RU2547564C2 - Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression - Google Patents
Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression Download PDFInfo
- Publication number
- RU2547564C2 RU2547564C2 RU2013134371/15A RU2013134371A RU2547564C2 RU 2547564 C2 RU2547564 C2 RU 2547564C2 RU 2013134371/15 A RU2013134371/15 A RU 2013134371/15A RU 2013134371 A RU2013134371 A RU 2013134371A RU 2547564 C2 RU2547564 C2 RU 2547564C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cholerae
- vitality
- determination
- viability
- samples
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для определения или подтверждения жизнеспособности некультивируемых форм (НФ) V. cholerae O1/O139 в водных объектах при проведении санитарных мероприятий или в научно-исследовательской работе.The invention relates to medical microbiology and can be used to determine or confirm the viability of uncultivated forms (NF) V. cholerae O1 / O139 in water bodies during sanitary events or in research work.
Уровень техникиState of the art
V. cholerae O1/O139 - возбудитель холеры - особо опасного инфекционного заболевания с диарейным синдромом. В окружающей среде и в экспериментальных условиях холерный вибрион может переходит в некультивируемое состояние (НС), которое характеризуется обратимой утратой способности расти на рутинных питательных средах. Образование некультивируемых форм (НФ) V. cholerae существенно затрудняет выявление возбудителя в различных объектах окружающей среды при проведении мониторинговых мероприятий и в исследовательской практике.V. cholerae O1 / O139 - the causative agent of cholera - a particularly dangerous infectious disease with diarrhea syndrome. In the environment and in experimental conditions, the cholera vibrio can turn into an uncultivated state (NS), which is characterized by a reversible loss of ability to grow on routine nutrient media. The formation of uncultivated forms (NF) of V. cholerae significantly complicates the identification of the pathogen in various environmental objects during monitoring activities and in research practice.
Отсутствие роста НФ на лабораторных питательных средах требует развития методов, исключающих необходимость визуализации выросших колоний. К таким методам относятся световая и люминесцентная микроскопия, иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако с помощью перечисленных методов не представляется возможным доказать жизнеспособность обнаруженных микробных клеток, а интактность клетки или амплификация специфической ДНК не эквивалентны жизнеспособности культуры.The absence of NF growth in laboratory nutrient media requires the development of methods that exclude the need for visualization of grown colonies. Such methods include light and luminescent microscopy, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR). However, using the above methods, it is not possible to prove the viability of the detected microbial cells, and the intactness of the cell or amplification of a specific DNA is not equivalent to the viability of the culture.
Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток, получивший название «прямого прижизненного подсчета» (DVD-метод от direct viable counts): тестируемую микробную культуру инкубируют с дрожжевым экстрактом в присутствии налидиксовой кислоты, которая подавляет репликацию бактериальной ДНК, блокируя тем самым деление клетки. Жизнеспособные клетки увеличиваются в размере, а визуализация результата ведется с помощью светового микроскопа. Применение данного способа ограничено тем, что из окружающей среды все чаще выделяют культуры V. cholerae O1/O139, устойчивую к налидиксовой кислоте (Mishra A. et al., 2011).A known method for determining the viability of microbial cells, called "direct lifetime counting" (DVD method from direct viable counts): the test microbial culture is incubated with yeast extract in the presence of nalidixic acid, which inhibits the replication of bacterial DNA, thereby blocking cell division. Viable cells increase in size, and visualization of the result is carried out using a light microscope. The use of this method is limited by the fact that cultures of V. cholerae O1 / O139 resistant to nalidixic acid are increasingly isolated from the environment (Mishra A. et al., 2011).
Известен способ определения жизнеспособности микробных клеток витальным окрашиванием акридиновым оранжевым (АО): микробную взвесь инкубируют 1-2 мин с АО в конечной концентрации 0,01% и визуализируют результат с помощью люминесцентного микроскопа. Жизнеспособные клетки флуоресцируют зеленым, а мертвые оранжевым (Hobbie J.E., et al., 1977). Ограничением способа является возможность изменения флуоресценции в зависимости от физиологического состояния культуры, концентрации красителя, времени экспозиции (Иванов В.Б., 1982).A known method for determining the viability of microbial cells by vital staining with acridine orange (AO): the microbial suspension is incubated for 1-2 minutes with AO at a final concentration of 0.01% and the result is visualized using a luminescent microscope. Viable cells fluoresce in green and dead cells in orange (Hobbie J.E., et al., 1977). A limitation of the method is the possibility of changing fluorescence depending on the physiological state of the culture, dye concentration, exposure time (Ivanov VB, 1982).
Учитывая вышеизложенное, для выявления НФ и определения их жизнеспособности чаще всего используют комбинацию микроскопически, молекулярно-генетических, иммуноферментных методов (Luo Z.J. c соавт., 2012, Mishra A. et. al., 2012).In view of the foregoing, a combination of microscopic, molecular genetic, enzyme-linked immunosorbent assays is most often used to detect NFs and determine their viability (Luo Z.J. et al., 2012, Mishra A. et. Al., 2012).
Соответственно, проблема разработки новых способов определения жизнеспособности НФ, которые можно использовать самостоятельно или в комбинации с микроскопическими и/или молекулярно-генетическими методиками, является актуальной.Accordingly, the problem of developing new methods for determining the viability of NF, which can be used independently or in combination with microscopic and / or molecular genetic techniques, is relevant.
Одним из перспективных инструментов определения жизнеспособности является регистрация метаболической активности с помощью радиоизотопных методов исследования, которые обладают очень высокой чувствительностью. Показано, что в НС у V. cholerae наблюдается существенная перестройка метаболизма по сапрофитическому типу, поэтому наиболее перспективной мишенью для разработки способа определения жизнеспособности является фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РДФК), 3-фосфо-D-глицерат-карбоксилаза, код 4.1.1.39.One of the promising tools for determining viability is the registration of metabolic activity using radioisotope research methods, which have very high sensitivity. It was shown that in cholerae NS there is a significant rearrangement of the metabolism according to the saprophytic type, therefore, the most promising target for developing a method for determining viability is the enzyme ribulose diphosphate carboxylase / oxygenase (RDFK), 3-phospho-D-glycerate carboxylase, code 4.1.1.39.
За прототип выбран способ определения активности РДФК в инактивных и некультивируемых клетках холерных вибрионов (Бурша с соавт., 1999 г. Соколенко с соавт. 2002). Данный способ не может быть использован для определения жизнеспособности НФ, так как он применяется для исследования метаболических путей вибрионов, но не учитывает изменение активности фермента в процессе некультивируемой трансформации, изменение концентрации белка при переходе в НС, не использует дополнительные способы контроля жизнеспособности.For the prototype, a method was selected for determining the activity of RDFK in inactive and uncultured cholera vibrio cells (Bursha et al., 1999 Sokolenko et al. 2002). This method cannot be used to determine the viability of NF, since it is used to study the metabolic pathways of vibrios, but does not take into account the change in enzyme activity during uncultivated transformation, the change in protein concentration during transition to NS, does not use additional methods of viability control.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Целью настоящего изобретения является разработка способа определения жизнеспособности НФ по активности РДФК с использованием меченого бикарбоната.The aim of the present invention is to develop a method for determining the viability of NF by the activity of RDFK using labeled bicarbonate.
Поставленная цель достигается тем, что проводят предварительную подготовку исследуемой микробной взвеси и контрольных штаммов V. cholerae O1 и V. cholerae O139, затем определяют концентрацию белка в пробах под контролем витального окрашивания с АО и определяют активность РДФК с помощью меченого бикарбоната.This goal is achieved by the preliminary preparation of the studied microbial suspension and control strains V. cholerae O1 and V. cholerae O139, then the protein concentration in the samples is determined under the control of vital staining with AO and the activity of RDFK is determined using labeled bicarbonate.
Способ осуществляется в соответствии со следующими стадиями:The method is carried out in accordance with the following stages:
1. Подготовка микробных взвесей.1. Preparation of microbial suspensions.
2. Определение белка по Лоури и люминесцентная микроскопия препаратов «раздавленная капля», окрашенных АО.2. Lowry protein determination and fluorescence microscopy of “crushed drop” preparations stained with AO.
3. Определение жизнеспособности НФ по экспрессии РДФК.3. Determination of the viability of NF by expression of RDFK.
На первой стадии контрольные штаммы в вегетативной форме выращивали 18 часов на агаре Маретна, рН 7,6-7,8, смывали 0,85% раствором натрия хлорида, рН 7,4, дважды отмывали центрифугированием в 50 мМ трис-804 буфере, рН 8,0. В этом же буфере концентрацию клеток доводили до 5×1010 кл/мл и разрушали их в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 10 мин на холоду. Аналогичным образом готовили переходные и некультивируемые пробы, для чего 50 мл бактериальной взвеси из флаконов центрифугировали для осаждения клеток при 10000 об/мин 10 мин, 2 мл осадка ресуспендировали в 50 мМ трис-804 буфера, еще раз центрифугировали. Полученную микробную взвесь некультивируемых клеток обрабатывали так же, как вегетативные пробы.At the first stage, control strains in vegetative form were grown for 18 hours on Maretna agar, pH 7.6–7.8, washed with 0.85% sodium chloride solution, pH 7.4, washed twice by centrifugation in 50 mM Tris-804 buffer, pH 8.0. In the same buffer, the cell concentration was adjusted to 5 × 10 10 cells / ml and destroyed in a glass homogenizer with a Teflon pestle for 10 min in the cold. Transitional and uncultured samples were similarly prepared, for which 50 ml of bacterial suspension from the vials were centrifuged to pellet the cells at 10,000 rpm for 10 min, 2 ml of the pellet were resuspended in 50 mM Tris-804 buffers, and centrifuged again. The resulting microbial suspension of uncultured cells was treated in the same way as vegetative samples.
НФ и переходные формы получали следующим образом. Культуру V. cholerae O1/O139 выращивали в течение трех часов на 0,3% бульоне Мартена, рН 7,6, пересевали газоном на агар Мартена, рН 7,8, инкубировали 18 часов при 37°С. Микробную массу смывали с поверхности агара средой суспендирования (речная, морская или дистиллированная вода, 0,85% р-р NaCl). Полученные таким образом микробные взвеси вносили в стеклянные флаконы емкостью 100 мл в объеме 50-70 мл и в конечной концентрации 106-109 мк.кл/мл в зависимости от целей эксперимента. Флаконы хранили в холодильнике при температуре 6-8°С без дополнительной аэрации и без освещения. О переходе в НС судили по отсутствию роста на агаре Мартена и наличию в мазках, окрашенных АО, подвижных или неподвижных флуоресцирующих зеленым клеток. Переходными считались культуры, в которых единичные клетки сохраняли способность расти на агаре Мартена в виде изолированных колоний, при окрашивании АО в препарате «раздавленная капля» количество клеток было близко исходному уровню.NF and transitional forms were prepared as follows. A culture of V. cholerae O1 / O139 was grown for three hours on 0.3% Marten broth, pH 7.6, was plated with lawn on Marten agar, pH 7.8, and incubated for 18 hours at 37 ° C. The microbial mass was washed off the surface of the agar with a suspension medium (river, sea or distilled water, 0.85% NaCl solution). The microbial suspensions thus obtained were introduced into glass bottles with a capacity of 100 ml in a volume of 50-70 ml and in a final concentration of 10 6 -10 9 μl / ml, depending on the purpose of the experiment. The bottles were stored in a refrigerator at a temperature of 6-8 ° C without additional aeration and without lighting. The transition to the NS was judged by the absence of growth on Marten agar and the presence in the smears, stained with AO, of motile or motionless fluorescent green cells. Cultures were considered transient, in which single cells retained the ability to grow on Marten agar in the form of isolated colonies; when staining AO in the “crushed drop” preparation, the number of cells was close to the initial level.
На второй стадии во всех исследуемых образцах определяли активность белка по Лоури, для чего отбирали 500 мкл подготовленной пробы, исследовали, как описано у Lowry et al., 1951, результаты учитывали на фотоколориметре KF-77 при длине волны 560 нм. Параллельно из всех исследуемых проб готовили препарат «раздавленная капля», витально окрашенный АО. Для этого на предметное стекло наносили каплю исследуемой микробной взвеси, добавляли АО в конечной концентрации 0,01% (рабочий раствор АО Sigma; разведение 1:6000 в дистиллированной воде), инкубировали 3-4 мин при комнатной температуре и изучали в люминесцентный микроскоп с иммерсионным объективом, увеличение ×1250, длина волны 420 нм. Наличие в поле зрения подвижных и/или неподвижных клеток типичной или измененной морфологии, флюоресцирующих зеленым, указывало на жизнеспособность культуры.At the second stage, the Lowry protein activity was determined in all the studied samples, for which 500 μl of the prepared sample was taken, investigated as described by Lowry et al., 1951, the results were taken into account using a KF-77 photocolorimeter at a wavelength of 560 nm. In parallel, from all the studied samples the preparation “crushed drop”, vitally colored AO, was prepared. For this, a drop of the studied microbial suspension was applied to a glass slide, AO was added at a final concentration of 0.01% (working solution of AO Sigma; dilution 1: 6000 in distilled water), incubated for 3-4 min at room temperature and studied in a luminescent microscope with immersion lens, magnification × 1250, wavelength 420 nm. The presence in the field of view of mobile and / or motionless cells of a typical or altered morphology, fluorescent green, indicated the viability of the culture.
На третьей стадии реакционная смесь содержала: 18 mM трис-Cl буфер, рН 8,0, 20 mM MgCl2×6H2O; 10 mM дитиотреитола, 4 mM рибозо-5-фосфата и 500 мкл суспензии гомогенизированных клеток. Пробы инкубировали при 30°С 30 минут с целью ферментативного превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат. Затем в реакционную смесь добавляли 0,026 mM NaH14CO3, 6 mM АТФ; 0,6 mM NAD-H и инкубировали 5 минут. Останавливали реакцию 0,02 мл 100% ТХУ. Смесь центрифугировали при 8000 об/мин, 200 мкл полученного супернатанта переносили во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. Подсчет активности вели в сцинтилляционном счетчике Mark-11. Параллельно контролировали радиационный фон. Активность фермента выражали в импульсах в минуту на мкг/белка (имп.мин/мкг белка).In the third stage, the reaction mixture contained: 18 mM Tris-Cl buffer, pH 8.0, 20 mM MgCl 2 × 6H 2 O; 10 mM dithiothreitol, 4 mM ribose-5-phosphate and 500 μl of a suspension of homogenized cells. Samples were incubated at 30 ° C for 30 minutes to enzymatically convert ribose-5-phosphate to ribulose-5-phosphate. Then, 0.026 mM NaH 14 CO 3 , 6 mM ATP was added to the reaction mixture; 0.6 mM NAD-H and incubated for 5 minutes. The reaction was stopped 0.02 ml of 100% TCA. The mixture was centrifuged at 8000 rpm, 200 μl of the obtained supernatant was transferred into vials with 5 ml of ZhS-8 scintillation fluid. The activity was counted in a Mark-11 scintillation counter. In parallel, the background radiation was monitored. Enzyme activity was expressed in pulses per minute per μg / protein (imp.min / μg protein).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1.Example 1
В качестве исследуемых культур использовали контрольные штаммы V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме, переходные и НФ разного возраста этих же культур, полученные во флаконах с морской водой. На первой стадии проводили предварительную подготовку культур: концентрировали центрифугированием, отмывали 50 мМ трис-SO4 буфере, рН 8,0, гомогенизировали на холоду. На второй стадии определяли в исследуемых пробах концентрацию белка по Лоури и готовили препараты «раздавленная капля» с АО, которые микроскопировали с помощью люминесцентного микроскопа. На третьей стадии в подготовленных пробах определяли активность РДФК.As the studied cultures, we used control strains of V. cholerae O1 17551 and V. cholerae O139 17673 in the vegetative form, transitional and NF of different ages of the same cultures obtained in bottles with sea water. At the first stage, cultures were preliminarily prepared: concentrated by centrifugation, washed with 50 mM Tris-SO 4 buffer, pH 8.0, homogenized in the cold. At the second stage, the protein concentration was determined in the studied samples according to Lowry and preparations were prepared for a “crushed drop” with AO, which were microscopied using a luminescent microscope. At the third stage, the prepared samples determined the activity of RDFK.
Из Таблицы 1 видно, что во всех пробах, как вегетативных, так и переходных и некультивируемых, при микроскопировании с флуорохромом фиксировали жизнеспособность культуры. Концентрация белка после небольшого увеличения в переходных популяциях снизилась в НФ, что необходимо учитывать при определении активности исследуемого фермента. Активность РДФК в вегетативных культурах была на уровне фона, что говорит об отсутствии его экспрессии. В переходных пробах обнаружена экспрессия РДФК, радиоактивность образцов превысила значения фона в 1,86-3,17 раз. В НФ активность фермента возросла еще больше, превысив фон в 2,9-3,44 раза. Таким образом, определение активности РДФК позволяет не только подтвердить жизнеспособность НФ, которые не растут на агаре Мартена, но и дифференцировать вегетативные культуры холерных вибрионов от переходных (старвирующих), что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.Table 1 shows that in all samples, both vegetative and transient and uncultivated, microscopy with fluorochrome recorded the viability of the culture. Protein concentration after a small increase in transitional populations decreased in NF, which must be taken into account when determining the activity of the studied enzyme. RDFK activity in vegetative cultures was at the background level, which indicates the absence of its expression. In transient samples, the expression of RDFK was found, the radioactivity of the samples exceeded the background value by 1.86-3.17 times. In NF, the enzyme activity increased even more, exceeding the background by 2.9-3.44 times. Thus, the determination of the activity of RDFK allows not only to confirm the viability of NFs that do not grow on Marten’s agar, but also to differentiate vegetative cultures of cholera vibrios from transient (aging) ones, which should be taken into account during monitoring activities.
Пример 2.Example 2
В качестве исследуемых использовали культуры контрольных штаммов V. cholerae O1 17551 и V. cholerae O139 17673 в вегетативной форме и их некультивируемые варианты возраста 7, 30 и 60 суток, полученные в микрокосмах с различными органическими добавками, которые встречаются в поверхностных водоемах.The cultures of control strains V. cholerae O1 17551 and V. cholerae O139 17673 in the vegetative form and their uncultivated variants of 7, 30, and 60 days old obtained in microcosms with various organic additives found in surface water bodies were used as the studied ones.
мкг/млEnd protein
mcg / ml
На этапе индукции НС в микрокосмы добавляли по одному из следующих компонентов: 1 или 10 мМ NH4Cl и 1 или 10 мМ KNO3, витамин Е 1 или 10 мМ, 1 или 10 мМ янтарной кислоты. Для определения жизнеспособности вегетативные и НФ проводили согласно трем стадиям, описанным выше.At the stage of NS induction, one of the following components was added to microcosms: 1 or 10 mM NH 4 Cl and 1 or 10 mM KNO 3 , vitamin E 1 or 10 mM, 1 or 10 mM succinic acid. To determine viability, autonomic and NF were carried out according to the three stages described above.
Из таблицы 2 видно, что в вегетативных культурах активность РДФК отсутствует. Витальное окрашивание АО показало, что все НФ, взятые в эксперимент, независимо от возраста и среды суспендирования, жизнеспособны. Концентрация белка после небольшого увеличения в 7-суточных НФ, снижалась в более старых культурах, достигая к 60-суткам порога чувствительности метода. Активность РДФК обнаружена как в самых молодых НФ (7-суточных), так и в 60-суточных. Максимальная экспрессия фермента зафиксирована в 30-суточных некультивируемых популяциях. В среднем радиоактивность образцов в 7-суточных НФ превышала уровень фона в 4,19 раз, в 30-суточных - в 26, 38 раз, в 60-суточных - в 7,87 раз.Table 2 shows that in vegetative cultures, the activity of RDFK is absent. Vital staining of AO showed that all NFs taken in the experiment, regardless of age and suspension medium, are viable. The protein concentration after a slight increase in 7-day NF decreased in older cultures, reaching the sensitivity threshold of the method by 60 days. RDFK activity was detected both in the youngest NFs (7-day old) and in 60-day old ones. The maximum expression of the enzyme was recorded in 30-day uncultured populations. On average, the radioactivity of the samples in 7-day NPs exceeded the background level by 4.19 times, in 30-day ones by 26, 38 times, and in 60-day ones by 7.87 times.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что определение активности фермента РДФК в некультивируемых популяциях позволяет выявить жизнеспособные культуры, не зависимо от состава среды инкубирования и возраста НФ с учетом депротеинизации культуры.Thus, from the foregoing, it follows that the determination of the activity of the RDFK enzyme in uncultivated populations makes it possible to identify viable cultures, regardless of the composition of the incubation medium and the age of the NF, taking into account the deproteinization of the culture.
Использование предлагаемого изобретения позволяет с высокой степенью чувствительности (≥20 мкг белка/мл) с помощью меченого бикарбоната определить жизнеспособность некультивируемых холерных вибрионов в водной среде разного состава, преодолевая тем самым главную проблему работы с НФ - отсутствие роста на плотных питательных средах. Обнаружение активности РДФК в некультивируемых или переходных пробах - показатель жизнеспособности возбудителя, трансформации его ферментативного профиля, свидетельство возможности переживания неблагоприятных условий в НС в окружающей среде, что должно учитываться при проведении мониторинговых мероприятий.Using the present invention allows with a high degree of sensitivity (≥20 μg protein / ml) using labeled bicarbonate to determine the viability of uncultured cholera vibrios in an aqueous medium of different compositions, thereby overcoming the main problem of working with NF - lack of growth on solid nutrient media. Detection of RDFK activity in uncultivated or transient samples is an indicator of the pathogen's viability, transformation of its enzymatic profile, evidence of the possibility of experiencing adverse conditions in NS in the environment, which should be taken into account when conducting monitoring activities.
Кроме того, способ может использоваться в научно-исследовательской работе с НФ как высокочувствительный инструмент определения жизнеспособности полученных культур в условиях индукции НС, изучения устойчивости НФ к различным воздействиям (антибиотикам, дезинфицирующим средствам, физическим воздействиям и т.д.) или как подтверждающий жизнеспособность тест при проведении витальной микроскопии или молекулярно-генетических исследований.In addition, the method can be used in research work with NFs as a highly sensitive tool for determining the viability of the obtained cultures under the conditions of induction of NSs, studying the resistance of NFs to various influences (antibiotics, disinfectants, physical influences, etc.) or as a viability test during vital microscopy or molecular genetic studies.
Список использованной литературыList of references
1. Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов V. cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. №6, с.90-91.1. Bursha O.S., Kagramanov B.C., Sokolenko A.V. Determination of the activity of ribulose-diphosphate carboxylase in inactive variants of V. cholerae eltor. // Journal. microbiol., epidemiol. and immunobiol. 1999. No. 6, pp. 90-91.
2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУ. М: 2011 г., 63 с.2. The procedure for organizing and conducting laboratory diagnosis of cholera for laboratories at the territorial, regional and federal levels. MU. M: 2011, 63 p.
3. Соколенко А.В., Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов B.C., Бурша Л.Е. Особенности обмена некультивируемых форм холерных вибрионов. // Успехи современного естествознания. 2002. №2, с.22-30.3. Sokolenko A.V., Lomov Yu.M., Aseeva L.E., Kagramanov B.C., Bursha L.E. Features of the exchange of uncultivated forms of cholera vibrios. // Successes of modern science. 2002. No. 2, p.22-30.
4. Luo Z.J., Zhou Z.S., Hao C.H., Guo Y.S., Liu H.Y., Zheng H.Y., Huang Z. Detection of the viable but nonculturable Escherichia coli 0157:H7 in aquatic microcosm. // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2012. Feb; 46(2): 129-32.4. Luo Z.J., Zhou Z.S., Hao C.H., Guo Y.S., Liu H.Y., Zheng H.Y., Huang Z. Detection of the viable but nonculturable Escherichia coli 0157: H7 in aquatic microcosm. // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2012. Feb; 46 (2): 129-32.
5. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Demonstration of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in fresh water environment of India using ciprofloxacin DFA-DVC method. // Lett. Appl. MicrobioL 2011 Jul; 53(1):124-6.5. Mishra A, Taneja N, Sharma M. Demonstration of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in fresh water environment of India using ciprofloxacin DFA-DVC method. // Lett. Appl. MicrobioL 2011 Jul; 53 (1): 124-6.
6. Mishra A, Taneja N, Sharma М. Viability kinetics, induction, resuscitation and quantitative real-time polymerase chain reaction analyses of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in freshwater microcosm. // J. Appl. Microbiol. 2012 May; 112(5):945-56. Mishra A, Taneja N, Sharma M. Viability kinetics, induction, resuscitation and quantitative real-time polymerase chain reaction analyses of viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in freshwater microcosm. // J. Appl. Microbiol. 2012 May; 112 (5): 945-5
7. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М., «Наука», 1982. - 214 с.7. Ivanov V.B. Active dyes in biology. M., "Science", 1982. - 214 p.
8. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33(5): 1225-1228.8. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33 (5): 1225-1228.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013134371/15A RU2547564C2 (en) | 2013-07-22 | 2013-07-22 | Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013134371/15A RU2547564C2 (en) | 2013-07-22 | 2013-07-22 | Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013134371A RU2013134371A (en) | 2015-01-27 |
RU2547564C2 true RU2547564C2 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53281224
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013134371/15A RU2547564C2 (en) | 2013-07-22 | 2013-07-22 | Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2547564C2 (en) |
-
2013
- 2013-07-22 RU RU2013134371/15A patent/RU2547564C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов V. cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. N6, С.90-91. А.В. СОКОЛЕНКО, Е.И. ШИМАНСКАЯ. Некультивируемые формы патогенных бактерий и здоровье человека. Ж-л Валеология, N2, 2008, с.10-21. Sokolenko A.V. et al. Morphology and enzyme activity of nonculturable forms of Vibrio cholerae. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 2002 Sep-Oct;(5):15-21. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. // Appl. Environ. Microbiol. 1977, 33(5): 1225-1228). Соколенко А.В. и др. Изучение взаимодействия некультивируемых форм холерных вибрионов с моноклональными антителами к липополисахариду О1 и О139 серогрупп // Биотехнология. " 2004. " N 3. " С. 87-92 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013134371A (en) | 2015-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Oliveira et al. | A protocol for determination of conidial viability of the fungal entomopathogens Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from commercial products | |
Davey et al. | Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide | |
Müller et al. | Functional single-cell analyses: flow cytometry and cell sorting of microbial populations and communities | |
Rasmussen et al. | Optical tweezers cause physiological damage to Escherichia coli and Listeria bacteria | |
Caron et al. | Assessment of bacterial viability status by flow cytometry and single cell sorting | |
Holm et al. | A flow-cytometric gram-staining technique for milk-associated bacteria | |
D'hondt et al. | Applications of flow cytometry in plant pathology for genome size determination, detection and physiological status | |
Davey et al. | Estimation of microbial viability using flow cytometry | |
JPH0655157B2 (en) | Rapid detection method for microorganisms in clinical samples | |
US20060134729A1 (en) | Process for the universal detection of microorganisms and reaction environment permitting the implementation of the process | |
Qin et al. | Application of EMA-qPCR as a complementary tool for the detection and monitoring of Legionella in different water systems | |
US20200299748A1 (en) | Method for determining the concentration of intact microorganisms in a sample | |
KR20200111720A (en) | Method for determining microbial concentration | |
US9290789B2 (en) | Method for measuring cells, and reagent for cell measurement | |
Molla Kazemiha et al. | Real-time PCR assay is superior to other methods for the detection of mycoplasma contamination in the cell lines of the National Cell Bank of Iran | |
Nisar et al. | Detection and quantification of viable but non-culturable Legionella pneumophila from water samples using flow cytometry-cell sorting and quantitative PCR | |
RU2547564C2 (en) | Method of vitality determination for no-cultivable forms of vibrio cholerae o1/o139 by ribulose biphosphate carboxylaze expression | |
Tebaldi et al. | Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds by flow cytometry, immunostaining and direct viable counting | |
ROLAIN et al. | Experimental infection of human erythrocytes from alcoholic patients with Bartonella quintana | |
Ali et al. | A fluorescence‐based assay for in vitro screening of Saprolegnia inhibitors | |
Ranganayaki et al. | Methods and techniques for isolation, enumeration and characterization of rhizosphere microorganisms | |
US20220145371A1 (en) | Viability detection and quantification assay of waterborne pathogens by enrichment | |
MI | Evaluation of the efficiency of URO-QUICKTM System in the Detection of Urinary Tract Infections and use of Fluorescence In-Situ Hybridization (FISH) In Detection of Escherichia coli in Urine | |
ES2893198T3 (en) | A method of quantifying the capacity of individual bacterial cell cultures using culture-independent parameters | |
Bolgova et al. | Optimal recultivation conditions of Candida albicans staying in non-culturable state |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170723 |