RU2565815C1 - Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate - Google Patents
Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate Download PDFInfo
- Publication number
- RU2565815C1 RU2565815C1 RU2014154471/10A RU2014154471A RU2565815C1 RU 2565815 C1 RU2565815 C1 RU 2565815C1 RU 2014154471/10 A RU2014154471/10 A RU 2014154471/10A RU 2014154471 A RU2014154471 A RU 2014154471A RU 2565815 C1 RU2565815 C1 RU 2565815C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydroxybutyrate
- concentration
- copolymer
- hours
- cultivation
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к способам получения биоразрушаемых высокомолекулярных биополимеров (гидроксиалкановых кислот (полигидроксиалканоатов, ПГА). Может быть использовано в биотехнологии для получения материалов, применяемых, например, в медицине для изготовления эндопротезов, хирургических шовных и других материалов, для функционирования фармакологических контролируемых систем доставки лекарственных средств, в качестве носителей для клеточной и тканевой инженерии, в сельском и коммунальном хозяйстве в виде разрушаемых тепличных конструкций, упаковки, например для удобрений, препаратов или семян, и в других отраслях народного хозяйства.The invention relates to methods for producing biodegradable high molecular weight biopolymers (hydroxyalkanoic acids (polyhydroxyalkanoates, PHA). Can be used in biotechnology to obtain materials used, for example, in medicine for the manufacture of endoprostheses, surgical suture and other materials, for the functioning of pharmacologically controlled drug delivery systems , as carriers for cell and tissue engineering, in agriculture and communal services in the form of destructible greenhouse constructions, packaging, for example, for fertilizers, preparations or seeds, and in other sectors of the national economy.
Биотехнологические способы получения ПГА основаны на способности прокариотических микроорганизмов продуцировать эти биополимеры в качестве эндогенного депо энергии и углерода.Biotechnological methods for producing PHA are based on the ability of prokaryotic microorganisms to produce these biopolymers as an endogenous depot of energy and carbon.
Известны способы получения многокомпонентных и разнообразных по составу ПГА, образованных не только мономерами 3-гидроксибутирата, но и другими мономерами: 2-гидроксибутирататом, 2-гидроксивалератом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом, 3-гидроксиоктаноатом, 3-гидроксидодеканоатом, а также 4-гидроксибутироатом, 4-гидроксивалератом и их сополимерами, штаммами-продуцентами. Эти ПГА, в отличие от гомогенного П3ГБ, характеризуются большей механической прочностью и эластичностью, способностью перерабатываться в разнообразные изделия с высокими физико-механическими характеристиками и более высокой скоростью биодеградации в биологических средах [патенты США №№: 5,245,023 (September 14, 1993); 6,323,010 (November 27, 2001); 6,316,262 (November 13,2001); 6,593,116 (Jule 15, 2003); 6,689,589 (February 10, 2004); 6,838,493 (January 4, 2005); 7,229,804 (June 12, 2007)].Known methods for producing multicomponent and diverse in composition PHA formed not only by 3-hydroxybutyrate monomers, but also by other monomers: 2-hydroxybutyrate, 2-hydroxyvalerate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, as well as 4 -hydroxybutyroatom, 4-hydroxyvalerate and their copolymers, producer strains. These PHA, in contrast to homogeneous P3GB, are characterized by greater mechanical strength and elasticity, the ability to be processed into a variety of products with high physical and mechanical characteristics and a higher rate of biodegradation in biological environments [US patents Nos. 5,245,023 (September 14, 1993); 6,323,010 (November 27, 2001); 6,316,262 (November 13,2001); 6,593,116 (Jule 15, 2003); 6,689,589 (February 10, 2004); 6,838,493 (January 4, 2005); 7,229,804 (June 12, 2007)].
Недостатки данных решений - использование в качестве продуцентов гетерополимерных ПГА генетически модифицированных организмов, которые требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования и возможностью снижения или утраты способности синтезировать ПГА требуемого состава и с высокими выходами.The disadvantages of these solutions are the use of genetically modified organisms as producers of heteropolymer PHA, which require specialized expensive media for growth, and are also characterized by instability during cultivation and the possibility of reducing or losing the ability to synthesize PHA of the required composition and in high yields.
Особо ценными и перспективными является сополимерные ПГА, содержащие в своем составе мономеры 4-гидроксимаслянй кислоты (4ГБ), которые придают полимерам свойства эластомеров. Для синтеза сополимеров, содержащих мономеры 4ГБ в качестве необходимого субстрата-предшественника в составе питательной среды используют 4-гидроксимасляную кислоту, γ-бутиролактон, 1,4-бутандиол, применение которых приводит к увеличению содержания 4-гидроксибутирата в сополимере, но ингибирует рост бактерий и накопление собственно сополимера. В зависимости от концентрации основного источника углерода (фруктоза, 3-гидроксимасляная кислота, масляная кислота и др.) и субстрата-предшественника (4-гидроксимасляная кислота, γ-бутиролактон, 1,4-бутандиол), а также режима культивирования бактерий, получают полимеры с различным соотношением 3-гидроксибутирата (3ГБ) и 4-гидроксибутирата (4ГБ).Particularly valuable and promising is copolymer PHAs containing 4-hydroxybutyric acid monomers (4GB), which give the polymers the properties of elastomers. For the synthesis of copolymers containing 4GB monomers, 4-hydroxybutyric acid, γ-butyrolactone, 1,4-butanediol are used as a necessary precursor substrate in the nutrient medium, the use of which leads to an increase in the content of 4-hydroxybutyrate in the copolymer, but inhibits the growth of bacteria and the accumulation of the actual copolymer. Depending on the concentration of the main carbon source (fructose, 3-hydroxybutyric acid, butyric acid, etc.) and the precursor substrate (4-hydroxybutyric acid, γ-butyrolactone, 1,4-butanediol), as well as the mode of bacterial cultivation, polymers are obtained with a different ratio of 3-hydroxybutyrate (3GB) and 4-hydroxybutyrate (4GB).
Известны способы получения 3-компонентных ПГА, образованных мономерами 3-гидроксибутирата (3ГБ), 4-гидроксибутирата (ГБ) и 3-гидроксивалерата (3ГВ), которые получены в культурах природных штаммов Cupriavidus sp. USMAA2-4 и Alcaligenes sp. А-04а.Known methods for producing 3-component PHA formed by monomers of 3-hydroxybutyrate (3GB), 4-hydroxybutyrate (GB) and 3-hydroxyvalerate (3GB), which are obtained in cultures of natural strains of Cupriavidus sp. USMAA2-4 and Alcaligenes sp. A-04a.
По способу, описанному в работе [Aziz NA, Sipaut CS, Abdullah AA-A. Improvement of the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) terpolyester by manipulating the culture condition. J Chem Technol Biotechnol. - 2012. - Vol. 87. - P. 1607-1614.50], в культуре Cupriavidus sp. USMAA2-4 варьированием составом субстратов-предшественников и соотношением C/N в среде получены сополимеры с содержанием мономеров 3ГВ на уровне 23 мол. % и мономеров 4ГБ 26 мол. %.According to the method described in [Aziz NA, Sipaut CS, Abdullah AA-A. Improvement of the production of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) terpolyester by manipulating the culture condition. J Chem Technol Biotechnol. - 2012. - Vol. 87. - P. 1607-1614.50], in the culture of Cupriavidus sp. USMAA2-4, by varying the composition of the precursor substrates and the C / N ratio in the medium, copolymers were obtained with the content of 3GV monomers at the level of 23 mol. % and 4GB monomers 26 mol. %
Известен способ синтеза 3-компонентных ПГА - П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) в культуре Ralstonia eutropha при культивировании в ферментере на глюкозе; обепечивший высокий выход по биомассе (136 г/л) и сополимера (62%). Доминирующими в 3-компонентном сополимере были мономеры 3ГБ, а содержание мономеров 3ГВ и 4ГБ были на низком уровне, 2 и 5 мол. % соответственно [Madden LA, Anderson AJ, Asrar J, Berger P, Garrett P. Production and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures. Polymer. - 2000. - Vol. 41. = P. 3499-3505.52].A known method for the synthesis of 3-component PHA - P (3GB / 3GB / 4GB) in a culture of Ralstonia eutropha when cultured in a fermenter on glucose; secured a high yield in biomass (136 g / l) and copolymer (62%). 3GB monomers were dominant in the 3-component copolymer, and the content of 3GB and 4GB monomers was low, 2 and 5 mol. % respectively [Madden LA, Anderson AJ, Asrar J, Berger P, Garrett P. Production and characterization of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures. Polymer - 2000. - Vol. 41. = P. 3499-3505.52].
Недостаток способов аналогов - невысокий общий выход сополимера и невысокое содержание в них мономеров 4ГБ и 3ГВ.The disadvantage of analog methods is the low overall yield of the copolymer and the low content of 4GB and 3GV monomers in them.
Прототипом изобретения является способ получения ПГА, заключающийся в культивировании штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей основной углеродный субстрат и субстраты-предшественники в качестве дополнительного источника углерода, при лимите азота на первом этапе и в безоазотной среде - на втором этапе [Патент РФ №2439143, опубл. 10.01.2012 г.]. Способ обеспечивает синтез сополимерных ПГА, в том числе трехкомпонентных, образованных мономерами 3-гидроксибутирата (3ГБ), 3-гидроксивалерата (3ГВ) и 4-гидркосибутирата (4ГБ) 3ГБ, 3ГВ, 4ГБ в различном соотношении; при этом содержание мономеров 3-гидрокисбутирата от 34,8 до 70,1 мол. %; 4-гидроксибутирата - ниже 30 мол. %, максимально до 28,5 мол. %; 3-гидроксивалерата максимально до 36,6 мол. %.The prototype of the invention is a method for producing PHA, which consists in cultivating a producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 under aeration and mixing in a liquid salt medium containing a basic carbon substrate and precursor substrates as an additional carbon source, with a nitrogen limit in the first stage and in a nitrogen-free environment - at the second stage [RF Patent No. 2439143, publ. 01/10/2012]. The method provides the synthesis of copolymer PHAs, including ternary, formed by the monomers of 3-hydroxybutyrate (3GB), 3-hydroxyvalerate (3GB) and 4-hydroxybutyrate (4GB) 3GB, 3GB, 4GB in various proportions; while the content of monomers of 3-hydroxybutyrate from 34.8 to 70.1 mol. %; 4-hydroxybutyrate - below 30 mol. %, up to a maximum of 28.5 mol. %; 3-hydroxyvalerate up to a maximum of 36.6 mol. %
Недостаток способа - невысокое содержание в сополимерных ПГА мономеров 4ГБ и 3ГВ; невысокие общие выходы сополимеров (28-49% от веса сухого вещества биомассы клеток), вариабельные значения степени кристалличности в диапазоне 12-46%.The disadvantage of this method is the low content in the copolymer PHA monomers 4GB and 3GV; low overall yields of copolymers (28-49% of the dry matter weight of the biomass of the cells), variable values of the degree of crystallinity in the range of 12-46%.
Задачей изобретения является увеличение общего выхода сополимера при его получении, улучшение физико-химических, физико-механических, технологических свойств полимера путем повышения содержания мономеров 4ГБ и 3ГВ в его составе и снижения степени кристалличности сополимеров, пригодных для получения эластичных пленок.The objective of the invention is to increase the overall yield of the copolymer upon receipt, to improve the physicochemical, physico-mechanical, technological properties of the polymer by increasing the content of 4GB and 3HB monomers in its composition and reducing the crystallinity of the copolymers suitable for producing elastic films.
Задача решается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата и 4-гидркосибутирата, включающем культивирование штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей основной углеродный субстрат и дополнительный источник углерода - субстраты-предшественники в виде валерата калия и гамма-бутиролактона, согласно изобретению жидкая солевая среда содержит дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л, в качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту, при этом валерат калия при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л вводят на первом этапе процесса ферментации постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.The problem is solved in that in the method for producing a copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate, including culturing the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 under conditions of aeration and mixing in a liquid salt medium containing a basic carbon substrate and an additional carbon source - precursor substrates in the form of potassium valerate and gamma-butyrolactone, according to the invention, the liquid salt medium contains a yeast extract at a concentration of 2 g / l, hl is used as the main carbon substrate yucose or oleic acid, while potassium valerate at a concentration of 1.0-2.0 g / l and gamma-butyrolactone at a concentration of 1.5-2.5 g / l are introduced at the first stage of the fermentation process gradually over 1.5- 2 hours with a total process time of at least 32 hours
Способ осуществляют следующим образом. Культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 выращивают в периодическом режиме при постоянной аэрации и перемешивании на солевой среде Шлегеля на сахарах или органических кислотах в качестве основного углеродного субстрата: на первом этапе при избытке углеродного субстрата на полной солевой среде и при лимитировании роста бактерий по азоту; на втором этапе - в безазотной среде при полной обеспеченности углеродным субстратом. На первом этапе в состав среды дополнительно вносят дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. В качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту. На первом этапе процесса ферментации в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат (субстраты-предшественники) - гамма-бутиролактон и валерат калия в концентрациях, не вызывающих резкого ингибирования роста бактерий и синтеза полимеров. Валерат калия вводят при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.The method is as follows. The culture of the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 is grown in batch mode with constant aeration and stirring on Schlegel salt medium on sugars or organic acids as the main carbon substrate: in the first stage, with an excess of carbon substrate in full salt medium and with limited bacterial growth on nitrogen; at the second stage, in a nitrogen-free medium with complete provision with a carbon substrate. At the first stage, yeast extract at a concentration of 2 g / l is additionally added to the medium. As the main carbon substrate, glucose or oleic acid is used. At the first stage of the fermentation process, an additional carbon substrate (precursor substrates), gamma-butyrolactone and potassium valerate, is added to the culture in concentrations that do not cause sharp inhibition of bacterial growth and polymer synthesis. Potassium valerate is administered at a concentration of 1.0-2.0 g / l and gamma-butyrolactone at a concentration of 1.5-2.5 g / l gradually over a period of 1.5-2 hours with a total process time of at least 32 hours.
Выделение полимера из биомассы проводят дихлорметаном. Полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе Rotavapor R-210 (Швейцария) осаждают изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения проводят многократно. Полимер сушат в боксе-ламинаре. Исследуют и анализируют физико-химические характеристики. Получают изделия, например пленки, одним из известных способов.Isolation of the polymer from biomass is carried out with dichloromethane. The obtained extract after its concentration on a Rotavapor R-210 rotary evaporator (Switzerland) is precipitated with isopropanol. To obtain highly purified samples, the re-dissolution and precipitation procedure is carried out repeatedly. The polymer is dried in a box-laminar. Investigate and analyze the physico-chemical characteristics. Receive products, such as films, by one of the known methods.
Физико-механические характеристики пленок изучали с использованием универсальной испытательной машины Instron 5565, 5KN (Instron, Великобритания) при комнатной температуре. Базовая (начальная) длина образцов - от 20,0 до 50,0 мм; скорость растяжения 3 мм/мин. Регистрировали относительное разрывное удлинение как показатель эластичности образцов.The physicomechanical characteristics of the films were studied using an Instron 5565, 5KN universal testing machine (Instron, UK) at room temperature. The base (initial) length of the samples is from 20.0 to 50.0 mm;
Адгезионные свойства поверхности пленок с различным содержанием мономеров 3ГБ, 3ГВ и 4ГБ исследованы в культуре линейных фибробластов NIH 3Т3. Образцы пленок помещали на дно 24-луночных планшетов (Orange Scientific). В качестве контроля были использованы планшеты без полимерных мембран из полистирола. Засев матриксов клетками проводили из расчета 105 клеток на см2. Культивирование клеток проводили от 3-х до 7-ми суток и более. Фибробласты культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и раствора антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/мл, пенициллин 100 ЕД/мл) (Sigma, США) в СO2-инкубаторе при 5% атмосфере СO2 при 37°C. Замену среды производили раз в три дня.The adhesive properties of the surface of films with different contents of 3GB, 3GB and 4GB monomers were studied in the culture of linear fibroblasts NIH 3T3. Film samples were placed on the bottom of 24-well plates (Orange Scientific). As a control, tablets without polymer polystyrene membranes were used. Inoculation of the matrix cells was performed at the rate of 10 5 cells per cm 2 . Cell cultivation was carried out from 3 to 7 days or more. Fibroblasts were cultured on DMEM medium with the addition of 10% fetal calf serum and a solution of antibiotics (
Сущность изобретения поясняется графическими материалами.The invention is illustrated graphic materials.
На фиг. 1 представлены структурная формула и 1H-ЯМР спектр сополимера 3-гидрокисмасляной, 3-гидроксивалеиановой и 4-гидроксимасляной кислот [П(3ГБ/3ГВ/4ГБ)], содержащего мономеры 3-гидроксибутирата (3ГБ), 3-гидроксивалерата (3ГВ), 4-гидроксибутирата (4ГБ).In FIG. 1 shows the structural formula and 1 H-NMR spectrum of a copolymer of 3-hydroxybutyric, 3-hydroxybaleanic and 4-hydroxybutyric acid [P (3GB / 3HB / 4GB)] containing monomers of 3-hydroxybutyrate (3GB), 3-hydroxyvalerate (3GB), 4-hydroxybutyrate (4GB).
На фиг. 2 представлены ионная хроматограмма и масс-спектры мономеров, входящих в состав сополимера: 3-гидрокисмасляной, 3-гидроксивалериановой и 4-гидроксимасляной кислот.In FIG. Figure 2 shows the ion chromatogram and mass spectra of the monomers that make up the copolymer: 3-hydroxybutyric, 3-hydroxyvaleric and 4-hydroxybutyric acids.
На фиг. 3 представлены РЭМ снимки пленок, полученных из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ)] с различным содержанием мономеров.In FIG. 3 shows SEM images of films obtained from copolymers P (3GB / 3GB / 4GB)] with different monomer contents.
На фиг. 4 представлены результаты оценки жизнеспобности фибробластов мыши линии NIH 3Т3 в МТТ тесте, культивируемых на полимерных пленках из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ), в сравнении с контролем (полистирол) и гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ).In FIG. Figure 4 presents the results of assessing the viability of NIH 3T3 mouse fibroblasts in the MTT test cultured on polymer films of copolymers P (3GB / 3GB / 4GB), in comparison with the control (polystyrene) and homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (PGB).
На фиг. 5 представлены фото фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на полимерных пленках из сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ), в сравнении с контролем (полистирол) и гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ). Окраска флуоресцентными красителями FITC и DAPI (маркеры на цитоплазму и ядерную ДНК).In FIG. Figure 5 shows photos of fibroblasts adhered and proliferating on polymer films from copolymers P (3GB / 3GV / 4GB), in comparison with the control (polystyrene) and homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (P3GB). Staining with fluorescent dyes FITC and DAPI (markers for cytoplasm and nuclear DNA).
Технический результат изобретения заключается в следующем. Предложенный способ культивирования штамма-продуцента при дозированной и постепенной подаче в культуру субстратов-предшественников и варьирование их доз и последующего времени культивирования обеспечивает синтез трехкомпонентных ПГА с выходами от 52 до 60% с суммарным содержание мономеров 3ГВ и 4ГБ выше 50 мол.% (от 51.7 до 74.7 мол. %) при содержании мономеров 3ГБ ниже 50 мол.% (от 25.30 до 46.20 мол.%). Образцы сополимеров П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) имеют степень кристалличности ниже 30% (максимально 24%, минимально 8%). Полученные полимерные пленки характеризуются эластичностью и имеют показатель удлинения при разрыве свыше 100% (от 146 до 318%). Обеспечивают более эффективную адгезию и рост клеток по сравнению с гомополимером 3-гидрокибутиратом (3ГБ) и контрольным полистиролом. Обеспечивают высокие показатели по адгезии, росту и жизнеспособности фибробластов NIH 3Т3.The technical result of the invention is as follows. The proposed method for cultivating a producer strain with dosed and gradual feeding of precursor substrates into the culture and varying their doses and subsequent cultivation time provides the synthesis of three-component PHA with yields from 52 to 60% with a total content of 3HB and 4GB monomers above 50 mol% (from 51.7 up to 74.7 mol.%) with a 3GB monomer content below 50 mol.% (from 25.30 to 46.20 mol.%). Samples of copolymers P (3GB / 3GV / 4GB) have a degree of crystallinity below 30% (maximum 24%, minimum 8%). The obtained polymer films are characterized by elasticity and have an elongation at break of more than 100% (from 146 to 318%). Provide more effective adhesion and cell growth compared to homopolymer 3-hydroxybutyrate (3GB) and control polystyrene. Provide high rates of adhesion, growth and viability of NIH 3T3 fibroblasts.
Для повышения продуктивности процесса на первом этапе в состав среды дополнительно вносят дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. В качестве основного углеродного субстрата используют глюкозу или олеиновую кислоту. На первом этапе процесса ферментации в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат (субстраты-предшественники) - гамма-бутиролактон и валерат калия в концентрациях, не вызывающих резкого ингибирования роста бактерий и синтеза полимеров. Валерат калия вводят при концентрации 1,0-2,0 г/л и гамма-бутиролактон при концентрации 1,5-2,5 г/л постепенно в течение 1,5-2 ч при общей продолжительности процесса не менее 32 ч.To increase the productivity of the process at the first stage, yeast extract at a concentration of 2 g / l is additionally added to the medium. As the main carbon substrate, glucose or oleic acid is used. At the first stage of the fermentation process, an additional carbon substrate (precursor substrates), gamma-butyrolactone and potassium valerate, is added to the culture in concentrations that do not cause sharp inhibition of bacterial growth and polymer synthesis. Potassium valerate is administered at a concentration of 1.0-2.0 g / l and gamma-butyrolactone at a concentration of 1.5-2.5 g / l gradually over a period of 1.5-2 hours with a total process time of at least 32 hours.
Получение 3-компонентных сополимерных полигидроксиалканоатов П(3ГБ/3ГВ/4ГБ) на основе штамма Cupriavidus eutrophus В-10646 и их свойства иллюстрируют следующие примеры.The preparation of 3-component copolymer polyhydroxyalkanoates P (3GB / 3GV / 4GB) based on the Cupriavidus eutrophus B-10646 strain and their properties are illustrated by the following examples.
Пример 1. Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, хранящуюся на агаризованной среде в при 5°С, суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 20 г/л, Na2HPO4·H2O - 9.1, KН2РO4 - 1.5; MgSO4·H2O - 0.2, Fе3C6 H5O7·7H2O - 0.25, CO(NH2)2 - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H3ВО3 - 0.228, СоСе2×6H2O - 0.030, CuSO4×5H2O - 0.008, MnCe2×4Н2O - 0.008, ZnSO4×7H2O - 0.176, NaMoO4×2H2O - 0.050, NiCe2 - 0.008 (г/л), и раствор железа лимоннокислого 5/г/л из расчета 5 мл раствора на 1 л среды. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.5 с использованием термостатируемого шейкера-инкубатора «Incubator Shaker Innova® серии 44» «New Brunswick Scientific» (США). Культивирование проводят в течение 15-18 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в периодическом режиме синтеза полимеров в двустадийной культуре, при котором на первом этапе синтез полимеров стимулируется лимитирующей концентрацией азота (50% от физиологической потребности культуры в концентрации 0,5 г/л); на втором - в безазотной среде. В составе среды содержится дрожжевой экстракт в концентрации 2 г/л. Коэффициент заполнения стеклянных колб объемом 1-2 л составляет от 0,3 до 0,5. Выращивание бактерий проводят при 30°C и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре не менее 5 г/л. Через 12 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 1,5 г/л и валерат калия - 2 г/л, продолжая культивирования еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 22 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л 15 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 37 ч. Общий выход полимера 52% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 46.20; 3-гидроксивалерат - 30.2; 4-гидроксибутират - 23,6 мол.%. Свойства сополимера представлены в таблице. Степень кристалличности образца составила 24%; температура плавления и термической деградации 171 и 280°C; средневесовая молекулярная масса (Мв) 745 кДа. Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 146%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 4,00±0,55×103 кл./см2.Example 1. Museum culture of the producer strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646, stored on an agar medium at 5 ° C, is suspended in a liquid salt medium containing (g / l): glucose - 20 g / l, Na 2 HPO 4 · H 2 O - 9.1; KH 2 PO 4 - 1.5; MgSO 4 · H 2 O - 0.2, Fe 3 C 6 H 5 O 7 · 7H 2 O - 0.25, CO (NH 2 ) 2 - 1.0. The Hoagland standard microelement solution at the rate of 3 ml per 1 liter of nutrient medium, which contains: H 3 BO 3 - 0.228, CoCe 2 × 6H 2 O - 0.030, CuSO 4 × 5H 2 O - 0.008, MnCe 2 × 4H 2 O - 0.008, ZnSO 4 × 7H 2 O - 0.176, NaMoO 4 × 2H 2 O - 0.050, NiCe 2 - 0.008 (g / L), and a solution of
Пример 2. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 1. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,0 г/л и валерат калия - 1,5 г/л, продолжая культивирование еще 10 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 20 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л еще 12 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 32 ч. Общий выход полимера 57,4% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 45.80; 3-гидроксивалерат - 23.30; 4-гидроксибутират - 31,30 мол.%. Свойства сополимера представлены в таблице. Степень кристалличности образца составила 21%; температура плавления и термической деградации 168 и 283°C; средневесовая молекулярная масса (Мв) 756 кДа. Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 168%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 3,84±0,17×103 кл/см2.Example 2. The cultivation of the producer strain is carried out similarly to Example 1. After 10 hours from the start of cultivation using a metering pump in the culture for 2 hours serves the substrate precursor gamma-butyrolactone at a concentration of 2.0 g / l and potassium valerate - 1, 5 g / l, continuing cultivation for another 10 hours. The total cultivation time in the first stage is 20 hours. After turning off the nitrogen supply to the culture, cultivation is continued when the culture is fed with glucose at a concentration of at least 5 g / l for another 12 hours. The total cultivation time of the strain is producer is 32 h. The total polymer yield of 57.4% (by weight of dry matter of the cell). The composition of the copolymer: 3-hydroxybutyrate - 45.80; 3-hydroxyvalerate - 23.30; 4-hydroxybutyrate - 31.30 mol.%. The properties of the copolymer are presented in the table. The degree of crystallinity of the sample was 21%; melting and thermal degradation temperatures of 168 and 283 ° C; weight average molecular weight (M in ) 756 kDa. The elongation at break of a film made from a sample of 168%. The number of fibroblasts adherent and proliferating on a copolymer film of this composition on the 7th day of cultivation amounted to 3.84 ± 0.17 × 10 3 cells / cm 2 .
Пример 3. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 1. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 2,0 г/л, продолжая культивирование еще 15 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры глюкозой в концентрации не ниже 5 г/л еще 10 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 35 ч. Общий выход полимера 60,0% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 39.45; 3-гидроксивалерат - 25.40; 4-гидроксибутират - 34,50 мол. %. Степень кристалличности образца составила 16%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 259%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования? составило 3,96±1,12×103 кл/см2.Example 3. The cultivation of the producer strain is carried out similarly to Example 1. After 10 hours from the start of cultivation using a metering pump in the culture for 2 hours serves the substrate precursor gamma-butyrolactone at a concentration of 2.5 g / l and potassium valerate - 2, 0 g / l, continuing cultivation for another 15 hours. The total cultivation time in the first stage is 25 hours. After turning off the nitrogen supply to the culture, cultivation is continued when the culture is fed with glucose at a concentration of at least 5 g / l for another 10 hours. The total cultivation time of the strain is producer is 35 hours. The total polymer yield of 60.0% (by weight of dry matter of the cell). The composition of the copolymer: 3-hydroxybutyrate - 39.45; 3-hydroxyvalerate - 25.40; 4-hydroxybutyrate - 34.50 mol. % The degree of crystallinity of the sample was 16%; temperature properties and weight average molecular weight - without significant changes (table). The elongation at break of a film made from a sample of 259%. The number of fibroblasts adherent and proliferating on a copolymer film of this composition on the 7th day of cultivation? amounted to 3.96 ± 1.12 × 10 3 cells / cm 2 .
Пример 4. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примерe 1. При этом среда в качестве основного С-субстрата содержит вместо глюкозы олеиновую кислоту в концентрации 10 г/л. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 1,0 г/л, продолжая культивирование еще 15 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 25 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры олеиновой кислотой при ее текущей концентрации в культуре бактерий не ниже 5 г/л еще 12 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 37 ч при общем выходе полимера 64,8% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 48.30; 3-гидроксивалерат - 16.90; 4-гидроксибутират - 34,80 мол.%. Степень кристалличности образца составила 8%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 236%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 5,36±1,06×103 кл/см2.Example 4. The cultivation of the producer strain is carried out similarly to Example 1. In this case, the medium as the main C-substrate contains instead of glucose oleic acid at a concentration of 10 g / L. After 10 hours from the start of cultivation using a metering pump, the gamma-butyrolactone precursor substrate at a concentration of 2.5 g / l and potassium valerate 1.0 g / l are fed into the culture for 2 hours, continuing cultivation for another 15 hours. General the cultivation time at the first stage is 25 hours. After turning off the nitrogen supply to the culture, cultivation is continued when the culture is fed with oleic acid at its current concentration in the bacterial culture of at least 5 g / l for another 12 hours. The total cultivation time of the producer strain is 37 hours with a total polymer yield 64 , 8% (by weight of dry matter of the cell). The composition of the copolymer: 3-hydroxybutyrate - 48.30; 3-hydroxyvalerate - 16.90; 4-hydroxybutyrate - 34.80 mol.%. The degree of crystallinity of the sample was 8%; temperature properties and weight average molecular weight - without significant changes (table). Elongation at break of a film made from a sample of 236%. The number of fibroblasts adherent and proliferating on a copolymer film of this composition on the 7th day of cultivation was 5.36 ± 1.06 × 10 3 cells / cm 2 .
Пример 5. Культивирование штамма-продуцента проводят аналогично Примеру 4. Через 10 ч от начала культивирования с помощью насоса-дозатора в культуру в течение 2 ч подают субстрат-предшественник гамма-бутиролактон в концентрации 2,5 г/л и валерат калия - 1,0 г/л, продолжая культивирование еще 5 ч; после этого вносят вторую добавку бутиролактона в культуру в концентрации 1,5 г/л в течение 1 ч, продолжая культивирование еще 6 ч. Общее время культивирования на первом этапе составляет 21 ч. После отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают при подпитке культуры олеиновой кислотой при текущей концентрации не ниже 5 г/л еще 15 ч. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 36 ч. Общий выход полимера 58,7% (к весу сухого вещества клетки). Состав сополимера: 3-гидроксибутират - 25.30; 3-гидроксивалерат - 12.20; 4-гидроксибутират - 62,50 мол.%. Степень кристалличности образца составила 12%; температура свойства и средневесовая молекулярная масса - без существенных изменений (таблица). Удлинение при разрыве изготовленной из образца пленки 318%. Количество фибробластов, адгезированных и пролиферирующих на сополимерной пленке данного состава на 7-е сутки культивирования, составило 5,45±0,66×103.Example 5. The cultivation of the producer strain is carried out similarly to Example 4. After 10 hours from the start of cultivation, a gamma-butyrolactone precursor substrate at a concentration of 2.5 g / l and
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014154471/10A RU2565815C1 (en) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014154471/10A RU2565815C1 (en) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2565815C1 true RU2565815C1 (en) | 2015-10-20 |
Family
ID=54327373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014154471/10A RU2565815C1 (en) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2565815C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2199587C2 (en) * | 1995-08-21 | 2003-02-27 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Method of isolation of polyhydroxyalkanoate from biomass and polyhydroxyalkanoate prepared by this method |
| RU2201453C1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-03-27 | Бонарцева Гарина Александровна | METHOD OF PREPARING POLY-β-HYDROXYBUTYRATE OF REQUIRED MOLECULAR MASS |
| RU2439143C1 (en) * | 2010-11-15 | 2012-01-10 | Татьяна Григорьевна Волова | Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF POLYHYDROXY ALKANOATES AND PRODUCTION METHOD THEREOF |
-
2014
- 2014-12-30 RU RU2014154471/10A patent/RU2565815C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2199587C2 (en) * | 1995-08-21 | 2003-02-27 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Method of isolation of polyhydroxyalkanoate from biomass and polyhydroxyalkanoate prepared by this method |
| RU2201453C1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-03-27 | Бонарцева Гарина Александровна | METHOD OF PREPARING POLY-β-HYDROXYBUTYRATE OF REQUIRED MOLECULAR MASS |
| RU2439143C1 (en) * | 2010-11-15 | 2012-01-10 | Татьяна Григорьевна Волова | Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF POLYHYDROXY ALKANOATES AND PRODUCTION METHOD THEREOF |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MADDEN L.A. et al. Production and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4-hydroxybutyrate) synthesized by Ralstonia eutropha in fed-batch cultures // Polymer, Vol. 41, 2000, р. 3499-3505. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sanhueza et al. | Polyhydroxyalkanoates as biomaterial for electrospun scaffolds | |
| Kusaka et al. | Properties and biodegradability of ultra-high-molecular-weight poly [(R)-3-hydroxybutyrate] produced by a recombinant Escherichia coli | |
| Kim et al. | Production of poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha | |
| Chanprateep et al. | Biosynthesis and biocompatibility of biodegradable poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) | |
| Bonartsev et al. | Biosynthesis, biodegradation, and application of poly (3-hydroxybutyrate) and its copolymers-natural polyesters produced by diazotrophic bacteria | |
| López-Cuellar et al. | Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) with canola oil as carbon source | |
| CN113801810B (en) | Halomonas strain and application thereof | |
| Lin et al. | Production of bacterial cellulose with various additives in a PCS rotating disk bioreactor and its material property analysis | |
| Shi et al. | Effect of different conditions on the average degree of polymerization of bacterial cellulose produced by Gluconacetobacter intermedius BC-41 | |
| CN110904012B (en) | Bacillus subtilis and application thereof in production of gamma-polyglutamic acid | |
| JPH0465425A (en) | Copolymer and its production | |
| CN101270345A (en) | 1-strain pseudomonas mendocina and uses thereof | |
| RU2439143C1 (en) | Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF POLYHYDROXY ALKANOATES AND PRODUCTION METHOD THEREOF | |
| WO2009156950A2 (en) | Methods for producing medium chain polyhydroxyalkanoates (pha) using vegetable oils as carbon source | |
| TW201920680A (en) | Polyester including 4-hydroxybutyrate units | |
| RU2565815C1 (en) | Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 4-hydroxybutyrate | |
| Millán et al. | Molecular mass of Poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) produced by Azotobacter vinelandii is influenced by the polymer content in the inoculum | |
| CN101508962B (en) | Non-glutamic acid dependent gamma-polyglutamic acid synthesis bacterium and fermentation method | |
| Hsieh et al. | 3D tissue culture and fermentation of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from Burkholderia cepacia D1 | |
| RU2565819C1 (en) | Method of obtaining of copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate | |
| RU2582255C1 (en) | Method of producing microbial copolymers formed by monomers of 3-hydroxybutyric acid and 4-hydroxybutyric acid acids | |
| CN113684612B (en) | Liquid crystal state composite fiber membrane and preparation and application thereof | |
| KR920009509B1 (en) | Method for producing poly-3-hb/3-hv | |
| Chobchuenchom et al. | Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida ATCC47054 using glycerol and sodium octanoate as substrates | |
| RU2782953C1 (en) | Paenibacillus polymyxa strain essutm-2 - producer of exopolysaccharides |