RU2565819C1

RU2565819C1 - Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate

Info

Publication number: RU2565819C1
Application number: RU2014154495/10A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Григорьевна Волова; Екатерина Игоревна Шишацкая
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2015-10-20

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate is offered. The method includes the cultivation of the strain producer Cupriavidus eutrophus VKPM V-10646 in conditions of aeration and stirring in liquid salt water with glucose. At the beginning of the process of fermentation the limiting concentration of sulphur compounds are used , also the substratum-predecessor is added - potassium hexanoate, at the concentration 1 g/l and inhibitor of reactions of beta oxidation cycle - acrylate, at the concentration 0.5-1.0 g/l partially 2-3 times within 1.5-2.5 h. Total duration of the process is 45 hours minimum.

EFFECT: high yield of copolymer, decrease of level of crystallinity of copolymer and improvement of elasticity of copolymer.

2 cl, 3 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способам получения биоразрушаемых высокомолекулярных биополимеров на основе гидроксиалкановых кислот (полигидроксиалканоатов, ПГА), в частности, сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот (3-гидроксибутират и 3-гидроксигексаноат, П3ГБ/3ГГ).The invention relates to biotechnology, and more specifically to methods for producing biodegradable high molecular weight biopolymers based on hydroxyalkanoic acids (polyhydroxyalkanoates, PHA), in particular, a copolymer of 3-hydroxybutyric and 3-hydroxyhexanoic acids (3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate, P3GB / 3G).

ПГА относятся к классу природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами. Эти полимеры термопластичны, характеризуются высокой биологической совместимостью и разрушаемостью в биологических средах. Среди них - различные материалы, от высококристалличных термопластов до конструкционных эластомеров, что определяется химическим строением мономеров, образующих эти полимеры. Потенциально сферы применения ПГА широки и включают медицину, фармакологию, сельское и коммунальное хозяйство, радиоэлектронику. Особо перспективны ПГА для конструирования изделий и устройств медико-биологического назначения, включая возможность получение нетканых и одноразовых изделий, шовных и перевязочных материалов, элементов для восстановительной хирургии и трансплантологии [Plastics from bacteria. Natural functions and applications / Eds.: G.-Q. Chen, A. Steinbüchel. - Springer. - 2010. Sudesh, K. Practical Guide to Microbial Polyhydroxyalkanoates. "Smitthes" (UK), 2010. Volova, Shishatskaya, Sinskey. Degradable Polymers: Production, Properties and Applications. - Nova Sci. Publ. Inc. USA - 2013].PHA belong to the class of natural polymers synthesized by microorganisms. These polymers are thermoplastic, characterized by high biocompatibility and destructibility in biological environments. Among them are various materials, from highly crystalline thermoplastics to structural elastomers, which is determined by the chemical structure of the monomers forming these polymers. Potentially, the scope of application of PHA is wide and includes medicine, pharmacology, agriculture and utilities, radio electronics. PGAs are especially promising for the design of products and devices for medical and biological purposes, including the possibility of obtaining non-woven and disposable products, suture and dressings, elements for reconstructive surgery and transplantation [Plastics from bacteria. Natural functions and applications / Eds .: G.-Q. Chen, A. Steinbüchel. - Springer. - 2010. Sudesh, K. Practical Guide to Microbial Polyhydroxyalkanoates. "Smitthes" (UK), 2010. Volova, Shishatskaya, Sinskey. Degradable Polymers: Production, Properties and Applications. - Nova Sci. Publ. Inc. USA - 2013].

Базовые физико-химические свойства сополимерных ПГА, в т.ч. степень кристалличности и температурные характеристики, определяют условия переработки полимеров и характеристики получаемых изделий.Basic physical and chemical properties of copolymer PHAs, incl. the degree of crystallinity and temperature characteristics determine the conditions for the processing of polymers and the characteristics of the resulting products.

Известны процессы синтеза сополимеров на различных субстратах (сахарах, органических и жирных кислотах), которые служат основным источником углерода. В состав сред для синтеза сополимеров П(3ГБ/3ГГ) необходимо внесение дополнительного углеродного субстрата в виде гексановой кислоты или ее солей в качестве субстрата-предшественника, необходимого для образования мономеров 3-гидроксигексаноата.Known processes for the synthesis of copolymers on various substrates (sugars, organic and fatty acids), which serve as the main source of carbon. An additional carbon substrate in the form of hexanoic acid or its salts as a precursor substrate necessary for the formation of 3-hydroxyhexanoate monomers is necessary in the composition of media for the synthesis of copolymers of P (3GB / 3GG).

Известны аналогичные способы получения сополимеров П(3ГБ/3ГГ), образованных коротко- и среднецепочечными мономерами, природным штаммом R. eutrophus В5786 [Волова Т.Г. Беляева О.Г., Гительзон И.И., и др. Синтез и исследование гетерополимерных полигидроксиалканоатов хемолитотрофными бактериями. - ДАН. 1996. - Т. 347. - С. 256-258; Волова Т.Г., Калачева Г.С., Плотников В.Ф. Биосинтез сополимерных полгидрокисалканоатов хемолитотрофными бактериями. - Микробиология. - 1998. - Т. 67. - С. 420-424]. П(3ГБ/3ГГ) синтезируют в культуре природного штамма R. eutrophus В5786 при автотрофном росте на CO₂ с добавками гексаноата с содержанием мономеров 3ГГ до 10-16 мол.%.Known similar methods for producing copolymers of P (3GB / 3GG), formed by short and medium chain monomers, a natural strain of R. eutrophus B5786 [Volova T.G. Belyaeva OG, Gitelzon II, et al. Synthesis and study of heteropolymer polyhydroxyalkanoates by chemolithotrophic bacteria. - DAN. 1996.- T. 347. - S. 256-258; Volova T.G., Kalacheva G.S., Plotnikov V.F. Biosynthesis of copolymer polyhydroxyalkanoates by chemolithotrophic bacteria. - Microbiology. - 1998. - T. 67. - S. 420-424]. P (3GB / 3GG) is synthesized in a culture of a natural strain of R. eutrophus B5786 with autotrophic growth on CO ₂ with the addition of hexanoate with a content of 3GG monomers up to 10-16 mol%.

Недостаток указанного способа получения сополимера П(3ГБ/3ГГ) - низкое содержание мономеров 3ГГ, что обусловливает достаточно высокие значения степени кристалличности образцов и их низкую эластичность.The disadvantage of this method for the preparation of copolymer P (3GB / 3GG) is the low content of 3GG monomers, which leads to rather high values of the degree of crystallinity of the samples and their low elasticity.

Прототипом изобретения является способ получения сополимеров П(3ГБ/3ГГ) культуре природного штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, обладающего повышенной устойчивостью к субстратам-предшественникам ряда мономеров на среде, содержащей основной углеродный ростовой субстрат, а также добавку углеродного субстрата-предшественника - гексаноата калия, и добавку ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, при лимите азота [Патент РФ №2439143 «Штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов и способ их получения», опубл. 10.01.2012 г.]. Способ представляет собой синтез сополимерных трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами 3-гидроксибутирата 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, при котором фактором, стимулирующим синтез ПГА, является лимитирующая подача азота. Полученные характеристики сополимеров: содержание мономеров 3ГГ от 0,2 до 56 мол.%; невысокий общий выход сополимера П(3ГБ/3ГГ) - 18-37%, степень кристалличности образцов сополимеров - от 30 до 41%.The prototype of the invention is a method for producing copolymers of P (3GB / 3HG) culture of the natural strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646, which has increased resistance to the precursor substrates of a number of monomers on a medium containing a basic carbon growth substrate, as well as the addition of a carbon substrate precursor - potassium hexanoate , and the addition of a beta-oxidation cycle inhibitor — acrylate, with a nitrogen limit [RF Patent No. 2439143 “Bacterial strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 - producer of polyhydroxyalkanoates and method for their preparation”, publ. 01/10/2012]. The method is the synthesis of copolymer three-component PHA formed by monomers of 3-hydroxybutyrate 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, in which the factor stimulating the synthesis of PHA is the limiting supply of nitrogen. The obtained characteristics of the copolymers: the content of 3GG monomers from 0.2 to 56 mol.%; a low overall yield of copolymer P (3GB / 3GG) is 18-37%, the degree of crystallinity of the samples of copolymers is from 30 to 41%.

Недостаток прототипа - низкий общий выход сополимеров П(3ГБ/3ГГ), невысокое содержание в сополимере мономеров 3ГГ и достаточно высокие значения степени кристалличности.The disadvantage of the prototype is the low total yield of copolymers P (3GB / 3GG), the low content of 3GG monomers in the copolymer and fairly high crystallinity.

Задача изобретения - повышение общего выхода сополимера, повышение содержания в составе сополимера мономера 3-гидроксигексаноата (3ГГ).The objective of the invention is to increase the overall yield of the copolymer, increasing the content of the monomer 3-hydroxyhexanoate (3HG) in the composition of the copolymer.

Задача решается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, включающем культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей глюкозу, при введении в культуру субстрата-предшественника - гексаноата калия, и ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, согласно изобретению,гексаноат калия при текущей концентрации 1 г/л и акрилат при концентрации 0,5-1,0 г/л вводят в культуру штамма продуцента дробно 2-3-кратно в течение 1,5-2,5 ч на первом этапе ферментации при общей продолжительности процесса не менее 45 ч. Кроме того, на первом этапе процесса ферментации в составе жидкой солевой среды используют лимитирующие концентрации соединений серы, при отсутствии серы в среде на втором этапе. В качестве соединения серы используют сульфат магния в концентрации не выше 0,1 г/л.The problem is solved in that in the method for producing a copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate, including culturing the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 under conditions of aeration and mixing on a liquid salt medium containing glucose, when a precursor substrate hexanoate is introduced into the culture potassium, and the beta-oxidation cycle inhibitor - acrylate, according to the invention, potassium hexanoate at a current concentration of 1 g / l and acrylate at a concentration of 0.5-1.0 g / l are introduced into the culture of the producer strain fractionally 2-3 times in for 1.5-2.5 hours per the first stage of fermentation with a total process duration of at least 45 hours. In addition, at the first stage of the fermentation process, limiting concentrations of sulfur compounds are used in the composition of the liquid salt medium, in the absence of sulfur in the medium at the second stage. As a sulfur compound, magnesium sulfate is used in a concentration of not higher than 0.1 g / l.

Способ осуществляют следующим образом. Процесс культивирования ведут в два этапа. На первом этапе получают биомассу бактерий. Используют штамм Cupriavidus eutrophus (депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), коллекционный номер ВКПМ В-10646). Штамм-продуцент выращивают в периодическом режиме на среде Шлегеля при избытке углеродного субстрата (глюкоза) на полной минеральной среде с лимитированным содержанием серы. На первом этапе процесса ферментации постепенно, в течение 1,5-2,5 ч в культуру дробно, например 2-3 раза, вносят углеродный субстрат-предшественник - гексаноат калия, в концентрации 1 г/л и ингибитор реакций цикла бета-окисления - акрилат, в концентрации 0,5-1,0 г/л. На втором этапе продолжают процесс при тех же условиях, но в среде, не содержащей источника серы. Общая продолжительность процесса синтеза сополимера П(3ГБ/3ГГ) составляет 45 ч. Полимер выделяют, концентрируют, очищают, сушат. Регистрируют физико-химические характеристики с применением рентгеноструктурного анализа, дифференциального термического анализа и жидкостной хроматографии. Получают биоразрушаемые изделия, например пленки для раневых покрытий, одним из известных способов.The method is as follows. The cultivation process is carried out in two stages. At the first stage, the biomass of bacteria is obtained. A strain of Cupriavidus eutrophus is used (deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), collection number VKPM B-10646). The producer strain is grown in batch mode on Schlegel medium with an excess of carbon substrate (glucose) in a complete mineral medium with a limited sulfur content. At the first stage of the fermentation process, a carbon substrate precursor, potassium hexanoate, at a concentration of 1 g / l and an inhibitor of the beta-oxidation cycle reactions are gradually introduced into the culture, for 1.5-2.5 hours, for example, 2-3 times acrylate, in a concentration of 0.5-1.0 g / l. At the second stage, the process is continued under the same conditions, but in an environment that does not contain a sulfur source. The total duration of the synthesis process of the copolymer P (3GB / 3GG) is 45 hours. The polymer is isolated, concentrated, purified, dried. Physicochemical characteristics are recorded using x-ray diffraction analysis, differential thermal analysis and liquid chromatography. Get biodegradable products, such as films for wound coverings, one of the known methods.

Техническим результатом изобретения является увеличение выхода сополимера П(3ГБ/3ГГ) свыше 50% от веса сухого вещества клеток, с содержанием мономеров 3ГГ более 50 мол.%, со степенью кристалличности сополимера не более 30-40% и повышенной эластичностью, показателем которой служит величина удлинения образца пленки при разрыве. Указанный результат обусловлен дробным 2-3-кратным постепенным (в течение 1,5-2,5 ч) введением в культуру субстрата-предшественника - гексаноата калия, при концентрации 1 г/л и ингибитора реакций цикла бета-окисления - акрилата, 0,5-1,0 г/л на первом этапе при общей продолжительности процесса не менее 45 ч. В качестве фактора, стимулирующего и максимизирующего накопление сополимера в клетках, используется сера, что обеспечивает повышение общего выхода сополимера.The technical result of the invention is to increase the yield of copolymer P (3GB / 3GG) over 50% by weight of dry matter of cells, with a content of 3GG monomers of more than 50 mol%, with a degree of crystallinity of the copolymer of not more than 30-40% and increased elasticity, the value of which elongation of the film sample at break. The specified result is due to fractional 2-3-fold gradual (within 1.5-2.5 hours) introduction into the culture of the precursor substrate - potassium hexanoate, at a concentration of 1 g / l and beta-oxidation cycle inhibitor - acrylate, 0, 5-1.0 g / l at the first stage with a total process duration of at least 45 hours. Sulfur is used as a factor that stimulates and maximizes the accumulation of the copolymer in the cells, which ensures an increase in the overall yield of the copolymer.

Использование штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в качестве продуцента, варьирование концентрации основного и дополнительного углеродных субстратов и лимитирующего рост бактерий элемента (серы), а также дозированный режим подачи субстрата-предшественника и акрилата позволяет получать с высокими выходами сополимер П(3ГБ/3ГГ), образованный мономерами 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата, характеризующийся стабильными показателями молекулярной массы и термических характеристик, существенным снижением степени кристалличности на фоне возрастания эластичности пленки.The use of the Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 strain as a producer, varying the concentration of the main and additional carbon substrates and the element limiting the growth of bacteria (sulfur), as well as the dosage regimen of the substrate precursor and acrylate, makes it possible to obtain copolymer P (3GB / 3GG) in high yields formed by monomers of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate, characterized by stable molecular weight and thermal characteristics, a significant decrease in crystallinity against crease elasticity of the film.

Получение сополимеров 3ГБ/3ГГ с использованием природного штамма Cupriavidus eutrophus В-10646 и их свойства иллюстрируют следующие примеры.Obtaining copolymers of 3GB / 3GH using a natural strain of Cupriavidus eutrophus B-10646 and their properties are illustrated by the following examples.

Пример 1. Синтезируют П(3ГБ/3ГГ). Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, хранящуюся на агаризованной среде при 5°C, суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 20 г/л, Na₂HPO₄·H₂O - 9.1, KH₂PO₄ - 1.5; MgSO₄·H₂O - 0.2, Fe₃C₆ Η₅O₇·7H₂O - 0.25, CO(NH₂)₂ - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H₃BO₃ - 0.228, СоСе₂×6H₂O - 0.030, CuSO₄×5H₂O - 0.008, MnCe₂×4H₂O - 0.008, ZnSO₄×7H₂O - 0.176, NaMoO₄×2H₂O - 0.050, NiCe₂ - 0.008 (г/л) и раствор железа лимоннокислого 5 г/л из расчета 5 мл раствора на 1 л среды. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.5 с использованием термостатируемого шейкера-инкубатора «Incubator Shaker Innova® серии 44» «New Brunswick Scientific)) (США). Культивирование проводят в течение 15-18 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в периодическом режиме синтеза полимеров в двустадийной культуре, при котором на первом этапе синтез полимеров стимулируется лимирующей концентрацией серы, которую подают в виде сульфата магния MgSO₄ в концентрации не выше 0.1 г/л, в отличие от прототипа, в котором синтез полимера стимулируется дефицитом азота; на втором - в среде, не содержащей источника серы. Коэффициент заполнения стеклянных колб объемом 1-2 л составляет от 0,3 до 0,5. Выращивание бактерий проводят при 30°C и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре не менее 5 г/л. Через 15 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру дважды в течение 2 ч подают гексаноат калия в концентрации 1 г/л и акрилат в концентрации 1,0 г/л. Продолжают культивирование еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи сульфата магния культивирование продолжают 20 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре не менее 5 г/л) и азота (50-100 мг/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 45 ч. Выделение полимера из биомассы проводят известным способом в среде дихлорметана. Полученный экстракт концентрируют на роторном испарителе Rotavapor R-210, осаждают изопропанолом. Процедуру перерастворения и осаждения проводят многократно - не менее 3-х раз. Полимер сушат при комнатной температуре в боксе-ламинаре.Example 1. Synthesize P (3GB / 3HG). Museum culture of the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 that is stored on an agar medium at 5 ° C, suspended in a liquid salt medium containing (g / l): glucose - 20 g / l, Na ₂ HPO ₄ · H ₂ O - 9.1, KH ₂ PO ₄ - 1.5; MgSO ₄ · H ₂ O - 0.2, Fe ₃ C ₆ Η ₅ O ₇ · 7H ₂ O - 0.25, CO (NH ₂ ) ₂ - 1.0. A Hoagland standard trace element solution at the rate of 3 ml per 1 liter of nutrient medium, which contains: H ₃ BO ₃ - 0.228, CoCe ₂ × 6H ₂ O - 0.030, CuSO ₄ × 5H ₂ O - 0.008, MnCe ₂ × 4H ₂ O - 0.008, ZnSO ₄ × 7H ₂ O - 0.176, NaMoO ₄ × 2H ₂ O - 0.050, NiCe ₂ - 0.008 (g / L) and a solution of citric iron 5 g / L at the rate of 5 ml of solution per 1 liter of medium. Cultivation of the producer strain was carried out batchwise in glass flasks with a volume of 1 liter at a fill factor of 0.5 using a Incubator Shaker Innova® Series 44 incubator shaker (New Brunswick Scientific)) (USA). Cultivation is carried out for 15-18 hours at 30 ° C and pH 7.0. The resulting culture is used as an inoculum for subsequent bacterial growth in the batch mode of polymer synthesis in a two-stage culture, in which, at the first stage, polymer synthesis is stimulated by a limiting concentration of sulfur, which is supplied as magnesium sulfate MgSO ₄ at a concentration of no higher than 0.1 g / l, in contrast from a prototype in which polymer synthesis is stimulated by a nitrogen deficiency; on the second - in an environment that does not contain a sulfur source. The fill factor of glass flasks with a volume of 1-2 l is from 0.3 to 0.5. Bacterial growth is carried out at 30 ° C and pH 7.0 at a current concentration of glucose in the culture of at least 5 g / l. After 15 hours from the start of cultivation using a metering pump, potassium hexanoate at a concentration of 1 g / L and acrylate at a concentration of 1.0 g / L are fed into the culture twice within 2 hours. The cultivation is continued for another 10 hours. The total cultivation time in the first stage is 25 hours. After turning off the supply of magnesium sulfate, cultivation is continued for 20 hours when a glucose solution (current concentration in the culture is at least 5 g / l) and nitrogen (50-100 mg) are fed into the culture / l). The total cultivation time of the producer strain is 45 hours. The polymer is isolated from biomass by a known method in a dichloromethane medium. The extract obtained is concentrated on a Rotavapor R-210 rotary evaporator, precipitated with isopropanol. The reconstitution and precipitation procedure is carried out repeatedly - at least 3 times. The polymer is dried at room temperature in a laminar box.

Физико-химические свойства П(3ГБ/3ГГ) исследованы с применением рентгеноструктурного анализа, дифференциального термического анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Относительное разрывное удлинение образцов измеряют, например, с использованием универсальной испытательной машины Instron 5565, 5KN (Instron, Великобритания) при комнатной температуре. Базовая (начальная) длина образцов - от 20,0 до 50,0 мм; скорость растяжения 3 мм/мин. Результаты представлены в таблице 1.The physicochemical properties of P (3GB / 3GG) were studied using X-ray diffraction analysis, differential thermal analysis and high performance liquid chromatography. The relative tensile elongation of the samples is measured, for example, using a universal testing machine Instron 5565, 5KN (Instron, UK) at room temperature. The base (initial) length of the samples is from 20.0 to 50.0 mm; stretching speed 3 mm / min. The results are presented in table 1.

Выход сополимера 58,0%; содержание 3-гидроксигексаноата 68,0 мол. %. Степень кристалличности 21%. Удлинение образца пленки при разрыве составило 477%.The copolymer yield of 58.0%; the content of 3-hydroxyhexanoate 68.0 mol. % The degree of crystallinity is 21%. The elongation of the film sample at break was 477%.

Пример 2. Способ синтеза П(ЗГБ/3ГГ) аналогичен способу, указанному в примере 1. В качестве основного источника углерода используют глюкозу, которую вместе с источником азота подают в культуру в заданных концентрациях. На первом этапе лимитирующий элемент - сера; на втором подачу сульфата магния прекращают. Через 15 ч от начала культивирования с помощью насоса дозатора в культуру трижды в течение 1,5 ч подают гексаноат калия в концентрации 1 г/л и акрилат в концентрации 0,5 г/л. Продолжают культивирование в течение 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи сульфата магния культивирование продолжают 20 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре не менее 5 г/л) и азота (50-100 мг/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 45 ч. Выделение полимера из биомассы и исследование образцов проводят аналогично примеру 1. Выход сополимера 64,3%, содержание 3-гидроксигексаноата 65,7 мол. %. Степень кристалличности 30%. Удлинение образца пленки при разрыве составило 290%. Результаты представлены в таблице 1.Example 2. The synthesis method of P (ZGB / 3GH) is similar to the method specified in example 1. As the main carbon source, glucose is used, which, together with a nitrogen source, is supplied to the culture in predetermined concentrations. At the first stage, the limiting element is sulfur; on the second supply of magnesium sulfate is stopped. After 15 hours from the start of cultivation using a metering pump, potassium hexanoate at a concentration of 1 g / l and acrylate at a concentration of 0.5 g / l are fed into the culture three times within 1.5 hours. The cultivation is continued for 10 hours. The total cultivation time in the first stage is 25 hours. After turning off the supply of magnesium sulfate, cultivation is continued for 20 hours when a glucose solution (current concentration in the culture is at least 5 g / l) and nitrogen (50-100 mg / l). The total cultivation time of the producer strain is 45 hours. The polymer is isolated from biomass and the samples are studied analogously to Example 1. The copolymer yield is 64.3%, the content of 3-hydroxyhexanoate is 65.7 mol. % The degree of crystallinity is 30%. The elongation of the film sample at break was 290%. The results are presented in table 1.

Примечание: Т_пл.°C - температура плавления; Т_дегр.°C - температура термической деградации, С_х, % - степень кристалличности; М_в - средневесовая молекулярная масса, кДа; D - полидисперсность.Note: T _pl. ° C - melting point; T _deg. ° C - temperature of thermal degradation, C _x ,% - degree of crystallinity; M _in - srednevekovaja molecular weight, kDa; D is the polydispersity.

На фиг. 1 представлены структурная формула и ¹H-ЯМР спектр сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот П(3ГБ/3ГГ) с содержанием мономеров 3ГГ 58,0 мол.%.In FIG. 1 shows the structural formula and ¹ H-NMR spectrum of a copolymer of 3-hydroxybutyric and 3-hydroxyhexanoic acids P (3GB / 3HG) with a content of 3GG monomers of 58.0 mol%.

Фиг. 2 - представлена ионная хроматограмма сополимера П(3ГБ/3ГГ). Время удерживания 9,489 мин соответствует β-ОН-бутирату; 11,548 мин - β-ОН-гексаноату.FIG. 2 - presents an ion chromatogram of copolymer P (3GB / 3GG). Retention time 9.489 min corresponds to β-OH-butyrate; 11.548 min - β-OH-hexanoate.

Фиг. 3. Масс-спектры мономеров 3-гидроксимасляной (3 ГБ) (а) и 3-гидроксигексановой (3ГГ) (б) кислот, входящих в состав сополимера П(3ГБ/3ГГ).FIG. 3. Mass spectra of monomers of 3-hydroxybutyric (3 GB) (a) and 3-hydroxyhexanoic (3GG) (b) acids that are part of the copolymer P (3GB / 3GG).

Claims

1. A method of obtaining a copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate, comprising culturing the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 under aeration and mixing in a liquid salt medium containing glucose, when potassium hexanoate, a precursor substrate and an inhibitor, are introduced into the culture reactions of the beta-oxidation cycle - acrylate, characterized in that at the first stage of the fermentation process, limiting concentrations of sulfur compounds are used in the composition of the liquid salt medium, and potassium hexanoate at a concentration of 1 g / l and acrylate at concentrations of 0.5-1.0 g / l are introduced fractionally 2-3 times for 1.5-2.5 hours with a total process duration of at least 45 hours and the absence of sulfur in the medium in the second stage.

2. A method of obtaining a copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate according to claim 1, characterized in that magnesium sulfate is used as a sulfur compound in a concentration of not higher than 0.1 g / l.