RU2569456C1

RU2569456C1 - Nutrient medium for detection of necrobacillosis pathogen

Info

Publication number: RU2569456C1
Application number: RU2015103615/10A
Authority: RU
Inventors: Аркадий Васильевич Иванов; Михаил Васильевич Харитонов; Тимур Рафкатович Гайнутдинов; Алмаз Габдраупович Хисамутдинов
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2015-11-27

Abstract

FIELD: veterinary medicine.

SUBSTANCE: nutrient medium for detection of the necrobacillosis pathogen comprises medium 199, blood serum of cattle, and 40% glucose solution at a predetermined ratio of components.

EFFECT: invention enables to improve the sensitivity of the nutrient medium to the necrobacillosis pathogen and to reduce the time of cultivation of inoculum.

6 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринаринарной микробиологии, в частности к выделению возбудителя некробактериоза бактериологическим методом.The invention relates to the field of veterinary microbiology, in particular to the isolation of the causative agent of necrobacteriosis by the bacteriological method.

Некробактериоз дистальных частей конечностей - одна из инфекционных болезней крупного рогатого скота, встречающаяся довольно часто в специализированных хозяйствах, в результате нарушения ветеринарно-санитарных и технологических нормативов: отсутствие активного моциона, нарушения параметров микроклимата, неполноценность рационов, решетчатые полы. По этой причине к заболеваниям конечностей практические ветеринарные специалисты подходят с неинфекционной позиции, т.е. как раневая хромота механического происхождения.Necrobacteriosis of the distal parts of the extremities is one of the infectious diseases of cattle, which occurs quite often in specialized farms, as a result of violation of veterinary and sanitary and technological standards: lack of active exercise, violation of microclimate parameters, inferiority of diets, trellised floors. For this reason, practical veterinary specialists approach limb diseases from a non-infectious position, i.e. like wound lameness of mechanical origin.

В производственных условиях возникновению и распространению некробактериоза способствует ассоциация на раневой поверхности вирулентного возбудителя некробактериоза с другими условно-патогенными микроорганизмами. В результате несвоевременного установления диагноза обычные лечебные процедуры не дают желаемых результатов, и болезнь начинает приобретать злокачественный характер, поражая одновременно 2-3 конечности.Under industrial conditions, the emergence and spread of necrobacteriosis is facilitated by the association on the wound surface of the virulent pathogen of necrobacteriosis with other opportunistic microorganisms. As a result of untimely diagnosis, conventional medical procedures do not give the desired results, and the disease begins to become malignant, affecting 2-3 limbs at the same time.

В ветеринарной практике для бактериологического исследования используют различные питательные среды.In veterinary practice, various nutrient media are used for bacteriological research.

Известно применение печеночного бульона, мозговой среды, свернутой сыворотки крови, мясопептонного агара с кровью, полужидкого агара с добавлением 2%-ного сахара (Балабанов В.А. Некробактериоз животных. - М., 1971; Лабораторные исследования в ветеринарии./Под ред. Б.И. Антонова. - М., 1986, с. 351).It is known the use of liver broth, brain medium, coagulated blood serum, meat peptone agar with blood, semi-liquid agar with the addition of 2% sugar (Balabanov V.A. Necrobacteriosis of animals. - M., 1971; Laboratory studies in veterinary medicine. / Ed. B.I. Antonova. - M., 1986, p. 351).

Недостатком данных питательных сред является низкая чувствительность сред для выявления некробактериоза, приводящая к увеличению срока культивирования посевного материала до 3-8 суток.The disadvantage of these culture media is the low sensitivity of the media for the detection of necrobacteriosis, leading to an increase in the period of cultivation of inoculum up to 3-8 days.

Известна среда Китта-Тароцци, состоящая из мясопептонного бульона, 0,5%-ной глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды («Анаэробные организмы», материал из Википедии - свободной энциклопедии - ru.m.wikipedia.org).Known medium Kitta-Tarozzi, consisting of meat and peptone broth, 0.5% glucose and pieces of liver or minced meat to absorb oxygen from the medium ("Anaerobic Organisms", material from Wikipedia - free encyclopedia - ru.m.wikipedia.org) .

Однако применение этой среды позволяет инкубировать посевы от трех до пяти суток, просматривая их ежедневно.However, the use of this medium allows incubation of crops from three to five days, viewing them daily.

Задачей изобретения является создание такой питательной среды, которая обладала бы повышенной чувствительностью и эффективностью диагностики некробактериоза с сокращением срока культивирования посевного материала.The objective of the invention is the creation of such a nutrient medium, which would have increased sensitivity and efficiency in the diagnosis of necrobacteriosis with a reduction in the period of cultivation of seed.

Поставленная задача решается тем, что питательная среда для выделения возбудителя некробактериоза содержит питательную среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ную глюкозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: питательная среда 199 - 85,0, сыворотка крови крупного рогатого скота - 10,0, 40%-ный раствор глюкозы - 5,0.The problem is solved in that the nutrient medium for isolation of the causative agent of necrobacteriosis contains nutrient medium 199, blood serum of cattle and 40% glucose in the following ratio of components, wt.%: Nutrient medium 199 - 85.0, blood serum of cattle - 10.0, 40% glucose solution - 5.0.

Входящая в состав питательной среды сыворотка крови крупного рогатого скота, 40%-ный раствор глюкозы являются источниками белка и углеводов, а также среда 199, имеющая широкий спектр питательных веществ с относительно невысокой их концентрацией (Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988, с. 56), что способствует быстрому размножению F. necrophorum и приводит к повышению чувствительности и эффективности диагностики некробактериоза, а также к сокращению сроков культивирования пасевного материала.Cattle blood serum, a 40% glucose solution, which are part of the nutrient medium, are sources of protein and carbohydrates, as well as medium 199, which has a wide range of nutrients with a relatively low concentration (G. Pinaev, Methods of cell cultivation. Collection of scientific Proceedings. - L .: Nauka, 1988, p. 56), which contributes to the rapid reproduction of F. necrophorum and leads to an increase in the sensitivity and effectiveness of the diagnosis of necrobacteriosis, as well as to a reduction in the cultivation time of grass material.

Питательную среду готовили следующим образом. К 85 мл основной среды 199 добавляют 10 мл сыворотки крупного рогатого скота и 5 мл 40%-ного раствора глюкозы, все тщательно перемешивают и по 10 мл разливают в стерильные пробирки.The nutrient medium was prepared as follows. To 85 ml of basic medium 199 add 10 ml of cattle serum and 5 ml of a 40% glucose solution, mix everything thoroughly and pour 10 ml into sterile tubes.

Предлагаемая среда была испытана в лаборатории биотехнологии (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ г. Казани) с использованием для культивирования хранящихся в лаборатории культур F. necrophorum штаммов «8TS630501», «12TSK630501», а также на посевах из патологического материала, полученного от убоя больных коров с поражением дистальных частей конечностей (некробактериозом).The proposed medium was tested in a biotechnology laboratory (Federal State Budgetary Institution FTsTRB-VNIVI, Kazan) using strains “8TS630501”, “12TSK630501” for cultivation of F. necrophorum cultures stored in the laboratory, and also on crops from pathological material obtained from slaughter of sick cows with damage to the distal parts of the limbs (necrobacteriosis).

Пример 1. Бактериальные суспензии F.necrophorum из штаммов «8TS630501» и «12TSK630501» с содержанием 500000 микробных тел по стандарту мутности готовят на физиологическом растворе и высевают в три пробирки с содержанием предлагаемой питательной среды с наслоением вазелинового масла и в три пробирки без масла. Дале пробирки помещают в термостат при температуре 37°C с установлением визуального наблюдения через каждый час до 16 ч, а затем через 36 ч после высева культур. Результаты исследования представлены в табл. 1 и рис. 1-а, б, 2-а, б, 3-а, б и 4а, б.Example 1. Bacterial suspensions of F.necrophorum from strains "8TS630501" and "12TSK630501" with a content of 500,000 microbial bodies according to the turbidity standard are prepared in physiological saline and plated in three test tubes containing the proposed nutrient medium with layering of liquid paraffin and in three test tubes without oil. Far the tubes are placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C with the establishment of visual observation every hour up to 16 hours, and then 36 hours after seeding of cultures. The results of the study are presented in table. 1 and fig. 1-a, b, 2-a, b, 3-a, b and 4a, b.

Как видно из табл. 1 первичный рост музейных штаммов F. necrophorum начинает появляться в первые же часы после посева (рис. 1а, 3а) с последующем усилением роста в виде помутнения среды (рис. 1б, 3б).As can be seen from the table. Primary growth of museum strains of F. necrophorum 1 begins to appear in the very first hours after sowing (Figs. 1a, 3a), followed by increased growth in the form of turbidity (Fig. 1b, 3b).

В аэробных условиях рост возбудителя значительно выше (рис. 2а, б, 4а, б).Under aerobic conditions, the growth of the pathogen is much higher (Fig. 2a, b, 4a, b).

В отличие от музейных штаммов патологический материал обладает более высокой вирулентностью и медленным ростом на питательных средах, поэтому были проведены испытания с выделением возбудителя из патологического материала, полученного от больных коров с поражением дистальных частей конечностей из животноводческих хозяйств ООО АФ «Южная» Нурлатского, ООО АФ «Татарстан» Высокогорского районов Республики Татарстан.Unlike museum strains, pathological material has higher virulence and slower growth on nutrient media; therefore, tests were performed to isolate the pathogen from pathological material obtained from diseased cows with lesions of the distal parts of the extremities from livestock farms of AF Yuzhnaya LLC Nurlatsky, AF LLC "Tatarstan" Vysokogorsky regions of the Republic of Tatarstan.

Пример 2. Посевной материал после соответствующей обработки высевают в три пробирки с предлагаемой в качестве изобретения питательной средой с наслоением вазелинового масла и в три пробирки без масла. Помещают в термостат при температуре 37°С и устанавливают наблюдение в тех же параметрах, что описано в примере 1. Результаты исследования представлены в табл. 2 и рис. 5а, б; 6а, б.Example 2. Seed after appropriate processing is seeded in three test tubes with the proposed invention as a nutrient medium with layering of liquid paraffin and in three test tubes without oil. Placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C and set the observation in the same parameters as described in example 1. The results of the study are presented in table. 2 and fig. 5a, b; 6a, b.

На день проведения испытаний в ООО АФ «Татарстан» Высокогорского района РТ было всего 1452 голов крупного рогатого скота голштино-фризской породы, завезенных в 2012 г. из Республики Беларусь. Из всего поголовья - 600 голов коров, 85 - нетели, остальное поголовье молодняк разного возраста. При клиническом осмотре из всего поголовья 254 (42,3%) коровы и 15 (18,5%) нетелей имели поражения дистальных частей конечностей в виде хромоты различной степени. Больных коров в количестве пяти голов фиксировали в станке Исляева-Кутлукаева, отбирали материал (витальные соскобы) на границе здоровой и пораженной ткани. В лаборатории биотехнологии из соскобов делали мазки-отпечатки и окрашивали по Грамму. В мазках при микроскопии просматривались грамотрицательные нити разной длины и палочки. Затем материал помещали в ступку, тщательно растирали, добавляя небольшое количество среды 199. Высевы делали в шести пробирках с содержанием предлагаемой питательной среды. В три пробирки для создания анаэробных условий вносили вазелиновое масло, затем все пробирки помещали в термостат с температурой 37°С и устанавливали наблюдения через каждый час до 16 ч, а затем через 36 ч.On the day of testing, OOO Tatarstan AF in the Vysokogorsky district of the Republic of Tatarstan had a total of 1,452 heads of Holstein-Friesian cattle imported in 2012 from the Republic of Belarus. Of the total number of cattle - 600 heads of cows, 85 - heifers, the rest of the number of young animals of different ages. On clinical examination, out of the total number of livestock, 254 (42.3%) cows and 15 (18.5%) heifers had lesions of the distal limbs in the form of lameness of varying degrees. Five sick cows were fixed in Islyaev-Kutlukaev's machine tool, material (vital scrapings) was selected at the border of healthy and diseased tissue. In the biotechnology laboratory, fingerprints were made from scrapings and Gram stained. Microscopic smears showed gram-negative filaments of different lengths and rods. Then the material was placed in a mortar, carefully triturated, adding a small amount of medium 199. Seeding was done in six test tubes containing the proposed nutrient medium. Vaseline oil was added to three tubes to create anaerobic conditions, then all the tubes were placed in a thermostat with a temperature of 37 ° C and observations were established every hour up to 16 hours, and then after 36 hours.

Результаты представлены в табл. 2 и рис. 5а, б и 6а, б.The results are presented in table. 2 and fig. 5a, b and 6a, b.

Как видно из табл. 2 появление первичного роста возбудителя из патологического материала в анаэробных условиях происходит через 4 ч после посева (рис. 5а, б), а в аэробных условиях через 2 ч (рис. 6а, б).As can be seen from the table. 2, the appearance of the primary growth of the pathogen from pathological material under anaerobic conditions occurs 4 hours after sowing (Fig. 5a, b), and under aerobic conditions after 2 hours (Fig. 6a, b).

Таким образом, предлагаемая питательная среда значительно повышает чувствительность бактериологического исследования (приблизительно в 15-20 раз), направленного на выявление возбудителя некробактериоза у больных животных, и может быть использована в ветеринарных лабораториях как экспресс-метод диагностика возбудителя некробактериоза.Thus, the proposed nutrient medium significantly increases the sensitivity of bacteriological studies (approximately 15-20 times) aimed at identifying the causative agent of necrobacteriosis in sick animals, and can be used in veterinary laboratories as an express method for the diagnosis of the pathogen of necrobacteriosis.

Claims

Nutrient medium for isolating the causative agent of necrobacteriosis, containing nutrient medium 199, blood serum of cattle and 40% glucose solution in the following ratio of components, wt.%:
Culture medium 199 85.0 Cattle blood serum 10.0 40% glucose solution 5,0