RU2552170C2 - Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein - Google Patents
Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein Download PDFInfo
- Publication number
- RU2552170C2 RU2552170C2 RU2013122048/10A RU2013122048A RU2552170C2 RU 2552170 C2 RU2552170 C2 RU 2552170C2 RU 2013122048/10 A RU2013122048/10 A RU 2013122048/10A RU 2013122048 A RU2013122048 A RU 2013122048A RU 2552170 C2 RU2552170 C2 RU 2552170C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- cells
- expression
- recombinant protein
- chinese hamster
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of biologically active substances (BAS) by genetic engineering methods, more specifically, to methods for producing recombinant proteins in cultured mammalian cells.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Рекомбинантные белки, полученные в культивируемых клетках млекопитающих, используются для производства не менее 50% лекарственных средств биологического происхождения, существенной части вакцин, препаратов для ветеринарии и реагентов для клинической диагностики. Наибольшее распространение среди линий клеток млекопитающих, используемых в биофармацевтическом производстве, получила линия клеток яичника китайского хомячка (Cricetulus griseus) СНО (Chinese hamster ovary cells) и ее производные. Очевидным ограничением продуктивности клетки-продуцента является уровень мРНК целевого гена. Традиционно для создания высокопродуктивных промышленно-пригодных клеток-продуцентов используют амплификацию в геноме клеток интегрированных генетических конструкций, кодирующих открытые рамки считывания целевых белков. При использовании сублиний СНО с инактивированным геном дигидрофолатредуктазы (DHFR), в частности, сублинии CHO-DG44, не содержащей активных аллелей DHFR и описанной в работах (Uriaub G, Chasm LA. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Jul; 77(7):4216-4220; Derouazi M et al., Genetic characterization of СНО production host DG44 and derivative recombinant cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 24; 340(4):1069-1077), амплификацию введенных в геном клетки генетических конструкций, содержащих открытую рамку считывания DHFR, можно вести путем продолжительного культивирования трансфицированных клеток в присутствии возрастающих концентраций ингибиторов DHFR, в качестве которых обычно используют метотрексат (МТХ).Recombinant proteins obtained in cultured mammalian cells are used to produce at least 50% of drugs of biological origin, a significant part of vaccines, preparations for veterinary medicine and reagents for clinical diagnosis. The most widespread among mammalian cell lines used in biopharmaceutical production is the Chinese hamster ovary cells (CHO) line of Chinese hamster (Cricetulus griseus) CHO (Chinese hamster ovary cells) and its derivatives. An obvious limitation on the productivity of the producer cell is the mRNA level of the target gene. Traditionally, to create highly productive, industrially suitable producer cells, amplification of integrated genetic constructs encoding an open reading frame of target proteins is used in the cell genome. When using CHO sublines with an inactivated dihydrofolate reductase gene (DHFR), in particular, the CHO-DG44 subline not containing active DHFR alleles and described in (Uriaub G, Chasm LA. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Jul; 77 (7): 4216-4220; Derouazi M et al., Genetic characterization of CHO production host DG44 and derivative recombinant cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 24; 340 (4): 1069 -1077), amplification of genetic constructs introduced into the cell genome containing an open reading frame of DHFR can be carried out by continuous cultivation of transfected cells in the presence of with increasing concentrations of DHFR inhibitors, which are usually used methotrexate (MTX).
Для существенной части фармацевтически значимых целевых белков достижение высокой концентрации их мРНК в клетках-продуцентах не приводит к экономически приемлемому уровню секреции зрелых форм целевых белков в культуральную среду либо приводит к секреции смеси корректной формы целевого белка и пассивных примесей - непроцессированных вариантов целевого белка или отдельных цепей гетеродимерных белков. Разделение корректной формы целевого белка и его остальных форм представляет собой сложную техническую проблему и в некоторых случаях технически неосуществимо. Например, избыточный уровень биосинтеза тяжелой цепи иммуноглобулинов G при экспрессии рекомбинантных антител приводит к появлению в культуральной среде димеров тяжелых цепей IgG, которые соочищаются с корректными молекулами IgG при аффинной хроматографии (Gonzalez R., В.A. Andrews, et al. (2002). "Kinetic model of BiP- and PDI-mediated protein folding and assembly." J. Theor. Biol. 214:529-537).For a significant portion of pharmaceutically significant target proteins, achieving a high concentration of their mRNA in producer cells does not lead to an economically acceptable level of secretion of mature forms of the target proteins into the culture medium or leads to secretion of a mixture of the correct form of the target protein and passive impurities - unprocessed variants of the target protein or individual chains heterodimeric proteins. Separation of the correct form of the target protein and its other forms is a complex technical problem and, in some cases, technically impossible. For example, an excessive level of immunoglobulin G heavy chain biosynthesis during expression of recombinant antibodies leads to the appearance of IgG heavy chain dimers in the culture medium, which co-purify with the correct IgG molecules during affinity chromatography (R. Gonzalez, B. A. Andrews, et al. (2002) . "Kinetic model of BiP- and PDI-mediated protein folding and assembly." J. Theor. Biol. 214: 529-537).
При экспрессии гена фактора свертывания крови IX человека в клетках линии СНО не менее 90% секретируемого целевого белка содержит неотделенный пропептид, такие молекулы фактора IX не обладают прокоагуляционной активностью и могут быть отделены от полностью процессированных молекул только при помощи псевдоаффинной хроматографии (Kaufman R.J., L.C. Wasley, B.C. Furie, B. Furie, and C.B. Shoemaker //J Biol Chem. 261(21): p.9622-8). Уровень процессинга пропептида фактора IX может быть увеличен до 70-80% при введении в геном клеток-продуцентов гена сигнальной протеиназы PACE/furin (Wasley L.C., A. Rehemtulla, J.A. Bristol, and R.J. Kaufman //J Biol Chem. 268(12): p.8458-65). Таким образом, обеспечение ко-экспрессии генов "вспомогательных" белков или независимой экспрессии генов цепей гетеромультимерных белков является важной технической задачей при создании клеточных линий-продуцентов.When expressing the human blood coagulation factor IX gene in CHO cells, at least 90% of the secreted target protein contains an unseparated propeptide, such factor IX molecules do not have procoagulation activity and can be separated from fully processed molecules only using pseudo-affinity chromatography (Kaufman RJ, LC Wasley , BC Furie, B. Furie, and CB Shoemaker // J Biol Chem. 261 (21): p. 9622-8). The factor IX propeptide processing level can be increased to 70-80% by introducing the PACE / furin signaling proteinase gene (Wasley LC, A. Rehemtulla, JA Bristol, and RJ Kaufman // J Biol Chem. 268 (12) into the genome of producer cells : p. 8458-65). Thus, the provision of co-expression of genes of "auxiliary" proteins or independent expression of the genes of chains of heteromultimeric proteins is an important technical task in creating cell lines of producers.
Как правило, оптимальные уровни биосинтеза вспомогательных белков должны быть существенно ниже, чем уровни биосинтеза целевого белка. Например, эффективная система биосинтеза протромбина человека в клетках линии СНО требует присутствия в геноме клеток-продуцентов гена гамма-глютамил карбоксилазы человека (GGCX), при этом уровень секреции корректно модифицированного протромбина человека максимален при отношении уровней экспрессии целевого гена и гена GGCX от 10:1 до 100:1 (патент США 7,842,477).As a rule, the optimal levels of biosynthesis of auxiliary proteins should be significantly lower than the levels of biosynthesis of the target protein. For example, an effective human prothrombin biosynthesis system in CHO cells requires the presence of human gamma-glutamyl carboxylase (GGCX) gene producers in the genome, while the level of secretion of correctly modified human prothrombin is maximum at a ratio of expression levels of the target gene and GGCX gene from 10: 1 up to 100: 1 (US patent 7,842,477).
Существуют три общих метода, позволяющих вести одновременную экспрессию нескольких трансгенов в культивируемых клетках - включение нескольких генов в состав одной плазмиды, одновременная трансфекция нескольких плазмид и последовательная трансфекция плазмид, кодирующих целевой белок и вспомогательные белки. Во всех случаях носителями генов могут выступать не только плазмиды, но и рекомбинантные вирусы, псевдовирусные частицы и так далее. При использовании в качестве носителей генетической информации плазмид второй и третий способы требуют использования различных совместимых между собой систем селекции стабильно трансфицированных клеток. Первый метод ко-экспрессии позволяет получать клетки-продуценты максимально быстро, однако относительные уровни экспрессии основного и вспомогательного гена, определяемые активностью их промоторов, будут одинаковыми для всех клонов; изменение отношения уровня экспрессии этих генов потребует модификации плазмиды и повторной трансфекции. При одновременной трансфекции нескольких плазмид и последующей селекции стабильно трансфицированных клеток, несущих в геноме все трансфицированные гены, возможно получение клонов клеток-продуцентов с различными отношениями уровня экспрессии трансфицированных генов в результате выполнения одной процедуры трансфекции, селекции и клонирования, в то же время популяция получаемых клеток-продуцентов будет иметь небольшие размеры из-за низкой вероятности инсерции в геном одной клетки нескольких плазмид. Последовательная трансфекция нескольких плазмид позволяет получать клональные линии-продуценты с практически произвольным отношением уровней экспрессии основного и вспомогательных генов, однако занимает более продолжительное время.There are three general methods that allow the simultaneous expression of several transgenes in cultured cells — the incorporation of several genes into a single plasmid, the simultaneous transfection of several plasmids and the sequential transfection of plasmids encoding the target protein and auxiliary proteins. In all cases, gene carriers can be not only plasmids, but also recombinant viruses, pseudovirus particles, and so on. When using plasmids as carriers of genetic information, the second and third methods require the use of various mutually compatible selection systems of stably transfected cells. The first co-expression method allows producing producer cells as quickly as possible, however, the relative expression levels of the main and auxiliary gene, determined by the activity of their promoters, will be the same for all clones; changing the ratio of the expression level of these genes will require modification of the plasmid and re-transfection. With the simultaneous transfection of several plasmids and the subsequent selection of stably transfected cells carrying all transfected genes in the genome, it is possible to obtain clones of producer cells with different ratios of the expression level of transfected genes as a result of one transfection, selection and cloning procedure, while the population of the resulting cells -producers will be small due to the low probability of insertion of several plasmids into the genome of one cell. Sequential transfection of several plasmids allows the production of clonal producer lines with an almost arbitrary ratio of expression levels of the main and auxiliary genes, however, it takes a longer time.
В случае использования системы селекции клеток-продуцентов, включающей ген дигидрофолатредуктазы, для отбора продуцентов "основного" белка, плазмиды, кодирующие гены "вспомогательных" белков, могут иметь селекционные маркеры устойчивости к действию антибиотиков, либо "амплифицируемые" селекционные маркеры устойчивости к отсутствию незаменимых аминокислот или предшественников нуклеотидов (глутамин-синтазу, аденозин-деаминазу). Поскольку "амплифицируемые" селекционные маркеры предполагают продолжительное культивирование поликлональной популяции трансфицированных клеток в селекционной среде до достижения максимального уровня экспрессии целевого гена, последовательный отбор популяции продуцентов "основного" и "вспомогательного" генов может занимать более 6 месяцев и приводить к исчерпанию пролиферативного потенциала клеток и потере/инактивации копий целевого гена, интегрированного в геном продуцентов при первой трансфекции.If a producer cell selection system, including the dihydrofolate reductase gene, is used to select producers of the “main” protein, plasmids encoding the genes of the “auxiliary” proteins may have selection markers of antibiotic resistance or amplified selection markers of resistance to the absence of essential amino acids or nucleotide precursors (glutamine synthase, adenosine deaminase). Since the “amplifiable” selection markers imply a continuous cultivation of the polyclonal population of transfected cells in the selection medium until the maximum expression level of the target gene is reached, sequential selection of the population of producers of the “main” and “auxiliary” genes can take more than 6 months and lead to the exhaustion of the cell proliferative potential and loss / inactivation of copies of the target gene integrated into the genome of the producers during the first transfection.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание семейства совместимых векторов для получения высокопродуктивных и стабильных систем экспрессии рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих, в частности в клетках СНО или клетках человека HEK-293, а также предоставление линии клеток млекопитающего, трансфицированных векторами данного семейства, - продуцентов рекомбинантных белков, в частности различных ферментов посттрансляционной модификации или определенных цепей гетеромультимерных белков. Указанная линия клеток млекопитающего может быть со-продуцентом двух и более рекомбинантных белков, экспрессирующихся независимо в составе двух и более различных векторов, при этом один из рекомбинантных белков является ферментом посттрансляционной модификации второго рекомбинантного белка, либо указанные разные рекомбинантные белки являются цепями гетеромультимерного рекомбинантного белка. Следующей технической задачей является предоставление способа получения рекомбинантного белка.The technical problem solved by the authors was the creation of a family of compatible vectors to obtain highly productive and stable expression systems of recombinant proteins in cultured mammalian cells, in particular in CHO cells or human HEK-293 cells, as well as the provision of a mammalian cell line transfected with vectors of this family, producers of recombinant proteins, in particular various enzymes of post-translational modification or certain chains of heteromultimeric proteins. The specified mammalian cell line can be a co-producer of two or more recombinant proteins expressed independently in two or more different vectors, while one of the recombinant proteins is an enzyme of post-translational modification of the second recombinant protein, or these different recombinant proteins are chains of a heteromultimeric recombinant protein. The next technical task is to provide a method for producing a recombinant protein.
Так, при использовании векторов одного типа для введения в геном клеток-продуцентов "основного" и "вспомогательных" генов предпочтительными маркерами устойчивости для плазмид, кодирующих "вспомогательные" гены, будут являться гены ферментов, обеспечивающих устойчивость клеток к действию антибиотиков. Такие селекционные маркеры обычно являются взаимно совместимыми, в частности, гены устойчивости к действию антибиотиков G418 (неомицина), зеоцина, гигромицина, не защищают клетки от действия других антибиотиков и не сообщают клеткам преимуществ при селекции на устойчивость к метотрексату. Избирательность ферментов устойчивости к действию антибиотиков G418 (неомицина), зеоцина, гигромицина достаточна высока для последовательной или одновременной трансфекции плазмид, кодирующих эти гены устойчивости и отбора популяций клеток, одновременно экспрессирующих несколько целевых генов (презентация компании ChanTest, http://www.chantest.com/media/cms/pdf/4_Cell_biology_support_for_drug_discovery_03092012.pdf, "Cell Biology Support for Drug Discovery", 10.03.2012).Thus, when using vectors of the same type for introducing into the genome of producer cells the “main” and “auxiliary” genes, the preferred resistance markers for plasmids encoding the “auxiliary” genes will be enzyme genes that ensure cell resistance to antibiotics. Such selection markers are usually mutually compatible, in particular, the genes for resistance to the action of antibiotics G418 (neomycin), zeocin, hygromycin, do not protect cells from the action of other antibiotics and do not tell the cells the benefits of selection for resistance to methotrexate. The selectivity of antibiotic resistance enzymes G418 (neomycin), zeocin, hygromycin is high enough for sequential or simultaneous transfection of plasmids encoding these resistance genes and selection of cell populations expressing several target genes at the same time (presentation by ChanTest, http: //www.chantest. com / media / cms / pdf / 4_Cell_biology_support_for_drug_discovery_03092012.pdf, "Cell Biology Support for Drug Discovery, 03/10/2012).
Ранее авторы настоящего изобретения показали (патентная заявка РФ 2011146243), что использование амплифицируемого селекционного маркера, такого, как ген DHFR, обычно позволяет увеличить уровень экспрессии целевого гена приблизительно в 10 раз при продолжительном культивировании стабильно трансфицированных клеток в присутствии возрастающих концентраций селекционного агента, таким образом, последующая трансфекция "вспомогательных" генов в векторах того же типа может позволить получить относительный уровень экспрессии "вспомогательных" генов около 1:10 по отношению к "основному" гену без использования процедур амплификации "вспомогательных" трансгенов. Одновременно с этим, фактический уровень экспрессии вспомогательных генов может зависеть не только от силы использованного промотора и числа копий интегрированной в геном клеток экспрессионной кассеты, но и от эффективности транскрипции, трансляции и пост-трансляционного процессинга использованных "вспомогательных" белков.Previously, the authors of the present invention showed (RF patent application 2011146243) that the use of an amplifiable selection marker, such as the DHFR gene, usually allows to increase the expression level of the target gene by about 10 times during prolonged cultivation of stably transfected cells in the presence of increasing concentrations of the selection agent, thus subsequent transfection of “auxiliary” genes in vectors of the same type may allow one to obtain a relative level of expression of “auxiliary” genes about 1:10 in relation to the "main" gene without amplification procedures "subsidiary" of transgenes. At the same time, the actual level of expression of auxiliary genes may depend not only on the strength of the used promoter and the number of copies of the expression cassette integrated into the cell genome, but also on the efficiency of transcription, translation and post-translational processing of the used “auxiliary” proteins.
При получении линий-продуцентов с использованием амплифицируемых в геноме генетических конструкций предпочтительным вариантом относительного расположения целевого гена и гена селекционного маркера является их объединение в бицистронный транскрипиционный элемент, что обеспечивает минимизацию вероятности инактивации целевого гена и сохранения гена селекционного маркера. В то же время при использовании "неамплифицируемых" селекционных маркеров устойчивости к действию антибиотиков наилучшим вариантом взаимного расположения целевых генов и генов селекционных маркеров может являться использование отдельного "слабого" промотора и терминатора транскрипции для селекционного маркера и вынесение гена селекционного маркера из контекста транскрипционной единицы целевого гена. Такое расположение функциональных элементов экспрессионной плазмиды может позволить провести одностадийную селекцию клонов, несущих только множественные копии интегрированной в геном экспрессионной плазмиды, находящиеся в эухроматинизированных (т.е. транскрипционно активных) областях генома.When producing producer lines using genomes amplified in the genome, the preferred option for the relative location of the target gene and the selection marker gene is to combine them into a bicistronic transcription element, which minimizes the likelihood of inactivation of the target gene and preservation of the selection marker gene. At the same time, when using “non-amplifying” selection markers of antibiotic resistance, the best option for the relative positioning of target genes and selection marker genes may be to use a separate “weak” promoter and transcription terminator for the selection marker and to remove the selection marker gene from the context of the transcription unit of the target gene . Such an arrangement of the functional elements of the expression plasmid can allow one-step selection of clones carrying only multiple copies of the expression plasmid integrated into the genome located in euchromatized (i.e. transcriptionally active) regions of the genome.
Технический результат достигался путем конструирования новой экспрессионной плазмидной ДНК р1.2 Mono, содержащей регуляторные элементы для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, и создания на ее основе семейства взаимно совместимых векторов с различными селекционными маркерами.The technical result was achieved by constructing a new expression plasmid DNA p1.2 Mono containing regulatory elements for heterologous expression of recombinant proteins in mammalian cells, and creating on its basis a family of mutually compatible vectors with different selection markers.
В основе технического решения лежит разработанное авторами семейство плазмидных ДНК векторов, содержащих функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена, кодирующего рекомбинантный белок, в клетках СНО, фланкированного 5' и 3' НТО указанного гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и последовательность, содержащую ген устойчивости к антибиотику и регуляторные элементы для его экспрессии в клетках млекопитающего, обеспечивающую дозозависимую устойчивость стабильно трансфицированных клеток к антибиотику, что позволяет вести направленную селекцию клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме СНО.The technical solution is based on a family of plasmid DNA vectors developed by the authors that contain the functional promoter and terminator of the
Использование указанных векторов позволяет создавать высокопродуктивные и стабильные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, в частности в клетках СНО или клетках человека HEK-293, и получать стабильные линии продуцентов и со-продуцентов рекомбинантных белков.The use of these vectors makes it possible to create highly productive and stable recombinant protein expression systems in mammalian cells, in particular in CHO cells or HEK-293 human cells, and to obtain stable lines of producers and co-producers of recombinant proteins.
Термин «экспрессионный вектор» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее целевого гена, например, промотор и терминатор, и элементы для амплификации экспрессионной кассеты и отбора клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме.The term "expression vector" means plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for the expression of the target gene embedded in it, for example, a promoter and terminator, and elements for amplification of the expression cassette and selection of clones with multiple copies of the expression cassette in the genome.
Термин «совместимые векторы» означает набор таких экспрессионных векторов, которые могут быть использованы для одновременной или последовательной трансфекции культивируемых клеток млекопитающих и последующей селекции стабильно трансфицированных клеток. Необходимым условием совместимости векторов является наличие в их составе различных генов устойчивости к действию селекционных агентов, сообщающих трансфицированным клеток устойчивость к действию только одного из нескольких используемых селекционных агентов.The term "compatible vectors" means a set of expression vectors that can be used for simultaneous or sequential transfection of cultured mammalian cells and subsequent selection of stably transfected cells. A necessary condition for the compatibility of vectors is the presence in their composition of various genes of resistance to the action of selection agents that impart resistance to transfected cells to the action of only one of several selection agents used.
Примерами наборов совместимых векторов являются наборы, состоящие из вектора p1.1, сообщающего устойчивость к действию метотрексата, и вектора p1.2-Neo, сообщающего устойчивость к действию неомицина, набора, состоящего из вектора p1.1, сообщающего устойчивость к действию метотрексата, и вектора p1.2-Zeo, сообщающего устойчивость к действию зеоцина, набора, состоящего из вектора p1.1, сообщающего устойчивость к действию метотрексата, и вектора p1.2-Hygro, сообщающего устойчивость к действию гигромицина, а также другие наборы, состоящие из вектора, отличного от p1.1, сообщающего устойчивость к действию метотрексата, и вектора семейства р1.2, сообщающего устойчивость к действию антибиотика, но не ограничивается ими.Examples of sets of compatible vectors are those consisting of the vector p1.1 reporting resistance to methotrexate and the vector p1.2-Neo reporting resistance to neomycin, the set consisting of vector p1.1 reporting resistance to methotrexate and vector p1.2-Zeo, reporting resistance to zeocin, a set consisting of vector p1.1, reporting resistance to methotrexate, and vector p1.2-Hygro, reporting resistance to hygromycin, as well as other sets consisting of vector , well from about p1.1, confers resistance to methotrexate action and vector family P1.2 communicating resistance to antibiotic action, but not limited thereto.
Вектор p1.1 (SEQ ID NO:6) был разработан авторами настоящего изобретения ранее (патентная заявка РФ 2011146243) и содержит функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена в клетках СНО, фланкированные 5' и 3' НТО этого гена, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), обеспечивающий реинициацию трансляции на бицистронной мРНК в клетках млекопитающих и полное генетическое сцепление уровней продукции целевого белка и DHFR; OPC DHFR мыши, экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR) и обеспечивающую устойчивость стабильно трансфицированных клеток к отсутствию в среде тимидина и дозозависимую устойчивость к воздействию метотрексата (МТХ), что позволяет вести направленную селекцию высокопродуктивных клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме СНО; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и ускорение процесса амплификации целевого гена в геноме под действием МТХ.Vector p1.1 (SEQ ID NO: 6) was previously developed by the authors of the present invention (RF patent application 2011146243) and contains a functional promoter and terminator of the
Последовательность вектора р1.2 Mono для моноцистронной экспрессии с конститутивным промотором и элементом, обеспечивающим множественную интеграцию в геном клеток, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Карта вектора представлена на Фиг.2.The sequence of the p1.2 Mono vector for monocistronic expression with a constitutive promoter and an element that provides multiple integration into the cell genome is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1. A map of the vector is shown in FIG. 2.
Примерами совместимых векторов для моноцистронной экспрессии с конститутивным промотором и элементом, обеспечивающим множественную интеграцию в геном клеток с различными селекционными маркерами, могут служить векторы р1.2 Hygro, р1.2 Neo и р1.2 Zeo. Последовательности векторов р1.2 Hygro, р1.2 Neo и р1.2 Zeo представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2-4, соответственно. Карты векторов представлены на Фиг.3-5, соответственно.Examples of compatible vectors for monocistronic expression with a constitutive promoter and an element that provides multiple integration into the genome of cells with different selection markers are the vectors p1.2 Hygro, p1.2 Neo and p1.2 Zeo. The sequences of vectors p1.2 Hygro, p1.2 Neo and p1.2 Zeo are presented in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 2-4, respectively. Maps of vectors are presented in FIGS. 3-5, respectively.
Конкретным примером генетических элементов согласно настоящему изобретению для экспрессии рекомбинантного белка являются промотор и терминатор фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, но не ограничиваются ими.A specific example of the genetic elements of the present invention for expression of a recombinant protein are, but are not limited to, the promoter and terminator of an
Примером последовательности промотора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 5' НТО этого гена, является последовательность, соответствующая нуклеотидам с 2373 по 6443 в последовательностях SEQ ID NO:1-4.An example of a promoter sequence of the
Примером последовательности терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 3' НТО этого гена, является последовательность, соответствующая нуклеотидам с 6467 по 10723 в последовательностях SEQ ID NO:1-4.An example of a Chinese
Нетранслируемая область (НТО, UTR - untranslated region) согласно настоящему изобретению представляет собой участок ДНК, не кодирующий открытых рамок считывания (ОРС), который при этом может содержать функциональные регуляторные элементы. Размер указанной нетранслируемой области варьируется в широких пределах и составляет 150 до 10000 нуклеотидов, предпочтительно 4000-5000 нуклеотидов, необходимых для обеспечения инициации и терминации транскрипции, процессинга транскрибируемой РНК, а также для эухроматинизации сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО.The untranslated region (UTR, UTR - untranslated region) according to the present invention is a portion of DNA that does not encode open reading frames (OPC), which may contain functional regulatory elements. The size of the indicated untranslated region varies widely and ranges from 150 to 10,000 nucleotides, preferably 4,000 to 5,000 nucleotides, necessary for the initiation and termination of transcription, processing of transcribed RNA, as well as for euchromatization of the integration sites of the expression cassette into the CHO genome.
Последовательность участка для клонирования открытых рамок считывания целевых белков (полилинкер) может представлять, например, последовательность, соответствующую нуклеотидам с 6443 по 6467 в последовательностях SEQ ID NO:1-4. Указанный полилинкер содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: AbsI (6446), XhoI (6446), SciII (6448), SnaBI (6455), NruI (6461), NheI (6467).The sequence of the region for cloning the open reading frames of the target proteins (polylinker) can represent, for example, the sequence corresponding to nucleotides 6443 to 6467 in the sequences of SEQ ID NO: 1-4. The indicated polylinker contains unique recognition sites for restriction endonucleases: AbsI (6446), XhoI (6446), SciII (6448), SnaBI (6455), NruI (6461), NheI (6467).
Фрагментом ДНК, кодирующим элемент для множественной интеграции и амплификации экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, может являться, например, фрагмент конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR). Последовательность участка фрагмента конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой, например, последовательность, соответствующую нуклеотидам с 1960 по 2361 в последовательностях SEQ ID NO:1-4.A DNA fragment encoding an element for the multiple integration and amplification of an expression cassette according to the present invention may be, for example, a fragment of the concathemer of the human Epstein-Barr virus terminal repeat repeat (EBVTR). The sequence of the portion of the concatemer fragment of the terminal Epstein-Barr virus human repeat (EBVTR) is, for example, the sequence corresponding to the nucleotides from 1960 to 2361 in the sequences SEQ ID NO: 1-4.
Генетическим элементом (кассетой, обеспечивающей экспрессию селекционного маркера) для селекции культивируемых клеток, содержащих хромосомную инсерцию генетического вектора согласно настоящему изобретению, являются гены устойчивости к антибиотикам, находящиеся под контролем генетических элементов для экспрессии в клетках млекопитающего.The genetic element (cassette for the expression of a selection marker) for the selection of cultured cells containing the chromosome insertion of a genetic vector according to the present invention are antibiotic resistance genes controlled by genetic elements for expression in mammalian cells.
Конкретным примером генов устойчивости к антибиотикам согласно настоящему изобретению являются гены устойчивости к действию гигромицина, неомицина, зеоцина, но не ограничиваются ими.A specific example of the antibiotic resistance genes of the present invention are, but are not limited to, hygromycin, neomycin, zeocin resistance genes.
Конкретным примером генетических элементов для экспрессии генов устойчивости к антибиотикам согласно настоящему изобретению являются область промотора и терминатора вируса Simian vacuolating virus 40 (SV40), но не ограничиваются ими.A specific example of genetic elements for the expression of the antibiotic resistance genes of the present invention are, but are not limited to, the promoter and terminator of the
Примером последовательности генов устойчивости к антибиотикам являются последовательности, соответствующие нуклеотидам с 11135 по 12160 в последовательности SEQ ID NO:2; с 11153 по 11947 в последовательности SEQ ID NO:3; с 11200 по 11574 в последовательности SEQ ID NO:4.An example of a sequence of antibiotic resistance genes are sequences corresponding to nucleotides 11135 through 12160 in the sequence of SEQ ID NO: 2; 11153 to 11947 in the sequence of SEQ ID NO: 3; from 11200 to 11574 in the sequence of SEQ ID NO: 4.
Примером последовательности области промотора и терминатора вируса SV40 являются последовательности, соответствующие нуклеотидам с 10758 по 11038 и с 12293 по 12412 в последовательности SEQ ID NO:2; с 10748 по 11117 и с 12121 по 12251 в последовательности SEQ ID NO:3; с 10748 по 11117 и с 11704 по 11834 в последовательности SEQ ID NO:4, соответственно.An example of a sequence of the promoter and terminator region of the SV40 virus are sequences corresponding to nucleotides 10758 to 11038 and 12293 to 12412 in the sequence of SEQ ID NO: 2; 10748 through 11117 and 12121 through 12251 in the sequence of SEQ ID NO: 3; from 10748 to 11117 and from 11704 to 11834 in the sequence of SEQ ID NO: 4, respectively.
Конкретным воплощением экспрессионного вектора согласно настоящему изобретению являются плазмиды семейства р1.2, представленные в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1-4. Структура плазмид приведена на Фиг.2-5.A specific embodiment of the expression vector according to the present invention are the plasmids of the p1.2 family represented in the sequence Listing under the numbers SEQ ID NO: 1-4. The structure of the plasmids is shown in Fig.2-5.
Плазмиды данного семейства состоят изPlasmids of this family consist of
1) 1-1960 участка, включающего1) 1-1960 section, including
а. 150-823 (674 по) область начала репликации плазмиды pUC,but. 150-823 (674 Po) region of the beginning of replication of the plasmid pUC,
b. 964-1824 (861 по) открытую рамку считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;b. 964-1824 (861 po) open reading frame for beta-lactamase providing resistance to ampicillin;
2) 1960-2361 (402 по) участка фрагмента конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR);2) 1960-2361 (402 po) plot of the concatemer fragment of the terminal Epstein-Barr virus human repeat (EBVTR);
3) 2373-6443 (4071 по) участка, содержащего функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена;3) 2373-6443 (4071 bp) of the region containing the functional promoter of the gene for the
4) 6443-6467 (25 по) участка для клонирования вставок целевых ОРС (полилинкер);4) 6443-6467 (25 on) plot for cloning inserts target OPC (polylinker);
5) 6467-10723 участка, содержащего сигнал полиаденилирования и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена;5) 6467-10723 of the site containing the polyadenylation signal and functional terminator of the gene for the
6) и участка, обеспечивающего экспрессию селекционного маркера, в частности6) and a site for the expression of a selection marker, in particular
10758-12412 участка в последовательности вектора р1.2 Hygro (SEQ ID NO:2);10758-12412 plot in the sequence of the vector p1.2 Hygro (SEQ ID NO: 2);
10748-12251 участка в последовательности вектора р1.2 Neo (SEQ ID NO:3);10748-12251 plot in the sequence of the vector p1.2 Neo (SEQ ID NO: 3);
10748-11834 участка в последовательности вектора р1.2 Zeo (SEQ ID NO:4).10748-11834 plot in the sequence of the vector p1.2 Zeo (SEQ ID NO: 4).
Векторы получали с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и химически синтезированных олигонуклеотидов (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).Vectors were obtained using standard genetic engineering techniques, commercially available plasmids and chemically synthesized oligonucleotides (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).
Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Взаимный порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.The elements of the vector are listed in the order of their arrangement. The mutual arrangement of functional elements is essential for the effective operation of the vector.
В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к интеграции в геном клетки-реципиента после трансфекции, содержащие конститутивный эукариотический промотор, экспрессионную бицистронную кассету и области, обеспечивающие эухроматинизацию района интеграции экспрессионный кассеты.As a recombinant plasmid according to the present invention, various plasmids can be used that are capable of integrating into the genome of the recipient cell after transfection, containing a constitutive eukaryotic promoter, expression bicistronic cassette, and regions providing euchromatization of the integration region of the expression cassette.
Предпочтительно, чтобы экспрессионный плазмидный вектор согласно настоящему изобретению дополнительно содержал консенсусную последовательность Козак. Последовательность Козак располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена.Preferably, the expression plasmid vector according to the present invention further comprises a Kozak consensus sequence. The Kozak sequence is located around the start codon of the target gene and helps to initiate translation of the mRNA of the target gene.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же регуляторные элементы, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same regulatory elements can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 1), for example, by the method of site-directed mutagenesis, so that one or more nucleotides in a certain The site will be delegated, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations.
В качестве клеток млекопитающего могут быть использованы любые традиционно применяемые линии культивируемых клеток. Предпочтительно использование клеток эпителия яичника китайского хомячка (СНО), клеток человека HEK-293 или А-293.As mammalian cells, any conventionally used cultured cell line can be used. Preferred are Chinese hamster ovary epithelial cells (CHO), human cells HEK-293 or A-293.
При использовании плазмиды p1.1 или подобной ей для экспрессии "основного" белка, в качестве клеток млекопитающего, не содержащих активные аллели дегидрофолатредуктазы, могут быть использованы любые традиционно применяемые линии клеток с инактивируемой дигидрофолатредуктазой. Предпочтительно использование клеток эпителия яичника китайского хомячка (СНО), нокаутных по гену дигидрофолатредуктазы (dhfr-/-), линия DG-44 (Invitrogen, США).When using plasmid p1.1 or the like for expression of a “base” protein, any conventionally used cell line with inactivated dihydrofolate reductase can be used as mammalian cells that do not contain active dehydrofolate reductase alleles. It is preferable to use Chinese hamster ovary (CHO) epithelial cells knocked out by the dihydrofolate reductase gene (dhfr - / -), DG-44 line (Invitrogen, USA).
В качестве клеток млекопитающего, продуцентов биофармацевтически значимых белков, подвергающихся метаболическому инжинирингу путем введения в геном дополнительных генов, могут быть использованы любые продуценты. Предпочтительно использование клеток эпителия яичника китайского хомячка (СНО), нокаутных по гену дигидрофолатредуктазы (dhfr-/-), линия DG-44 (Invitrogen, США), содержащих в геноме кассету с геном целевого биофармацевтически значимого белка, внутренний участок связывания рибосом (IRES) и миниген дигидрофолатредуктазы как селекционный маркер.As mammalian cells, producers of biopharmaceutically significant proteins undergoing metabolic engineering by introducing additional genes into the genome, any producers can be used. It is preferable to use Chinese hamster ovary (CHO) epithelial cells knocked out according to the dihydrofolate reductase gene (dhfr - / -), the DG-44 line (Invitrogen, USA) containing the cassette in the genome of the target biopharmaceutically significant protein gene, an internal ribosome binding site (IRES) and dihydrofolate reductase minigen as a selection marker.
Целевым рекомбинантным белком согласно настоящему изобретению может быть любой белок, представляющий интерес в данной области техники. Примером таких белков является, например, зеленый флуоресцентный белок eGFP, использованный в настоящем изобретении в иллюстративных целях, но не ограничиваются ими.The target recombinant protein of the present invention may be any protein of interest in the art. An example of such proteins is, for example, green fluorescent protein eGFP, used in the present invention for illustrative purposes, but is not limited to.
Примерами фермента посттрансляционной модификации другого рекомбинантного белка являются, например, сигнальная протеиназа PACE/furin, гамма-глютамил карбоксилаза человека (GGCX), альфа-2,6-сиалилтрансфераза (ST6GalI), альфа-2,3-сиалилтрансфераза (ST3GalIII), бета-1,4-галактозилтрансфераза, но не ограничиваются ими.Examples of an enzyme for post-translational modification of another recombinant protein are, for example, PACE / furin signaling proteinase, human gamma-glutamyl carboxylase (GGCX), alpha-2,6-sialyltransferase (ST6GalI), alpha-2,3-sialyltransferase (ST3GalIII),
Примерами гетеромультимерного рекомбинантного белка, состоящего из различных пептидных цепей, являются, например, иммуноглобулины класса G, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, хорионический гонадотропин, тромбоцитарный фактор роста АВ, но не ограничиваются ими.Examples of a heteromultimeric recombinant protein consisting of various peptide chains are, for example, class G immunoglobulins, follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, chorionic gonadotropin, platelet-derived growth factor AB, but are not limited to them.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, включающего культивирование в питательной среде описанных выше клеток млекопитающих - продуцентов целевого рекомбинантного белка, и выделение полученного целевого рекомбинантного белка из культуральной жидкости.It is also an object of the present invention to provide a method for producing recombinant proteins in mammalian cells, comprising culturing in a nutrient medium the mammalian cells described above producing the target recombinant protein, and isolating the obtained target recombinant protein from the culture fluid.
Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.Cell growth, isolation and purification of the target protein from a culture or similar fluid can be carried out in a manner similar to traditional cultivation methods in which a recombinant protein is produced using mammalian cells.
Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.The culture medium used for cultivation can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, an appropriate amount of nutritional supplements necessary for cell growth. Various carbohydrates such as glucose or sucrose and other organic acids can be used as a carbon source. As the nitrogen source, various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural sources of nitrogen, can be used. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used.
Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием CO2 (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. Обычно, выращивание в течение от 12 часов до 4 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде или в цитоплазме клетки.Cultivation can be carried out under aerobic conditions, preferably with a high content of CO 2 (8%), such as mixing the culture fluid in the flasks, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. Usually, growing for 12 hours to 4 days leads to the accumulation of the target recombinant protein in the culture medium or in the cytoplasm of the cell.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищен методами хроматографии и/или концентрирования.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation, and then the target protein can be isolated and purified by chromatography and / or concentration.
Особенности вектора и результаты его практического применения приведены на следующих Фигурах.The features of the vector and the results of its practical application are shown in the following Figures.
Краткое описание ФигурShort Description of Shapes
На Фигуре 1 показана схема получения плазмид р1.2 mono, p1.2 Hygro, p1.2 Neo, р1.2 Zeo. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования, указаны под названиями плазмид.The Figure 1 shows the scheme for obtaining plasmids p1.2 mono, p1.2 Hygro, p1.2 Neo, p1.2 Zeo. Designations: the dotted line indicates the PCR stages, the solid line indicates the restriction-ligation stages, the restriction endonucleases used for cloning are indicated under the names of plasmids.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2 mono (длина 10727 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBVTR - участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); 5CHEF - функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена; 3CHEF - функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 2 shows a map of the expression plasmid p1.2 mono (
На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды p1.2 Hygro (длина 12424 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 2; SV40 promoter - область промотора вируса SV40; SV40pA,terminator - терминатор и сигнал полиаденилирования вируса SV40; hygroB - ген устойчивости к гигромицину.Figure 3 shows a map of the expression plasmid p1.2 Hygro (
На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды р1.2 Neo (длина 12255 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 3; neoR - ген устойчивости к неомицину.Figure 4 shows a map of the expression plasmid p1.2 Neo (
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды р1.2 Zeo (длина 11838 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 3; zeoR - ген устойчивости к зеоцину.Figure 5 shows a map of the expression plasmid p1.2 Zeo (
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды р 1.1 (длина 11909 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 2; 5'CHEF-1 UTR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена; EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV); DHFR - открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках; 3'CHEF-1 UTR - функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования (7920-7925) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3'НТО этого гена.Figure 6 shows a map of the expression plasmid p 1.1 (
На Фигуре 7 показана схема получения плазмид p1.2-Hygro-eGFP, p1.2-Neo-eGFP, p1.2-Zeo-eGFP. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования, указаны под названиями плазмид.The Figure 7 shows the scheme for obtaining plasmids p1.2-Hygro-eGFP, p1.2-Neo-eGFP, p1.2-Zeo-eGFP. Designations: the dotted line indicates the PCR stages, the solid line indicates the restriction-ligation stages, the restriction endonucleases used for cloning are indicated under the names of plasmids.
Существо настоящего изобретения и его промышленная применимость в биотехнологии иллюстрируются следующими примерами.The essence of the present invention and its industrial applicability in biotechnology are illustrated by the following examples.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Получение плазмиды р1.2 Mono для моноцистронной экспрессииExample 1. Obtaining plasmid p1.2 Mono for monocistronic expression
Для получения плазмид р1.2 Mono проводили рестрикцию донорной плазмиды pAL-3CHEF123 SEQ ID NO:5 эндонуклеазами AgeI u NheI и лигировали полученный рестриктный фрагмент с акцепторным фрагментом, полученным при рестрикции AgeI и NheI и дефосформилировании реципиентной плазмиды p1.1 (SEQ ID NO:6; карта плазмиды представлена на рис.6).To obtain plasmids p1.2 Mono, the donor plasmid pAL-3CHEF123 SEQ ID NO: 5 was restricted with AgeI and NheI endonucleases and the obtained restriction fragment was ligated with the acceptor fragment obtained by restriction with AgeI and NheI and de-forming the recipient plasmid p1.1 (SEQ ID NO: 6; a plasmid map is shown in Fig. 6).
Рестрикцию донорной плазмиды вели 2 часа при 37°С, после чего продукты реакции рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли с помощью набора реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System по методике производителя. Реципиентную плазмиду p1.1 рестрицировали, инактивировали эндонуклеазы рестрикции прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Очищенный донорный фрагмент и реципиентную плазмиду лигировали с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 18 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+)phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°С в течение 45 секунд и инкубировали на льду в течение 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOB и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO:7) и SQ-5CH6-F (SEQ ID NO:8). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO:7) и SQ-5CH6-F (SEQ ID NO:8).The donor plasmid was restricted for 2 hours at 37 ° C, after which the products of the restriction reaction were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System reagent kit according to the manufacturer's procedure. Recipient plasmid p1.1 was restriction, restriction endonucleases were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes, and alkaline phosphatase dephosphorylation (Fermentas, Lithuania) was performed according to the manufacturer's protocol. Alkaline phosphatase was inactivated by heating to 85 ° C for 20 minutes. Restricted and dephosphorylated plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 -2 μg / μl. The purified donor fragment and the recipient plasmid were ligated using T4 phage DNA ligase and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania). Ligation was carried out in a volume of 10 μl with a molar ratio of vector and insert 1:10, for 18 hours at room temperature. The obtained ligase mixtures transformed E. coli cells of strain DH5α, with the genotype F-φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r k -, m k +) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. For this, 5 μl of the ligase mixture was added to 200 μl of a frozen E. coli cell suspension, incubated on ice for 20 minutes to sorb plasmid DNA, heated to 42 ° C for 45 seconds, and incubated on ice for 5 minutes. Then 800 μl of SOB nutrient broth was added and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Then the suspension was transferred to a Petri dish with solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / 1 ml of agar, and placed in a thermostat for 18 hours at 37 ° C. E. coli colonies were analyzed by PCR from clones from primers AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO: 7) and SQ-5CH6-F (SEQ ID NO: 8). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth, plasmid DNA was isolated with the Wizard Plus SV Minipreps kit. The nucleotide sequence was verified by PCR sequencing from the primers AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO: 7) and SQ-5CH6-F (SEQ ID NO: 8).
Пример 2. Получение плазмид pAL-Hygro, pAL-Neo и pAL-Zeo, содержащих гены устойчивости к антибиотиками и элементы для их экспрессии в животных клеткахExample 2. Obtaining plasmids pAL-Hygro, pAL-Neo and pAL-Zeo containing antibiotic resistance genes and elements for their expression in animal cells
Для получения плазмид pAL-Hygro, pAL-Neo и pAL-Zeo проводили ПЦР, используя адапторные праймеры AD-HYG-AscIF(SEQ ID NO:9) и AD-HYG-AscIR(SEQ ID NO:10), и плазмиды pcDNA3.1/Hygro, pcDNA3.1(+), pcDNA4/HisMax-TOPO в качестве матриц соответственно.To obtain plasmids pAL-Hygro, pAL-Neo and pAL-Zeo, PCR was performed using adapter primers AD-HYG-AscIF (SEQ ID NO: 9) and AD-HYG-AscIR (SEQ ID NO: 10), and plasmid pcDNA3. 1 / Hygro, pcDNA3.1 (+), pcDNA4 / HisMax-TOPO as matrices, respectively.
ПЦР проводили при помощи смеси Encyclo PCR Kit по (ЗАО «Евроген») инструкции производителя на приборе РТС-100 Thermal Cycler («MJ Reseach», США). Режим амплификации: 1) 95°С - 3 мин и 18 циклов: 95°С - 20 сек/градиент 52-65°С - 20 сек/72°С - 1 мин, финальная элонгация 72°С - 5 мин. Продукты ПЦР, размером 1707, 1538 и 1121 п.о. соответственно, выделяли из 1% агарозного геля, используя набор реактивов «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего лигировали в Т-вектор pAL-TA («Евроген», Россия), и трансформировали клетки E.coli полученной лигазной смесью, как описано в примере 1. Трансформантов высевали на чашки Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин, X-Gal и IPTG, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров SP6 (SEQ ID NO:11)и T7prom (SEQ ID NO:12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность области вставки полученных плазмид pAL-Hygro, pAL-Neo и pAL-Zeo определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров SP6 (SEQ ID NO:11)и T7prom (SEQ ID NO:12).PCR was performed using an Encyclo PCR Kit mixture according to (Eurogen CJSC) manufacturer's instructions on a RTS-100 Thermal Cycler device (MJ Reseach, USA). Amplification mode: 1) 95 ° С - 3 min and 18 cycles: 95 ° С - 20 sec / gradient 52-65 ° С - 20 sec / 72 ° С - 1 min, final elongation 72 ° С - 5 min. PCR products,
Пример 3. Получение плазмид р1.2 Hygro, p1.2 Neo и р1.2 Zeo для моноцистронной экспрессииExample 3. Obtaining plasmids p1.2 Hygro, p1.2 Neo and p1.2 Zeo for monocistronic expression
Для получения плазмид р1.2 Hygro, р1.2 Neo и р1.2 Zeo проводили рестрикцию плазмид pAL-Hygro, pAL-Neo и pAL-Zeo соответственно эндонуклеазой AscI и лигировали с акцепторным фрагментом, полученным при рестрикции AscI и дефосформилировании реципиентной плазмиды р1.2 Mono (карта плазмиды представлена на рис.2, последовательность SEQ ID NO:1). Рестрикцию донорных плазмид эндонуклеазой AscI вели 2 часа при 37°С, после чего продукты реакции рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли с помощью набора реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System no методике производителя. Реципиентную плазмиду p1.2 Mono рестрицировали 2 часа при 37°С, затем фермент инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Реакцию лигирования очищенных донорных фрагментов и реципиентной плазмиды и трансформацию лигатами клеток Е.coli штамма DHSa вели, как описано в примере 1. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров AD-HYG-AscIR (SEQ ID NO:9) и 3CHEF6-F (SEQ ID NO:13), селектируя клоны с плазмидной ДНК, содержащие целевую вставку в нужной ориентации (отбирали клоны с сонаправленными промоторами генов селекционного маркера и целевого белка). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps». Нуклеотидную последовательность верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-HYG-AscIF(SEQ ID NO:9) и AD-HYG-AscIR(SEQ ID NO:10).To obtain plasmids p1.2 Hygro, p1.2 Neo and p1.2 Zeo, restriction of plasmids pAL-Hygro, pAL-Neo and pAL-Zeo with AscI endonuclease, respectively, was performed and ligated with the acceptor fragment obtained by AscI restriction and de-formation of the recipient plasmid p1. 2 Mono (a plasmid map is shown in Fig. 2, sequence SEQ ID NO: 1). The restriction of donor plasmids with AscI endonuclease was performed for 2 hours at 37 ° C, after which the products of the restriction reaction were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System no reagent kit according to the manufacturer's method. The recipient plasmid p1.2 Mono was
Плазмидные ДНК р1.2 Hygro, p1.2 Neo и р1.2 Zeo для трансфекции нарабатывали в клетках Escherichia coli (штамм Stb14, #11635018 «Invitrogen»), трансформированных экспрессионными конструкциями. Клетки культивировали в 0,5 л среды ТВ-Амп в течение 18 ч, и выделяли плазмиды с использованием набора EndoFree Plasmid MaxiKit («Qiagen», США) по протоколу фирмы-производителя.Plasmid DNA p1.2 Hygro, p1.2 Neo and p1.2 Zeo for transfection were obtained in Escherichia coli cells (Stb14 strain, # 11635018 Invitrogen) transformed with expression constructs. Cells were cultured in 0.5 L of TV-Amp medium for 18 h, and plasmids were isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit kit (Qiagen, USA) according to the manufacturer's protocol.
Пример 4. Получение экспрессионных конструкций, кодирующих зеленый флуоресцентный белок eGFPExample 4. Obtaining expression constructs encoding a green fluorescent protein eGFP
При помощи праймеров AD-EG-AbsF(SEQ ID 14) и AD-EG-NheR (SEQ ID 15) и pEGFP-c2 (Clontech, США) в качестве матрицы получили ПЦР-продукт eGFP PCR (SEQ ID 16), содержащий ОРС зеленого флуоресцентного белка (аминокислотная последовательность SEQ ID 17). Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-ТА и анализировали секвенированием области вставки, используя праймеры SP6, после обнаружения клонов с корректной нуклеотидной последовательностью области вставки плазмиду PAL-eGFP рестрицировали AbsI и NheI и переносили фрагмент, содержащий ОРС eGFP с участком консенсусной последовательности Козак в рестрицированные AbsI и NheI векторы p1.2-Hygro (SEQ ID NO:2), p1.2-Neo (SEQ ID NO:3), p1.2-Zeo (SEQ ID NO:4) p1.2-Neo (SEQ ID 1) с образованием p1.2-Hygro-eGFP (SEQ ID NO:18), p1.2-Neo-eGFP (SEQ ID NO:19), p1.2-Zeo-eGFP (SEQ ID NO:20) соответственно. Получение конструкций представлено на фигуре 7. Нуклеотидную последовательность полученных экспрессионных плазмид верифицировали при помощи ПЦР-секвенирования с праймеров AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO:7) и SQ-5CH6-F (SEQ ID NO:8).Using primers AD-EG-AbsF (SEQ ID 14) and AD-EG-NheR (SEQ ID 15) and pEGFP-c2 (Clontech, USA), the PCR product eGFP PCR (SEQ ID 16) containing OPC was obtained as a template green fluorescent protein (amino acid sequence of SEQ ID 17). The resulting PCR product was cloned into the PAL-TA vector and analyzed by sequencing the insertion region using SP6 primers, after detection of clones with the correct nucleotide sequence of the insertion region, the PAL-eGFP plasmid was restricted with AbsI and NheI and the fragment containing OPC eGFP with the Kozak consensus sequence fragment was transferred into the restricted AbsI and NheI vectors p1.2-Hygro (SEQ ID NO: 2), p1.2-Neo (SEQ ID NO: 3), p1.2-Zeo (SEQ ID NO: 4) p1.2-Neo (SEQ ID 1) with the formation of p1.2-Hygro-eGFP (SEQ ID NO: 18), p1.2-Neo-eGFP (SEQ ID NO: 19), p1.2-Zeo-eGFP (SEQ ID NO: 20), respectively. The preparation of the constructs is shown in Figure 7. The nucleotide sequence of the obtained expression plasmids was verified by PCR sequencing from the primers AD-3CHEF1-R (SEQ ID NO: 7) and SQ-5CH6-F (SEQ ID NO: 8).
Пример 5. Получение сверхскрученной и линеаризованной плазмидной ДНК для трансфекции клеток СНОExample 5. Obtaining supercoiled and linearized plasmid DNA for transfection of CHO cells
Полученными в Примере 4 экспрессионными генетическими конструкциями p1.2-Neo-eGFP, p1.2-Zeo-eGFP, p1.2-Hygro-eGFP трансформировали клетки Е.coli штамма ТОР10 (Invitrogen, США), одиночными колониями трансформантов инокулировали пробирки, содержащие по 5 мл среды LB с 50 мкг/мл ампициллина, выращивали культуры в течение 6-8 ч и инокулировали ими колбы, содержащие по 100 мл жидкой среды LB с 100 мкг/мл ампициллина. Выращивали культуры в течение 14-18 ч. Выделение сверхскрученной плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса бактерий с использованием набора GeneJet Plasmid Midiprep Kit (Fermentas, Литва) по методике производителя. Получали от 0,1 до 0,3 мг сверхскрученной плазмидной ДНК, содержащей менее 5% релаксированной кольцевой и линейной форм и менее 50 ЭЕ/мл ЛАЛ-эндотоксина. Для аликвот растворов сверхскрученных плазмид p1.2-Neo-eGFP, p1.2-Zeo-eGFP, содержащих по 50 мкг ДНК, проводили получение линеаризованных форм путем расщепления эндонуклеазой рестрикции PvuI. Полученные линеаризованные формы содержали в обоих случаях разрыв кольца в области гена устойчивости к ампициллину bla. Плазмиду p1.2-Hygro-eGFP линеаризовали рестриктазой BspHI, вносящей два разрыва в области гена устойчивости к ампициллину bla. Обессоливание и стерилизацию линейных ДНК проводили переосаждением 70% этанолом, операции вели в асептических условиях, осадок ДНК растворяли в стерильной воде для инъекций, конечная концентрация ДНК составила 0,6-1 мкг/мкл.The p1.2-Neo-eGFP, p1.2-Zeo-eGFP, p1.2-Hygro-eGFP expression constructs obtained in Example 4 were used to transform E. coli cells of strain TOP10 (Invitrogen, USA), and tubes containing inoculant colonies were inoculated with
Пример 6. Транзиентная трансфекцияExample 6. Transient Transfection
Использовали клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО), нокаутные по гену дигидрофолатредуктазы (dhfr-/-), линия DG-44 (Invitrogen, США), культивируемые в суспнзионных условиях в культуральной среде CD DG44 (Invitrogen). Клетки пассировали за 24 ч до трансфекции, используя плотность при рассеве 0,3 млн клеток в 1 мл среды. Трансфекцию вели методом электротрансформации с использованием раствора Gene Pulser® Electroporation Buffer (Bio-Rad, США), аппарата Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) и кювет с щелью 4 мм. Электротрансформацию проводили по методике производителя буферного раствора для 7,5 млн клеток и 15 мкг каждой линеаризованной ДНК. Через 48 часов после введения ДНК рассчитывали долю живых и долю трансфицированных клеток в культурах путем подсчета в камере Горяева с окрашиванием трипановым синим в проходящем свете и при помощи пары светофильтров для детекции флуоресцеинизотионата (таблица 1).We used Chinese hamster ovary (CHO) epithelial cells knocked out by the dihydrofolate reductase gene (dhfr - / -), the DG-44 line (Invitrogen, USA), cultured under suspension conditions in CD DG44 culture medium (Invitrogen). Cells were passaged 24 hours before transfection using a sieving density of 0.3 million cells in 1 ml of medium. Transfection was performed by the method of electrotransformation using a Gene Pulser® Electroporation Buffer solution (Bio-Rad, USA), a Gene Pulser Xcell apparatus (Bio-Rad) and a cuvette with a 4 mm gap. Electrotransformation was carried out according to the method of the manufacturer of a buffer solution for 7.5 million cells and 15 μg of each linearized DNA. 48 hours after DNA injection, the fraction of living and the fraction of transfected cells in the cultures was calculated by counting in a Goryaev chamber stained with trypan blue in transmitted light and using a pair of light filters to detect fluorescein isothionate (table 1).
Эффективность транзиентной трансфекции для всех трех плазмид не имела существенных различий.The effectiveness of transient transfection for all three plasmids did not have significant differences.
Пример 7. Получение популяций стабильно трансфицированных клеток при различном селекционном давлении антибиотиковExample 7. Obtaining populations of stably transfected cells with different selection pressure of antibiotics
Транзиентно трансфицированные клетки через 48 ч после трансфекции переносили в лунки 6-луночных планшетов по 1 млн клеток на лунку в 5 мл среды. Использовали по 4 лунки для каждого из антибиотиков. Схема добавления антибиотиков приведена в таблице 2.Transiently transfected cells 48 hours after transfection were transferred to the wells of 6-well plates, 1 million cells per well in 5 ml of medium. Used 4 holes for each of the antibiotics. The antibiotic supplementation schedule is shown in table 2.
Вели культивацию планшетов с периодической сменой среды в течение 20 дней, полученные популяции стабильно трансфицированных клеток исследовали методом поточной цитофлуориметрии. Доля клеток, экспрессирующих ген eGFP, и средняя интенсивность флюоресценции eGFP среди экспрессирующих клеток приведены в Таблицах 3-5.The plates were cultured with a periodic change of medium for 20 days, the obtained population of stably transfected cells was studied by flow cytometry. The proportion of cells expressing the eGFP gene and the average fluorescence intensity of eGFP among expressing cells are shown in Tables 3-5.
Таким образом, для всех использованных концентраций антибиотиков все три вектора позволили получить стабильно трансфицированные популяции клеток, в которых более 75% клеток активно экспрессировали ген флюоресцентного белка. При использовании плазмиды p1.2-Hygro-eGFP и антибиотика гигромицин были получены популяции, практически полностью состоящие из клеток, экспрессирующих ген eGFP, при этом варьирование концентрации гигромицина позволило изменять среднюю интенсивность флюоресценции в 1,3 раза. Во всех трех векторах доля клеток, стабильно эксперессирующих целевой ген, практически не менялась для широкого диапазона концентраций антибиотика, что позволяет использовать векторы семейства р1.2 для культивируемых линий клеток с различной чувствительностью к антибиотикам G-418, зеоцин, гигромицин.Thus, for all antibiotic concentrations used, all three vectors allowed us to obtain stably transfected cell populations in which more than 75% of the cells actively expressed the fluorescent protein gene. Using plasmid p1.2-Hygro-eGFP and the antibiotic hygromycin, populations were obtained that consist almost entirely of cells expressing the eGFP gene, while varying the concentration of hygromycin allowed us to change the average fluorescence intensity by 1.3 times. In all three vectors, the proportion of cells stably expressing the target gene remained practically unchanged for a wide range of antibiotic concentrations, which allows the use of the p1.2 family vectors for cultured cell lines with different sensitivity to antibiotics G-418, zeocin, hygromycin.
Пример 8. Определение концентрации eGFP в лизатах стабильно трансфицированных популяцийExample 8. The determination of the concentration of eGFP in the lysates of stably transfected populations
Для всех полученных культур стабильно трансфицированных популяций клеток, а также контрольных культур нетрансфицированных клеток DG-44 и клеток DG-44, стабильно трансфицированных плазмидой p1.1-eGFP при селекционном давлении метотрексата 200 мкМ, осаждали клетки центрифугированием, собирая по 1-2 млн клеток, ресуспендировали осадок клеток в фосфатно-буферизованном растворе и повторно центрифугировали. Промытый осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН=7,5, 1% Тритона Х-100 и набор ингибиторов протеаз (Sigma, США), выдерживали 30 мин на льду при периодическом перемешивании. Использовали 100 мкл лизирующего раствора на 1 млн клеток. Отделяли клеточный дебрис центрифугированием, супернатант переносили в новые пробирки. Для лизата, полученного из популяции клеток Н-4, определяли концентрацию eGFP спектрофотометрией на длине волны 488 нм, использовали молярный коэффициент экстинкции 55000 М-1*см-1 и молекулярную массу eGFP 32,7 кДа. Определяли интенсивность флюоресценции eGFP во всех полученных лизатах, использовали серию разведения лизата популяции Н-4 для построения калибровочной кривой и пересчета интенсивности флюоресценции в концентрацию eGFP. Для всех полученных лизатов определяли концентрацию общего белка по методу Брэдфорд, в качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина. Вычисляли долю eGFP среди всех растворимых белков, результаты приведены в таблице 6.For all cultures obtained stably transfected cell populations, as well as control cultures of untransfected DG-44 cells and DG-44 cells stably transfected with plasmid p1.1-eGFP at a selection pressure of 200 μM methotrexate, cells were besieged by centrifugation, collecting 1-2 million cells , resuspended the cell pellet in a phosphate-buffered solution and centrifuged again. The washed cell pellet was resuspended in a lysis solution containing 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% Triton X-100 and a set of protease inhibitors (Sigma, USA), kept for 30 min on ice with periodic stirring. Used 100 μl of lysis solution per 1 million cells. Cell debris was separated by centrifugation, the supernatant was transferred to new tubes. For the lysate obtained from the H-4 cell population, the concentration of eGFP was determined by spectrophotometry at a wavelength of 488 nm, the molar extinction coefficient 55000 M -1 * cm -1 and the molecular weight of the eGFP 32.7 kDa were used. The fluorescence intensity of eGFP was determined in all obtained lysates, a series of dilution of the lysate of the H-4 population was used to construct a calibration curve and convert the fluorescence intensity to eGFP concentration. For all lysates obtained, the concentration of total protein was determined by the Bradford method, and a bovine serum albumin solution was used as a standard. The proportion of eGFP among all soluble proteins was calculated, the results are shown in table 6.
Было установлено, что использование всех трех разработанных векторов позволяет получать высокие концентрации целевых белков (1,7-8,9% от тотального белка для eGFP) для широкого диапазона концентраций антибиотиков. Концентрация целевого белка при использовании векторов семейства р1.2 не ниже, чем при использовании вектора p1.1 (без амплификации геномных вставок плазмиды под действием метотрексата).It was found that the use of all three developed vectors allows to obtain high concentrations of target proteins (1.7-8.9% of the total protein for eGFP) for a wide range of antibiotic concentrations. The concentration of the target protein when using vectors of the p1.2 family is not lower than when using the vector p1.1 (without amplification of the genomic inserts of the plasmid by methotrexate).
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Claims (13)
- культивирование в питательной среде клеток по пп. 8-11; и
- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.12. A method of producing a recombinant protein, comprising the following stages:
- cultivation in a nutrient medium of cells according to paragraphs. 8-11; and
- isolation of the resulting recombinant protein from the culture fluid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013122048/10A RU2552170C2 (en) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013122048/10A RU2552170C2 (en) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013122048A RU2013122048A (en) | 2014-11-20 |
| RU2552170C2 true RU2552170C2 (en) | 2015-06-10 |
Family
ID=53295357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013122048/10A RU2552170C2 (en) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2552170C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469093C2 (en) * | 2008-12-19 | 2012-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | EXPRESSION PLASMID DNA pCID-PROC CODING HUMAN PROTEIN C AND CELL LINE DG-CID-PROC-1 PRODUCING RECOMBINANT HUMAN PROTEIN C |
| RU2011146243A (en) * | 2011-11-16 | 2013-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Expression plasmid vector for heterologous expression of recombinant proteins, HIGH FREQUENCY INTEGRATION AND REINFORCED AMPLIFICATION expression cassettes in mammalian cells, a bicistronic mRNA, METHOD FOR PRODUCING STABLE PRODUCERS LINES USING RECOMBINANT PROTEINS DESCRIBED VECTOR AND A METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS |
-
2013
- 2013-05-14 RU RU2013122048/10A patent/RU2552170C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469093C2 (en) * | 2008-12-19 | 2012-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | EXPRESSION PLASMID DNA pCID-PROC CODING HUMAN PROTEIN C AND CELL LINE DG-CID-PROC-1 PRODUCING RECOMBINANT HUMAN PROTEIN C |
| RU2011146243A (en) * | 2011-11-16 | 2013-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Expression plasmid vector for heterologous expression of recombinant proteins, HIGH FREQUENCY INTEGRATION AND REINFORCED AMPLIFICATION expression cassettes in mammalian cells, a bicistronic mRNA, METHOD FOR PRODUCING STABLE PRODUCERS LINES USING RECOMBINANT PROTEINS DESCRIBED VECTOR AND A METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013122048A (en) | 2014-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6140086A (en) | Methods and compositions for cloning nucleic acid molecules | |
| US7244609B2 (en) | Synthetic genes and bacterial plasmids devoid of CpG | |
| US8470593B2 (en) | Plasmid system for multigene expression | |
| ES2574584T3 (en) | Stable serum-free transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines | |
| RU2707542C1 (en) | METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM | |
| CA2983364A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders | |
| JPH01165395A (en) | Manifestation system for manifestation of recombinant protein | |
| US20230212612A1 (en) | Genome editing system and method | |
| WO2002057447A2 (en) | Methods and reagents for amplification and manipulation of vector and target nucleic acid sequences | |
| CN110959041A (en) | Methods and compositions for enhancing the production of proteins containing unnatural amino acids | |
| Kaufman | Amplification and expression of transfected genes in mammalian cells | |
| CN112941107B (en) | Gene editing application of prokaryotic Argonaute protein | |
| WO2001027260A1 (en) | Template molecule having broad applicability and highly efficient function means of cell-free synthesis of proteins by using the same | |
| RU2488633C1 (en) | Expression plasmid vector for heterological expression of recombinant proteins, high-frequency integration and amplified amplification of expression cassette in cells of mammals, bicistronic messenger riziform, method of production of stable lines of producents of recombinant proteins using specified vector, method for production of recombinant proteins | |
| RU2552170C2 (en) | Expression plasmid vector of monocistronic expression of recombinant proteins in mammalian cells, cell line of mammals-producers of recombinant protein, method of obtaining recombinant protein | |
| ES2849728T3 (en) | Efficient selectivity of recombinant proteins | |
| JP2010522549A (en) | Polynucleotide for enhancing expression of polynucleotide of interest | |
| RU2500816C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pAK380 CODING POLYPEPTIDE OF RECOMBINANT FACTOR IX OF HUMAN BLOOD COAGULABILITY, LINE OF CELLS Cricetulus griseus CHO, 1E6-PRODUCER OF RECOMBINANT FACTOR IX OF HUMAN BLOOD COAGULABILITY, AND METHOD FOR OBTAINING POLYPEPTIDE HAVING ACTIVITY OF RECOMBINANT FACTOR IX | |
| RU2585532C2 (en) | Plasmid for expression of human recombinant blood clotting factor ix, cho cell producing human recombinant blood clotting factor ix and method of producing said factor | |
| RU2561466C2 (en) | Expression plasmid for human recombinant coagulation factor viii with deleted b-domain in cho cells, cho cell producing human recombinant coagulation factor viii with deleted b-domain, and method for producing above factor | |
| JP2022529063A (en) | Stable target integration | |
| ES2789073T3 (en) | Manufacturing method of a therapeutic protein | |
| RU2469093C2 (en) | EXPRESSION PLASMID DNA pCID-PROC CODING HUMAN PROTEIN C AND CELL LINE DG-CID-PROC-1 PRODUCING RECOMBINANT HUMAN PROTEIN C | |
| CA2156260A1 (en) | Bi-functional expression system | |
| EA010059B1 (en) | Flp-mediated recombination |