RU2550223C1

RU2550223C1 - THROMBOCYTE AGGREGATION-INHIBITING HETEROMERIC PEPTIDES BASED ON IMIDAZO[4,5-e]BENZO[1,2-c;3,4-c']DIFUROXANE

Info

Publication number: RU2550223C1
Application number: RU2014116844/04A
Authority: RU
Inventors: Алексей Анатольевич Алексеев; Максим Игоревич Брылев; Вячеслав Леонидович Королев; Дмитрий Сергеевич Лоторев; Антон Юрьевич Лизунов; Людмила Анатольевна Павлова; Наталья Николаевна Белушкина
Priority date: 2014-04-28
Filing date: 2014-04-28
Publication date: 2015-05-10

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: thrombocyte aggregation-inhibiting heteromeric peptides based on imidazo[4,5-e]benzo[1,2-c;3,4-c']difuroxane are disclosed:

, where R=Phe-Ile-Ala-Asp-Thr; Arg-Tyr-Gly-Asp-Arg; Lys-Ile-Ala-Asp-Asp; His-Ile-Gly-Asp-Asp.

EFFECT: improved properties.

1 dwg, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к фармации, в частности к синтезу фармакологически активных соединений.The invention relates to pharmacy, in particular to the synthesis of pharmacologically active compounds.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности населения в России. Наиболее часто в основе сердечно-сосудистых заболеваний лежит атеротромбоз - процесс патологического тромбообразования, ведущий к инфаркту миокарда и инсульту.Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality in Russia. The most common basis for cardiovascular disease is atherothrombosis, the process of pathological thrombosis leading to myocardial infarction and stroke.

В образовании тромба значимую роль играют гликопротеиновые рецепторы тромбоцитов. Именно связывание фибриногена с активированными GP IIb/IIIa-рецепторами тромбоцитов является конечным звеном в агрегации последних. Ингибиторы GP IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов являются мощными антитромбоцитарными препаратами, так как механизм их действия заключается в блокировании конечного этапа агрегации тромбоцитов - процесса образования мостиков из молекул фибриногена между соседними активированными тромбоцитами. Антагонисты GP IIb/IIIa рецепторов тромбоцитов представлены разными классами химических соединений, однако существенный интерес среди антиагрегантов представляют антагонисты GP IIb/IIIa рецепторов, имеющие пептидную природу.In the formation of a blood clot, a significant role is played by platelet glycoprotein receptors. It is the binding of fibrinogen with activated platelet GP IIb / IIIa receptors that is the final link in the aggregation of the latter. Inhibitors of GP IIb / IIIa platelet receptors are powerful antiplatelet agents, as their mechanism of action is to block the final stage of platelet aggregation, the process of forming bridges from fibrinogen molecules between adjacent activated platelets. Antagonists of GP IIb / IIIa platelet receptors are represented by different classes of chemical compounds, however, antagonists of GP IIb / IIIa receptors of a peptide nature are of significant interest.

Известно также, что в результате взаимодействия оксида азота (NO) с тромбоцитами и лейкоцитами снижается их агрегация и адгезия на стенках кровеносных сосудов, что приводит к ингибированию процессов тромбообразования. Нарушения, связанные с нормальным протеканием вышеуказанных реакций, лежат в основе патофизиологических процессов, характерных для развития различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. При таких заболеваниях наблюдаются множественные нарушения синтеза эндогенного NO, его рецепции растворимой формой гуанилатциклазы (рГЦ), а также регуляции уровня циклических нуклеотидов и ионов кальция [Dessy С, Ferron О. Pathophysiological Roles of Nitric Oxide: In the Heart and the Coronary Vasculature. Current Medical Chemistry - Anti-mflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2004. Vol. 3. P. 207-216].It is also known that as a result of the interaction of nitric oxide (NO) with platelets and leukocytes, their aggregation and adhesion on the walls of blood vessels decrease, which leads to inhibition of thrombogenesis. Disorders associated with the normal course of the above reactions underlie the pathophysiological processes characteristic of the development of various diseases of the cardiovascular system. In such diseases, multiple disturbances in the synthesis of endogenous NO, its reception by the soluble form of guanylate cyclase (rHC), and the regulation of the level of cyclic nucleotides and calcium ions are observed [Dessy C, Ferron O. Pathophysiological Roles of Nitric Oxide: In the Heart and the Coronary Vasculature. Current Medical Chemistry - Anti-mflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2004. Vol. 3. P. 207-216].

К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате биотрансформации нитроглицерина и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов. Однако, их существенным недостатком является возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга. 2004, 360 с.].To date, the formation of nitric oxide as a result of biotransformation of nitroglycerin and other nitrates, which are used to treat cardiovascular diseases as anti-ischemic and antianginal drugs, has been proven. However, their significant drawback is the occurrence of tolerance and other side effects with prolonged use [Granik VG, Grigoryev NB Nitric oxide (NO). A new path to the search for medicines: a monograph. - M.: University book. 2004, 360 pp.].

В связи с этим проводится поиск новых соединений, способных образовывать NO в живом организме неэнзиматическим путем. Данный подход рассматривается как актуальное и перспективное направление создания новых, более эффективных в сравнении с известными ранее антигипертензивными и антиагрегантными фармпрепаратами, обладающими антиангинальной и антиишемической активностью.In this regard, a search is being made for new compounds capable of forming NO in a living organism by a non-enzymatic pathway. This approach is considered as an urgent and promising direction of creating new, more effective in comparison with previously known antihypertensive and antiaggregant pharmaceuticals with antianginal and anti-ischemic activity.

Один из классов химических соединений, производные которого являются донорами оксида азота - фуроксаны. Фуроксаны рассматриваются как пролекарства, реализующие свою биологическую активность через рГЦ-цГМФ-путь [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга. 2004, 360 с; Граник В.Г., Каминка М.Э., Григорьев М.Б., Северина И.С., Калинкина М.А., Макаров В.А., Левина В.И. Фуроксанопиримидины как экзогенные доноры оксида азота // Хим. Фарм. Журнал. 2002, Том 36, №10, стр. 7-11].One of the classes of chemical compounds, derivatives of which are donors of nitric oxide - furoxanes. Furoxans are considered as prodrugs that realize their biological activity through the rGC-cGMP pathway [Granik VG, Grigoryev NB Nitric oxide (NO). A new path to the search for medicines: a monograph. - M.: University book. 2004, 360 s; Granik V.G., Kaminka M.E., Grigoriev M.B., Severina I.S., Kalinkina M.A., Makarov V.A., Levina V.I. Furoxanopyrimidines as exogenous donors of nitric oxide // Chem. Farm. Journal. 2002, Volume 36, No. 10, pp. 7-11].

В патенте RU 2119354 1998 описан направленный транспорт лекарств, заключающийся в связывании in vivo молекул-носителей фармакоактивных соединений с форменными элементами крови. Для связывания синтезированы производные фармакологических агентов и пептида, содержащего RGD последовательность. Однако, в вышеописанном патенте не рассматривается антиагрегационное действие пептида и он используется лишь как носитель фармакоактивных соединений.The patent RU 2119354 1998 describes the directed transport of drugs, which consists in binding in vivo carrier molecules of pharmacologically active compounds with blood cells. Derivatives of pharmacological agents and a peptide containing the RGD sequence have been synthesized for binding. However, the above patent does not address the anti-aggregation effect of the peptide and is used only as a carrier of pharmacologically active compounds.

В патенте US №2012/021007 2012 г. был проведен скрининг фуроксанов, однако их антиагрегационная активность не исследовалась.In US patent No. 2012/021007 2012, furoxans were screened, however, their anti-aggregation activity was not investigated.

В патентах RU 2123046 1998 г. и RU 2139932 1998 г. описаны фуроксаны как доноры оксида азота и активаторы рГЦ, но данные по их антиагрегационной активности не представлены.Patents RU 2123046 1998 and RU 2139932 1998 describe furoxans as nitric oxide donors and activators of RHC, but data on their anti-aggregation activity are not presented.

В патенте US №7838023 2010 г. упоминается, что биологически активные производные фуроксана обладают антиагрегационной активностью, однако никаких данных по исследованиям не приведено.In US patent No. 7838023 2010, it is mentioned that biologically active derivatives of furoxan have anti-aggregation activity, however, no research data are provided.

Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов с двумя различными механизмами воздействия на агрегацию тромбоцитов, состоящих из двух фармакофор: пептидной - ингибиторы GP IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов и фуроксановой - доноры оксида азота.The present invention is the creation of new effective platelet aggregation inhibitors with two different mechanisms of action on platelet aggregation, consisting of two pharmacophores: peptide inhibitors of platelet GP IIb / IIIa receptors and furoxan - nitric oxide donors.

Поставленная задача решается гетеромерными пептидами на основе имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксана общей формулы:The problem is solved by heteromeric peptides based on imidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxane of the general formula:

где R=Phe-Ile-Ala-Asp-Thr; Arg-Tyr-Gly-Asp-Arg; Lys-Ile-Ala-Asp-Asp; His-Ile-Giy-Asp-Asp.where R = Phe-Ile-Ala-Asp-Thr; Arg-Tyr-Gly-Asp-Arg; Lys-Ile-Ala-Asp-Asp; His-Ile-Giy-Asp-Asp.

Предварительный выбор именно этих соединений в качестве вероятных ингибиторов агрегации тромбоцитов сделан на основании результатов математического моделирования.A preliminary choice of these particular compounds as likely inhibitors of platelet aggregation was made based on the results of mathematical modeling.

С помощью программы «Алгокомб» [Ramensky V., Sobol A., Zaitseva N. et al. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results // Proteins. - 2007; 69 (2): 349-357] нами выполнено компьютерное моделирование связывания гетеромерных пептидов с имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксановым фрагментом на N-конце с белком интегрин αIIb/β3. Расчет оценки связывания [Хельтье Х.-Д., Зиппель В., Роньян Д. и др. Молекулярное моделирование: теория и практика. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 318] с белком интегрин αIIb/β3 проводился для соединений вида Fur-A-B-C-Asp-D, где «Fur» - метиленимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксан; «А», «В», «С», «D» - L-аминокислотные остатки, структура которых варьировалась в процессе моделирования; в качестве аминокислоты «С» рассматривались глицин или аланин. Всего сгенерировано 48000 молекул.Using the Algocomb program [Ramensky V., Sobol A., Zaitseva N. et al. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results // Proteins. - 2007; 69 (2): 349-357] we performed a computer simulation of the binding of heteromeric peptides to imidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxan fragment at the N-terminus with integrin protein αIIb / β3. Calculation of binding estimates [Helthier H.-D., Zippel V., Ronyan D. et al. Molecular modeling: theory and practice. - M .: BINOM. Laboratory of Knowledge, 2009. - 318] with the integrin protein αIIb / β3 was carried out for compounds of the form Fur-ABC-Asp-D, where "Fur" is methyleneimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3.4 -c ′] difuroxan; “A”, “B”, “C”, “D” - L-amino acid residues, the structure of which varied during the modeling process; glycine or alanine was considered as amino acid “C”. A total of 48,000 molecules were generated.

Для докинга из базы данных PDB (открытая база данных PDB (Protein Data Bank) является общепринятым источником используемой при расчетах информации о пространственной структуре белков) был выбран комплекс белка интегрин αIIb/β3 с идентификатором 2vdp. Докинг начинали с правильного расположения кислотного фрагмента гетеромерного пептида для учета наличия ионной связи лиганда с ионом магния в активном сайте. Так же в процессе докинга учитывали наличие двух молекул воды в активном сайте белка. Молекулы воды образуют водородные связи с С-концевым остатком и с кислородом третьего с С-конца остатка нативного лиганда.For docking from the PDB database (the open PDB database (Protein Data Bank) is a generally accepted source used in calculating the spatial structure of proteins), the integrin protein complex αIIb / β3 with the identifier 2vdp was selected. Docking began with the correct location of the acid fragment of the heteromeric peptide to take into account the presence of the ionic bond of the ligand with the magnesium ion in the active site. In the docking process, the presence of two water molecules in the active site of the protein was taken into account. Water molecules form hydrogen bonds with the C-terminal residue and with the oxygen of the third from the C-terminus of the native ligand residue.

Выбор вышеуказанных четырех соединений из общего количества сгенерированных (48000 молекул) определялся хорошими результатами их оценки связывания с белком интегрин αIIb/β3 (таблица 1).The choice of the above four compounds from the total number of generated (48,000 molecules) was determined by the good results of their assessment of binding to the integrin αIIb / β3 protein (table 1).

Синтез целевых соединений.Synthesis of target compounds.

Синтез гетеромерных пептидов был выполнен на твердой фазе в условиях автоматического пептидного синтезатора ABI 433А PeptideSynthesizer (AppliedBiosystems, США), используя FastMoc 0.25-стратегию. Стратегия FastMoc 0.25 подразумевает последовательное присоединение остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил- используется для защиты N-групп каждого аминокислотного остатка. Остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами.The synthesis of heteromeric peptides was performed on the solid phase in an ABI 433A Peptide Synthesizer automated peptide synthesizer (AppliedBiosystems, USA) using the FastMoc 0.25 strategy. The FastMoc 0.25 strategy involves the sequential addition of amino acid residues to an insoluble polymer substrate. The basic labile group Fmoc - 9-fluorenylmethoxycarbonyl - is used to protect the N-groups of each amino acid residue. Residues that have potentially reactive side chains are protected by acid-resistant groups.

После удаления группы Fmoc пиперидином следующая защищенная аминокислота добавляется, используя или реактив сцепления, или предварительно активированное производное аминокислоты.After removal of the Fmoc group with piperidine, the following protected amino acid is added using either a coupling reagent or a preactivated amino acid derivative.

В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (DCC). Реакция протекает в присутствии 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса.Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) acts as an activator of the first amino acid in the Fmoc strategy in the reaction of its addition to the resin. The reaction proceeds in the presence of 4-dimethylaminopyridine (DCC / DMAP), which plays the role of a catalyst in the process.

В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол / дициклогексилкарбодиимид (HOBt/DCC) в диметилформамиде. Реакция протекает с образованием активированной аминокислоты и N,N′-дициклогексилмочевины (DCU).The activator of the second and subsequent amino acids in the Fmoc strategy is 1-hydroxybenzotriazole / dicyclohexylcarbodiimide (HOBt / DCC) in dimethylformamide. The reaction proceeds with the formation of an activated amino acid and N, N′-dicyclohexylurea (DCU).

Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе.All of the above operations proceed in a peptide synthesizer.

Для снятия гетеромерных пептидов со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: 2.5% тианизола (TAN), 2.5% триизопропилсилана (TIPS), 5.0% этандитиола (EDT), 90.0% трифторуксусной кислоты (TFA). Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия гетеромерных пептидов помещали пептид-смолу и перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали и выдерживали на качалке в течение 4 часов.To remove heteromeric peptides from the resin in a fume hood in a polypropylene tube, a mixture was prepared with the following ratio of components: 2.5% tianisole (TAN), 2.5% triisopropylsilane (TIPS), 5.0% ethanedithiol (EDT), 90.0% trifluoroacetic acid (TFA). The prepared mixture was placed on ice until cooling for 20-30 minutes. Then, a peptide resin was placed in a cold mixture to remove heteromeric peptides and mixed. The peptide-resin tube was placed in a polypropylene tube, closed and kept on a rocking chair for 4 hours.

Экстракция гетеромерных пептидов со смолы проводилась на стеклянном фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метилтретбутиловый эфир). По окончанию снятия сливали смесь со смолой и пептидом на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь, оставляли не менее, чем на 1 час при -20°C. Осадок отфильтровывали, сушили. Схема синтеза гетеромерных пептидов представлена на рисунке 1, где Z = радикалы аминокислот, Pr. Group (Protected Group) = защитные группы аминокислот.Heteromeric peptides were extracted from the resin on a glass funnel filter in a fume hood. The funnel was pre-rinsed twice with MTBE (methyl tertiary butyl ether). At the end of removal, the mixture with resin and peptide was poured onto a Schott filter. The tube in which the TFA reaction was washed was washed, the wash was poured onto the filter. It was filtered under low vacuum until the resin was dried. Cold MTBE was added, the resin was thoroughly washed and filtered until dry. The tube containing the peptide resin was washed three times with cold MTBE and a wash was added to the main drain. The suspension was thoroughly mixed, left for at least 1 hour at -20 ° C. The precipitate was filtered off and dried. The synthesis scheme for heteromeric peptides is shown in Figure 1, where Z = amino acid radicals, Pr. Group (Protected Group) = amino acid protecting groups.

Очистку гетеромерных пептидов осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматографа PtiriFlash 450 (InterChim). Содержание основных веществ после очистки составляло не менее 95%.Heteromeric peptides were purified using a PtiriFlash 450 high performance preparative liquid chromatograph (InterChim). The content of basic substances after purification was at least 95%.

Условия ВЭЖХ: картридж InterChim PF-C18 (20g), 15 мкм. Могут использоваться другие обращенные картриджи С18 или С8.HPLC conditions: InterChim PF-C18 cartridge (20g), 15 μm. Other inverted C18 or C8 cartridges may be used.

a. Детекторная ячейка: препаративнаяa. Detector Cell: Preparative

b. Скорость потока - 20.0 мл/минb. Flow rate - 20.0 ml / min

c. Длина волны: диапазон 200-400 нмc. Wavelength: range 200-400 nm

d. Диапазон детектирования: 2 AUFSd. Detection Range: 2 AUFS

e. Величина петли: 2 мл (объем инжекции 1.5-1.8 мл образца)e. Loop size: 2 ml (injection volume 1.5-1.8 ml of sample)

f. Элюент А: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты в водеf. Eluent A: 5.0% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid in water

g. Элюент В: 0.1% трифторуксусной кислоты в ацетонитрилеg. Eluent B: 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile

h. Градиент: 10-90% В в течение 12 мин.h. Gradient: 10-90% B for 12 min.

Строение синтезированных соединений подтверждено методом хромато-масс-спектроскопии.The structure of the synthesized compounds was confirmed by chromatography-mass spectroscopy.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD - ESI с УФ- и масс-спектрометрическими детекторами: длина волны 220 нм, температура пробоотборника 15°C, температура термостата колонок 40°C. MSD - параметры: температура источника 130°C, температура газа 400°C, напряжение на капилляре 3kV; колонка Waters Acquity 1.7 µm 2.1·50 mm. Градиент от 5 до 100% В за 4 мин (А: 0.1% муравьиной кислоты в воде; В: 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле).Chromatography-mass spectrometric analysis was performed on a Waters MSD SQD-ESI instrument with UV and mass spectrometric detectors: wavelength 220 nm, sampler temperature 15 ° C, column thermostat temperature 40 ° C. MSD - parameters: source temperature 130 ° C, gas temperature 400 ° C, capillary voltage 3kV; column Waters Acquity 1.7 µm 2.1 · 50 mm. A gradient of 5 to 100% B in 4 minutes (A: 0.1% formic acid in water; B: 0.1% formic acid in acetonitrile).

Исходные производные аминокислот, содержащие защитные группы, полимерная подложка и растворители для пептидного синтеза произведены фирмой «Applied Biosystems», США, N-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксан получен по методике [В.В. Топоров, В.Л. Королев, В.П. Ившин, В.М. Даниленко. Исследование поведения имидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксанов в реакциях нитрования, алкилирования и кислотного гидролиза. // Тез. докл. XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Москва, 23-28 сентября, 2007, 462].The initial derivatives of amino acids containing protective groups, a polymer substrate and solvents for peptide synthesis were manufactured by Applied Biosystems, USA, N-carboxymethylimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxane obtained by the method [V.V. Toporov, V.L. Korolev, V.P. Ivshin, V.M. Danilenko. Study of the behavior of imidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxanes in nitration, alkylation and acid hydrolysis reactions. // Abstract. doc. XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, Moscow, September 23-28, 2007, 462].

Пример 1. К 423.73 мг полимерной подложки Wang Resin (количество активных центров 0.59 ммоль/г, масштаб синтеза 0.25 моль) добавляли 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Thr(tBu)-OH в диметилформамиде, 10 мл раствора дициклогексилкарбодиимида (1 моль) / 4-диметиламинопиридина (0.1 моль) в диметилформамиде, выдерживали 1 час, промывали 3×5 мл диметилформамида. Добавляли 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде, выдерживали 20 минут, промывали 3×5 мл диметилформамида. Добавляли 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Asp(otBu)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1-гидроксибензотриазола (0.1 моль) / дициклогексилкарбодиимида (1 моль) в диметилфорамиде, выдерживали 30 мин, промывали 3×5 мл диметилформамида. Добавляли 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде, выдерживали 20 минут, промывали 3×5 мл диметилформамида. Аналогично Fmoc-Asp(otBu)-OH последовательно пришивали Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH с последующей депротекцией 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде после каждого цикла присоединения аминокислоты. Добавляли 10 мл раствора 0,1 ммоль N-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксана в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1-гидроксибензотриазола (0.1 моль) / дициклогексилкарбодиимида (1 моль) в диметилфорамиде, выдерживали 30 мин, промывали 3×5 мл диметилформамида, 3×5 мл дихлорметана. Все вышеперечисленные операции проходили в пептидном синтезаторе. К полимерной подложке с присоединенным гетеромерным пептидом добавляли 10 мл охлажденного раствора, содержащего: 250 мкл TAN, 250 мкл TIPS, 500 мкл EDT, 9 мл TFA, перемешивали 4 часа, отфильтровали на фильтре Шотта (поры 40) при вакууме. К маточному раствору кислоты, содержащей гетеромерный пептид, добавляли 50 мл холодного метилтретбутилового эфира (МТВЕ), перемешивали, охлаждали при -20°C на 1 час, осадок отфильтровывали на фильтре Шотта (поры 14). Получали 151,3 мг (выход 72%) продукта. Масс-спектр [MS (ES)] m/z 840.6 [М+Н]⁺, время удерживания 2.78 мин.Example 1. To 423.73 mg of the Wang Resin polymer substrate (the number of active sites is 0.59 mmol / g, the synthesis scale is 0.25 mol), 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Thr (tBu) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of dicyclohexylcarbodiimide (1 mol) / were added 4-dimethylaminopyridine (0.1 mol) in dimethylformamide, held for 1 hour, washed with 3 × 5 ml of dimethylformamide. Added 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide, kept for 20 minutes, washed with 3 × 5 ml of dimethylformamide. 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Asp (otBu) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1-hydroxybenzotriazole (0.1 mol) / dicyclohexylcarbodiimide (1 mol) in dimethylformamide were added, kept for 30 min, washed with 3 × 5 ml of dimethylformamide. Added 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide, kept for 20 minutes, washed with 3 × 5 ml of dimethylformamide. Similarly, Fmoc-Asp (otBu) -OH was sequentially sewn with Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, followed by deprotection of 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide after each amino acid addition cycle. 10 ml of a solution of 0.1 mmol of N-carboxymethylimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxan in dimethyl foramide, 10 ml of a solution of 1-hydroxybenzotriazole (0.1 mol) / dicyclohexylcarbodiimide (10 ml) were added. 1 mol) in dimethylformamide, held for 30 min, washed with 3 × 5 ml of dimethylformamide, 3 × 5 ml of dichloromethane. All of the above operations were performed in a peptide synthesizer. 10 ml of a cooled solution containing 250 μl of TAN, 250 μl of TIPS, 500 μl of EDT, 9 ml of TFA was added to a polymer substrate with a heteromeric peptide attached, stirred for 4 hours, filtered on a Schott filter (pores 40) under vacuum. To the mother liquor of the acid containing the heteromeric peptide, 50 ml of cold methyl tert-butyl ether (MTBE) was added, stirred, cooled at -20 ° C for 1 hour, and the precipitate was filtered off on a Schott filter (pores 14). 151.3 mg (72% yield) of product were obtained. Mass spectrum [MS (ES)] m / z 840.6 [M + H] ⁺ , retention time 2.78 min.

Пример 2. В условиях, описанных в примере 1, из 2 х 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Arg(Pbf)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Asp(otBu)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Gly-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Tyr-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль №карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксана в диметилфорамиде получали 152.9 мг (выход 65%) продукта. Масс-спектр [MS (ES)] m/z 940.7 [М+Н]⁺, время удерживания 1.81 мин.Example 2. Under the conditions described in example 1, from 2 x 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Arg (Pbf) -OH in dimethyl foramide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Asp (otBu) -OH in dimethyl foramide, 10 ml of solution 1 mol of Fmoc-Gly-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Tyr-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of No. carboxymethylimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′ ] difuroxane in dimethyl foramide, 152.9 mg (yield 65%) of the product was obtained. Mass spectrum [MS (ES)] m / z 940.7 [M + H] ⁺ , retention time 1.81 min.

Пример 3. В условиях, описанных в примере 1, из 2×10 мл раствора 1 моль Fmoc-Asp(otBu)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Gly-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Ile-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-His(trt)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль N-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксана в диметилфорамиде получали 141.2 мг (выход 68%) продукта. Масс-спектр [MS (ES)] m/z 830.6 [М+Н]⁺, время удерживания 2.16 мин.Example 3. Under the conditions described in example 1, from 2 × 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Asp (otBu) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Gly-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc- Ile-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-His (trt) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of N-carboxymethylimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] Difuroxane in dimethyl foramide, 141.2 mg (68% yield) of the product are obtained. Mass spectrum [MS (ES)] m / z 830.6 [M + H] ⁺ , retention time 2.16 min.

Пример 4. В условиях, описанных в примере 1, из 2×10 мл раствора 1 моль Fmoc-Asp(otBu)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Ala-ОН в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Ile-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль Fmoc-Lys(Boc)-OH в диметилфорамиде, 10 мл раствора 1 моль N-карбоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с′]дифуроксана в диметилфорамиде получали 154.5 мг (выход 74%) продукта. Масс-спектр [MS (ES)] m/z 835.6 [М+Н]⁺, время удерживания 2.11 мин.Example 4. Under the conditions described in example 1, from 2 × 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Asp (otBu) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Ala-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc- Ile-OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of Fmoc-Lys (Boc) -OH in dimethylformamide, 10 ml of a solution of 1 mol of N-carboxymethylimidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] Difuroxane in dimethyl foramide, 154.5 mg (yield 74%) of the product are obtained. Mass spectrum [MS (ES)] m / z 835.6 [M + H] ⁺ , retention time 2.11 min.

Фармакологическое действие.Pharmachologic effect.

Оценку специфической активности антиагрегационного действия гетеромерных пептидов проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Взятие крови проводили непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия (3.8%). Соотношение антикоагулянт: кровь соответствовало 1:9.The specific activity of the antiplatelet activity of heteromeric peptides was evaluated in vitro using the blood of healthy donors. Blood sampling was carried out immediately before the study using sodium citrate (3.8%) as an anticoagulant. The ratio of anticoagulant: blood corresponded to 1: 9.

Антиагрегационная активность полученных соединений изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием аденозиндифосфата (АДФ) в качестве индуктора агрегации тромбоцитов.The anti-aggregation activity of the obtained compounds was studied in platelet-rich plasma using adenosine diphosphate (ADP) as an inducer of platelet aggregation.

Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь сразу после получения центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистирольной посуде, обладающей тромборезистентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и бестромбоцитарная плазма находились при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°C.To prepare platelet-rich plasma, blood immediately after preparation was centrifuged for 10 minutes at 1000 rpm, after which the upper plasma layer was transferred to another tube, and the residue was centrifuged for 20 minutes at 3000 rpm to obtain platelet-free plasma. All procedures were carried out in polystyrene dishes with thromboresistant properties. Throughout the study period, rich and platelet-free plasma was at room temperature, and platelet aggregation was recorded at 37 ° C.

Для исследования специфической антиагрегационной активности руководствовались требованиями к доклиническим исследованиям фармакологических веществ данного класса, утвержденными Фармакологической службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.To study specific anti-aggregation activity, they were guided by the requirements for preclinical studies of pharmacological substances of this class approved by the Pharmacological Service for Supervision of Health and Social Development.

Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна (Born, 1962), основанного на изменении пропускания света (540 нм) через исследуемую плазму при ее постоянном перемешивании (1000 об/мин). В качестве образца сравнения использовали бестромбоцитарную плазму. Светопропускание через бестромбоцитарную плазму принимали за 100%, а светопропускание через богатую тромбоцитами плазму принимали за 0%. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2.5·10^-8 клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмой.Platelet aggregation was studied using the Born turbidimetric method (Born, 1962), based on the change in light transmission (540 nm) through the plasma under study with constant stirring (1000 rpm). Platelet-free plasma was used as a reference sample. Light transmission through platelet-free plasma was taken as 100%, and light transmission through platelet-rich plasma was taken as 0%. The platelet concentration was adjusted to 2.5 × 10 ⁻⁸ cells / ml in platelet-rich plasma by diluting platelet-poor plasma.

Для проведения исследования применяли двухканальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов/счетчик 230LA-2 (НПФ «Биола»). Объем пробы составлял 300 мкл. Время проведения измерения - 8 мин. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 50 мкМ. Получаемые агрегограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации. Изучаемые соединения (в виде водного раствора, при необходимости, содержащего ДМСО до 0.2%) в разных концентрациях добавляли в пробу до внесения индуктора агрегации (АДФ). Полумаксимальное ингибирование (IC₅₀) гетеромерных пептидов представлено в таблице 2.A two-channel laser platelet aggregation analyzer / counter 230LA-2 (NPF Biola) was used for the study. The sample volume was 300 μl. The measurement time is 8 minutes. ADP at a concentration of 50 μM was used as an inductor. The resulting aggregograms are the dependence of the degree of aggregation on the time elapsed after the addition of the aggregation inducer. The studied compounds (in the form of an aqueous solution, if necessary, containing DMSO up to 0.2%) at various concentrations were added to the sample before the introduction of the aggregation inducer (ADP). The half-maximum inhibition (IC ₅₀ ) of heteromeric peptides is presented in table 2.

Claims

Heteromeric peptides based on imidazo [4,5-e] benzo [1,2-s; 3,4-s ′] difuroxan inhibiting platelet aggregation:

where R = Phe-Ile-Ala-Asp-Thr; Arg-Tyr-Gly-Asp-Arg; Lys-Ile-Ala-Asp-Asp; His-Ile-Gly-Asp-Asp.