in which the intensity of the 30 kDa band decreases with time when processing pIC in SK-Mel-147 cells).
Для определения вклада MDA-5 в цитотоксическую активность BO-110, короткие шпилечные РНК (кшРНК), комплементарные MDA-5, трансдуцировали в клетки меланомы при помощи лентивирусных векторов для стабильного нокдауна MDA-5 (см. иммуноблоты белков на фигуре 3B). кшРНК к MDA-5 значительно снижала обусловленную BO-110 гибель клеток меланомы без какого-либо обнаруживаемого неспецифического воздействия на контрольные клетки (фигура 3C, p<0,05).To determine the contribution of MDA-5 to the cytotoxic activity of BO-110, short hairpin RNAs (kshRNAs) complementary to MDA-5 were transduced into melanoma cells using lentiviral vectors for stable knockdown of MDA-5 (see protein immunoblots in Figure 3B ). kshRNA to MDA-5 significantly reduced BO-110-induced death of melanoma cells without any detectable nonspecific effect on control cells ( Figure 3C , p <0.05).
Важно отметить, что индукция и процессинг MDA-5 являлись не просто следствием активации механизма гибели в клетках меланомы. Обработка бортезомибом, ингибитором протеасом, способным активировать как естественный, так и опосредованный рецептором смерти пути апоптоза в меланоме, не оказывала влияния на уровни или процессинг MDA-5 (фигура 5A). Эти результаты иллюстрируют основные различия в механизмах осуществления программ клеточной гибели в случае BO-110 и других проапоптотических индукторов.It is important to note that the induction and processing of MDA-5 was not just a consequence of the activation of the death mechanism in melanoma cells. Treatment with bortezomib, a proteasome inhibitor capable of activating both the natural and death-mediated apoptotic pathways in melanoma, did not affect the levels or processing of MDA-5 ( Figure 5A ). These results illustrate the main differences in the mechanisms of the implementation of cell death programs in the case of BO-110 and other proapoptotic inducers.
Пример 4. Фармакологические ингибиторы аутофагии препятствуют цитотоксической активности BO-110Example 4. Pharmacological autophagy inhibitors inhibit the cytotoxic activity of BO-110
Следующие эксперименты были сфокусированы на механизмах, лежащих в основе приведения в действие индуцированной BO-110 гибели клеток. 3-метиладенин (3-MA) и хлорохин часто используют для независимой проверки механизмов аутофагии из-за их способности препятствовать образованию аутофагосом или аутолизосомальной активности, соответственно (Maiuri et al., 2007; Klionsky et al., 2008).The following experiments focused on the mechanisms underlying the activation of BO-110 induced cell death. 3-methyladenine (3-MA) and chloroquine are often used to independently test autophagy mechanisms because of their ability to inhibit the formation of autophagosomes or autolysosomal activity, respectively (Maiuri et al., 2007; Klionsky et al. , 2008).
Для проверки того, существовало ли это препятствование в клетках меланомы, обработанных BO-110, клетки меланомы SK-Mel-103 обрабатывали 3-метиладенином или хлорохином через 12 часов после обработки BO-110 или буферным контролем (растворителем). Результаты представлены на фигуре 6.To check whether this obstruction existed in melanoma cells treated with BO-110, SK-Mel-103 melanoma cells were treated with 3-methyladenine or
Как было показано с помощью флуоресцентной микроскопии (фигура 6A и фигура 6B), 3-MA блокировал образование очагов GFP-LC3, вызванное BO-110. В присутствии хлорохина аутофагосомы накапливались, но, что интересно, эта индукция не была продуктивной в качестве индуктора гибели клеток (фигура 6C, было обнаружено, что процент погибших клеток, наблюдаемый в присутствии хлорохина, ниже, чем таковой, наблюдаемый с пепстатином A, E64d, или сочетанием обоих). Таким образом, эти результаты подтверждают сценарий, при котором цитотоксическая активность BO-110 не является пассивным побочным продуктом образования аутофагосом: литическая активность лизосом является важным медиатором уничтожения BO-110 клеток меланомы.As shown by fluorescence microscopy ( Figure 6A and Figure 6B ), 3-MA blocked the formation of foci of GFP-LC3 caused by BO-110. Autophagosomes accumulated in the presence of chloroquine, but, interestingly, this induction was not productive as an inducer of cell death ( Figure 6C , it was found that the percentage of dead cells observed in the presence of chloroquine was lower than that observed with pepstatin A, E64d, or a combination of both). Thus, these results confirm the scenario in which the cytotoxic activity of BO-110 is not a passive by-product of the formation of autophagosomes: the lytic activity of lysosomes is an important mediator of the destruction of BO-110 melanoma cells.
Пример 5. BO-110 приводит в действие слияние аутофагосом/лизосом для последующего запуска программ уничтоженияExample 5. BO-110 drives the fusion of autophagosomes / lysosomes for the subsequent launch of destruction programs
Если аутолизосомы являются ключевым фактором BO-110, блокирование лизосомальных гидролаз должно защищать клетки меланомы при обработке BO-110. Невозможно блокировать всю зависимую от лизосом активность, поскольку в этой органелле могут локализоваться множество ферментов с перекрывающимися мишенями (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). Тем не менее, полезную информацию о лизосомальной активности можно получать благодаря ингибиторам широкого спектра протеаз E64d и пепстатину A, поскольку эти соединения эффективно блокируют различные катепсины (B, D и L) в аутолизосомах (Klionsky et al., 2008). Вследствие этого, проводили испытание для сравнения эффекта хлорохина, пепстатина A или E64d на гибель клеток через 20 часов после обработки буферным контролем или BO-110. Результаты представлены на фигуре 6C, упомянутой ранее. Примечательно, что пепстатин и E64d уменьшали на 50% степень гибели клеток из-за BO-110.If autolysosomes are a key factor in BO-110, blocking lysosomal hydrolases should protect melanoma cells during BO-110 treatment. It is not possible to block all lysosome-dependent activity, since many enzymes with overlapping targets can be localized in this organelle (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). However, useful information on lysosomal activity can be obtained thanks to a wide range of E64d protease inhibitors and pepstatin A, since these compounds effectively block various cathepsins (B, D, and L) in autolysosomes (Klionsky et al., 2008). As a result, a test was conducted to compare the effect of chloroquine, pepstatin A, or E64d on
Для подтверждения того, что везикулы соответствовали прежде идентифицированным крупным мультивезикулярным структурам, которые включали большие эндосомы, которые, в свою очередь, рекрутировали множественные аутофагосомы (для создания гибридных структур, известных как амфисомы), и эти везикулы не происходили из недействующих аутофагосом, в которых лизосомы были либо не рекрутированы, либо дисфункциональны, или аутофагосомы являлись результатом накопления неполноценного разлагающегося материала, клетки меланомы трансфицировали продуктами слияния GFP и Cherry-LC3. Сигналы Cherry-GFP-LC3 приводили к красной и зеленой флуоресценции у аутофагосом из-за двух флуоресцентных белков (Cherry и GFP), однако они теряли сигнал GFP (зеленый) в кислой среде аутолизосом.To confirm that the vesicles corresponded to the previously identified large multivesicular structures, which included large endosomes, which in turn recruited multiple autophagosomes (to create hybrid structures known as amphisomes), and these vesicles did not come from inactive autophagosomes in which lysosomes were either not recruited or dysfunctional, or autophagosomes were the result of accumulation of defective decomposing material, melanoma cells were transfected with food by the merger of GFP and Cherry-LC3. Cherry-GFP-LC3 signals led to red and green fluorescence in autophagosomes due to two fluorescent proteins (Cherry and GFP), however, they lost the GFP signal (green) in the acidic environment of autolysosomes.
Использование такой стратегии позволило установить, что, действительно, BO-110, подобно рапамицину, индуцировал образование аутолизосом в клетках меланомы, о чем свидетельствовало наличие только красных очагов LC3 на фигуре 6C. Хлорохин, в соответствии с предыдущими испытаниями, блокировал гибель клеток меланомы, вызываемую BO-110 (фигура 6D), не затрагивая эндосомальное поглощение этого мимика дсРНК (что определяли по совместной локализации меченого Fluo Red BO-110 и слитого с GFP раннего эндосомального белка Rab5 (фигура 6E). Сходные ингибиторные эффекты наблюдали при использовании ингибиторов широкого спектра протеаз E64d и пепстатина A, а также блокатора вакуолярной АТФазы бафиломицина (фигура 6D), что свидетельствовало в пользу нового механизма действия BO-110, зависимого от лизосом.Using this strategy, it was established that, in fact, BO-110, like rapamycin, induced the formation of autolysosomes in melanoma cells, as indicated by the presence of only red LC3 foci in Figure 6C. Chloroquine, in accordance with previous tests, blocked the death of melanoma cells caused by BO-110 ( Figure 6D ) without affecting the endosomal uptake of this dsRNA mimic (as determined by the co-localization of labeled Fluo Red BO-110 and GFP fused early endosomal protein Rab5 ( figure 6E). Similar inhibitory effects were observed when using the broad-spectrum protease inhibitors E64d and pepstatin a, and vacuolar ATPase blocker bafilomitsina (6D figure), indicating the benefit of the new mechanism of action BO-110, dependent on lysosomes.
Чтобы независимо контролировать лизосомальную активность в процессе обработки BO-110, клетки тестировали на способность процессировать DQ-БСА (производное БСА, зеленая флуоресценция которого гасится, если он не расщеплен протеолитическими ферментами). Как показано на фигуре 6F, DQ-БСА эффективно расщеплялся в присутствии BO-110. Обратите внимание, что эмиссия DQ-БСА была обнаружена в лизосомах, на что указывает совместная локализация с помощью Lysotracker red, красителя, способность проникать в клетку которого зависит от pH, и который испускает красную флуоресценцию при попадании в кислотную среду функциональных лизосом). Результат резко отличается от минимальной эмиссии флуоресценции, вызванной DQ-БСА, которая наблюдается в клетках SK-Mel-103, обработанных BO-110, когда лизосомальная активность блокирована хлорохином (фигура 6F и фигура 6G).To independently control lysosomal activity during BO-110 treatment, cells were tested for their ability to process DQ-BSA (a derivative of BSA whose green fluorescence is quenched if it is not cleaved by proteolytic enzymes). As shown in FIG. 6F , DQ-BSA was efficiently cleaved in the presence of BO-110. Note that DQ-BSA emission was detected in lysosomes, as indicated by co-localization with Lysotracker red, a dye whose pH penetration into the cell and which emits red fluorescence when functional lysosomes enter the acidic environment). The result is very different from the minimal DQ-BSA-induced fluorescence emission observed in SK-Mel-103 cells treated with BO-110 when lysosomal activity is blocked by chloroquine ( Figure 6F and Figure 6G ).
Чтобы далее охарактеризовать способность BO-110 вызывать начало и полное развитие процесса аутофагии, слияние аутофагосом и лизосом визуализировали при помощи конфокальной микроскопии. Для этого клетки SK-Mel-103, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, обрабатывали BO-110 или соответствующим буфером в качестве контроля и инкубировали в присутствии Lysotracker-Red. Анализ двойной эмиссии зеленой и красной флуоресценции (для слитого продукта GFP-LC3 и Lysotracker, соответственно), на основе отдельных клеток и клеточных популяций показал четкую совместную локализацию аутофагосом и лизосом (см. репрезентативные микрофотографии флуоресценции на фигуре 6H и 6I, а также соответствующие количественные данные на фигуре 6J). Важно, что эта совместная локализация являлась ранним событием в ответных реакциях, вызванных BO-110 (уже обнаруживаемым через 4-8 часов после обработки), и предшествовала организованной гибели клеток.To further characterize the ability of BO-110 to trigger the onset and complete development of the autophagy process, the fusion of autophagosomes and lysosomes was visualized using confocal microscopy. For this, SK-Mel-103 cells stably expressing GFP-LC3 were treated with BO-110 or the appropriate buffer as a control and incubated in the presence of Lysotracker-Red. Analysis of the double emission of green and red fluorescence (for the fused product GFP-LC3 and Lysotracker, respectively), based on individual cells and cell populations showed a clear joint localization of autophagosomes and lysosomes (see representative microphotographs of fluorescence in figures 6H and 6I , as well as corresponding quantitative data in figure 6J ). It is important that this joint localization was an early event in the responses induced by BO-110 (already detectable 4-8 hours after treatment) and preceded organized cell death.
Определив, что аутофагосомы сливаются с активными лизосомами в ответ на BO-110, авторы изобретения оценили, взаимодействовали ли эти органеллы с эндосомами и были ли ректурированы в эндосомы. Во-первых, была оценена эндосомальная динамика в клетках меланомы, экспрессирующих GFP, слитый с поздним эндосомальным маркером Rab7 (Luzio et al., 2007). Базальное создание и разрушение эндосом (то есть, постепенное сокращение размеров) определяли в необработанных клетках меланомы (левая панель на фигуре 7A). Однако обработка BO-110 заметно усиливала эндосомальную активность, индуцируя устойчивое и многоволновое образование эндосом (средняя и правая панели фигуры 7A). Эти эндосомы оказались заполнены лизосомами, что определяли по двойной визуализации GFP-Rab7 и Lysotracker red (фигура 7B). Кроме того, микроскопия с замедленной съемкой выявила быструю кинетику множественного рекрутинга лизосом в меченые GFP-Rab7 эндосомы, что также продемонстрировано в последовательной серии событий слияния на фигуре 7C. Важно отметить, что, как показано на фигуре 7B (правые панели), слияние эндосом-лизосом значительно ингибировалось, если клетки избыточно экспрессировали Rab7-T22N, известный доминантно-негативный мутант этого белка. В целом, эти результаты демонстрируют динамическую мобилизацию эндо/лизосомальных компартментов в опухолевых клетках, обработанных BO-110.Having determined that autophagosomes fuse with active lysosomes in response to BO-110, the inventors evaluated whether these organelles interacted with endosomes and whether they were rectified into endosomes. First, the endosomal dynamics in melanoma cells expressing GFP fused to the late endosomal marker Rab7 was evaluated (Luzio et al., 2007). The basal creation and destruction of endosomes (i.e., a gradual reduction in size) was determined in untreated melanoma cells (left panel in Figure 7A ). However, treatment with BO-110 markedly enhanced endosomal activity, inducing stable and multi-wave formation of endosomes (middle and right panels of Figure 7A ). These endosomes were filled with lysosomes, which was determined by double visualization of GFP-Rab7 and Lysotracker red ( Figure 7B ). In addition, slow-motion microscopy revealed the rapid kinetics of multiple recruitment of lysosomes to GFP-Rab7-labeled endosomes, which is also demonstrated in the sequential series of fusion events in Figure 7C . It is important to note that, as shown in Figure 7B (right panels), fusion of endosome-lysosomes was significantly inhibited if cells overexpressed Rab7-T22N, a known dominantly negative mutant of this protein. In general, these results demonstrate the dynamic mobilization of endo / lysosomal compartments in tumor cells treated with BO-110.
Пример 6. BO-110 связывает аутофагию с апоптотическими каспазамиExample 6. BO-110 binds autophagy with apoptotic caspases
Лизосомальные протеазы могут влиять на программы клеточной гибели на различных уровнях (Maiuri et al., 2007; Hoyer-Hansen and Jaatella, 2008). В случае митохондрий, они могут нарушать регуляцию продукции активных форм кислорода (ROS) и/или вовлекать классические апоптотические каспазы (регуляторную casp-9 и эффекторные casp-3 и -7). Внешние пути, зависящие от casp-8, также могут отвечать на лизосомальную активацию (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). Для выяснения участия ROS в механизме действия BO-110, проводили обработку в присутствии витамина E, тролокса или тирона, акцепторов радикалов с различной антиоксидантной активностью, и панкаспазного ингибитора z-VAD-fmk. Данные анализа результатов по клеточной гибели в каждом из этих случаев представлены на фигуре 8A, при этом данные, полученные с витамином E, приведены в качестве репрезентативного случая результатов, полученных с упомянутыми химическими антиоксидантами при дозах данных реагентов, которые блокируют апоптоз в меланоме, контролируемый ROS (Fernandez, 2006). Как показано на фигуре, в присутствии данных антиоксидантов не было обнаружено существенного влияния на гибель клеток из-за BO-110. Напротив, панкаспазный ингибитор z-VAD-fmk ингибировал гибельное воздействие BO-110 на 70%. В совокупности эти результаты подтверждают зависимый от каспаз механизм, активируемый после программы аутофагии.Lysosomal proteases can affect cell death programs at various levels (Maiuri et al., 2007; Hoyer-Hansen and Jaatella, 2008). In the case of mitochondria, they may upregulate the production of reactive oxygen species (ROS) and / or involve classic apoptotic caspases (regulatory casp-9 and effector casp-3 and -7). Casp-8 dependent external pathways may also respond to lysosomal activation (Fehrenbacher and Jaattella, 2005). To determine the participation of ROS in the mechanism of action of BO-110, the treatment was performed in the presence of vitamin E, trolox or thyrone, radical scavengers with different antioxidant activity, and a pan-caspase inhibitor z-VAD-fmk. Data analysis of cell death results in each of these cases is shown in FIG. 8A , with data obtained with vitamin E as a representative case of results obtained with the mentioned chemical antioxidants at doses of these reagents that block ROS-controlled apoptosis in melanoma (Fernandez, 2006). As shown in the figure, in the presence of these antioxidants, no significant effect on cell death due to BO-110 was found. In contrast, the pan-caspase z-VAD-fmk inhibitor inhibited the fatal effects of BO-110 by 70%. Together, these results confirm a caspase-dependent mechanism activated after the autophagy program.
Каспазный процессинг, действительно, был эффективно стимулирован BO-110, что определяли иммуноблоттингом клеточных экстрактов, собранных через различные периоды времени либо после отсутствия обработки (NT), за исключением буферного контроля без PEI, либо после обработки PEI, pIC, комплексом BO-110 или известным индуктором каспазного расщепления, бортезомибом (фигура 8B и фигура 8C). На фигуре 8B приведено сравнение способности PEI, pIC и BO-110 индуцировать апоптотический процессинг каспаз 8 и 9 в различных линиях метастатической меланомы: эффективная активация каспаз 9 и 8 была отчетливо заметна через 20 ч после обработки BO-110 во всех протестированных линиях клеток меланомы человека; аналогично тому, что наблюдали при использовании бортезомиба. Более того, кинетика и степень каспазного процессинга при помощи BO-110 в высокой степени совпадали (фигура 5B), независимо от мутационного статуса BRAF (например, SK-Mel-19), NRAS (SK-Mel-103, -147), или p53 (SK-Mel-28).Caspase processing, in fact, was effectively stimulated by BO-110, which was determined by immunoblotting of cell extracts collected at different time periods either after no treatment (NT), except for buffer control without PEI, or after treatment with PEI, pIC, complex BO-110 or a known caspase cleavage inducer, bortezomib ( Figure 8B and Figure 8C ). Figure 8B compares the ability of PEI, pIC, and BO-110 to induce apoptotic processing of
На фигуре 8C представлены результаты аналогичного теста, проведенного с линией SK-Mel-103, в котором был проделан более полный анализ, включающий, в дополнение к апоптотическим каспазам 9 и 8, эффекторные каспазы 3 и 7. Аналогичный тест проводили с линией SK-Mel-147, который дал сходные результаты. Эффективный процессинг casp-9, -3 и -7 в клетках SK-Mel-103 и -147 был особенно важен. Эти линии имеют низкие уровни Apaf-1 и очень неэффективны в вовлечении casp-9/Apaf-1 апоптосом (Fernandez et al., 2005; Soengas et al., 2006) в ответ на классические противораковые лекарственные средства, такие как доксорубицин, этопозид и цисплатин (см. график на фигуре 1C). Таким образом, данные результаты свидетельствуют о превосходной способности BO-110 активировать апоптотические программы и обходить внутренние механизмы резистентности к стандартным химиотерапевтическим лекарственным средствам. Figure 8C presents the results of a similar test performed with the SK-Mel-103 line, in which a more complete analysis was performed, including, in addition to
Пример 7. Активация гибели клеток посредством BO-110 при отсутствии компенсаторных эффектов на антиапоптотические члены семейства Bcl-2Example 7. Activation of cell death by BO-110 in the absence of compensatory effects on antiapoptotic members of the Bcl-2 family
Для более подробного анализа механизма действия BO-110 и для определения событий, которые могут быть уникальным образом активированы данным агентом, реакцию на лекарственное средство сравнивали с эффектами бортезомиба. Это вещество было выбрано, поскольку оно также является сильным активатором механизма апоптоза в клетках меланомы (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2006).For a more detailed analysis of the mechanism of action of BO-110 and to determine events that can be uniquely activated by this agent, the response to the drug was compared with the effects of bortezomib. This substance was chosen because it is also a strong activator of the apoptosis mechanism in melanoma cells (Wolter et al., 2007; Fernandez et al., 2006).
Однако авторы изобретения ожидали, что бортезомиб и BO-110 будут различаться по механизму действия. Мишенью бортезомиба являются протеосомы, а не лизосомы (Qin et al., 2005). Кроме того, как показано на фигуре 5A, бортезомиб убивает клетки меланомы без индукции или процессинга MDA-5. Бортезомиб также интересен, поскольку он может способствовать массированному накоплению проапоптотического NOXA, но также индуцирует быструю и сильную повышенную регуляцию его антиапоптотического антагониста фактора MCL-1 (Fernandez et al., 2005), члена семейства Bcl-2. Важно отметить, что MCL-1 действует как внутренний компенсаторный механизм протеасомного ингибирования и блокирует противоопухолевый эффект бортезомиба in vitro и in vivo (Wolter et al., 2007; Qin et al., 2006).However, the inventors expected that bortezomib and BO-110 would differ in their mechanism of action. The targets of bortezomib are proteosomes, not lysosomes (Qin et al., 2005). In addition, as shown in FIG. 5A , bortezomib kills melanoma cells without inducing or processing MDA-5. Bortezomib is also interesting because it can promote massive accumulation of proapoptotic NOXA, but it also induces fast and strong upregulation of its anti-apoptotic factor antagonist MCL-1 (Fernandez et al., 2005), a member of the Bcl-2 family. It is important to note that MCL-1 acts as an internal compensatory mechanism of proteasome inhibition and blocks the antitumor effect of bortezomib in vitro and in vivo (Wolter et al., 2007; Qin et al., 2006).
Для оценки сходства и различия между бортезомибом и pIC («голой» или в комплексе с PEI), клетки меланомы инкубировали с каждым из этих соединений, и экстракты собирали в различные моменты времени после обработки для оценки уровней NOXA, MCL-1 и других членов семейства Bcl-2 (Bcl-xL или Bcl-2). Результаты представлены на фигуре 9.To assess the similarities and differences between bortezomib and pIC (naked or complexed with PEI), melanoma cells were incubated with each of these compounds, and extracts were collected at various points in time after treatment to evaluate levels of NOXA, MCL-1, and other family members Bcl-2 (Bcl-xL or Bcl-2). The results are presented in figure 9 .
Как показано на панелях A и B фигуры 9, «голая» pIC не была способна индуцировать NOXA систематически или постоянно в клетках меланомы SK-Mel-28 или SK-Mel-147 (клетки, экспрессирующие p53 с мутацией L145R или p53 дикого типа, соответственно). С другой стороны, BO-110 индуцировал NOXA на уровнях, превышающих в 35, 10 и 5 раз базальные уровни в клетках SK-Mel-28, SK-Mel-147 и SK-Mel-103, соответственно (см. иммуноблоты на панелях A и C фигуры 9, и репрезентативные количественные данные на фигуре 9B из результатов, полученных в клетках SK-Mel-28), что еще раз подчеркивает различную активность «голой» и в комплексе с PEI pIC.As shown in Panels A and B of Figure 9 , the naked pIC was not able to induce NOXA systematically or continuously in SK-Mel-28 or SK-Mel-147 melanoma cells (cells expressing p53 with a wild-type L145R or p53 mutation, respectively ) On the other hand, BO-110 induced NOXA at
Что касается ингибиторных регуляторов NOXA, уровни MCL-1 были минимально индуцированы BO-110 (фигура 9A и первый график из фигуры 9B). Это отличается от ситуации с бортезомибом, который сильно активирует NOXA, однако индуцирует одновременное накопление MCL-1, как описано ранее (Fernandez et al., 2005). Другие антиапоптотические члены семейства Bcl-2, такие как Bcl-2 и Bcl-xL, также не подвергались влиянию BO-110 (см. иммуноблоты для SK-Mel-103 на фигуре 9C).Regarding NOXA inhibitory regulators, MCL-1 levels were minimally induced by BO-110 ( Figure 9A and the first graph from Figure 9B ). This differs from the situation with bortezomib, which strongly activates NOXA, but induces the simultaneous accumulation of MCL-1, as described earlier (Fernandez et al., 2005). Other anti-apoptotic members of the Bcl-2 family, such as Bcl-2 and Bcl-xL, were also not affected by BO-110 (see immunoblots for SK-Mel-103 in Figure 9C ).
При отсутствии компенсаторных механизмов относительно более низкие уровни NOXA, индуцированного BO-110, могут быть достаточными, чтобы способствовать гибели клеток. Для проверки этой гипотезы клетки меланомы трансдуцировали кшРНК, которая, как показано ранее, специфически ингибирует мРНК и белок NOXA (Fernandez et al., 2005), и использовали в качестве контроля клетки, инфицированные лентивирусным вектором, экспрессирующим неактивную контрольную кшРНК. Как показано на фигуре 9D, 50% снижение экспрессии белка NOXA из-за кшРНК ингибировало повышенную регуляцию NOXA, вызванную BO-110, также примерно на 50% и ингибировало токсичность BO-110 (фигура 9E).In the absence of compensatory mechanisms, relatively lower levels of NOXA induced by BO-110 may be sufficient to promote cell death. To test this hypothesis, melanoma cells transduced cshRNA, which, as shown earlier, specifically inhibits mRNA and NOXA protein (Fernandez et al., 2005), and cells infected with a lentiviral vector expressing inactive control cshRNA were used as a control. As shown in FIG. 9D, a 50% decrease in NOXA protein expression due to kshRNA inhibited the upregulation of NOXA induced by BO-110, also by about 50%, and inhibited the toxicity of BO-110 ( FIG. 9E ).
Далее авторы изобретения использовали кшРНК против MDA-5 для определения потребности в данном белке для регуляции NOXA посредством BO-110 и провели такой же тест, как и ранее, но с количественным определением уровней NOXA. Результаты приведены на графике фигуры 9F. Интересно, что кшРНК для MDA-5 ингибировала уровни белка NOXA на 70% (фигура 9F) без побочных эффектов на другие члены семейства Bcl-2.Further, the inventors used anti-MDA-5 kshRNA to determine the need for a given protein to regulate NOXA via BO-110 and performed the same test as before, but quantifying NOXA levels. The results are shown in the graph of figure 9F . Interestingly, the kshRNA for MDA-5 inhibited NOXA protein levels by 70% ( Figure 9F ) without side effects on other members of the Bcl-2 family.
В совокупности данные результаты позволили выявить новый аспект действия MDA-5 в механизме апоптоза, обусловленном индукцией NOXA.Together, these results revealed a new aspect of the action of MDA-5 in the apoptosis mechanism due to the induction of NOXA.
Пример 8. Различная эффективность «голой» pIC и BO-110 у иммунокомпетентных мышейExample 8. Different efficacy of naked pIC and BO-110 in immunocompetent mice
Затем антимеланомную активность pIC и BO-110 оценивали in vivo. В моделях меланомы «голую» pIC следовало вводить либо в высоких дозах, либо в сочетании с другими веществами (например, ингибиторами белкового синтеза) для эффективной активации программ врожденного иммунитета. Данные, полученные в предыдущих экспериментах, указывали на то, что pIC будет гораздо более эффективной в присутствии PEI. Эффект лечения сначала анализировали на иммунокомпетентном генетическом фоне. Клетки B16 мышиной меланомы, либо не трансдуцированные, либо трансдуцированные GFP (для облегчения обнаружения флуоресценции), имплантировали в сингенных нормальных мышей. Использовали две стратегии: инъекцию опухолевых клеток (i) подкожно (п/к) или (ii) внутривенно для оценки прогрессирования опухоли в локализованных участках или в виде отдаленных метастазов, соответственно. Мыши получали PEI, pIC или BO-110, или 100 мкл 5% глюкозы (группа NT).Then the anti-melanoma activity of pIC and BO-110 was evaluated in vivo. In melanoma models, naked pIC should be administered either in high doses or in combination with other substances (for example, protein synthesis inhibitors) to effectively activate innate immunity programs. Data from previous experiments indicated that pIC would be much more effective in the presence of PEI. The treatment effect was first analyzed against an immunocompetent genetic background. Murine melanoma B16 cells, either non-transduced or transduced with GFP (to facilitate detection of fluorescence), were implanted in syngeneic normal mice. Two strategies were used: injection of tumor cells (i) subcutaneously (s / c) or (ii) intravenously to evaluate tumor progression in localized areas or as distant metastases, respectively. Mice received PEI, pIC or BO-110, or 100 μl of 5% glucose (NT group).
На фигуре 10A вкратце приведена стратегия экспериментов с п/к ксенотрансплантатами, приводящими к образованию B16, а также дозировка и схема лечения. Во время лечения перитуморальными инъекциями вводили 2 нг/кг массы тела «голой» pIC или pIC в комплексе с PEI. Figure 10A summarizes a strategy for experiments with sub xenografts leading to the formation of B16, as well as the dosage and treatment regimen. During treatment with peritumoral injections, 2 ng / kg of body weight of “naked” pIC or pIC was administered in combination with PEI.
Примечательно, что BO-110, как оказалось, превосходил pIC во всех изученных случаях. Так, мыши с растущими подкожно меланомами B16, которые получали растворитель, отдельно PEI или pIC, должны были быть умерщвлены через 15-25 дней после имплантации из-за чрезмерного роста опухоли (фигура 10A). При тех же условиях подкожные меланомы в группе лечения BO-110 либо не обнаруживались, либо были значительно меньшего размера (фигура 10A).It is noteworthy that BO-110, as it turned out, was superior to pIC in all studied cases. So, mice with subcutaneous growing B16 melanomas that received the solvent, either PEI or pIC alone, had to be euthanized 15-25 days after implantation due to excessive tumor growth ( Figure 10A ). Under the same conditions, subcutaneous melanomas in the BO-110 treatment group were either not detected, or were significantly smaller ( Figure 10A ).
На фигуре 10B вкратце приведена стратегия экспериментов с внутривенной имплантацией клеток меланомы B16-eGFP и последующим лечением pIC, PEI, BO-110 или 5% глюкозой (группа NT). На этой фигуре также приведены флуоресцентные изображения легких умерщвленных животных (фигура 10B) и количественные данные о легочных метастазах (фигура 10C). В этом эксперименте BO-110 оказался в 5 раз более эффективным, чем «голая» pIC также в суррогатных моделях легочных метастазов меланомы, как определяли по визуализации флуоресценции. Figure 10B summarizes a strategy for experiments with intravenous implantation of B16-eGFP melanoma cells and subsequent treatment with pIC, PEI, BO-110, or 5% glucose (NT group). This figure also shows fluorescence images of the lungs of euthanized animals ( Figure 10B ) and quantitative data on pulmonary metastases ( Figure 10C ). In this experiment, BO-110 was 5 times more effective than the “naked” pIC also in surrogate models of pulmonary metastases of melanoma, as determined by visualization of fluorescence.
Пример 9. IFN не воспроизводит вызывающие гибель клеток особенности BO-110Example 9. IFN does not reproduce causing cell death features of BO-110
pIC является классическим индуктором управляемого IFN клеточного иммунитета (Wenzel et al., 2008). Однако данные, приведенные в предыдущих примерах, свидетельствуют о том, что pIC, будучи в комплексе с PEI, может также действовать в клетке автономно, что может отличаться от опосредованных IFN ответов в «профессиональных» иммунных клетках. Для оценки такой возможности, клетки B16 меланомы и макрофаги тестировали на их способность секретировать и отвечать на IFN-α. Результаты ОТ-ПЦР показали, что клетки обоих типов активировали классические мишени IFN-α, такие как IFIT-1 (IFN-индуцируемый белок с тетратрикопептидными повторами), после обработки BO-110 (фигура 11A). PEI был необязательным для pIC-опосредованной индукции мишеней IFN в макрофагах (фигура 11A). Это ожидалось, поскольку эти клетки могут эффективно воспринимать вирусную дсРНК. Однако клетки меланомы были неспособны индуцировать IFIT-1 при использовании только «голой» pIC (фигура 11A).pIC is the classic inducer of IFN-driven cellular immunity (Wenzel et al., 2008). However, the data presented in the previous examples indicate that pIC, being in complex with PEI, can also act autonomously in the cell, which may differ from IFN-mediated responses in “professional” immune cells. To assess this possibility, B16 melanoma cells and macrophages were tested for their ability to secrete and respond to IFN-α. RT-PCR results showed that both types of cells activated classic IFN-α targets, such as IFIT-1 (IFN-inducible protein with tetratricopeptide repeats), after treatment with BO-110 ( Figure 11A ). PEI was optional for pIC-mediated induction of IFN targets in macrophages ( Figure 11A ). This was expected because these cells can efficiently perceive viral dsRNA. However, melanoma cells were unable to induce IFIT-1 using only naked pIC ( Figure 11A ).
Для прямой оценки продукции IFN-α клетками меланомы проводили анализ Elispot, используя рекомбинантный человеческий IFN-α в качестве эталонного контроля. Уровни IFN-α, секретируемого клетками меланомы после обработки BO-110, были ниже, чем 10 пг/мл. Для определения того, может ли IFN-α заменять BO-110 (то есть, является ли секреция IFN-α основным индуктором гибели клеток меланомы), возрастающие количества этого цитокина добавляли к клеткам меланомы. Интересно, что высокие дозы IFN-α (в 10 выше уровней, секретируемых после обработки BO-110) были не способны влиять на жизнеспособность клеток меланомы (фигура 11B).To directly evaluate IFN-α production by melanoma cells, an Elispot assay was performed using recombinant human IFN-α as a reference. The levels of IFN-α secreted by melanoma cells after treatment with BO-110 were lower than 10 pg / ml. To determine whether IFN-α can replace BO-110 (that is, whether IFN-α secretion is the main inducer of melanoma cell death), increasing amounts of this cytokine were added to melanoma cells. Interestingly, high doses of IFN-α (10 higher than the levels secreted after treatment with BO-110) were not able to affect the viability of melanoma cells ( Figure 11B ).
Интересно также отметить, что тесты с микрочипами показали, что в ответе на pIC, помимо того, что он являлся очень преходящим, все вовлеченные гены были ожидаемыми для ответа на интерферон, как показано на фигуре 11C). Напротив, эффект BO-110, помимо его продолжительности, распространялся на дополнительные транскрипты.It is also interesting to note that tests with microarrays showed that in the response to pIC, in addition to being very transient, all the genes involved were expected to respond to interferon, as shown in Figure 11C ). In contrast, the effect of BO-110, in addition to its duration, extended to additional transcripts.
Таким образом, данные результаты демонстрируют внутренние различия в узнавании и восприятии мимиков дсРНК в макрофагах и клетках меланомы.Thus, these results demonstrate internal differences in the recognition and perception of dsRNA mimics in macrophages and melanoma cells.
Пример 10. BO-110 может ингибировать метастатический рост на фоне сильно ослабленного иммунитетаExample 10. BO-110 can inhibit metastatic growth amid highly weakened immunity.
Поскольку клетки меланомы часто являются иммунорезистентными, было протестировано, является ли прямая токсичность BO-110 в отношении клеток меланомы также эффективной на фоне сильно ослабленного иммунитета. Наиболее часто эффекторными механизмами, связанными с иммунотолерантностью меланомы, являются дефекты сигнализации в NK, T и B-клетках (Kirkwood et al., 2008). Вследствие этого, способность pIC (в виде отдельного вещества или в комплексе с PEI) блокировать рост меланомы тестировали на мышах линии SCID Beige с нарушенной функцией NK, T и B-лимфоцитов.Since melanoma cells are often immunoresistant, it has been tested whether the direct toxicity of BO-110 to melanoma cells is also effective against a background of highly weakened immunity. The most common effector mechanisms associated with immunotolerance of melanoma are signaling defects in NK, T, and B cells (Kirkwood et al., 2008). As a result, the ability of pIC (as a single substance or in combination with PEI) to block the growth of melanoma was tested on SCID Beige mice with impaired function of NK, T and B lymphocytes.
Для отслеживания эффективности лечения в контроле с легочными метастазами клетки меланомы метили GFP и вводили внутривенной инъекцией, следуя схеме лечения, описанной на фигуре 10. Меланому B16 (фигура 12 панели A, B и C) и SK-Mel-103 (фигура 12, панели D и E) анализировали в качестве репрезентативных примеров мышиной и человеческой меланом, соответственно.To monitor the effectiveness of treatment in the control with pulmonary metastases, melanoma cells were labeled with GFP and administered by intravenous injection following the treatment regimen described in FIG. 10 . Melanoma B16 ( Figure 12 of Panel A, B and C ) and SK-Mel-103 ( Figure 12 , Panel D and E ) were analyzed as representative examples of murine and human melanoma, respectively.
В обеих клеточных моделях BO-110 проявлял способность ингибировать рост меланом в легких. На фигуре 12A показано поразительное различие в количестве метастазов B16, видимых на поверхности легких после обработки BO-110 (см. количественные данные на фигуре 12B). Гистологический анализ также подтвердил уменьшенное число и размеры вызванных B16 легочных узелков в группе BO-110 (фигура 12C). Аналогичные анализы показали четкий противоопухолевый эффект BO-110 (но не «голой» pIC) в контроле диссеминированного роста SK-Mel-103 (фигура 12 панели D и E). Таким образом, данные авторов изобретения подтверждают новый механизм действия мимика дсРНК, индуцирующего сильную противомеланомную активность in vivo у мышей линии SCID beige, у которых отсутствует компетентная иммунная система (Cray and Chapeau, 1990).In both cell models, BO-110 showed the ability to inhibit the growth of melanoma in the lungs. Figure 12A shows a striking difference in the number of B16 metastases visible on the surface of the lungs after treatment with BO-110 (see quantitative data in Figure 12B ). Histological analysis also confirmed the reduced number and size of B16-induced pulmonary nodules in the BO-110 group ( Figure 12C ). Similar analyzes showed a clear antitumor effect of BO-110 (but not “naked” pIC) in the control of disseminated growth of SK-Mel-103 ( figure 12 of panel D and E ). Thus, the data of the inventors confirm a new mechanism of action of a dsRNA mimic that induces strong anti-melanoma activity in vivo in SCID beige mice that lack a competent immune system (Cray and Chapeau, 1990).
Пример 11. Ингибирование BO-110 метастатического роста в животных моделях меланомы человекаExample 11. Inhibition of BO-110 metastatic growth in animal models of human melanoma
Для сравнения различий между pIC и BO-110 использовали более адекватный дизайн эксперимента. У мышей Tyr::NRASQ61K×INK4a/ARF-/- развиваются меланомы с характеристиками, аналогичными болезни человека (Ackermann et al., 2005). Мышам один раз местно наносили ДМБА (7,12-диметилбенз[а]антрацен, приобретенный у Sigma). Когда пигментированные очаги достигали 1 мм в диаметре, контрольный PEI, «голую» pIC или pIC, конъюгированную с PEI, в виде препаратов для доставки in vivo вводили внутрибрюшинными инъекциями (в/б) два раза в неделю.To compare the differences between pIC and BO-110, a more adequate experimental design was used. Tyr :: NRAS Q61K × INK4a / ARF - / - mice develop melanomas with characteristics similar to human disease (Ackermann et al. , 2005). DMBA (7,12-dimethylbenz [a] anthracene purchased from Sigma) was topically applied to mice once. When the pigmented lesions reached 1 mm in diameter, the control PEI, naked pIC or pIC conjugated to PEI was administered in vivo as intravenous injection (ip) twice weekly.
И вновь было отмечено, что противоопухолевая активность BO-110 была значительно выше, чем у pIC, на что указывали прямые измерения размеров опухолей (фигуры 13A и 13B), метаболическая активность опухолей, определенная при помощи PET-CT (фигура 13C), и гистологический анализ (фигура 13A).Again, it was noted that the antitumor activity of BO-110 was significantly higher than that of pIC, as indicated by direct measurements of the size of the tumors ( figures 13A and 13B ), the metabolic activity of the tumors determined using PET-CT ( figure 13C ), and histological analysis ( Figure 13A ).
Интересно, что BO-110 удваивал сроки жизни без каких-либо прогрессирующих поражений (фигура 13A) при лечебных дозах, используемых без признаков вторичной токсичности (см. анализ на фигуре 13D).Interestingly, BO-110 doubled the life expectancy without any progressive lesions ( Figure 13A ) at therapeutic doses used without signs of secondary toxicity (see analysis in Figure 13D ).
Данные результаты подтверждают целесообразность способов лечения, основанных на введении аналогов дсРНК, в целях борьбы с агрессивным поведением клеток меланомы.These results confirm the feasibility of treatment methods based on the introduction of dsRNA analogues in order to combat the aggressive behavior of melanoma cells.
Пример 12. Цитотоксическое действие BO-110 на различные опухолевые клеткиExample 12. The cytotoxic effect of BO-110 on various tumor cells
Поскольку генетические и эпигенетические изменения, имеющие место в меланоме и влияющие на восприятие дмРНК и аутофагию, могут не сохраняться в различных видах рака, не было очевидно, может ли BO-110 иметь терапевтический эффект при других злокачественных новообразованиях. В частности, опухоли поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника являются агрессивными и резистентными к различным методам лечения, отчасти из-за плейотропной инактивации программ клеточной гибели.Since the genetic and epigenetic changes that occur in melanoma and affect the perception of dmRNA and autophagy may not persist in various types of cancer, it was not clear whether BO-110 could have a therapeutic effect in other malignant neoplasms. In particular, tumors of the pancreas, colon, bladder, brain, breast, prostate, lung and ovary are aggressive and resistant to various methods of treatment, partly due to pleiotropic inactivation of cell death programs.
Чтобы определить, может ли BO-110 представлять собой новую противоопухолевую стратегию широкого спектра действия, серия независимо выделенных линий клеток, относящихся к приведенным выше видам рака, была выбрана из хорошо известной панели NCI-60 (фигура 14). Таким образом, в совокупности, данные клеточные линии охватывают множество опухолей (то есть, поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника) различного генетического фона. Как показано на фигуре 14, анализируемые клеточные линии имели такую же чувствительность к BO-110, что и эталонный контроль из клеток меланомы. Из этих данных следует, что BO-110 способен запускать двойную индукцию апоптоза и аутофагии, приводящую к координированному и избирательному уничтожению (без влияния на жизнеспособность нормальных компартментов) не только меланом, но также и клеток, относящихся к различным другим видам опухолей, например: поджелудочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, предстательной железы, легкого и яичника.To determine whether BO-110 could represent a new broad-spectrum antitumor strategy, a series of independently isolated cell lines belonging to the above cancers were selected from the well-known NCI-60 panel ( Figure 14 ). Thus, collectively, these cell lines span many tumors (i.e., pancreas, colon, bladder, breast, prostate, lung, and ovary) of various genetic backgrounds. As shown in FIG. 14 , the analyzed cell lines had the same sensitivity to BO-110 as the reference control from melanoma cells. From these data, it follows that BO-110 is capable of triggering a double induction of apoptosis and autophagy, leading to coordinated and selective destruction (without affecting the viability of normal compartments) not only of melanoma, but also of cells belonging to various other types of tumors, for example: pancreas gland, colon, bladder, breast, prostate, lung and ovary.
Пример 13. Индуцированная BO-110 гибель клеток зависит от активации MDA-5, Noxa и аутофагии в линиях опухолевых клетокExample 13. BO-110 Induced Cell Death Depends on Activation of MDA-5, Noxa, and Autophagy in Tumor Cell Lines
Поскольку чувствительность к BO-110 невозможно предсказать заранее (то есть, на основании типа опухолевых клеток), было необходимо определить сигнальные каскады, опосредующие ответ на BO-110. Высокопроизводительные генетические анализы (на базе матриц кДНК) в клетках меланомы указывали на то, что BO-110 способен вызывать сильную повышенную регуляцию сенсора дсРНК MDA-5, а также проапоптотического фактора NOXA. Интересно, что при помощи анализов иммуноблоттингом авторы изобретения продемонстрировали, что в действительности чувствительность и устойчивость к BO-110 (например, в линиях HCT116 или MiaPaCa2) коррелирует со способностью клеток индуцировать MDA-5 и NOXA (фигура 15). В соответствии с проапоптотической ролью BO-110, указанной выше, в чувствительных клеточных линиях наблюдали отчетливый процессинг каспазы-9, который можно визуализировать в виде изменений в электрофоретической подвижности (фигура 15).Since sensitivity to BO-110 cannot be predicted in advance (that is, based on the type of tumor cells), it was necessary to determine the signaling cascades mediating the response to BO-110. High-performance genetic analyzes (based on cDNA matrices) in melanoma cells indicated that BO-110 is capable of causing strong upregulation of the MDA-5 dsRNA sensor, as well as proapoptotic factor NOXA. Interestingly, using immunoblot analyzes, the inventors demonstrated that in reality sensitivity and resistance to BO-110 (for example, in the HCT116 or MiaPaCa2 lines) correlates with the ability of cells to induce MDA-5 and NOXA ( Figure 15 ). In accordance with the pro-apoptotic role of BO-110 indicated above, a distinct processing of caspase-9 was observed in sensitive cell lines, which can be visualized as changes in electrophoretic mobility ( Figure 15 ).
Список литературыBibliography
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES
<110> Fundación Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III.<110> Fundación Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III.
<120> СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА<120> METHOD FOR IDENTIFICATION OF COMPOUNDS FOR TREATMENT OF CANCER
<130> PCT-03837<130> PCT-03837
<160> 3<160> 3
<170> PatentIn version 3.3<170> PatentIn version 3.3
<210> 1<210> 1
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)..(21)<222> (1) .. (21)
<223> Целевая последовательность кшРНК, используемая для понижающей<223> The target sequence of kshRNA used to reduce
регуляции MDA-5Regulation MDA-5
<400> 1<400> 1
<210> 2<210> 2
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Прямой праймер ОТ-ПЦР для обнаружения экспрессии MDA-5<223> Direct RT-PCR primer for detecting MDA-5 expression
<400> 2<400> 2
<210> 3<210> 3
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная<213> Artificial
<220><220>
<223> Обратный праймер ОТ-ПЦР для обнаружения экспрессии MDA-5<223> RT-PCR reverse primer for detecting MDA-5 expression
<400> 3<400> 3
Claims (10)
(i) группы линий клеток рака поджелудочной железы: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 и Panc-1;
(ii) группы линий клеток рака толстой кишки: САСО, SW480 и SW1222;
(iii) группы линий клеток рака мочевого пузыря: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 и SW1170;
(iv) группы линий клеток глиомы: U87MG, U251 и T98G;
(v) группы линий клеток рака молочной железы: MDA231, MCF7 и T47D;
(vi) группы линий клеток рака предстательной железы: LNCaP, РС3 и DU145;
(vii) группы линий клеток рака легкого: Н1299 и NCIH460; и
(viii) группы линий клеток рака яичника: NCI Н23, CHQK1 и SK-OV-3.2. The complex according to claim 1, which induces autophagy in a cell line selected from:
(i) Pancreatic cancer cell line groups: IMIMPC2, MiaPaCa2, Aspc1, A6L, SKPC1 and Panc-1;
(ii) groups of colon cancer cell lines: CACO, SW480 and SW1222;
(iii) bladder cancer cell line groups: RT112, MGHu4, 639V, 253J, MGHu3 and SW1170;
(iv) glioma cell line groups: U87MG, U251 and T98G;
(v) groups of breast cancer cell lines: MDA231, MCF7, and T47D;
(vi) groups of prostate cancer cell lines: LNCaP, PC3, and DU145;
(vii) lung cancer cell line groups: H1299 and NCIH460; and
(viii) groups of ovarian cancer cell lines: NCI H23, CHQK1 and SK-OV-3.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200930417A ES2368963B1 (en) | 2009-07-04 | 2009-07-04 | PROCEDURE FOR IDENTIFICATION OF THERAPEUTIC AGENTS AGAINST MELANOMA AND USE OF IDENTIFIED AGENT. |
ES200930417 | 2009-07-04 | ||
PCT/EP2010/059593 WO2011003883A1 (en) | 2009-07-04 | 2010-07-05 | Process for the identification of compounds for treating cancer |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012103902A RU2012103902A (en) | 2013-08-20 |
RU2575828C2 true RU2575828C2 (en) | 2016-02-20 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004045491A2 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Targeted double stranded rna mediated cell killing |
WO2006001956A2 (en) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Compositions for inhibiting cell growth and inducing apoptosis in cancer cells and methods of use thereof |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004045491A2 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Targeted double stranded rna mediated cell killing |
WO2006001956A2 (en) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Compositions for inhibiting cell growth and inducing apoptosis in cancer cells and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Dong-chul Kang et al. mda-5: An interferon-inducible putative RNA helicase with double-stranded RNA-dependent ATPase activity and melanoma growth-suppressive properties. Proceedings of the National Academy of Sciences, 20020122 National Academy of Sciences, US. 22.01.2002. Vol:99, Nr:2, Page(s):637 " 642. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6222749B2 (en) | Pharmaceutical composition and use thereof | |
Herrera et al. | Low-dose radiotherapy reverses tumor immune desertification and resistance to immunotherapy | |
Khan et al. | Cancer therapeutics: Targeting the apoptotic pathway | |
ES2863996T3 (en) | Combination therapy for cancer treatment | |
KR20150008846A (en) | Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation | |
CN111315382A (en) | TRPV2 antagonists | |
US20110021440A1 (en) | Apoptotic pathway targeting for the diagnosis and treatment of cancer | |
CN115843249A (en) | Combination therapy with deoxyuridine triphosphatase inhibitors | |
RU2575828C2 (en) | Method for identifying compounds for treating cancer | |
AU2017235611B2 (en) | Antiviral immunotherapy by membrane receptor ligation | |
DE102019114735A1 (en) | Class I and II HLA tumor antigen peptides for the treatment of breast cancer | |
WO2020081528A1 (en) | Method and system for treating cancer utilizing tinagl 1 | |
JP6659250B2 (en) | Cancer testing method, cancer cell growth inhibitor, anticancer agent and screening method for anticancer agent | |
Guerrero Hernández | Targeting tumor microenvironment crosstalk through GPCR receptors and PI3K pathway | |
Zhang et al. | Gastrointestinal (Non-colorectal) Cancer | |
Trefzer et al. | FC13 DERMA Phase III trial of MAGE-A3 immunotherapy as adjuvant treatment in stage III melanoma: MAGE-A3 gene expression frequency and baseline demographics | |
WO2019177159A1 (en) | Cancer immunotherapy companion drug | |
Chapman | The role of mitochondria in regulating the senescence-associated secretory phenotype during cellular senescence | |
Angiero et al. | Evaluation of the cytotoxic and genotoxic effects of orthodontic bonding adhesives upon a human gingival papillae through immunohistochemical expression of P53, P63 and P16 | |
Kodigepalli | Role and Regulation of SnoN/SkiL and PLSCR1 Located at 3q26. 2 and 3q23, Respectively, in Ovarian Cancer Pathophysiology |