RU2546917C1 - Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) - Google Patents
Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2546917C1 RU2546917C1 RU2013146057/10A RU2013146057A RU2546917C1 RU 2546917 C1 RU2546917 C1 RU 2546917C1 RU 2013146057/10 A RU2013146057/10 A RU 2013146057/10A RU 2013146057 A RU2013146057 A RU 2013146057A RU 2546917 C1 RU2546917 C1 RU 2546917C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsp70
- protein
- sucrose
- carried out
- concentration
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и биофармакологии и касается способа микробиологического синтеза гибридного белка E7-HSP70, в частности, E7(6)HSP70 или E7(11)-HSP70 или E7(16)-HSP70 или E7(18)-HSP70. Эти гибридные белки состоят из аминокислотных последовательностей онкобелка Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) 6, 11, 16 или 18 типов соответственно, слитых с аминокислотной последовательностью белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70) бактерий Mycobacterium tuberculosis, 16 С-концевых аминокислотных остатков которого заменены на искусственную последовательность, включающую 6 остатков гистидина.The invention relates to the field of biotechnology and biopharmacology and relates to a method for microbiological synthesis of a hybrid protein E7-HSP70, in particular, E7 (6) HSP70 or E7 (11) -HSP70 or E7 (16) -HSP70 or E7 (18) -HSP70. These hybrid proteins consist of the amino acid sequences of the human papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (HPV)
Вирус папилломы человека (ВПЧ) 6 и/или 11 типа является возбудителем таких заболеваний, как аногенитальный кондиломатоз и рецидивирующий респираторный папилломатоз (РРП), а (ВПЧ) 16 и/или 18 типа - возбудителем опухолевых заболеваний аногенитальной области.Human papilloma virus (HPV)
Аногенитальный кондиломатоз - возникновение кондилом (бородавок) в аногенитальной области у мужчин и женщин - является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний, передающихся половым путем, и распространенной формой проявления инфекции ВПЧ. Примерно за 90% случаев этого заболевания ответственны ВПЧ 6 и 11 типа, за оставшиеся 10% случаев - ВПЧ 42 и 54 типов [А.В. Миченко, 2010; Баткаев, Э.А., 2001].Anogenital condylomatosis - the occurrence of genital warts (warts) in the anogenital area in men and women - is one of the most common sexually transmitted viral diseases and a common manifestation of HPV infection. For about 90% of cases of this disease,
Несмотря на отсутствие летальных случаев, аногенитальные кондиломы наносят существенный вред здоровью, снижают качество жизни пациентов, требуют длительного лечения и часто рецидивируют независимо от типа лечения. В литературных источниках есть сведения, что кондиломы нередко способствуют развитию рака гениталий [Беляева Т.Л. и соавт., 1989; Васильева, В.В. 1999; Козлова В.И. и соавт., 2000; Кулаков В.И., 2003; Djurdjewic С. et al., 1999; Zielinski G.D. et al., 1999].Despite the absence of fatal cases, anogenital warts cause significant harm to health, reduce the quality of life of patients, require long-term treatment, and often recur regardless of the type of treatment. In the literature there is evidence that condylomas often contribute to the development of genital cancer [T. Belyaeva et al., 1989; Vasiliev, V.V. 1999; Kozlova V.I. et al., 2000; Kulakov V.I., 2003; Djurdjewic C. et al., 1999; Zielinski G..D. et al., 1999].
Особой формой ВПЧ-инфекции является рецидивирующий папилломатоз респираторного тракта (РРП).A particular form of HPV infection is recurrent papillomatosis of the respiratory tract (RRP).
Проблема РРП привлекает пристальное внимание исследователей. Это, прежде всего, связано с тяжестью патологии (рост папиллом в самом узком участке дыхательных путей приводит к выраженному стенозу гортани, вплоть до асфиксии), потенциально возможной малигнизацией папиллом (у взрослых РРП расценивают как облигатное предраковое состояние), а также длительностью заболевания и его клинической непредсказуемостью [Ю.Л. Солдатский Адъювантная терапия …, 2006; В.В. Барышев, В.Г. 2009].The problem of RRS attracts the close attention of researchers. This is primarily due to the severity of the pathology (the growth of papillomas in the narrowest section of the respiratory tract leads to severe laryngeal stenosis, up to asphyxiation), the potential malignancy of papillomas (in adults, RRS is regarded as an obligate precancerous condition), as well as the duration of the disease and its clinical unpredictability [Yu.L. Soldier Adjuvant Therapy ..., 2006; V.V. Baryshev, V.G. 2009].
Рак шейки матки - злокачественная опухоль, которая по данным медицинской статистики среди онкологических заболеваний у женщин занимает четвертое место (после рака желудка, кожи и молочных желез). Источником раковой опухоли шейки матки служат нормальные клетки, покрывающие шейку матки. Ежегодно эту опухоль выявляют более чем у 600 тысяч пациенток. За 70% случаев рака шейки матки ответственны папилломавирусы человека 16 и 18 типов.Cervical cancer is a malignant tumor, which, according to medical statistics, ranks fourth among oncological diseases in women (after cancer of the stomach, skin and mammary glands). The source of a cervical cancer is normal cells that cover the cervix. This tumor is detected annually in more than 600 thousand patients. For 70% of cases of cervical cancer, human papillomaviruses of
Белок Е7, входящий в состав гибридного белка E7-HSP70, играет ключевую роль в репликации ВПЧ и способен влиять на дифференциацию инфицированных клеток. Белок Е7 нарушает регуляцию контроля клеточного цикла, образуя стабильный неактивный комплекс с серией регулирующих клеточный цикл белков, инициирует репликацию вирусных генов и нарушает регуляцию пролиферации инфицированных клеток [Сахарова О.В., М.И. Нечушкин, 1999; De Villiers Е.-М., 1994].The E7 protein, which is part of the E7-HSP70 fusion protein, plays a key role in HPV replication and is able to influence the differentiation of infected cells. Protein E7 disrupts the regulation of cell cycle control, forming a stable inactive complex with a series of proteins that regulate the cell cycle, initiates the replication of viral genes and upregulates the proliferation of infected cells [Sakharova OV, M.I. Nechushkin, 1999; De Villiers E.-M., 1994].
Белок Е7 является белком исключительно вирусного происхождения, постоянно присутствует в инфицированных клетках и отсутствует в неинфицированных, поэтому он является подходящей мишенью для высокоспецифичной иммунотерапии для предотвращения и лечения папилломатоза. Иммунотерапия может быть как терапевтической, нацеленной на активацию Т-клеточного иммунного ответа против антигенов ВПЧ, экспрессируемых в инфицированных клетках, так и профилактической, индуцирующей выработку нейтрализующих антител [Kanodia et al., 2008].Protein E7 is a protein of exclusively viral origin, is constantly present in infected cells and absent in uninfected, therefore it is a suitable target for highly specific immunotherapy for the prevention and treatment of papillomatosis. Immunotherapy can be both therapeutic, aimed at activating the T-cell immune response against HPV antigens expressed in infected cells, and prophylactic, inducing the production of neutralizing antibodies [Kanodia et al., 2008].
Иммуногенность белка Е7 в составе терапевтических вакцин может быть увеличена за счет присоединения к нему белка-носителя, который стимулирует Т-клеточный ответ. Таким белком является белок теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis. Иммунные системы животных способны распознавать многочисленные В и Τ клеточные эпитопы, которые присутствуют в составе этого белка, что позволяет ему выполнять функцию мощного неспецифического стимулятора иммунной системы [Qian et al, 2006].The immunogenicity of the E7 protein in therapeutic vaccines can be increased by attaching to it a carrier protein that stimulates the T-cell response. Such a protein is the heat shock protein HSP70 Mycobacterium tuberculosis. Animal immune systems are able to recognize the numerous B and Τ cell epitopes that are present in this protein, which allows it to function as a powerful nonspecific stimulator of the immune system [Qian et al, 2006].
Белки теплового шока (Heat shock protein - HSP) относятся к семейству стрессовых белков и представляют собой полифункциональные белки, метаболизм которых в клетках изменяется в ответ на воздействие неблагоприятных условий. Важнейшими свойствами белков HSP являются их способность к улучшению презентации антигена на поверхности дендритных клеток и макрофагов, а также способность выступать в роли носителей иммуногенных пептидов [Gaston J.S.H., Clin. Exp. Immunol. 127: 1-3, 2002; Khlebodarova T.M., Genetika 38: 437-452, 2002; Lussow A.R. et al., Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302, 1991., а также патент РФ 2229307].Heat shock proteins (HSPs) belong to the family of stress proteins and are multifunctional proteins whose metabolism in cells changes in response to adverse conditions. The most important properties of HSP proteins are their ability to improve the presentation of antigen on the surface of dendritic cells and macrophages, as well as the ability to act as carriers of immunogenic peptides [Gaston J.S.H., Clin. Exp. Immunol. 127: 1-3, 2002; Khlebodarova T.M., Genetika 38: 437-452, 2002; Lussow A.R. et al., Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302, 1991., and also the patent of the Russian Federation 2229307].
Одними из наиболее важных представителей белков HSP являются белки семейства HSP70. В настоящее время известно более 10 представителей HSP70 эукариот [Bernelli-Zazzera A. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 120-124, 1992.]. В отличие от большинства других стрессовых белков HSP функционируют в виде мономеров и обладают способностью к связыванию крупных пептидных фрагментов. В качестве основного компонента новых препаратов наиболее предпочтительным является использование HSP70 из Mycobacterium tuberculosis, поскольку этот белок вызывает наиболее мощную стимуляцию клеточного иммунологического ответа к связанным с ним антигенным пептидам.One of the most important representatives of HSP proteins are the proteins of the HSP70 family. Currently, more than 10 representatives of HSP70 eukaryotes are known [Bernelli-Zazzera A. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 120-124, 1992.]. Unlike most other stressful proteins, HSPs function as monomers and are capable of binding large peptide fragments. As the main component of the new drugs, it is most preferable to use HSP70 from Mycobacterium tuberculosis, since this protein causes the most powerful stimulation of the cellular immunological response to related antigenic peptides.
Российская компания ООО «Аванген» разработала способ получения препарата на основе гибридного белка E7-HSP70, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа и белка HSP70 Mycobacterium tuberculosis [RU 2290204]. В способе, разработанном ООО «Аванген», биосинтез целевого белка осуществляют в клетках Escherichia coli, трансформированных плазмидой pQE30-E711-dnaK. Белок получают в виде телец включения. После разрушения клеток бактерий тельца включения отмывают и проводят денатурацию-ренатурацию целевого белка. Исходя из описания [RU 2290204], можно предположить, что отсутствие в процессе получения белка E7-HSP70 специфических стадий очистки препарата от комплекса липополисахаридов (ЛПС) будет приводить к тому, что препараты белка E7-HSP70, получаемые согласно описанной процедуре, будут содержать значительное и варьирующее от образца к образцу количество бактериального ЛПС, обладающего токсичным и пирогенным действием. Тем самым применение в лечебных целях белка E7-HSP70, синтезированного в клетках E. coli, будет затруднено.The Russian company Avangen LLC has developed a method for producing a preparation based on the E7-HSP70 hybrid protein, which consists of
В качестве ближайшего аналога заявляемого способа рассмотрим способ получения белка E7-HSP70, содержащего аминокислотную последовательность белка Е7 ВПЧ 11 типа (RU 2489481), в котором описано использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве альтернативных продуцентов белка E7-HSP70. Эти дрожжи, входящие в список микроорганизмов, безопасных для человека, не содержат токсичный и пирогенный бактериальный ЛПС [Gordonova et al., 2002]. В настоящее время их используют для производства 28 разрешенных к применению в медицине белков, включая вакцины [Ferrer-Miralles et al., 2009].As the closest analogue of the proposed method, we consider a method for producing E7-HSP70 protein containing the amino acid sequence of
В ближайшем аналоге приводится способ получения рекомбинантного гибридного белка E7-HSP70, состоящего из аминокислотной последовательности онкобелка Е7 вируса папилломы человека 11 типа, слитой с аминокислотной последовательностью белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70) бактерий Mycobacterium tuberculosis. Штамм S. cerevisiae SCR-702-E7-HSP70 продуцент E7-HSP70 получают путем трансформации лабораторного штамма S. cerevisiae D702 экспрессионным вектором pPDX3-E7-HSP70. Способ получения рекомбинантного гибридного белка заключается в культивировании штамма-продуцента в ферментере объемом 3 л. 50 мл посевного материала используют для засева 3-литрового ферментера Anglicon, содержащего 950 мл среды YPD. Ферментацию проводят при температуре 28°С, аэрации 1 л/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин. Через 24 часа после засева ферментера начинают подпитку среды культивирования 50%-м раствором глюкозы со скоростью 2 мл/ч и устанавливают рН-статирование культуры на уровне рН 6.8±0.1, используя для подтитровки растворы 10% серной кислоты и 10% NaOH. Общее время ферментации составляет 72 часа.The closest analogue provides a method for producing a recombinant E7-HSP70 fusion protein consisting of the amino acid sequence of the Oncoprotein E7 of
По данным электрофоретического анализа уровень продукции рекомбинантного белка E7-HSP70 составляет 100 мг/л среды (3).According to electrophoretic analysis, the production level of the recombinant protein E7-HSP70 is 100 mg / l of medium (3).
Способ - ближайший аналог характеризуется недостаточно высоким уровнем микробиологического синтеза при значительной продолжительности времени культивирования.Method - the closest analogue is characterized by an insufficiently high level of microbiological synthesis with a significant duration of cultivation time.
Задача заявляемого изобретения: расширение арсенала способов микробиологического синтеза гибридного белка E7-HSP70.The objective of the invention: the expansion of the arsenal of methods of microbiological synthesis of the hybrid protein E7-HSP70.
Задача решена путем:The problem is solved by:
- разработки способа микробиологического синтеза гибридного белка E7(6)-HSP70 путем культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3919, продуцирующих такой белок, в подходящих условиях на среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу, а процесс культивирования проводят в две фазы: первую из которых осуществляют при температуре 25-26°С и начальной концентрации сахарозы 25-30 г/л, а по достижении концентрации сахарозы в среде 15 мг/л для проведения второй фазы процесса культивирования температуру снижают и поддерживают на уровне не более 23°С, значение рН поддерживают на уровне 5,7-5,9, а концентрацию сахарозы поддерживают на уровне 15 мг/л путем экспоненциальной подпитки;- development of a method for microbiological synthesis of the E7 (6) -HSP70 hybrid protein by culturing the yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3919 producing such a protein under suitable conditions on a medium containing sucrose as a carbon source, and the cultivation process is carried out in two phases: the first of which are carried out at a temperature of 25-26 ° C and an initial concentration of sucrose of 25-30 g / l, and upon reaching a concentration of sucrose in the medium of 15 mg / l for the second phase of the cultivation process, the temperature is reduced and maintained at a level of no more than 23 ° C, the pH value is maintained at a level of 5.7-5.9, and the concentration of sucrose is maintained at a level of 15 mg / l by exponential feeding;
- разработки способа микробиологического синтеза гибридного белка E7(11)-HSP70 путем культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3853, продуцирующих такой белок, в подходящих условиях на среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу, а процесс культивирования проводят в две фазы: первую из которых осуществляют при температуре 25-26°С и начальной концентрации сахарозы 25-30 г/л, а по достижении концентрации сахарозы в среде 15 мг/л для проведения второй фазы процесса культивирования температуру снижают и поддерживают на уровне не более 23°С, значение рН поддерживают на уровне 5,7-5,9, а концентрацию сахарозы поддерживают на уровне 15 мг/л путем экспоненциальной подпитки;- development of a method for microbiological synthesis of the E7 (11) -HSP70 hybrid protein by culturing the yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-3853 producing such a protein under suitable conditions on a medium containing sucrose as a carbon source, and the cultivation process is carried out in two phases: the first of which are carried out at a temperature of 25-26 ° C and an initial concentration of sucrose of 25-30 g / l, and upon reaching a concentration of sucrose in the medium of 15 mg / l for the second phase of the cultivation process, the temperature is reduced and maintained at a level of no more than 23 ° C , the pH value is maintained at 5.7-5.9, and the sucrose concentration is maintained at 15 mg / L by exponential feeding;
- разработки способа микробиологического синтеза гибридного белка E7(16)-HSP70 путем культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-4057, продуцирующих такой белок, в подходящих условиях на среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу, а процесс культивирования проводят в две фазы: первую из которых осуществляют при температуре 25-26°С и начальной концентрации сахарозы 25-30 г/л, а по достижении концентрации сахарозы в среде 15 мг/л для проведения второй фазы процесса культивирования температуру снижают и поддерживают на уровне не более 23°С, значение рН поддерживают на уровне 5,7-5,9, а концентрацию сахарозы поддерживают на уровне 15 мг/л путем экспоненциальной подпитки;- development of a method for microbiological synthesis of the E7 (16) -HSP70 hybrid protein by cultivating the yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-4057 producing such a protein under suitable conditions on a medium containing sucrose as a carbon source, and the cultivation process is carried out in two phases: the first of which are carried out at a temperature of 25-26 ° C and an initial concentration of sucrose of 25-30 g / l, and upon reaching a concentration of sucrose in the medium of 15 mg / l for the second phase of the cultivation process, the temperature is reduced and maintained at a level of no more than 23 ° C , the pH value is maintained at 5.7-5.9, and the sucrose concentration is maintained at 15 mg / L by exponential feeding;
- разработки способа микробиологического синтеза гибридного белка E7(18)-HSP70 путем культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-4058, продуцирующих такой белок, в подходящих условиях на среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу, а процесс культивирования проводят в две фазы: первую из которых осуществляют при температуре 25-26°С и начальной концентрации сахарозы 25-30 г/л, а по достижении концентрации сахарозы в среде 15 мг/л для проведения второй фазы процесса культивирования температуру снижают и поддерживают на уровне не более 23°С, значение рН поддерживают на уровне 5,7-5,9, а концентрацию сахарозы поддерживают на уровне 15 мг/л путем экспоненциальной подпитки.- development of a method for microbiological synthesis of the E7 (18) -HSP70 hybrid protein by culturing the yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-4058 producing such a protein under suitable conditions on a medium containing sucrose as a carbon source, and the cultivation process is carried out in two phases: the first of which are carried out at a temperature of 25-26 ° C and an initial concentration of sucrose of 25-30 g / l, and upon reaching a concentration of sucrose in the medium of 15 mg / l for the second phase of the cultivation process, the temperature is reduced and maintained at a level of no more than 23 ° C , the pH value is maintained at a level of 5.7-5.9, and the sucrose concentration is maintained at a level of 15 mg / L by exponential recharge.
Способ в общем видеThe method in General
Инокулят одного из штаммов-продуцентов выращивают в колбах Эрленмейера с питательной стерильной средой А, содержащей в мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 2, KH2PO4 - 0,01, (NH4)2SO4 - 0,5, вода - остальное.The inoculum of one of the producer strains is grown in Erlenmeyer flasks with sterile nutrient medium A, containing in wt. %: peptone - 2, yeast extract - 2, KH 2 PO 4 - 0.01, (NH 4 ) 2 SO 4 - 0.5, water - the rest.
Для получения инокулята в каждую колбу вносят раствор сахарозы до концентрации 25-30 г/л и по 1 мл стока рабочей культуры в 15% глицерине. Колбы инкубируют при встряхивании (200 об/мин) при температуре 25-26°С и до конечной оптической плотности не менее 10 о.е.To obtain an inoculum, a sucrose solution is added to each flask to a concentration of 25-30 g / l and 1 ml of the working culture effluent in 15% glycerol. The flasks are incubated with shaking (200 rpm) at a temperature of 25-26 ° C and to a final optical density of at least 10 p.u.
В ферментере подготавливают питательную среду А и стерилизуют ее при 116°С в течение 40 мин. В остывшую среду вносят раствор сахарозы до концентрации 25-30 г/л. Инокулят переносят в ферментер, при этом посевная доза составляет 4-7% от объема среды А.In a fermenter, culture medium A is prepared and sterilized at 116 ° C. for 40 minutes. A sucrose solution is added to the cooled medium to a concentration of 25-30 g / l. The inoculum is transferred to the fermenter, while the inoculum dose is 4-7% of the volume of medium A.
Процесс культивирования делится на два этапа - фаза накопления биомассы и фаза биосинтеза целевого продукта. Целью первого этапа является максимальное накопление пула клеток, необходимых для производства продукта. Для этого на первом этапе культивирования созданы оптимальные условия для активного роста культуры.The cultivation process is divided into two stages - the phase of biomass accumulation and the phase of biosynthesis of the target product. The goal of the first stage is to maximize the accumulation of the pool of cells needed to produce the product. For this, the first stage of cultivation created optimal conditions for the active growth of the culture.
В течение первого этапа клетки активно растут благодаря повышенной температуре 25-26°С, обогащенной культуральной среде и стартовому субстрату - сахарозе. В течение первой фазы культивирования в процессе отсутствует рН-статирование, с начала второй фазы культивирования рН поддерживают на уровне 5,7-5,9.During the first stage, cells grow actively due to an elevated temperature of 25-26 ° C, an enriched culture medium and a starting substrate - sucrose. During the first phase of cultivation, there is no pH-stating in the process; from the beginning of the second phase of cultivation, the pH is maintained at 5.7-5.9.
С 22-24 часа культивирования по достижении концентрации сахарозы в среде 15 мг/л проводят биосинтез гибридного белка. Для повышения уровня экспрессии температуру роста снижают до уровня не более 23°С и проводят подпитку сахарозой, поддерживая ее концентрацию на уровне 15 мг/л.From 22-24 hours of cultivation, upon reaching sucrose concentration in the medium of 15 mg / l, biosynthesis of the hybrid protein is carried out. To increase the level of expression, the growth temperature is reduced to a level of no more than 23 ° C and sucrose is fed, maintaining its concentration at the level of 15 mg / L.
Культивирование проводят в течение 60-65 ч.Cultivation is carried out for 60-65 hours
Уровень биосинтеза целевого белка в результате культивирования штамма S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70 или S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70 или S. cerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 или S. cerevisiae SCR-702-E7(18)-HSP70 в ферментере составляет не менее 550 мг/л культуральной жидкости.The level of biosynthesis of the target protein as a result of cultivation of the strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 or S. cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70 or S. cerevisiae SCR-702-E7 (16) -HSP70 or S. cerevisiae SCR-702-E7 (18) -HSP70 in the fermenter is at least 550 mg / l of culture fluid.
Заявляемое изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг. 1. Параметры культивирования штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70 в объеме 10 л по предлагаемой схеме. По оси абсцисс - часы культивирования, по оси ординат - значения параметров культивирования.FIG. 1. The cultivation parameters of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 in a volume of 10 l according to the proposed scheme. The abscissa shows the cultivation hours, the ordinate shows the cultivation parameters.
Фиг. 2. Анализ содержания белка в лизате биомассы штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70 методом электрофореза в ПААГ, полученной в ходе процесса культивирования по предлагаемой схеме. Стрелкой показано положение полноразмерного белка E7(6)-HSP70.FIG. 2. Analysis of protein content in the biomass lysate of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 by electrophoresis in SDS page obtained during the cultivation process according to the proposed scheme. The arrow shows the position of the full-sized protein E7 (6) -HSP70.
Фиг. 3. Параметры культивирования штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70 в объеме 12 л по предлагаемой схеме. По оси абсцисс - часы культивирования, по оси ординат - значения параметров культивирования.FIG. 3. The cultivation parameters of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70 in a volume of 12 l according to the proposed scheme. The abscissa shows the cultivation hours, the ordinate shows the cultivation parameters.
Фиг. 4. Анализ содержания белка в лизате биомассы штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70 методом электрофореза в ПААГ, полученной в ходе процесса культивирования по предлагаемой схеме. Стрелкой показано положение полноразмерного белка E7(11)-HSP70.FIG. 4. Analysis of the protein content in the biomass lysate of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70 by SDSP electrophoresis obtained during the cultivation process according to the proposed scheme. The arrow shows the position of the full-sized protein E7 (11) -HSP70.
Фиг. 5. Western-анализ лизатов биомассы штаммов-продуцентов S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70 и S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70. Для Western-анализа использовали антитела anti-HPV 11, oncoprotein Е7 Mab 711-66, специфичные к белку Е7 11 типа. St-внутренний стандарт белка E7(11)HSP70; 1,3-лизаты биомассы штамма S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70; 2,4-лизаты биомассы штамма S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70.FIG. 5. Western analysis of biomass lysates of producer strains of S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 and S. cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70. For Western analysis, anti-HPV 11 antibodies, oncoprotein E7 Mab 711-66, specific for
Фиг. 6. Western-анализ образцов субстанций белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, Е7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70. Для Western-анализа использовали антитела anti-HSP70 Mab TS29, специфичные к белку HSP70. 1, 2, 3, 4 - образцы субстанций белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70 соответственно.FIG. 6. Western analysis of samples of substances of the proteins E7 (6) -HSP70, E7 (11) -HSP70, E7 (16) -HSP70 and E7 (18) -HSP70. Anti-HSP70 Mab TS29 antibodies specific for the HSP70 protein were used for Western analysis. 1, 2, 3, 4 — samples of substances of the proteins E7 (6) -HSP70, E7 (11) -HSP70, E7 (16) -HSP70 and E7 (18) -HSP70, respectively.
Фиг. 7. Параметры культивирования штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 в объеме 10 л по предлагаемой схеме. По оси абсцисс - часы культивирования, по оси ординат - значения параметров культивирования.FIG. 7. The cultivation parameters of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (16) -HSP70 in a volume of 10 l according to the proposed scheme. The abscissa shows the cultivation hours, the ordinate shows the cultivation parameters.
Фиг. 8. Анализ содержания белка в лизате биомассы штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 методом электрофореза в ПААГ, полученной в ходе процесса культивирования по предлагаемой схеме. Стрелкой показано положение полноразмерного белка E7(16)-HSP70.FIG. 8. Analysis of the protein content in the biomass lysate of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (16) -HSP70 by SDSP electrophoresis obtained during the cultivation process according to the proposed scheme. The arrow shows the position of the full-sized protein E7 (16) -HSP70.
Фиг. 9. Параметры культивирования штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7(18)-HSP70 в объеме 10 л по предлагаемой схеме. По оси абсцисс - часы культивирования, по оси ординат - значения параметров культивирования.FIG. 9. The cultivation parameters of the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (18) -HSP70 in a volume of 10 l according to the proposed scheme. The abscissa shows the cultivation hours, the ordinate shows the cultivation parameters.
Фиг. 10. Карта экспрессионной плазмиды pPDX3U-E7(6)-HSP70. Бирепликонная плазмида pPDX3U-E7(6)-HSP70 содержит структурный ген рекомбинантного белка E7(6)-HSP70 (E7(6)-HSP70), включающего в свой состав последовательности онкобелка Е7 вируса папилломы человека серотипа-6 и белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis, 16 С-концевых аминокислотных остатков которого замещены на искусственную последовательность, включающую 6 остатков гистидина, слитый в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей убиквитин (Ubi) дрожжей S. cerevisiae, под контролем промотора GAL1 (GAL1). В состав вектора входят последовательности ДНК, кодирующие селективные маркеры URA3 (URA3) и PGK1 (PGK1) дрожжей S. cerevisiae, последовательность терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей S. cerevisiae (cyc1T), обеспечивающая терминацию транскрипции гена слитого белка, а также фрагмент 2-микронной эндогенной плазмиды дрожжей S. cerevisiae (2 mkm), обеспечивающий репликацию плазмиды pPDX3U-E7(6)-HSP70 в клетках дрожжей S. cerevisiae, и фрагмент плазмиды pUC18 (pUC18), содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и ориджин репликации, и обеспечивающий селективную амплификацию вектора в клетках E. coli.FIG. 10. Map of the expression plasmid pPDX3U-E7 (6) -HSP70. The bireplicon plasmid pPDX3U-E7 (6) -HSP70 contains the structural gene of the recombinant protein E7 (6) -HSP70 (E7 (6) -HSP70), which includes the sequence of the oncoprotein E7 of human papilloma virus serotype-6 and the heat shock protein HSP70 Mycobacterium tuberosis , 16 C-terminal amino acid residues of which are replaced by an artificial sequence comprising 6 histidine residues, fused in the same reading frame as the sequence encoding the ubiquitin (Ubi) of S. cerevisiae yeast, under the control of the GAL1 (GAL1) promoter. The vector contains DNA sequences encoding the selective markers URA3 (URA3) and PGK1 (PGK1) of S. cerevisiae yeast, the sequence terminator for the transcription term of the S. cerevisiae yeast CYC1 gene (cyc1T), which terminates the transcription of the fusion protein gene, as well as a 2-micron fragment an endogenous S. cerevisiae yeast plasmid (2 mkm) that replicates the pPDX3U-E7 (6) -HSP70 plasmid in S. cerevisiae yeast cells and a pUC18 plasmid fragment (pUC18) containing the beta-lactamase gene (ApR) and the origin of replication, and providing selective amplification of the vector in E. coli cells.
Фиг. 11. Карта экспрессионной плазмиды pPDX3U-E7(16)-HSP70. Бирепликонная плазмида pPDX3U-E7(16)-HSP70 содержит структурный ген рекомбинантного белка E7(16)-HSP70 (E7(16)-HSP70), включающего в свой состав последовательности онкобелка Е7 вируса папилломы человека серотипа-16 и белка теплового шока Hsp70 Mycobacterium tuberculosis, 16 С-концевых аминокислотных остатков которого замещены на искусственную последовательность, включающую 6 остатков гистидина, слитый в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей убиквитин (Ubi) дрожжей S. cerevisiae, под контролем промотора GAL1 (GAL1). В состав вектора входят последовательности ДНК, кодирующие селективные маркеры URA3 (URA3) и PGK1 (PGK1) дрожжей S. cerevisiae, последовательность терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей S. cerevisiae (cyc1T), обеспечивающая терминацию транскрипции гена слитого белка, а также фрагмент 2-микронной эндогенной плазмиды дрожжей S. cerevisiae (2 mkm), обеспечивающий репликацию плазмиды pPDX3U-E7(16)-HSP70 в клетках дрожжей S. cerevisiae, и фрагмент плазмиды pUC18 (pUC18), содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и ориджин репликации, и обеспечивающий селективную амплификацию вектора в клетках E. coli.FIG. 11. Map of the expression plasmid pPDX3U-E7 (16) -HSP70. The bireplicon plasmid pPDX3U-E7 (16) -HSP70 contains the structural gene of the recombinant protein E7 (16) -HSP70 (E7 (16) -HSP70), which includes the sequence of the oncoprotein E7 of human papilloma virus serotype-16 and the heat shock protein Hsp70 Mycobacterium tuberosis , 16 C-terminal amino acid residues of which are replaced by an artificial sequence comprising 6 histidine residues, fused in the same reading frame as the sequence encoding the ubiquitin (Ubi) of S. cerevisiae yeast, under the control of the GAL1 (GAL1) promoter. The vector contains DNA sequences encoding the selective markers URA3 (URA3) and PGK1 (PGK1) of S. cerevisiae yeast, the sequence terminator for the transcription term of the S. cerevisiae yeast CYC1 gene (cyc1T), which terminates the transcription of the fusion protein gene, as well as a 2-micron fragment an endogenous S. cerevisiae yeast plasmid (2 mkm) that replicates pPDX3U-E7 (16) -HSP70 plasmid in S. cerevisiae yeast cells and a pUC18 plasmid fragment (pUC18) containing the beta-lactamase gene (ApR) and the origin of replication, and providing selective amplification of the vector in E. coli cells.
Фиг. 12. Карта экспрессионной плазмиды pPDX3U-E7(18)-HSP70. Бирепликонная плазмида pPDX3U-E7(18)-HSP70 содержит структурный ген рекомбинантного белка E7(18)-HSP70 (E7(18)-HSP70), включающего в свой состав последовательности онкобелка Е7 вируса папилломы человека серотипа-18 и белка теплового шока Hsp70 Mycobacterium tuberculosis, 16 С-концевых аминокислотных остатков которого замещены на искусственную последовательность, включающую 6 остатков гистидина, слитый в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей убиквитин (Ubi) дрожжей S. cerevisiae, под контролем промотора GAL1 (GAL1). В состав вектора входят последовательности ДНК, кодирующие селективные маркеры URA3 (URA3) и PGK1 (PGK1) дрожжей S. cerevisiae, последовательность терминатора транскрипции гена CYC1 дрожжей S. cerevisiae (cyc1T), обеспечивающая терминацию транскрипции гена слитого белка, а также фрагмент 2-микронной эндогенной плазмиды дрожжей S. cerevisiae (2 mkm), обеспечивающий репликацию плазмиды pPDX3U-E7(18)-HSP70 в клетках дрожжей S. cerevisiae, и фрагмент плазмиды pUC18 (pUC18), содержащий ген бета-лактамазы (ApR) и ориджин репликации, и обеспечивающий селективную амплификацию вектора в клетках E. coli.FIG. 12. Map of the expression plasmid pPDX3U-E7 (18) -HSP70. The bireplicon plasmid pPDX3U-E7 (18) -HSP70 contains the structural gene of the recombinant protein E7 (18) -HSP70 (E7 (18) -HSP70), which includes the human papilloma virus E7 oncoprotein sequence serotype-18 and the heat shock protein Hsp70 Mycobacterium tuberosis , 16 C-terminal amino acid residues of which are replaced by an artificial sequence comprising 6 histidine residues, fused in the same reading frame as the sequence encoding the ubiquitin (Ubi) of S. cerevisiae yeast, under the control of the GAL1 (GAL1) promoter. The vector contains DNA sequences encoding the selective markers URA3 (URA3) and PGK1 (PGK1) of S. cerevisiae yeast, the sequence terminator for the transcription term of the S. cerevisiae yeast CYC1 gene (cyc1T), which terminates the transcription of the fusion protein gene, as well as a 2-micron fragment an endogenous S. cerevisiae yeast plasmid (2 mkm), which replicates the pPDX3U-E7 (18) -HSP70 plasmid in S. cerevisiae yeast cells, and a pUC18 plasmid fragment (pUC18) containing the beta-lactamase gene (ApR) and the origin of replication, and providing selective amplification of the vector in E. coli cells.
Пример 1. Способ микробиологического синтеза гибридного белка E7(6)-HSP70Example 1. The method of microbiological synthesis of a hybrid protein E7 (6) -HSP70
Разработка структуры синтетического гена и синтез гена белка Е7 серотипа 6.The development of the structure of the synthetic gene and the synthesis of the E7 protein gene of
Синтетический ген кодирует белок, идентичный прототипу белка Е7 вируса папилломы человека серотипа 6 (GenBank, Р06464). В структуре гена используются кодоны, наиболее часто используемые в высокоэкспрессируемых генах дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Для облегчения последующих стадийThe synthetic gene encodes a protein identical to the prototype of the human papillomavirus E7 protein serotype 6 (GenBank, P06464). The codons most commonly used in highly expressed yeast genes Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris are used in the gene structure. To facilitate subsequent stages
клонирования в составе вектора экспрессии структурный ген белка Е7(6) фланкирован сайтами рестрикции BglII и BamHI.Cloning of the expression vector of the structural gene of the E7 protein (6) is flanked by the BglII and BamHI restriction sites.
Конструирование фрагмента ДНК, кодирующего белок E7-Hsp70 типа 6Construction of a DNA fragment encoding an E7-
ДНК ранее сконструированной плазмиды pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] расщепляют по уникальным концевым сайтам BglII и BamH1. Уникальный BglII/BamH1 фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-11 вируса папилломы человека серотипа 11, замещают на синтетический BglII/BamH1 фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-6 папилломы человека серотипа 6. В результате получают плазмиду pUC19MX-E7(6)-HSP70. Полученная плазмида pUC19MX-E7(6)-HSP70 содержит ген рекомбинантного белка E7(6)-HSP70, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 6-ого типа и белка теплового шока Hsp70 из М. tuberculosis, содержащего на С-конце взамен 16 С-концевых аминокислотных остатков природного белка Hsp70 аминокислотную последовательность, включающую 6 остатков гистидина.The DNA of the previously constructed plasmid pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] is cleaved at the unique terminal sites of BglII and BamH1. The unique BglII / BamH1 DNA fragment containing the sequence of the structural gene of the E7 HPV-11 protein of
Конструирование экспрессионного вектора рРDХ3-GAL1UConstruction of the expression vector pPDX3-GAL1U
Конструирование проводят с использованием лабораторного вектора pPDX3. Вектор pPDX3 отличается от вектора pPDX2 [RU 2010123696] тем, что включает вариант структурного гена URA3, содержащий мутацию в последовательности сайта Ncol (ccatgg изменен на ccatga), не приводящую к инактивации гена URA3. Конструирование проводят следующим образом.The design is carried out using the laboratory vector pPDX3. The pPDX3 vector differs from the pPDX2 vector [RU 2010123696] in that it includes a variant of the URA3 structural gene containing a mutation in the Ncol site sequence (ccatgg changed to ccatga), which does not lead to inactivation of the URA3 gene. The design is as follows.
Структурный ген убиквитина дрожжей амплифицируют в реакции ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК лабораторного штамма S. cerevisiae Y618(1), выделяемой по методу Сидорука(2). Праймерами для ПЦР-амплификации служат N513-A (5′-ggagaaaaaactaccatgcagatcttcgtcaag) и N514 (5′-actggatccacctcttagccttagcacaac). Амплифицируют фрагмент ДНК плазмиды pUC18x-GAL1, заключающий нуклеотидную последовательность промотора гена GALl дрожжей S.cerevisiae. Праймерами для ПЦР-амплификации служат N168 (5′-gccagggttttcccagtcacga) и N513-B (5′-cttgacgaagatctgcatggtagttttttctcc). Амплифицированные фрагменты ДНК смешивают и лигируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N168 и N514. Результирующий фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля с использованием кита Qiagen (Qiagen, cat-No 28706), обрабатывают рестриктазами HindIII и XhoI и клонируют в расщепленном по тем же сайтам лабораторном векторе pPDX3.The structural gene of yeast ubiquitin is amplified in a PCR reaction using the laboratory strain S. cerevisiae Y618 (1) isolated by the Sidoruk method (2) as a chromosomal DNA template. Primers for PCR amplification are N513-A (5′-ggagaaaaaactaccatgcagatcttcgtcaag) and N514 (5′-actggatccacctcttagccttagcacaac). The DNA fragment of plasmid pUC18x-GAL1 amplifying the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GALl promoter is amplified. Primers for PCR amplification are N168 (5′-gccagggttttcccagtcacga) and N513-B (5′-cttgacgaagatctgcatggtagttttttctcc). Amplified DNA fragments are mixed and ligated in a PCR reaction using primers N168 and N514. The resulting DNA fragment was eluted from the agarose gel using a Qiagen whale (Qiagen, cat No. 28706), digested with HindIII and XhoI restriction enzymes, and cloned into the pPDX3 laboratory vector digested at the same sites.
В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3-GAL1U, ДНК которого содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую убиквитин дрожжей S.cerevisiae, слитую с нуклеотидной последовательностью промоторной области гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae.Cloning yields the expression vector pPDX3-GAL1U, the DNA of which contains a nucleotide sequence encoding the S. cerevisiae yeast ubiquitin fused to the nucleotide sequence of the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter region.
Конструирование экспрессионного вектора pPDX3U-E7(6)-HSP70Construction of the expression vector pPDX3U-E7 (6) -HSP70
BglII/XhoI фрагмент ДНК плазмиды pUC19MX-E7(6)-HSP70, заключающийBglII / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC19MX-E7 (6) -HSP70, concluding
структурный ген белка E7(6)-HSP70, включающего аминокислотные последовательности онкобелка Е7 ВПЧ 6-ого типа и белка теплового шока Hsp70 М. tuberculosis, содержащего на С-конце последовательность, включающую 6 остатков гистидина, лигируют с ДНК экспрессионного вектора pPDX3-GAL1U, расщепленного по сайтам BamHI и XhoI.the structural gene of the E7 (6) -HSP70 protein, including the amino acid sequences of
В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3U-E7(6)-HSP70 (Фиг. 10), включающий последовательность структурного гена рекомбинантного белка E7(6)-HSP70, слитую с последовательностью гена убиквитина дрожжей S. cerevisiae под контролем промотора гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae.Cloning yields the expression vector pPDX3U-E7 (6) -HSP70 (Fig. 10), including the sequence of the structural gene of the recombinant protein E7 (6) -HSP70, fused to the sequence of the S. cerevisiae yeast ubiquitin gene under the control of the yeast GAL1 gene promoter S. cerevisiae.
Конструирование штамма S.cerevisiae ВКПМ Y-3919Construction of strain S.cerevisiae VKPM Y-3919
Штамм ВКПМ Y-3919, продуцент белка E7(6)-HSP70 получают в результате трансформации лабораторного штамма D702 [RU 2489481] экспрессионным вектором pPDX3U-E7(6)-HSP70. Для трансформации клетки штамма D702 подращивают в течение 18-24 часов при температуре 28°С на агаризованной среде YPGE, следующего состава в мас. %: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, бактоагар - 2, этанол - 2, глицерин - 3, вода - остальное. Трансформацию выращенных клеток штамма D702 проводят по методу Ito (3). Трансформанты отбирают по способности расти на среде YPD следующего состава, в масс. %: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, бактоагар - 2, вода - остальное. Один из полученных трансформантов называют штаммом S.cerevisiae ВКПМ Y-3919.The VKPM strain Y-3919, a protein producer of E7 (6) -HSP70, was obtained by transforming the laboratory strain D702 [RU 2489481] with the expression vector pPDX3U-E7 (6) -HSP70. To transform the cells of strain D702 grow up for 18-24 hours at a temperature of 28 ° C on agar medium YPGE, the following composition in wt. %: bactopeptone - 2, yeast extract - 1, bactoagar - 2, ethanol - 2, glycerin - 3, water - the rest. The transformation of the grown cells of strain D702 is carried out according to the Ito method (3). Transformants are selected for their ability to grow on the YPD medium of the following composition, in mass. %: bactopeptone - 2, yeast extract - 1, glucose - 2, bactoagar - 2, water - the rest. One of the obtained transformants is called a strain of S. cerevisiae VKPM Y-3919.
Микробиологический синтез белка E7(6)-HSP70Microbiological protein synthesis E7 (6) -HSP70
Заявляемый способ реализован для штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7 (6)-HSP70 (ВКПМ Y-3919) при культивировании в ферментере (Sartorius Biostat С30-3, Германия) в объеме среды 10 л. Культивирование ведут при температуре 26°С в ходе первой фазы и при температуре 21°С в ходе второй фазы, при концентрации растворенного кислорода 50-100% при скорости перемешивания 800 об/мин, уровне аэрации 10 л/мин. Во второй фазе культивирования рН поддерживают на уровне 5,7 титрованием 20%-ным раствором фосфорной кислоты и 12,5%-ным раствором аммиака. Инокулят в объеме 0,5 л выращивают до оптической плотности 15 о.е. (оптических единиц) и вносят в ферментер со стерильной питательной средой. В качестве стартового субстрата в среду вносят сахарозу до концентрации 30 г/л. После внесения инокулята в биореактор и установки значений контроллера производят мониторинг основных параметров роста культуры: ОД600, рН, морфология клеток, уровень растворенного кислорода, концентрация сахарозы в культуральной жидкости. Первые 10 часов роста клетки утилизируют сахарозу с образованием спирта (процесс брожения). Значение рН при этом снижается. Затем культуру клеток переключают на потребление спирта, рН растет. В этот же момент резко падает уровень рО2, идет процесс дыхания. Кривая рН принимает характерную S-образную форму. На выходе на плато, на 25 часу роста с началом второй фазы культивирования начинают рН-статирование на уровне 5,9, снижают температуру до значения 23°С и проводят экспоненциальную подпитку 50%-ным раствором сахарозы. Подпитку ведут так, чтобы концентрация сахарозы в культуральной жидкости не превышала 15 мг/л, при этом в культуре идет процесс дыхания, происходит автоиндукция экспрессии, но рост культуры не тормозится. На 59 часу роста оптическая плотность составляет 130 о.е., при этом скорость роста культуры падает до 0,01. На 60 час культивирование остановлено.The inventive method is implemented for the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 (VKPM Y-3919) when cultured in a fermenter (Sartorius Biostat C30-3, Germany) in a volume of 10 l. Cultivation is carried out at a temperature of 26 ° C during the first phase and at a temperature of 21 ° C during the second phase, with a dissolved oxygen concentration of 50-100% at a stirring speed of 800 rpm, an aeration level of 10 l / min. In the second phase of cultivation, the pH is maintained at a level of 5.7 by titration with a 20% solution of phosphoric acid and a 12.5% solution of ammonia. The inoculum in a volume of 0.5 l is grown to an optical density of 15 p.u. (optical units) and contribute to the fermenter with a sterile culture medium. As a starting substrate, sucrose is added to the medium to a concentration of 30 g / l. After the inoculum is introduced into the bioreactor and the controller values are set, the main parameters of the culture growth are monitored: OD 600 , pH, cell morphology, level of dissolved oxygen, concentration of sucrose in the culture fluid. The first 10 hours of cell growth utilize sucrose to form alcohol (fermentation process). The pH value is reduced. Then the cell culture is switched to alcohol consumption, the pH rises. At the same moment, the level of pO 2 drops sharply, and the process of respiration is in progress. The pH curve takes a characteristic S-shape. On reaching the plateau, at 25 hours of growth, with the beginning of the second phase of cultivation, pH-stating is started at a level of 5.9, the temperature is reduced to a value of 23 ° C and exponential feeding with a 50% sucrose solution is performed. Make-up is carried out so that the concentration of sucrose in the culture fluid does not exceed 15 mg / l, while the process of respiration is in progress, expression is auto-induced, but the growth of the culture is not inhibited. At 59 hours of growth, the optical density is 130 pu, while the growth rate of the culture drops to 0.01. At 60 hours cultivation is stopped.
Для анализа уровня накопления растворимого гибридного белка E7(6)HSP70 биомассу штамма-продуцента суспендируют в лизирующем буфере с ингибиторами протеаз (1 мМ EDTA и 2 мМ PMSF) и разрушают путем дезинтеграции в гомогенизаторе Bullet Blender (Next Advance, США) с использованием стеклянных шариков диаметром 500 мкм при 12000 об/мин в течение 5 мин при +4°C. Лизаты дрожжевых клеток анализируют методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах проводят с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).To analyze the accumulation level of the soluble E7 (6) HSP70 fusion protein, the biomass of the producer strain is suspended in a lysis buffer with protease inhibitors (1 mM EDTA and 2 mM PMSF) and destroyed by disintegration in a Bullet Blender homogenizer (Next Advance, USA) using glass beads with a diameter of 500 microns at 12,000 rpm for 5 min at + 4 ° C. Yeast cell lysates were analyzed by electrophoresis in 8% PAGE in the presence of Laemmli sodium dodecyl sulfate. The analysis of the intensity of the bands on electrophoregrams is carried out using the Gene Tools software (Syngene, England).
Продуктивность штамма S. cerevisiae SCR-702-E7(6)-HSP70 при культивировании составила 580 мг/л культуральной жидкости.The productivity of the strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (6) -HSP70 during cultivation was 580 mg / l of culture fluid.
Пример 2. Способ микробиологического синтеза гибридного белка E7(11)-HSP70Example 2. The method of microbiological synthesis of a hybrid protein E7 (11) -HSP70
Заявляемый способ реализован для штамма-продуцента & cerevisiae SCR-702-E7 (11)-HSP70 (ВКПМ Y-3853) при культивировании в ферментере (Sartorius Biostat С30-3, Германия) в объеме среды 12 л. Культивирование ведут при температуре 25°С в ходе первой фазы и при температуре 20°С в ходе второй фазы, при концентрации растворенного кислорода 40-100% при скорости перемешивания 800 об/мин, уровне аэрации 12 л/мин. Во второй фазе культивирования рН поддерживают на уровне 5,9 титрованием 20%-ным раствором фосфорной кислоты и 12,5%-ным раствором аммиака. Инокулят в объеме 0,6 л выращен до оптической плотности 15 о.е. и внесен в ферментер со стерильной питательной средой.The inventive method is implemented for the producer strain & cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70 (VKPM Y-3853) when cultured in a fermenter (Sartorius Biostat C30-3, Germany) in a volume of 12 l. Cultivation is carried out at a temperature of 25 ° C during the first phase and at a temperature of 20 ° C during the second phase, with a dissolved oxygen concentration of 40-100% at a stirring speed of 800 rpm, an aeration level of 12 l / min. In the second phase of the cultivation, the pH is maintained at a level of 5.9 by titration with a 20% solution of phosphoric acid and a 12.5% solution of ammonia. The inoculum in a volume of 0.6 l was grown to an optical density of 15 p.u. and introduced into the fermenter with a sterile nutrient medium.
В качестве стартового субстрата в среду вносят сахарозу до концентрации 25 г/л. После внесения инокулята в биореактор и установки значений контроллера производят мониторинг основных параметров роста культуры: ОД600, рН, морфология клеток, уровень растворенного кислорода, концентрация сахарозы в культуральной жидкости. Первые 9,5 часов роста клетки утилизируют сахарозу до спирта в процессе брожения. Значение рН при этом падает. Затем культуру клеток переключают на потребление спирта, рН растет. В этот же момент резко падает уровень рO2, идет процесс дыхания. Кривая рН принимает характерную S-образную форму. На выходе на плато, на 24,5 часу роста с началом второй фазы культивирования, при этом проводят рН-статирование на уровне 5,7, снижают температуру до значения 23°С и начинают экспоненциальную подпитку 50%-ным раствором сахарозы. Подпитку ведут так, что концентрация сахарозы в культуральной жидкости не превышает 15 мг/л, в культуре идет процесс дыхания, происходит автоиндукция экспрессии, но рост культуры не тормозится. На 64 час роста оптическая плотность составляет 133 о.е., при этом скорость роста культуры - 0,01. На 65 часу процесс культивирования останавливают.As a starting substrate, sucrose is added to the medium to a concentration of 25 g / l. After the inoculum is introduced into the bioreactor and the controller values are set, the main parameters of the culture growth are monitored: OD 600 , pH, cell morphology, level of dissolved oxygen, concentration of sucrose in the culture fluid. The first 9.5 hours of cell growth utilize sucrose to alcohol during fermentation. The pH value decreases. Then the cell culture is switched to alcohol consumption, the pH rises. At the same moment, the level of pO 2 drops sharply, and the process of respiration is in progress. The pH curve takes a characteristic S-shape. At the exit to the plateau, at 24.5 hours of growth with the beginning of the second phase of cultivation, the pH-stating is carried out at the level of 5.7, the temperature is reduced to 23 ° С and the exponential feeding with 50% sucrose solution is started. Make-up is carried out so that the concentration of sucrose in the culture fluid does not exceed 15 mg / l, the process of respiration is in progress, expression is auto-induced, but the growth of the culture is not inhibited. At 64 hours of growth, the optical density is 133 pu, while the growth rate of the culture is 0.01. At 65 hours, the cultivation process is stopped.
Для анализа уровня накопления растворимого гибридного белка E7(11)HSP70 биомассу штамма-продуцента суспендируют в лизирующем буфере с ингибиторами протеаз (1 мМ EDTA и 2 мМ PMSF), разрушают путем дезинтеграции в гомогенизаторе Bullet Blender (Next Advance, США) с использованием стеклянных шариков диаметром 500 мкм при 12000 об/мин в течение 5 мин при +4°C. Лизаты дрожжевых клеток анализируют методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах проводят с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).To analyze the accumulation level of the soluble E7 (11) HSP70 hybrid protein, the biomass of the producer strain is suspended in a lysis buffer with protease inhibitors (1 mM EDTA and 2 mM PMSF), destroyed by disintegration in a Bullet Blender homogenizer (Next Advance, USA) using glass beads with a diameter of 500 microns at 12,000 rpm for 5 min at + 4 ° C. Yeast cell lysates were analyzed by electrophoresis in 8% PAGE in the presence of Laemmli sodium dodecyl sulfate. Analysis of the intensity of the bands on electrophoregrams is carried out using the Gene Tools software (Syngene, England).
В результате продуктивность штамма S. cerevisiae SCR-702-E7(11)-HSP70 составляет 630 мг/л культуральной жидкости.As a result, the productivity of the strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (11) -HSP70 is 630 mg / l of culture fluid.
Пример 3. Способ микробиологического синтеза гибридного белка E7(16)-HSP70Example 3. The method of microbiological synthesis of a hybrid protein E7 (16) -HSP70
Разработка структуры синтетического гена и синтез гена белка Е7 серотипа 16.The development of the structure of the synthetic gene and the synthesis of the E7 protein gene of
Синтетический ген кодирует белок, идентичный прототипу белка Е7 вируса папилломы человека серотипа 16 (GenBank, Р03129). В структуре гена используются кодоны, наиболее часто используемые в высокоэкспрессируемых генах дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Для облегчения последующих стадий клонирования в составе вектора экспрессии структурный ген белка Е7(16) фланкирован сайтами рестрикции BglII и BamHI.The synthetic gene encodes a protein identical to the prototype of the human papillomavirus E7 protein serotype 16 (GenBank, P03129). The codons most commonly used in highly expressed yeast genes Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris are used in the gene structure. To facilitate the subsequent stages of cloning in the expression vector, the structural gene of the E7 protein (16) is flanked by the BglII and BamHI restriction sites.
Конструирование фрагмента ДНК, кодирующего белок E7-Hsp70 типа 16Construction of a DNA fragment encoding an E7-
ДНК ранее сконструированной плазмиды pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] расщепляют по уникальным концевым сайтам BglII и BamHI. Уникальный BglII/BamHl фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-11 вируса папилломы человека серотипа 11, замещают на синтетический BglII/BamH1 фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-16 папилломы человека серотипа 16.The DNA of the previously constructed plasmid pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] is cleaved at the unique terminal sites of BglII and BamHI. A unique BglII / BamHl DNA fragment containing the sequence of the structural gene of the E7 HPV-11 protein of
В результате получают плазмиду pUC19MX-E7(16)-HSP70.The result is the plasmid pUC19MX-E7 (16) -HSP70.
Полученная плазмида pUC19MX-E7(16)-HSP70 содержит ген рекомбинантного белка E7(16)-HSP70, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 16-ого типа и белка теплового шока Hsp70 из M.tuberculosis, содержащего на С-конце взамен 16 С-концевых аминокислотных остатков природного белка Hsp70 аминокислотную последовательность, включающую 6 остатков гистидина.The obtained plasmid pUC19MX-E7 (16) -HSP70 contains the gene for the recombinant protein E7 (16) -HSP70, consisting of HPV oncoprotein E7 of the 16th type and heat shock protein Hsp70 from M. tuberculosis, containing 16 C-terminal ones at the C-terminus amino acid residues of the natural protein Hsp70 amino acid sequence comprising 6 histidine residues.
Конструирование экспрессионного вектора рРDХ3-GAL1UConstruction of the expression vector pPDX3-GAL1U
Конструирование осуществляют таким же образом, как в Примере 1.The design is carried out in the same manner as in Example 1.
Конструирование экспрессионного вектора pPDX3U-E7(16)-HSP70Construction of the expression vector pPDX3U-E7 (16) -HSP70
BglII/XhoI фрагмент ДНК плазмиды pUC19MX-E7(16)-HSP70, заключающий структурный ген белка E7(16)-HSP70, включающего аминокислотные последовательности онкобелка Е7 ВПЧ 16-ого типа и белка теплового шока Hsp70 M.tuberculosis, содержащего на С-конце последовательность, включающую 6 остатков гистидина, лигируют с ДНК экспрессионного вектора pPDX3-GAL1U, расщепленного по сайтам BamHI и XhoI.BglII / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC19MX-E7 (16) -HSP70 containing the structural gene of the E7 (16) -HSP70 protein, including the amino acid sequences of HPV type E7 oncoprotein of
В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3U-E7(16)-HSP70Cloning yields the expression vector pPDX3U-E7 (16) -HSP70
(Фиг. 11), включающий последовательность структурного гена рекомбинантного белка E7(16)-HSP70, слитую с последовательностью гена убиквитина дрожжей S. cerevisiae под контролем промотора гена GAL1 дрожжей S. cerevisiae.(Fig. 11), including the sequence of the structural gene of the recombinant protein E7 (16) -HSP70, fused with the sequence of the ubiquitin gene of the yeast S. cerevisiae under the control of the promoter of the GAL1 gene of the yeast S. cerevisiae.
Конструирование штамма S.cerevisiae ВКПМ Y-4057Construction of S.cerevisiae strain VKPM Y-4057
Штамм ВКПМ Y-4057, продуцент белка E7(16)-HSP70 получают в результате трансформации лабораторного штамма D702 [RU 2489481] экспрессионным вектором pPDX3U-E7(16)-HSP70. Для трансформации клетки штамма D702 подращивают в течение 18-24 часов при температуре 28°С на агаризованной среде YPGE, следующего состава в мас. %: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, бактоагар - 2, этанол - 2, глицерин - 3, вода - остальное. Трансформацию выращенных клеток штамма D702 проводят по методу Ito (3). Трансформанты отбирают по способности расти на среде YPD следующего состава, в мас.%: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, бактоагар - 2, вода - остальное. Один из полученных трансформантов называют штаммом S.cerevisiae ВКПМ Y-4057.The VKPM strain Y-4057, producer of the E7 (16) -HSP70 protein, was obtained by transforming the laboratory strain D702 [RU 2489481] with the expression vector pPDX3U-E7 (16) -HSP70. To transform the cells of strain D702 grow up for 18-24 hours at a temperature of 28 ° C on agar medium YPGE, the following composition in wt. %: bactopeptone - 2, yeast extract - 1, bactoagar - 2, ethanol - 2, glycerin - 3, water - the rest. The transformation of the grown cells of strain D702 is carried out according to the Ito method (3). Transformants are selected according to their ability to grow on YPD medium of the following composition, in wt.%: Bactopeptone - 2, yeast extract - 1, glucose - 2, bactoagar - 2, water - the rest. One of the obtained transformants is called the strain S. cerevisiae VKPM Y-4057.
Микробиологический синтез белка E7(16)-HSP70Microbiological protein synthesis E7 (16) -HSP70
Заявляемый способ реализован для штамма-продуцента S. cerevisiae SCR-702-E7 (16)-HSP70 (ВКПМ Y-4057) при культивировании в ферментере (Sartorius Biostat С30-3, Германия) в объеме среды 10 л. Культивирование ведут при температуре 26°С в ходе первой фазы и при температуре 21°С в ходе второй фазы, при концентрации растворенного кислорода 50-100% при скорости перемешивания 800 об/мин, уровне аэрации 10 л/мин. Во второй фазе культивирования рН поддерживают на уровне 5,9 титрованием 20%-ным раствором фосфорной кислоты и 12,5%-ным раствором аммиака. Инокулят в объеме 0,5 л выращен до оптической плотности 13,5 о.е. и внесен в ферментер со стерильной питательной средой. В качестве стартового субстрата в среду внесят сахарозу до концентрации 27 г/л. После внесения инокулята в биореактор и установки значений контроллера производят мониторинг основных параметров роста культуры: ОД600, рН, морфология клеток, уровень растворенного кислорода, концентрация сахарозы в культуральной жидкости. Первые 10 часов роста клетки утилизируют сахарозу до спирта (процесс брожения). Уровень рН падает. Затем культуру клеток переключают на потребление спирта, уровень рН растет. В этот же момент происходит резкое падение уровня рO2, (начало процесса дыхания). Кривая рН принимает характерную S-образную форму. На выходе на плато, с 25 часа роста идет вторая фаза культивирования, при этом проводят рН-статирование на уровне 5,9, снижают температуру до значения 23°С и начинают экспоненциальную подпитку 50%-ным раствором сахарозы так, чтобы концентрация сахарозы в культуральной жидкости не превышала 15 мг/л. При таких условиях в культуре идет процесс дыхания, происходит автоиндукция экспрессии, а рост культуры не тормозится. На 58 час роста оптическая плотность составляет 135 о.е., а скорость роста культуры - 0,01. На 60 часу культивирование остановливают.The inventive method is implemented for the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (16) -HSP70 (VKPM Y-4057) when cultured in a fermenter (Sartorius Biostat C30-3, Germany) in a volume of 10 l. Cultivation is carried out at a temperature of 26 ° C during the first phase and at a temperature of 21 ° C during the second phase, with a dissolved oxygen concentration of 50-100% at a stirring speed of 800 rpm, an aeration level of 10 l / min. In the second phase of the cultivation, the pH is maintained at a level of 5.9 by titration with a 20% solution of phosphoric acid and a 12.5% solution of ammonia. The inoculum in a volume of 0.5 l was grown to an optical density of 13.5 p.u. and introduced into the fermenter with a sterile nutrient medium. As a starting substrate, sucrose is introduced into the medium to a concentration of 27 g / l. After the inoculum is introduced into the bioreactor and the controller values are set, the main parameters of the culture growth are monitored: OD 600 , pH, cell morphology, level of dissolved oxygen, concentration of sucrose in the culture fluid. The first 10 hours of cell growth utilize sucrose to alcohol (fermentation process). The pH level drops. Then the cell culture is switched to alcohol consumption, the pH level rises. At the same moment, a sharp drop in the level of pO 2 occurs (the beginning of the respiration process). The pH curve takes a characteristic S-shape. At the plateau exit, from the 25th hour of growth, the second phase of cultivation takes place, at the same time, pH-stating is carried out at a level of 5.9, the temperature is reduced to a value of 23 ° C and exponential feeding with a 50% sucrose solution is started so that the concentration of sucrose in the culture fluid did not exceed 15 mg / l. Under such conditions, the process of respiration occurs in the culture, auto-induction of expression occurs, and the growth of the culture is not inhibited. At 58 hours of growth, the optical density is 135 pu, and the culture growth rate is 0.01. At 60 hours, the cultivation is stopped.
Для анализа уровня накопления растворимого гибридного белка E7(16)HSP70 биомассу штамма-продуцента суспендируют в лизирующем буфере с ингибиторами протеаз (1 мМ EDTA и 2 мМ PMSF), разрушают путем дезинтеграции в гомогенизаторе Bullet Blender (Next Advance, США) с использованием стеклянных шариков диаметром 500 мкм при 12000 об/мин в течение 5 мин при +4°C. Лизаты дрожжевых клеток анализируют методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах проводят с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).To analyze the accumulation level of the soluble E7 (16) HSP70 hybrid protein, the biomass of the producer strain is suspended in a lysis buffer with protease inhibitors (1 mM EDTA and 2 mM PMSF), destroyed by disintegration in a Bullet Blender homogenizer (Next Advance, USA) using glass beads with a diameter of 500 microns at 12,000 rpm for 5 min at + 4 ° C. Yeast cell lysates were analyzed by electrophoresis in 8% PAGE in the presence of Laemmli sodium dodecyl sulfate. The analysis of the intensity of the bands on electrophoregrams is carried out using the Gene Tools software (Syngene, England).
Продуктивность штамма S.cerevisiae SCR-702-E7(16)-HSP70 при культивировании составляет 645 мг/л культуральной жидкости.The productivity of the strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (16) -HSP70 during cultivation is 645 mg / l of culture fluid.
Пример 4. Способ микробиологического синтеза гибридного белка E7(18)-HSP70Example 4. The method of microbiological synthesis of the hybrid protein E7 (18) -HSP70
Разработка структуры синтетического гена и синтез гена белка Е7 серотипа 18.Development of the structure of the synthetic gene and synthesis of the E7 protein gene of
Синтетический ген кодирует белок, идентичный прототипу белка Е7 вируса папилломы человека серотипа 18 (GenBank, P06788). В структуре гена используются кодоны, наиболее часто используемые в высокоэкспрессируемых генах дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Для облегчения последующих стадий клонирования в составе вектора экспрессии структурный ген белка Е7(18) фланкирован сайтами рестрикции BglII и BamHI.The synthetic gene encodes a protein identical to the prototype of the human papillomavirus E7 protein serotype 18 (GenBank, P06788). The codons most commonly used in highly expressed yeast genes Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris are used in the gene structure. To facilitate the subsequent stages of cloning in the expression vector, the structural gene of the E7 protein (18) is flanked by the BglII and BamHI restriction sites.
Конструирование фрагмента ДНК, кодирующего белок E7-Hsp70 типа 18Construction of a DNA fragment encoding an E7-
ДНК ранее сконструированной плазмиды pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] расщепляют по уникальным концевым сайтам BglII и BamHI. Уникальный BglII/BamHI фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-11 вируса папилломы человека серотипа 11, замещают на синтетический BglII/BamHI фрагмент ДНК, заключающий последовательность структурного гена белка Е7 ВПЧ-18 папилломы человека серотипа 18.The DNA of the previously constructed plasmid pUC19MX-E7-HSP70 [RU 2489481] is cleaved at the unique terminal sites of BglII and BamHI. A unique BglII / BamHI DNA fragment containing the sequence of the structural gene of the E7 HPV-11 protein of human
В результате получают плазмиду рUС19МХ-Е7(18)-Н8Р70.The result is the plasmid pUC19MX-E7 (18) -H8P70.
Полученная плазмида pUC19MX-E7(18)-HSP70 содержит ген рекомбинантного белка E7(18)-HSP70, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 18-ого типа и белка теплового шока Hsp70 из М. tuberculosis, содержащего на С-конце взамен 16 С-концевых аминокислотных остатков природного белка Hsp70 аминокислотную последовательность, включающую 6 остатков гистидина.The resulting plasmid pUC19MX-E7 (18) -HSP70 contains the gene for the recombinant protein E7 (18) -HSP70, consisting of
Конструирование экспрессионного вектора рРDХ3-GALlUConstruction of the expression vector pPDX3-GALlU
Конструирование осуществляют таким же образом, как в Примере 1.The design is carried out in the same manner as in Example 1.
Конструирование экспрессионного вектора pPDX3U-E7(18)-HSP70Construction of the expression vector pPDX3U-E7 (18) -HSP70
BglII/XhoI фрагмент ДНК плазмиды pUC19MX-E7(18)-HSP70, заключающий структурный ген белка E7(18)-HSP70, включающего аминокислотные последовательности онкобелка Е7 ВПЧ 18-ого типа и белка теплового шока Hsp70 М. tuberculosis, содержащего на С-конце последовательность, включающую 6 остатков гистидина, лигируют с ДНК экспрессионного вектора pPDX3-GAL1U, расщепленного по сайтам BamHI и XhoI.BglII / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC19MX-E7 (18) -HSP70 containing the structural gene of the E7 (18) -HSP70 protein, including the amino acid sequences of
В результате клонирования получают экспрессионный вектор pPDX3U-E7(18)-HSP70Cloning yields the expression vector pPDX3U-E7 (18) -HSP70
(Фиг. 12), включающий последовательность структурного гена рекомбинантного белка E7(18)-HSP70, слитую с последовательностью гена убиквитина дрожжей S.cerevisiae под контролем промотора гена GAL1 дрожжей S.cerevisiae.(Fig. 12), comprising the sequence of the structural gene of the recombinant protein E7 (18) -HSP70, fused with the sequence of the S.cerevisiae yeast ubiquitin gene under the control of the S.cerevisiae yeast GAL1 promoter.
Конструирование штамма S.cerevisiae ВКПМ Y-4058Construction of S.cerevisiae strain VKPM Y-4058
Штамм ВКПМ Y-4058, продуцент белка E7(18)-HSP70 получают в результате трансформации лабораторного штамма D702 [RU 2489481] экспрессионным вектором pPDX3U-E7(18)-HSP70. Для трансформации клетки штамма D702 подращивают в течение 18-24 часов при температуре 28°С на агаризованной среде YPGE, следующего состава в мас. %: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, бактоагар - 2, этанол - 2, глицерин - 3, вода - остальное. Трансформацию выращенных клеток штамма D702 проводят по методу Ito (3). Трансформанты отбирают по способности расти на среде YPD следующего состава, в мас. %: бактопептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, бактоагар - 2, вода - остальное. Один из полученных трансформантов называют штаммом S.cerevisiae ВКПМ Y-4058.The VKPM strain Y-4058, producer of the E7 (18) -HSP70 protein, was obtained by transforming the laboratory strain D702 [RU 2489481] with the expression vector pPDX3U-E7 (18) -HSP70. To transform the cells of strain D702 grow up for 18-24 hours at a temperature of 28 ° C on agar medium YPGE, the following composition in wt. %: bactopeptone - 2, yeast extract - 1, bactoagar - 2, ethanol - 2, glycerin - 3, water - the rest. The transformation of the grown cells of strain D702 is carried out according to the Ito method (3). Transformants are selected by their ability to grow on YPD medium of the following composition, in wt. %: bactopeptone - 2, yeast extract - 1, glucose - 2, bactoagar - 2, water - the rest. One of the obtained transformants is called the strain S. cerevisiae VKPM Y-4058.
Микробиологический синтез белка E7(18)-HSP70Microbiological protein synthesis E7 (18) -HSP70
Заявляемый способ реализован для штамма-продуцента S.cerevisiae SCR-702-E7 (18)-HSP70 (ВКПМ Y-4058) при культивировании в ферментере (Sartorius Biostat С30-3, Германия) в объеме среды 10 л. Культивирование ведут при температуре 26°С в ходе первой фазы и при температуре 20°С в ходе второй фазы, при концентрации растворенного кислорода 50-100% при скорости перемешивания 1000 об/мин, уровне аэрации 10 л/мин. Во второй фазе культивирования рН поддерживают на уровне 5,7 титрованием 20%-ным раствором фосфорной кислоты и 12,5%-ным раствором аммиака. Инокулят в объеме 0,5 л выращен до оптической плотности 13 о.е. и внесен в ферментер со стерильной питательной средой.The inventive method is implemented for the producer strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (18) -HSP70 (VKPM Y-4058) when cultured in a fermenter (Sartorius Biostat C30-3, Germany) in a volume of 10 l. Cultivation is carried out at a temperature of 26 ° C during the first phase and at a temperature of 20 ° C during the second phase, with a dissolved oxygen concentration of 50-100% at a stirring speed of 1000 rpm, aeration level of 10 l / min. In the second phase of cultivation, the pH is maintained at a level of 5.7 by titration with a 20% solution of phosphoric acid and a 12.5% solution of ammonia. The inoculum in a volume of 0.5 l was grown to an optical density of 13 p.u. and introduced into the fermenter with a sterile nutrient medium.
В качестве стартового субстрата в среду вносят сахарозу до концентрации 30 г/л. После внесения инокулята в биореактор и установки значений контроллера производят мониторинг основных параметров роста культуры: ОД600, рН, морфология клеток, уровень растворенного кислорода, концентрация сахарозы в культуральной жидкости. Первые 10 часов роста клетки утилизируют сахарозу до спирта (процесс брожения). Значение рН падает. Затем культуру переключают на потребление спирта, рН растет. В этот же момент происходит резкое падение уровня рO2, идет процесс дыхания. Кривая рН принимает характерную S-образную форму. На выходе на плато, с 24,5 часа роста идет вторая фаза культивирования, при этом проводят рН-статирование на уровне 5,8, снижают температуру до значения 23°С и начинают экспоненциальную подпитку 50%-ным раствором сахарозы так, чтобы концентрация сахарозы в культуральной жидкости не превышала 15 мг/л. При таких условиях в культуре идет процесс дыхания, происходит автоиндукция экспрессии, но рост культуры не тормозится. На 58 час роста оптическая плотность составляет 126,5 о.е., а скорость роста культуры - 0,01. На 60 часу культивирование остановливают.As a starting substrate, sucrose is added to the medium to a concentration of 30 g / l. After the inoculum is introduced into the bioreactor and the controller values are set, the main parameters of the culture growth are monitored: OD 600 , pH, cell morphology, level of dissolved oxygen, concentration of sucrose in the culture fluid. The first 10 hours of cell growth utilize sucrose to alcohol (fermentation process). The pH value drops. Then the culture is switched to alcohol consumption, the pH rises. At the same moment, there is a sharp drop in the level of pO2, there is a process of respiration. The pH curve takes a characteristic S-shape. At the exit to the plateau, from the 24.5 hours of growth, the second phase of cultivation takes place, at the same time, pH-stating is carried out at a level of 5.8, the temperature is reduced to a value of 23 ° C and exponential feeding with a 50% sucrose solution is started so that the sucrose concentration in the culture fluid did not exceed 15 mg / l. Under such conditions, the process of respiration occurs in the culture, expression auto-induction occurs, but the growth of the culture is not inhibited. At 58 hours of growth, the optical density is 126.5 pu, and the growth rate of the culture is 0.01. At 60 hours, the cultivation is stopped.
Для анализа уровня накопления растворимого гибридного белка E7(18)HSP70 биомассу штамма-продуцента суспендируют в лизирующем буфере с ингибиторами протеаз (1 мМ EDTA и 2 мМ PMSF), разрушают дезинтеграцией в гомогенизаторе Bullet Blender (Next Advance, США) с использованием стеклянных шариков диаметром 500 мкм при 12000 об/мин в течение 5 мин при +4°C. Лизаты дрожжевых клеток анализируют методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах проводят с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).To analyze the accumulation level of the soluble E7 (18) HSP70 fusion protein, the biomass of the producer strain is suspended in a lysis buffer with protease inhibitors (1 mM EDTA and 2 mM PMSF), destroyed by disintegration in a Bullet Blender homogenizer (Next Advance, USA) using glass beads with a diameter of 500 μm at 12,000 rpm for 5 min at + 4 ° C. Yeast cell lysates were analyzed by electrophoresis in 8% PAGE in the presence of Laemmli sodium dodecyl sulfate. Analysis of the intensity of the bands on electrophoregrams is carried out using the Gene Tools software (Syngene, England).
Продуктивность штамма S.cerevisiae SCR-702-E7(18)-HSP70 составляет 550 мг/л культуральной жидкости.The productivity of the strain S. cerevisiae SCR-702-E7 (18) -HSP70 is 550 mg / l of culture fluid.
Таким образом, заявляемый способ микробиологического синтеза гибридного белка белка E7(6)-HSP70 или E7(l 1)-HSP70 или E716)-HSP70 или E7(18)-HSP70:Thus, the claimed method of microbiological synthesis of a hybrid protein protein E7 (6) -HSP70 or E7 (l 1) -HSP70 or E716) -HSP70 or E7 (18) -HSP70:
- позволяет синтезировать гибридные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70 в количестве не менее 550 мг/л, что превосходит уровень синтеза гибридного белка E7(11)-HSP70 в ближайшем аналоге более, чем в 5 раз;- allows the synthesis of hybrid proteins E7 (6) -HSP70, E7 (11) -HSP70, E7 (16) -HSP70 and E7 (18) -HSP70 in an amount of not less than 550 mg / l, which exceeds the level of synthesis of the hybrid protein E7 (11 ) -HSP70 in the closest analogue more than 5 times;
- позволяет осуществить процесс микробиологического синтеза гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 или E7(18)-HSP70 в течение не более 65 часов, что на 7 часов меньше, чем время необходимое для синтеза гибридного белка Е7(11)-HSP70 в ближайшем аналоге.- allows the process of microbiological synthesis of hybrid proteins E7 (6) -HSP70, E7 (11) -HSP70, E7 (16) -HSP70 or E7 (18) -HSP70 for no more than 65 hours, which is 7 hours less than time necessary for the synthesis of the hybrid protein E7 (11) -HSP70 in the nearest analogue.
Источники научно-технической информацииSources of scientific and technical information
1. Kartashova N.N., Kuchin S.V., Benevolensky S.V. (1996). Genetic aspects of carbon catabolite repression of the STA2 glucoamylase gene in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12: 1297-13.1. Kartashova N.N., Kuchin S.V., Benevolensky S.V. (1996). Genetic aspects of carbon catabolite repression of the STA2 glucoamylase gene in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 12: 1297-13.
2. Сидорук К.В., Левитан Е.И. (2008). Универсальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов, основанный на предварительной обработке биомассы раствором ацетата аммония. Сборник тезисов и докладов "Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: вторые чтения, посвященные памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко", Дубна: ОИЯИ, 2008, стр.100.2. Sidoruk K.V., Levitan E.I. (2008). A universal method for the isolation of high molecular weight DNA from microorganisms, based on preliminary processing of biomass with a solution of ammonium acetate. Collection of abstracts and reports "Actual issues of genetics, radiobiology and radioecology: second readings dedicated to the memory of V.I. Korogodin and V.A. Shevchenko", Dubna: JINR, 2008, p. 100.
3. Ito, H., et al., Transformation of intact cells treated with alkali cations. J. Bacteriol., 153, 163-8(1983).3. Ito, H., et al., Transformation of intact cells treated with alkali cations. J. Bacteriol., 153, 163-8 (1983).
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013146057/10A RU2546917C1 (en) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013146057/10A RU2546917C1 (en) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2546917C1 true RU2546917C1 (en) | 2015-04-10 |
RU2013146057A RU2013146057A (en) | 2015-04-27 |
Family
ID=53282871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013146057/10A RU2546917C1 (en) | 2013-10-16 | 2013-10-16 | Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2546917C1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2229307C1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-05-27 | ООО "Фирма"БиоМедИнвест" | Recombinant protein composition, method for preparing such composition, pharmaceutical kit of reagents for immunotherapy and prophylactic vaccination of tumor diseases in anus-genital sphere, method for immunotherapy and prophylactic vaccination based on thereof |
RU2290204C1 (en) * | 2005-07-27 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Аванген" | Recombinant fused protein, preparation for immunotherapy based on thereof and method for immunotherapy of relapsing larynx papillomatosis |
RU2489481C1 (en) * | 2012-01-16 | 2013-08-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | METHOD TO PRODUCE PROTEIN E7-HSP70 AND YEAST STRAIN Saccharomyces cerevisiae FOR ITS REALISATION |
-
2013
- 2013-10-16 RU RU2013146057/10A patent/RU2546917C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2229307C1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-05-27 | ООО "Фирма"БиоМедИнвест" | Recombinant protein composition, method for preparing such composition, pharmaceutical kit of reagents for immunotherapy and prophylactic vaccination of tumor diseases in anus-genital sphere, method for immunotherapy and prophylactic vaccination based on thereof |
RU2290204C1 (en) * | 2005-07-27 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Аванген" | Recombinant fused protein, preparation for immunotherapy based on thereof and method for immunotherapy of relapsing larynx papillomatosis |
RU2489481C1 (en) * | 2012-01-16 | 2013-08-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | METHOD TO PRODUCE PROTEIN E7-HSP70 AND YEAST STRAIN Saccharomyces cerevisiae FOR ITS REALISATION |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LI H. ET AL. Modified HPV16 E7/HSP70 DNA vaccine with high safety and enhanced cellular immunity represses murine lung metastatic tumors with downregulated expression of MHC class I molecules // Gynecologic Oncology, 2007, 104, pp. 564-571 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013146057A (en) | 2015-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dadar et al. | Advances in designing and developing vaccines, drugs and therapeutic approaches to counter human papilloma virus | |
ES2527756T3 (en) | Improved production procedures for yeast-based vaccines | |
JP2019194261A (en) | Immunotherapeutic yeast-muc1 compositions and uses thereof | |
US20060121053A1 (en) | High cell density process for growth of Listeria | |
JP2007054074A (en) | Papillomavirus polyprotein construct | |
US20170065708A1 (en) | Truncated L1 Protein of Human Papillomavirus Type 11 | |
KR20170045254A (en) | Methods of treating cervical cancer | |
KR102148413B1 (en) | Cyaa-based chimeric proteins comprising a heterologous polypeptide and their uses in the induction of immune responses | |
US20100255021A1 (en) | Truncated l1 protein of human papillomavirus type 6 | |
EP3971215A2 (en) | Artificial multi-antigen fusion protein and preparation and use thereof | |
CN101063142A (en) | Human papilloma virus 16 type DNA vaccine and gene adjuvant and its application | |
CN110564751A (en) | Design and application of micro-ring DNA vaccine | |
US11911455B2 (en) | HPV therapeutic nucleic acid vaccine | |
RU2546917C1 (en) | Method for microbiological synthesis of hybrid protein e7-hsp70 (versions) | |
Thean et al. | To plate or to simply unfreeze, that is the question for optimal plasmid extraction | |
US20110033893A1 (en) | Improved methods for protein production | |
KR20150031487A (en) | Hpv/cyaa-based chimeric proteins and their uses in the induction of immune responses against hpv infection and hpv-induced disorders | |
CN116217675A (en) | HPV epitope and application thereof | |
US10240179B2 (en) | Method for the production of protein complexes and vaccine compositions comprising the same | |
US11203760B2 (en) | Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 and the method for obtaining thereof | |
Juan et al. | Genetic stability of an Escherichia coli strain engineered to produce a novel therapeutic DNA vaccine encoding chicken type II collagen for rheumatoid arthritis | |
KR100947376B1 (en) | A method for producing a Recombinant protein using a GAL80 Deficient Yeast Strain | |
JP4412658B2 (en) | Thioredoxin-rich yeast and method for producing the same | |
Li et al. | Prevention and treatment of HPV‐related cancer through a mRNA vaccine expressing APC‐targeting antigen | |
RU2489481C1 (en) | METHOD TO PRODUCE PROTEIN E7-HSP70 AND YEAST STRAIN Saccharomyces cerevisiae FOR ITS REALISATION |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |