RU2565397C2

RU2565397C2 - Композиции для лечения геморроя и связанных с ним заболеваний

Info

Publication number: RU2565397C2
Application number: RU2012107855/15A
Authority: RU
Inventors: Луиза РИЦЦА; Сальваторе МУНАФО'; Альберто СЕРРАЙНО
Original assignee: Бионап Срл
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2015-10-20
Also published as: WO2011026606A3; EP2473178B1; HK1171677A1; CN102548570B; ITMI20091523A1; US9028883B2; WO2011026606A2; BR112012004714A2; EP2473178A2; ES2443574T3; US20120183627A1; IT1395509B1; RU2012107855A; CN102548570A

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки. Комбинация экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea для одновременного или раздельного применения для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки. Композиция экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки. Применение вышеописанной комбинации в качестве мукозащитного средства для ректальной слизистой оболочки для предотвращения или лечения указанных областей. Вышеуказанные средства эффективны для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым фармацевтическим, нутрицевтическим и диетическим пищевым продуктам и медицинским устройствам для предотвращения или лечения геморроя, его осложнений и связанных с ним заболеваний.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям для перорального применения или местного нанесения, содержащим полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica в сочетании с экстрактами листьев оливы (Olea europaea corticoids) и необязательно с местными анестетиками, сосудосуживающими веществами, вяжущими веществами и/или экстрактами растений, оказывающими антиоксидантное или противовоспалительное воздействие, а также в сочетании с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или других натуральных источников, и их комбинациями, эффективными для предотвращения и лечения геморроя и связанных с ним заболеваний.

Предпосылки изобретения

Геморроидальные узлы представляют собой анатомические сосудистые кавернозные образования в анальном канале, которые появляются во время внутриутробного развития и сохраняются у взрослых и обеспечивают удерживание кишечного содержимого за счет притока и оттока крови, увеличиваясь в объеме (закрывая просвет анального канала) благодаря притоку крови, и уменьшаясь в объеме (открывая просвет анального канала) благодаря оттоку крови.

При геморрое происходит частичное сползание оболочки анального канала: слизистая оболочка прямой кишки сползает вниз, выталкивая наружу внутренние геморроидальные узлы, которые, в свою очередь, выталкивают наружу наружные геморроидальные узлы.

Этиопатогенез геморроя включает наследственные и системные факторы; однако причина его развития в настоящее время неизвестна. Учитывая повторные проявления заболевания у нескольких членов семьи, возможно, что иногда развитие обусловлено генетическими факторами. Запор может усиливать геморрой из-за раздражающего воздействия, которое оказывают на анальный канал твердый кал и затрудненная дефекация.

Во время беременности существенные изменения женского тела провоцируют развитие и усиление геморроя и варикозного расширения вен нижних конечностей: при беременности, в сущности, увеличение массы тела женщины отрицательно влияет на венозный комплекс (при беременности, в сущности, увеличивающаяся в объеме матка давит на брюшную полость, препятствую току крови).

Запор (который может возникать или усиливаться во время беременности) часто является причиной возникновения геморроя во время беременности.

У людей, страдающих от запора, геморрой часто сопровождается трещинами, разрывами и язвами анального канала, которые возникают в конце анального канала в результате затрудненной дефекации, которая может вызывать повреждения ткани в этой области.

Геморрой представляет собой широко распространенное заболевание, поражающее от 1 до 10 миллионов людей как в Северной Америке, так и в Европе (Holzheimer RG, Eur J Med Res, 26 JAN 2004; 9 (1): 18-36, Hemorrhoidectomy: indications and risks). Геморрой, как правило, лечат с применением строгих правил, касающихся диеты и образа жизни, в сочетании с фармакологическими способами лечения. Большинство людей, страдающих от геморроя, способны жить с этим заболеванием благодаря соблюдению строгих правил, касающихся диеты, образа жизни и гигиены, и/или применению местных препаратов, содержащих стероиды (которые оказывают противовоспалительное действие), и местных анестетиков.

При необходимости правила, касающиеся диеты и образа жизни, можно сочетать с фармакологическими способами лечения с применением местных препаратов (кремы, мази, смазки, пенистые вещества и суппозитории), содержащих стероиды, которые воздействуют на боль и отек, и/или местных анестетиков, которые облегчают зуд и боль. Однако эти препараты рекомендуют для применения при краткосрочном лечении, поскольку долгосрочное лечение этими препаратами может вызывать раздражение в области нанесения, особенно в области слизистой оболочки прямой кишки и анального канала.

Если здоровая сбалансированная пища в сочетании с применением подходящего лекарственного средства оказывается неэффективной и патологическое состояние прогрессирует, применяют хирургическое вмешательство (геморроидэктомия, геморроидопексия или эктомия ректального пролапса), но это может вызывать послеоперационные осложнения, а также приводить к появлению кровотечений, трещин, фистул, абсцессов, перианальных инфекций, к задержанию мочи и недержанию мочи или кала.

С учетом широкого распространения геморроя, особенно у беременных женщин и у женщин в послеродовом периоде, и с учетом частого возникновения его осложнений и связанных с ним заболеваний, в настоящее время актуален поиск надежного и эффективного способа предотвращения и лечения таких заболеваний, которые, в то же время, позволяли бы избегать повторного фармакологического и хирургического лечения, с целью устранения заболевания и родственных симптомов.

Описание изобретения

Описаны новые фармацевтические, лечебно-косметические, нутрицевтические, диетические пищевые продукты и медицинские устройства, которые помогают уменьшать воспалительный компонент геморроя и его осложнения. Эти композиции также имеют мукопротективный эффект и, таким образом, могут защищать слизистую оболочку анального канала и прямой кишки от раздражающего воздействия веществ, которые могут присутствовать в фекалиях и вызывать боль на острой стадии заболевания, повышая вероятность рецидива.

Эти композиции содержат полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica в сочетании с экстрактом листьев Olea europaea, который оказывает антиоксидантное и/или противовоспалительное воздействие, и необязательно в сочетании с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или других натуральных источников и их комбинациями, эффективными для предотвращения и лечения геморроя и связанных с ним заболеваний.

В описании настоящего изобретения термин "медицинское устройство" относится к "активному медицинскому устройству" (класс I) согласно классификации по Директиве 93/42/EEC Annex IX.

Opuntia ficus indica (мексиканский кактус) представляет собой растение семейства Cactaceae, происходящее из Мексики и юго-запада Соединенных Штатов, но широко распространенное даже среди самосевной средиземноморской растительности.

Фрукты и молодые кладодии (мягкие) с древних времен применяют в питании и получении алкогольных напитков.

В традиционной медицине растение применяют многими способами: фрукты считали вяжущим средством; благодаря высокому содержанию витамина С их применяли в питании моряков для предотвращения цинги; молодые кладодии применяют в горячих компрессах - нагревая их в печи - в качестве смягчающего средства; мякоть кладодиев при лечении ран и трещин оказывает сильное противовоспалительное, восстанавливающее эпителий и заживляющее воздействие: это традиционное сицилийское лекарственное средство, которое по традиции применяют и в настоящее время; отвар цветков оказывает диуретическое воздействие.

В последнее время обнаружили, что: 1) фрукты Opuntia ficus indica оказывают антиоксидантное воздействие (Tesoriere и al., Supplementation with cactus pear (Opuntia ficus-indica) fruit decreases oxidative stress in healthy humans: a comparative study with vitamin C, Am J Clin Nutr. 2004 Aug; 80(2): 391-395); 2) экстракт Opuntia ficus indica эффективен в лечении похмелья (Wiese J и al., Effect of Opuntia ficus indica on symptoms of alcohol hangover, Arch Intern Med. 2004 Jun 28; 164(12): 1334- 1340); 3) высокая концентрация полисахаридной фракции в кладодиях Opuntia, в основном составленная полимерами галактозы, арабинозы и других сахаров, подавляет лигандные свойства жиров и сахаров (делая невозможным их всасывание), что хорошо влияет на гликолипидный метаболизм и метаболический синдром; 4) показано, что растительная слизь и пектины кладодиев Opuntia ficus indica имеют гастропротективные свойства в экспериментальной модели на животных (Vazquez-Ramirez R. и al., Reversing gastric mucosal alterations during ethanol-induced chronic gastritis in rats by oral administration of Opuntia ficus indica mucilage, World J. Gastroenterol. 2006 Jul 21; 12(27): 4318-4324).

Trombetta et al. (Trombetta D. and al., Effects of polysaccharides from Opuntia ficus indica (L.) cladodes on the healing of dermal wounds in the rat, Phytomedicine, 13 (2006) 352-358) показали, что полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica оказывают заживляющее воздействие на кожу, воздействуя на внеклеточный матрикс и слои ламинина.

Неожиданно было обнаружено, что полисахариды, выделенные из кладодиев Opuntia ficus indica, оказывают противовоспалительное действие совместно с экстрактом листьев Olea europaea и что этот эффект можно усиливать посредством добавления экстрактов бутонов Capparis spinosa, антоционазидов из красных апельсинов, черного риса или других натуральных источников, причем экстракты Opuntia ficus и Olea europaea можно эффективно применять для предотвращения и лечения геморроя и связанных с ним заболеваний.

Согласно варианту осуществления изобретения, экстракты Opuntia ficus и Olea europaea предоставляют в форме комбинированного препарата для одновременного или раздельного применения в предотвращении и лечении геморроя, его осложнений и связанных с ним заболеваний, и особенно для применения в мукопротекции слизистой оболочки анального канала и прямой кишки для предотвращения или лечения их воспаления.

По настоящему изобретению полисахариды из кладодиев Opuntia ficus indica могут быть представлены в форме растительной слизи, которую получают посредством отжима или обработки водой при комнатной температуре. Альтернативно, после отжима сок кладодиев центрифугируют, и супернатант подвергают ультрафильтрации с получением водного раствора, обогащенного фракцией полисахаридов MW>10⁴ Да, который можно концентрировать с последующим высушиванием. Содержание полисахаридов в экстракте кладодиев Opuntia ficus indica варьирует от 1 до 70%.

Листья Olea europaea можно подвергать экстракции с применением водных или водно-спиртовых растворителей (10-80% этанол) при комнатной температуре или при 60-70°C. Водно-спиртовую экстракцию можно повторять для получения более высоких концентраций биофенолов. По завершении экстракции водный растворитель удаляют в вакууме при 40°C.

Кроме того, высокую концентрацию биофенолов можно получать посредством нанесения сухого экстракта на смолы, предпочтительно стироловые смолы, и элюирования их с применением раствора этанол:вода 50:50 (об./об.).

Экстракты листьев Olea europaea содержат фенолы (тирозол, гидрокситирозол и их производные), коричные кислоты, флавоноиды (такие как апигенин, лютеолин и их глюкозидные производные, рутин, кверцетин), лигнаны, секоридоиды (такие как олеурозид, олеуропеин и их производные, эленолевая кислота) и характеризуются определенным составом полифенолов: флавоноиды (апигенин, лютеолин и их производные) 2-40% (масс./масс.), олеуропеин 0,5-10% (масс./масс.) и гидрокситирозол и производные 1-30% (масс./масс.).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим, лечебно-косметическим, нутрицевтическим, диетическим композициям и медицинским устройствам для перорального введения, местного или ректального нанесения, содержащим полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica в комбинации с экстрактом листьев Olea europaea, который оказывает антиоксидантное и/или противовоспалительное воздействие, и необязательно в сочетании с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или других натуральных источников и их комбинациями для предотвращения и лечения геморроя и связанных с ним заболеваний.

По настоящему изобретению, термины "комбинация" и "комбинированный препарат" применяют для фиксированных и терапевтических комбинаций рассматриваемых экстрактов или активных веществ. В первом случае (фиксированная комбинация) экстракты или активные вещества включены в одну композицию вместе с носителями, эксципиентами или другими ингредиентами, пригодными для предложенных способов применения; во втором случае (терапевтическая комбинация) активные ингредиенты можно вводить или наносить в составе раздельных композиций, а также посредством различных способов введения для получения комбинированного терапевтического эффекта.

Синергическое действие, обусловленное комбинированием рассматриваемых активных веществ или экстрактов, позволяет эффективно уменьшать воспалительный компонент геморроя, и благодаря тому, что рассматриваемые композиции также оказывают мукопротективное воздействие, они одновременно могут защищать слизистую оболочку прямой кишки, предоставляя быстрое избавление от симптомов с высокой степенью безопасности, что является очень важным фактором в случае повторного лечения, в основном для лечения способом местного применения, и, в частности, для беременных женщин или женщин в послеродовом периоде, а также для пожилых пациентов.

Это позволяет создать эффективный и безопасный способ направленной терапии, подходящий для предотвращения или лечения геморроя и его осложнений, а также анальных трещин даже в комбинации с другими фармакологическими или хирургическими способами лечения указанных заболеваний.

Целью изобретения, таким образом, является предоставление фармацевтических, лечебно-косметических, нутрицевтических, диетических пероральных или местных (ректальных) композиций и медицинских устройств, содержащих полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica в фиксированной или терапевтической комбинации с экстрактом листьев Olea europaea и необязательно в сочетании с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или другими натуральными источниками и их комбинациями для предотвращения и лечения геморроя, его осложнений и связанных с ним заболеваний (например, анальных трещин), для предотвращения рецидивов указанного заболевания и защиты слизистой оболочки прямой кишки от раздражающего воздействия некоторых пищевых компонентов, которые могут присутствовать в фекалиях.

Описание чертежей

Дальнейшие характеристики и преимущества настоящего изобретения будут более наглядны благодаря приведенному ниже описанию нескольких вариантов осуществления, приведенных в качестве неограничивающих примеров со ссылками на фигуры, где, согласно предоставленным композициям:

- на фиг.1 представлена схема модели мукоадгезии in vitro;

- на фиг.2 представлено сравнение процентов мукоадгезии (проценты ингибирования связывания лектина после обработки) экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и гиалуроновой кислоты на модели мукоадгезии in vitro на эпителиальных клетках слизистой оболочки прямой кишки;

- на фиг.3 представлены проценты ингибирования маркера воспаления ICAM-1, определенные для полисахаридов из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстрактов листьев Olea europaea, на клетках Caco2, обработанных противовоспалительными веществами;

- на фиг.4 представлены проценты ингибирования маркера воспаления IL-8, определенные для полисахаридов из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстрактов листьев Olea europaea, на клетках Caco2, обработанных противовоспалительными веществами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим, лечебно-косметическим, нутрицевтическим, диетическим пищевым продуктам и медицинским устройствам для перорального введения или местного нанесения или интраректального нанесения для лечения геморроя и связанных с ним заболеваний (а также анальных трещин) и для предотвращения рецидивов определенных патологических состояний, которые включают полисахариды, выделенные из кладодиев Opuntia ficus indica, необязательно в сочетании с мальтодекстринами в соотношении до 50% (масс./масс.), в фиксированной или терапевтической комбинации с экстрактом листьев Olea europaea, оказывающим антиоксидантое и противовоспалительное воздействие, и необязательно в сочетании с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или другими натуральными источниками и их комбинациями для предотвращения и лечения указанных заболеваний.

Активные вещества из экстракта листьев Olea europaea, пригодные для предоставленных композиций, могут включать в качестве неограничивающих примеров: фенолы (такие как тирозол, гидрокситирозол и их производные), коричные кислоты, флавоноиды (такие как апигенин, лютеолин и их глюкозидные производные, рутин, кверцетин), лигнаны, секоридоиды (такие как олеурозид, олеуропеин и их производные, эленолевая кислота).

Предоставленные композиции могут быть жидкими, твердыми или полужидкими, и их можно вводить per os (например, пероральные растворы, пероральные суспензии, пероральные эмульсии, таблетки, порошки и таблетки для получения пероральных растворов, суспензий или эмульсий) или применять посредством местного нанесения (например, кремы, мази, пены, суппозитории, гель, спрей).

Эти композиции могут, кроме того, включать консерванты, ионогенные и неионогенные буферные вещества и добавки, которые традиционно применяют для получения пероральных композиций или композиций для местного нанесения.

Заявленные композиции могут, кроме того, содержать другие натуральные компоненты, пригодные для лечения указанных патологических состояний, такие как местные анестетики и сосудосуживающие вещества (например, флавоноиды из экстрактов Aesculus hippocastanum, которые оказывают противовоспалительное и сосудосуживающее действие, и эсцин, активное вещество из Aesculus hippocastanum, который оказывает вазопротекторное, противоотечное и антиоксидантное действие и помогает стабилизировать сопротивление и проницаемость сосудов и который в настоящее время применяют в препаратах местного применения и препаратах, оказывающих системное действие; экстракт Ruscus aculeatus, богатый веществами, сходными с содержащимися в Aesculus hippocastanum, которые оказывают венотоническое, сосудосуживающее и противовоспалительное действие, показанное в ряде клинических исследований, и экстракты полифенолов и флавоноидов из Cupressus, которые оказывают противовоспалительное и сосудосуживающее действие). Эти вещества редко имеют нежелательные эффекты, в отличие от традиционных флеботоников (основным противопоказанием для препаратов, содержащих кортизон, является, помимо беременности, кровоточащий геморрой, особенно с сочащейся кровью: в этом случае кортизон может мешать заживлению и, таким образом, желательно применять препараты без кортизона).

Самый распространенный растворитель для жидких композиций, суспензий или эмульсий представляет собой воду или водный раствор, содержащий компоненты, пригодные для перорального или местного применения.

Композиции для местного применения могут содержать поверхностно-активные вещества (например, глицерилмоностеарат), жирные вещества (в качестве основы суппозиториев), основы для мазей (например, стеариновая кислота, стеариловый спирт или ланолин), суспендирующие средства (например, тальк, кремниев ангидрид), антибактериальные консерванты (например, метил п-гидроксибензоат, пропил п-гидроксибензоат или бутил п-гидроксибензоат), смазочные средства (например, стеарат кальция стеарат магния, стеарат алюминия, стеариловая кислота, стеариновая кислота, цетиловый спирт, пальмитиновая кислота, крахмал или PEG) и вещества, оказывающие умеренное антисептическое действие (например, экстракт лаванды или экстракт розмарина) и их комбинации.

Полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica

Химическую структуру и состав растительной слизи из кладодиев Opuntia ficus indica анализировали несколько исследовательских групп (D. McGarvie, H. Parolis, Methylation analysis of the mucilage of Opuntia ficus indic. Carbohydrate Research, (1981) 88: 305-314; M. S. Karawya et al. Mucilages and Pectines of Opuntia, Tamarindus и Cydonia. Planta Medica (1980) Supplement:68-75; M. E. Malainine et al. Structure and morphology of cladodes and spines of Opuntia ficus indica. Cellilose extraction and characterisation. Carbohydrate polymers (2003) 51:77-83).

Полагают, что растительная слизь состоит из 1,4-α-D-галактопиранозилуроновой кислоты и остатков 1,2-β-L-рамнопиранозила, к которым присоединены короткие цепи остатков 1,6-β-D-галактопиранозила в положении 4 относительно всех остатков рамнопиранозила. Большая часть остатков галактозила разветвлена на O-3, или на O-4, которые в основном несут остатки арабинофуранозила и ксилопиранозила.

(D. McGarvie, H. Parolis, Methylation analysis of the mucilage of Opuntia ficus indic. Carbohydrate Research, (1981) 88: 305-314).

Растительную слизь из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica выделяют простым отжимом (D. Trombetta et al. Effect of polysacharides from Opuntia ficus-indica (L.) cladodes on the healing of dermal wounds in the rat. Phytomedicine (2006) 13: 352-358) или посредством обработки водой (R. Vazquez-Ramirez et al. Reversing gastric mucosal alterations during ethanol-induced chronic gastritis in rats by oral administration of Opuntia ficus-indica mucilage. World J Gastroenterol (2006) 12(27):4318-4324).

Способ экстракции из кладодиев Opuntia ficus indica

Кладодии Opuntia ficus indica отмывают и нарезают на куски размером приблизительно 10 см², а затем выжимают посредством гидропрессования.

Сок, полученный посредством отжима кладодиев, центрифугируют в течение 15 мин при 5000 g, и супернатант подвергают ультрафильтрации. Таким образом, получают водный раствор, обогащенный фракцией полисахаридов MW>10⁴ Да. Этот водный раствор затем концентрируют при низком давлении и температуре 35-40°C, а затем высушивают посредством сушки распылением или лиофилизации.

Анализ полисахаридной фракции из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica подтверждает наличие арабинозы, рамнозы, ксилозы, галактозы и галактуроновой кислоты (D. McGarvie, H. Parolis, Methylation analysis of the mucilage of Opuntia ficus indic. Carbohydrate Research, (1981) 88: 305-314). ЯМР (Ядерный магнитный резонанс) позволяет выяснить типичный состав полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica. Содержание полисахаридов в экстракте кладодиев Opuntia ficus indica составляет от 1 до 70% масс./масс.

Экстракт листьев Olea europaea

Экстракт листьев Olea europaea имеет характерный состав биофенолов, включая простые фенолы (тирозол, гидрокситирозол и их производные), флавоноиды (апигенин, лютеолин и их глюкозидные производные) и секоридоиды (олеуропеин и его производные).

Биофенолы выделяют из листьев оливы с применением водных или водно-спиртовых растворителей, содержащих этанол от 10 до 80% об./об. (Lee O.H. et al. Assessment of phenolics-enriched extract and fractions of olive leaf and their antioxidant activities Bioresour Technol (2009) Epub ahead of print; Mylonaki S. et al. Optimisation of the extraction of olive (olea europaea) leaf phenolics using water\ethanol-based solvent systems and response surface methodology. Anal Bioanal Chem. (2008) 392(5):977-85). Выделение, как правило, проводят при комнатной температуре, чтобы избежать нарушения структуры или разложения активных веществ, но в некоторых случаях выделение можно проводить при температуре до 60-70°C. Выделение биофенолов из цитоплазмы растения можно проводить даже с применением микроволн (Japon-Lujan R, Luque de Castro MD. Small branches of olive tree: a source of biophenols complementary to olive leaf. J Agric Food Chem. (2007) 30;55(11):4584-8), ультразвука (Vassiliki T Papoti, Maria Z. Tsimidou. Impact of sampling parameters on the radical scavening potential of olive (Olea europaea L.) leaf. J Agric Food Chem 2009, 57, 3470-3477), или c применением перегретой жидкости (Japon-Lujan R, Luque de Castro MD. Superheated liquid extraction of oleuropein and related biophenols from olive leaf. J Chromatogr A. (2006) 1136(2): 185-91), сильно сокращая время контактирования растворителя с цитоплазмой растений (от 3 часов до 10 минут).

Выделение биофенолов из листьев Olea europaea

Листья Olea europaea сушат, нарезают и затем обрабатывают раствором этанол/вода 50:50 (об./об.) при комнатной температуре в течение 12 часов. Выделение проводят с применением соотношения 1:5 (г/мл) лекарственное средство:растворитель. По завершении выделения удаляют экстракт, и листья подвергают второму циклу водно-спиртовой экстракции при тех же условиях. Затем экстракты смешивают, и растворитель удаляют посредством выпаривания в вакууме при 40°C. На последнем этапе для повышения концентрации биофенолов экстракт адсорбируют на стироловых смолах и биофенолах, а затем элюируют с применением раствора этанол/вода 50:50 (об./об.).

Полученный экстракт содержит: флавоноиды (апигенин, лютеолин и их производные) 2-40%, олеуропеин 0,5-10% и гидрокситирозол и их производные 1-30%.

Способы получения предоставленных фармацевтических или нутрицевтических композиций известны в данной области. Полисахариды, выделенные из Opuntia ficus indica, могут составлять от 0,5 до 50% от общей композиции, в то время как другие активные вещества могут составлять от 1 до 30% (масс./масс. или масс./об.).

Каждое из предоставленных веществ применяют в области диетологии, так что все они безопасны даже для пациентов с высокой чувствительностью, а также для пожилых людей, детей или беременных.

Предоставленные композиции могут содержать вещества из природных источников, оказывающие вяжущее действие (а также экстракт Hamamelis virginiana, оксид цинка или каламин), сосудосуживающие вещества (например, фенилэфрин HCl, эфедрина сульфат, эпинефрин и эпинефрин HCl), стероидные противовоспалительные препараты (например, гидрокортизон), фитостероиды (например, флавиолигнан, энтеролигнаны, куместрол, эквол, бета-ситостерин, гинзеноиды), местные анестетики (например, бензокаин 5-20%, бензиловый спирт 1-4%, дибукаин 0,25-1%, лидокаин 0,5-5%, прамоксин приблизительно 1%, тетракаин 0,5-1%) и их комбинации. Предпочтительно указанные компоненты применяют в водорастворимой форме (например, сложные эфиры или соли).

Настоящее изобретение включает применение описанных композиций для лечения геморроя и предотвращения его рецидивов посредством введения индивидууму терапевтически эффективного количества композиций, как определено выше, необязательно в комбинации с экстрактами бутонов Capparis spinosa, антоционазидами из красных апельсинов, черного риса или других натуральных источников, и их комбинациями, для предотвращения и лечения указанных заболеваний.

Неограничивающие примеры композиций по изобретению приведены в таблицах ниже.

Пример 1: Композиции

1. Твердые капсулы:

Компоненты	Мг/капсула
Экстракт кладодиев Opuntia ficus indica	200-400 мг
Экстракт листьев Olea europaea	200-400 мг
Лактоза	Остаток капсулы

2. Гели:

Компоненты	% об./об.
Натролзол (гидроксиэтилцеллюлоза)	1,75
Экстракт кладодиев Opuntia ficus indica	0,5-10
Экстракт листьев Olea europaea	0,5-10
Пропиленгликоль	10,00
Цитрат натрия	0,30

Метабисульфит натрия	0,50
Диэдетат натрия	0,10
Метил п-гидроксибензоат	0,20
Пропил п-гидроксибензоат	0,05
Дистиллированная вода	До 100 г

3. Суппозитории:

Компоненты	Мг/суппозиторий
Экстракт кладодиев Opuntia ficus indica	200-400 мг
Экстракт листьев Olea europaea	200-400 мг
BHA	0,15 мг
BHT	0,15 мг
Витепсол S 55	Остаток

4. Мази:

Компоненты	% об./об.
Экстракт кладодиев Opuntia ficus indica	100-200 мг
Экстракт листьев Olea europaea	100-200 мг
Макрогол 400	55 г
Макрогол 4000	39,9 г
Дистиллированная вода	До 100 г

Пример 2: Определение мукоадгезии полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica in vitro

Для оценки мукоадгезивных свойств полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica применяли анализ мукоадгезии in vitro, описанный Patel (Patel D. e altri, An in vitro mucosal model predictive of bioadhesive agents in oral cavity. J Control Release, 1999, 61 (1-2): 175-183) на суспендированных клетках кишечного эпителия Caco2. В этом тесте мукоадгезию (способность к адгезии рассматриваемых веществ в отношении связывания с клетками слизистой оболочки) определяют как функцию ингибирования связывания лектин-гликопротеин мембраны, которое определяют посредством скрытия клеточной поверхности в результате воздействия мукоадгезивных веществ.

Материалы и способы

Обработка клеток слизистой оболочки биотинилированным лектином и стрептавидин-пероксидазой придает образцу желтую окраску; предварительная обработка клеток мукоадгезивным веществом (30°C, за 15 минут до обработки лектином) скрывает участок связывания лектина, уменьшая конечную интенсивность желтой окраски.

Лектин представляет собой белок, содержащийся в некоторых растениях Leguminosae (Canavalia ensiformis) и имеющий высокую способность связывать глюкозидные и маннозидные остатки мембранных гликопротеинов; биотин (витамин H) связывается с лектином в результате его связывания с стрептавидин-пероксидазой, которую добавляют к клеточной суспензии с получением комплекса белок-глюкоза-лектин-биотин-стрептавидин-пероксидаза.

При добавлении o-фенилендиамин дигидрохлорида (o-pd) и пероксида водорода к клеточной суспензии o-pd окисляется комплексом белок-глюкоза-лектин-биотин-стрептавидин-пероксидаза до 2,3-диаминофеназина, и образец становится желтым (фиг.2).

Затем через 1 мин реакцию останавливают посредством добавления H₂SO₄ 1 M. Интенсивность окраски оценивают на спектрофлуориметре, причем она пропорциональна связыванию лектина и гликозидных остатков на клеточной мембране.

Клетки Caco2 хранили в среде Minimun Essential Medium (MEM) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C и 95:5% воздух:CO₂. Среду меняли каждые 2-3 суток. За 24 часа до обработки клетки трипсинизировали, подсчитывали с применением гемацитометра, центрифугировали при 1500 об./мин./5 мин и ресуспендировали в 2 мл 0,05 M TBS (забуференный физиологический раствор Tris) (pH 4).

Полисахариды из кладодиев Opuntia ficus indica и гиалуроновую кислоту (применяемую в качестве эталонного вещества из-за ее мукоадгезивных способностей) растворяли в 0,9% растворе NaCl при 0,5% масс./об., и эти растворы затем применяли для предварительной обработки для теста с клетками Caco2. Результаты выражали в процентах связывания исследуемого вещества с клетками слизистой оболочки, обратно пропорциональных процентам уменьшения окраски образца по сравнению с контролем.

Весь эксперимент повторяли 5 раз. Статистический анализ результатов проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением апостериорного теста Бонферрони.

Результаты

Как показано на фиг.3, результаты, полученные в анализе мукоадгезии in vitro на суспендированных клетках Caco2, показывают, что процент мукоадгезии полисахаридов Opuntia ficus indica составляет 48%, что значительно выше, чем процент мукоадгезии, наблюдаемый для натрия гиалуроната (29%).

Выводы

Результаты анализа мукоадгезии in vitro показывают, что полисахариды из кладодиев Opuntia ficus indica проявляют сильные мукоадгезивные свойства на клетках Caco2. Этот эффект обеспечивает, после перорального введения или местного ректального нанесения, образование слоя, способного защищать слизистую оболочку кишечника и прямой кишки от раздражающего воздействия некоторых веществ, которые поступают в организм с пищей и могут присутствовать в фекалиях. Этот эффект полезен для сокращения симптомов геморроя и предотвращения рецидивов заболевания.

Пример 3: Оценка противовоспалительной активности полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea in vitro.

Для оценки противовоспалительной активности полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea проводили тест in vitro на клетках Caco2.

Клетки кишечника Caco2 - широко применяемые для изучения функционирования желудочно-кишечного тракта (Sambuy Y. et al., The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics, Cell Biol Toxicol. 2005; 21(1): 1-26; Navarro-Peran E. e altri, The anti-inflammatory and anti-cancer properties of epigallocatechin-3-gallate are mediated by folate cycle disruption, adenosine release and NF-kappaB suppression, Inflamm Res. 2008 Oct 2) - выбраны благодаря их морфологическим и биохимическим свойствам, характерным для энтероцитов.

Клетки Caco2 стимулировали провоспалительными веществами. Затем определяли способность полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea уменьшать воспаление в кишечном эпителии в отношении выработки маркеров воспаления - молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 и интерлейкина-8 (IL-8). ICAM-1 представляет собой важный фактор, вовлеченный в удерживание T-клеток в воспаленном эпителии, который предоставляет важные костимуляторные сигналы для CD4 T и CD8 (Ramakers JD e altri, Arachidonic acid but not eicosapentaenoic acid (EPA) and oleic acid activates NF-kappaB and elevates ICAM-1 expression in Caco-2 cells. Lipids 2007; 42(8):687-98).

IL-8 продуцируют моноциты, фибробласты, эндотелиальные и эпителиальные клетки во время воспалительных нарушений, и этот фактор очень важен для рекрутинга T-лимфоцитов и нейтрофилов (Vavricka SR e altri, hPepT1 transports muramyl dipeptide, activating NF-kappaB and stimulating IL-8 secretion in human colonic Caco2/bbe cells, Gastroenterology 2004; 127(5): 1401-9).

Воспаление кишечного эпителия индуцировали интерлейкином-1β (IL-1β) и интерфероном-γ (IFN-γ), которые представляют собой одни из самых сильных про-воспалительных факторов (Garat C. e altri, Intercellular IL-1Ra type 1 inhibits IL-l-induced IL-6 and IL-8 production in Caco-2 intestinal epithelial cells through inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB pathways. Cytokine. 2003 Jul; 23(1-2):31-40).

Материалы и способы

Полисахариды из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea разбавляли до 100 мг/мл. Этот раствор затем разбавляли для обработки клеточных культур.

Клетки хранили в среде Minimun Essential Medium (MEM) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C и 95:5% воздух:CO₂. Среду меняли каждые 2-3 суток. За 24 часа до обработки клетки трипсинизировали, подсчитывали с применением гемацитометра, а затем высевали в 96-луночные планшеты (для проведения теста ELISA) и 100 мм чашки Петри (для проведения Вестерн-блоттинга).

Затем клетки обрабатывали смесью IL-1β (10 нг/мл) и IFN-γ (200 ед./мл) и полисахаридами из кладодиев Opuntia ficus indica и/или экстрактом листьев Olea europaea в количестве 200 мкг/мл в течение 48 часов.

Уровни экспрессии ICAM-1 определяли посредством Вестерн-блоттинга, а уровни экспрессии IL-8 определяли посредством теста ELISA. Результаты выражали в процентах ингибирования маркеров воспаления в клетках, обработанных полисахаридами из кладодиев Opuntia ficus indica и/или экстрактом листьев Olea europaea, по сравнению с клетками, обработанными IL-1β и IFN-γ.

- Вестерн-блоттинг

Белки выделяли из клеток через 48 часов после обработки, помещали на 4-12% полиакриламидный гель, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с моноклональными антителами к ICAM-1. Экспрессию белка количественно определяли посредством денитометрического анализа авторадиограмм, и полученные значения выражали в условных денситометрических единицах, соответствующих интенсивности сигнала.

Результаты нормализировали с уровнями α-тубулина как референтного белка для контроля.

- ELISA

IL-8 измеряли в свободном от клеток супернатанте, собранном через 48 часов после обработки, с применением набора для теста ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), который позволяет специфически распознавать белок посредством связывания антиген-антитело. Комплекс распознается и связывается поликлональным антителом, меченным ферментом. Посредством определения активности фермента после добавления субстрата возможно получить оценку, прямо пропорциональную количеству тестируемого антигена. Значения представлены в пг/мл ± SEM.

Результаты

Результаты, полученные при проведении Вестерн-блоттинга на клетках Caco2, показали, что полисахариды из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea отражают соответствующие проценты ингибирования, оставляющие 27% и 33% (фиг.3 и 4).

Показано, что способность ингибировать экспрессию IL-8 в той же клеточной культуре, определяемую посредством ELISA, составляет 26% для полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica и 24% для экстракта листьев Olea europaea (фиг.4).

Кроме того, в обоих экспериментах при обработке клеток Caco2 смесью полисахаридов из кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea наблюдается синергическое действие на процент ингибирования ICAM-1 (76%) и IL-8 (70%, фиг.3 и 4).

Выводы

Тест in vitro показывает, что экстракт листьев Olea europaea оказывает неожиданное синергическое действие в отношении противовоспалительного действия полисахаридов из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica, в частности, синергическое действие в отношении снижения экспрессии маркеров воспаления ICAM-1 и IL-8, индуцированного в клетках Caco2 посредством про-воспалительных веществ.

Экспериментальные данные показывают, что полисахариды из экстракта кладодиев Opuntia ficus indica оказывают мукоадгезивное и противовоспалительное действие. Противовоспалительное действие неожиданно усиливается синергетически экстрактом листьев Olea europaea.

Оба этих эффекта можно применять для предотвращения и лечения геморроя, его осложнений и связанных с ним заболеваний.

Claims

1. Комбинация экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea для одновременного или раздельного применения для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки, где
i) экстракт кладодиев Opuntia ficus indica получен отжимом кладодиев и содержит от 1 до 70% масс./масс. полисахаридов в форме растительной слизи; и экстракт Olea europaea получен путем экстракции листьев раствором этанол/вода 50:50 об./об., который содержит флавоноиды 2-40% масс./масс., олеуропеин 0,5-10% масс./масс. и гидрокситиразол 1-30% масс./масс., и
ii) содержание каждого из экстрактов составляет от 0,5 до 10% масс./масс.

2. Комбинация по п. 1, где указанные полисахариды выделяют посредством способа, включающего отжим кладодиев с последующим центрифугированием сока и ультрафильтрацией супернатанта с получением водного раствора, обогащенного фракцией полисахаридов MW >10⁴ Да.

3. Комбинация по п. 1, где указанный экстракт листьев Olea europaea получен способом, включающим помещение высушенного экстракта на смолу и элюирование раствором этанол:вода 50:50 об./об.

4. Комбинация по п. 1, где указанный способ проводят при комнатной температуре или при нагревании до 60-70°C, необязательно повторении процесса экстракции и затем удалении растворителя в вакууме при 40°C.

5. Композиция экстракта кладодиев Opuntia ficus indica и экстракта листьев Olea europaea для предотвращения и лечения воспаления ректальной слизистой оболочки, где
i) экстракт кладодиев Opuntia ficus indica получен отжимом кладодиев и содержит от 1 до 70% масс./масс. полисахаридов в форме растительной слизи; и экстракт Olea europaea получен путем экстракции листьев раствором этанол/вода 50:50 об./об., который содержит флавоноиды 2-40% масс./масс., олеуропеин 0,5-10% масс./масс. и гидрокситиразол 1-30% масс./масс., и
ii) содержание каждого из экстрактов составляет от 0,5 до 10% масс./масс.

6. Композиция по п. 5, дополнительно содержащая экстракты бутонов Capparis spinosa, антоционазиды из красных апельсинов или черного риса и их комбинации.

7. Композиция по п. 5, дополнительно содержащая один или несколько ингредиентов, выбранных из группы, включающей местные анестетики, противовоспалительные вещества, предпочтительно выбранные из экстрактов Aesculus hippocastanum, Ruscus aculeatus или Cupressus, фитостероиды, вещества с вяжущим действием, предпочтительно выбранные из экстракта Hamamelis virginiana, оксида цинка и каламина; сосудосуживающие вещества, предпочтительно выбранные из фенилефрина HCl, эфедрина сульфата, эпинефрина и эпинефрина HCl; стероидные противовоспалительные вещества и их комбинации.

8. Композиция по п. 5, подходящая для перорального, интраректального или местного применения.

9. Композиция по п. 8, представленная в форме перорального раствора, пероральной суспензии, пероральной эмульсии, таблеток, капсул, порошков и контейнеров для получения пероральных суспензий или пероральных эмульсий, кремов, мазей, пен, гелей, препаратов в форме спрея и суппозиториев.

10. Композиция по любому из пп. 5-9, выбранная из:
i) капсулы, имеющей следующий состав:

ii) местного/интраректального геля, имеющего следующий состав:

iii) суппозитория, имеющего следующий состав:

11. Применение комбинации по п. 1 в качестве мукозащитного средства для ректальной слизистой оболочки для предотвращения или лечения указанных областей.