RU2541130C1

RU2541130C1 - Противоопухолевое средство

Info

Publication number: RU2541130C1
Application number: RU2013157917/15A
Authority: RU
Inventors: Лев Евгеньевич Панин; Роман Александрович Князев
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2015-02-10

Abstract

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и представляет собой противоопухолевое средство, включающее глюкокортикоидный гормон в количестве 0,3 мкг%-40 мкг%, липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства не менее 1 мг%, и дополнительно физиологически приемлемый растворитель, которое может быть использовано для подавления роста опухоли путем запуска апоптоза опухолевых клеток. Изобретение обеспечивает повышение эффективности противоопухолевого средства и расширение показаний к применению. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 6 табл., 5 ил.

Description

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к онкологии, и может быть использовано для подавления роста опухоли путем запуска апоптоза опухолевых клеток в экспериментальной и клинической онкологии.

Липопротеины, как транспортная форма лекарственных веществ, в том числе цитостатиков, использовались в различных работах. Считается, что поглощение липопротеинов опухолевыми клетками значительно выше, чем здоровыми (1). Активно пролиферирующие опухолевые клетки имеют повышенную потребность в липидах. Кроме того, быстрый захват липопротеинов обусловлен большим числом рецепторов к ним на клеточных мембранах (2).

Известно противоопухолевое средство, включающее липопротеины низкой плотности (ЛПНП) или липопротеины высокой плотности (ЛПВП) в комплексе с цитостатиками (5-флуороурацил, 5-иододиоксиуридин, доксорубицин, виндезин) и используемое для подавления опухолевого роста рака шейки матки и рака молочной железы (3). Недостатком известного противоопухолевого средства является то, что его применение ограничено гормонзависимыми опухолями (рак шейки матки и молочной железы), оно имеет ограничение по отношению к опухолям другой природы. Другим недостатком известного средства является то, что его действие недостаточно для активного подавления клеточной пролиферации.

Известно противоопухолевое средство, представляющее собой частицы, содержащие липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липофильное производное цитостатика. В качестве цитостатика использован метотрексат или 5-флуородезоксиуридин (ФДУ). Липофильное производное цитостатика получают синтетическим путем на основе олеиновой кислоты. Одна частица ЛПНП включает 30 молекул моноолеинового производного ФДУ (4). Недостатком известного средства является его низкая эффективность, токсичность цитостатика и сложная технология получения.

Известно противоопухолевое средство, включающее противоопухолевый агент паклитаксел и эмульсию, богатую холестерином (липопротеины низкой плотности) в молярном соотношении 1:6. Смешение двух компонентов увеличило размер частиц на 50%, но не повлияло на химическую структуру цитостатика. Указанный комплекс проникает в опухолевую клетку при участии рецепторов к липопротеинам низкой плотности. Комплекс является стабильным и обладающим цитостатической активностью, при этом препарат проявляет меньшую токсичность у крыс. Снижение побочных эффектов и транспортировка паклитаксела в опухолевые ткани позволяет рекомендовать липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в качестве адъюванта для цитостатиков (5). Эффективность заявленного средства подтверждена на пациентах с раком молочной железы (6). Недостатком известного средства является то, что паклитоксел имеет достаточно ограниченные показания к применению, не входит в список наиболее активных противоопухолевых препаратов.

Известно противоопухолевое средство, включающее альбумин и паклитаксел, образующие в смеси наночастицы размером около 130 нм, что позволяет использовать его для внутривенного введения. Клинические испытания показали его эффективность при раке молочной железы, в том числе на стадии метастазов для пациентов, которым терапия антрациклином не показана (7). Недостатком известного аналога являются ограниченные показания к применению, т.к. альбумин как переносчик не обладает высокой направленностью действия по отношению к опухолевым клеткам.

Известно средство, включающее липопротеины, липопептиды и их аналоги, содержащие липопептид сомоцистинамид A (somocystinamide А), а также использование липосом, содержащих их, для индукции апоптоза в нормальной или опухолевой клетке, или замедления роста опухоль-ассоциированных сосудов (эндотелия капилляров) (8). Недостатком известного аналога является сложная композиция, высокая трудоемкость на этапе получения переносчика. Кроме того, липосомы быстро разрушаются в периферической крови и не могут быть эффективными переносчиками цитостатиков.

Известно противоопухолевое средство, представляющее собой стабильные наночастицы, включающие цитостатик, биодеградируемый полимер, поверхностно-активное вещество, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани. В качестве цитостатика используется паклитоксел, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани - С-концевой домен альфа-фетопротеина (р3дАФП) (9). Недостаток средства заключается в использовании паклитаксела в качестве противоопухолевого препарата, не обладающего широким спектром действия, а также техническая сложность и трудоемкость получения противоопухолевого средства, удорожающие стоимость конечного продукта.

Недостатком всех описанных средств лечения опухолей служит применение цитостатиков - чужеродных химических соединений, оказывающих значительное токсическое действие на организм. Такое лечение сопровождается развитием тяжелых осложнений в виде органосклерозов с выраженной функциональной недостаточностью органов и систем.

Наиболее близким к заявляемому является противоопухолевое средство для лечения хронического лимфолейкоза, включающее аполипопротеин Е4 (апоE4) - содержащие липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) в комбинации со стероидным гормоном. В качестве стероидного гормона применяют эстрогены или андрогены. Авторами предполагается использовать ЛПОНП, содержащие определенный генотип апоЕ - апоЕ4. Для усиления противоопухолевого действия у женщин с лимфоцитарной лимфомой дополнительно вводятся эстрогены, у мужчин - андрогены. Присутствие апоЕ4 в ЛПОНП должно подтверждаться генотипированием (10, прототип). Недостатком прототипа является недостаточная эффективность известного средства, узкий спектр действия заявленного средства, ограниченный гормон-зависимыми опухолями, его неэффективность для терапии других видов онкологических заболеваний, например, опухолей печени.

Технической задачей изобретения является повышение эффективности противоопухолевого средства, расширение показаний к применению.

Решение поставленной задачи достигается тем, что для подавления роста опухоли путем запуска апоптоза опухолевых клеток заявленное противоопухолевое средство в качестве стероидного гормона включает гормон из группы глюкокортикоидов в количестве 0,3 мкг % - 40 мкг %, липопротеины очень низкой плотности - в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства не менее 1 мг %; средство дополнительно содержит физиологически приемлемый растворитель; в качестве глюкокортикоидов оно включает кортизол или его аналоги.

Описание сущности изобретения

Заявленное противоопухолевое средство включает глюкокортикоидный гормон в количестве 0,3 мкг % - 40 мкг %, липопротеины очень низкой плотности - в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства не менее 1 мг %; средство дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель; в качестве глюкокортикоидов оно включает кортизол или его аналоги.

В качестве аналогов кортизола заявленное средство может включать, например, кортикостерон, тетрагидрокортизол или их синтетические производные.

В состав заявленного средства могут быть включены нативные или синтетические липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП).

Нативные ЛПОНП получают путем ультрацентрифугирования сыворотки крови пациента в градиенте плотности KBr согласно (11).

Синтетические ЛПОНП могут быть получены путем механического перемешивания (12) их основных составных компонентов, которые выпускаются как коммерческие препараты. При этом аполипопротеин Е, фосфолипиды и холестерин должны использоваться в пропорциях, соответствующих их содержанию в нативных липопротеинах очень низкой плотности плазмы крови (13).

В качестве физиологически приемлемого растворителя используют физиологический раствор, воду для инъекций или буферные растворы, например, фосфатно-солевой буфер pH 7,4 состав: KH₂PO₄ - 231 мг %, Na₂HPO₄ - 738 мг %, NaCl - 877 мг %.

При применении in vivo средство предназначено для внутривенного или внутрибрюшинного введения.

Апоптоз является природным механизмом гибели любых клеток, не сопровождается развитием воспалительных процессов и не приводит к осложнениям (14).

Известно, что кортизол относится к индукторам апоптоза животных клеток (11), а липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) богаты сфингомиелином, который в сфингомиелиновом цикле клетки превращается в церамид - индуктор апоптоза (11, 14). Кроме того, белковый компонент ЛПОНП - апоЕ подавляет синтез белка в опухолевых клетках (15, 16). Однако каждый из указанных компонентов заявленного средства в отдельности не обеспечивает эффективного запуска апоптоза опухолевых клеток. Установлено, что при использовании заявленного соотношения компонентов образуется комплекс глюкокортикоидного гормона с липопротеином очень низкой плотности, обеспечивающий синергизм противоопухолевого действия лиганда (глюкокортикоидный гормон) и его переносчика (липопротеины очень низкой плотности). Преимущественное действие заявленного средства на опухолевые клетки обусловлено тем, что в отличие от нормальных клеток они более активно захватывают липопротеины очень низкой плотности (17). Широкий спектр действия заявленного средства на опухоли различной локализации обеспечивается участием глюкокортикоидных гормонов в метаболизме клеток различных органов и тканей и наличием клеточных рецепторов к ним (18).

Эффективность заявленного средства оценивали в опытах in vitro на культурах клеток асцитной гепатомы НА-1, полученной в результате индукции мышей самцов линии A/Sn о-аминоазотолуолом (виварий Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). В экспериментах использовали клетки, выделенные на десятые сутки после перевивания их в брюшную полость мышей той же линии из расчета 1 млн клеток на особь. Также в работе использовали мышей линии ICR с асцитной карциномой Эрлиха (виварий Института цитологии и генетики СО РАН). Клетки перитонеального экссудата получали на десятые сутки после пассажа опухоли для последующего культивирования. На мышах с асцитной НА-1 гепатомой, а также с асцитной карциномой Эрлиха в результате введения заявленного средства получено снижение численности популяции опухолевых клеток, а также уменьшение объема асцитической жидкости, которая образуется при прогрессивном развитии опухоли. Морфологически обнаружена полная картина апоптоза опухолевых клеток, включающая секвестрацию цитоплазмы, фрагментацию ядер, подавление синтеза нуклеиновых кислот и белка.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг.1. Клетки асцитной НА-1 гепатомы с опухоль-ассоциированными макрофагами. Окраска по Романовскому-Гимза (ув. ×400).

Фиг.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле. Дорожки: (1) - контроль; (2) - ЛПОНП; (3) - заявленное средство состава 3.

Фиг.3. Электронная микроскопия клеток асцитной карциномы Эрлиха, ×8000. Действие заявленного средства состава 3 (1 - погибшая клетка; 2 - клетка в состоянии апоптоза), ×8000.

Фиг.4. Электронная микроскопия клеток асцитной карциномы Эрлиха после внутри-брюшинного введения. А - Контроль (введение физ. раствора), ×1000; Б - заявленное средство состава 5 (×8000).

Фиг.5. Мыши линии ICR на 12-е сутки после перевивания асцитной карциномы Эрлиха. А - Контроль (физ. раствор); Б - Опыт (заявленное средство состава 5)

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Цитостатическое действие заявленного средства в культуре клеток асцитной НА-1 гепатомы мышей (клетки опухоли печени), инкубированных совместно с опухоль-ассоциированными макрофагами.

Совместную культуру клеток асцитной НА-1 гепатомы мышей и опухоль-ассоциированных макрофагов использовали для того, чтобы приблизить условия эксперимента к целостному организму, т.к. известно, что макрофаги организма активно взаимодействуют с опухолевыми клетками.

Липопротеины очень низкой плотности получали из плазмы крови экспериментальных крыс линии Wistar. Выделение липопротеинов из плазмы крови крыс проводили методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na₂ на центрифуге «Optima L-90 K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70.1 Ti. Получали фракцию липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, 0.94<d<1.006 г/мл). Полученные таким методом ЛПОНП диализовали 24 часа при 4°C против 0,05 М калий-фосфатного буфера с pH 7.4, содержащего 0,15 М NaCl и 0,3 мМ ЭДТА - Na₂, далее стерилизовали фильтрованием через «Milliporell» (USA) с диаметром пор 22 мкм и использовали в течение недели. Анализ чистоты липопротеинов проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия («Serva», Германия).

Для формирования опухоли мышам линии A/Sn внутрибрюшинно перевивали клетки асцитной НА-1 гепатомы из расчета 1,0 млн клеток на мышь. Клетки перитонеального экссудата получали на десятые сутки после пассажа опухоли для последующего культивирования. Свежевыделенные опухолевые клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с L-глутамином, содержащей 20 мМ HEPES/NaOH (pH 7,4), 2 мМ L-глутатиона, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5.6 mM глюкозы, 10 нМ инсулина. Инкубацию проводили при 37°C в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха при влажности 85%. Конечная плотность опухолевых клеток составила 5×10⁶ на мм². Продолжительность инкубации 24 часа. Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали по скорости включения ³H-тимидина в ДНК. Содержание белка в образцах определяли по методике Варбурга Кристиана (19).

Для оценки противоопухолевого эффекта на культуре опухолевых клеток асцитной НА-1 гепатомы in vitro использовали заявленное средство двух составов.

Заявленное средство состава 1, включающее кортизол (40 мкг %), липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства 1 мг %; физиологический раствор. Заявленное средство состава 1 вводили в культуру клеток в объеме 200 мкл на мл инкубационной среды.

Заявленное средство состава 2, включающее кортикостерон (0.3 мкг %), липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства 1 мг %; фосфатно-солевой буфер. Заявленное средство состава 2 вводили в культуру клеток в объеме 200 мкл на мл инкубационной среды.

Клетки асцитной НА-1 гепатомы с опухоль-ассоциированными макрофагами представлены на фиг.1. В организме мышей (in vivo) они активно делятся, так, что продолжительность жизни животных не превышает 2-3 недель. Культуру данных клеток без добавления заявленного средства использовали в качестве контроля.

Показано, что заявленное средство состава 1 тормозит пролиферацию опухолевых клеток, о чем свидетельствует снижение скорости биосинтеза ДНК в 2 раза по сравнению с контролем (Табл.1), при этом эффект заявленного средства состава 1 более выражен, чем при действии каждого из его активных компонентов отдельно.

Сходные результаты получены в случае применения заявленного средства состава 2 (Таблица 2).

Таблица 1.
Изменение скорости биосинтеза ДНК в сокультуре клеток НА-1 гепатомы под влиянием заявленного средства состава 1 в сравнении с эффектом его активных компонентов по отдельности
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	14233±1802
ЛПОНП	9647±1613
Кортизол	9903±2644
Заявленное средство состава 1	6909±565*
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,01)

Таблица 2.
Изменение скорости биосинтеза ДНК в сокультуре клеток НА-1 гепатомы под влиянием заявленного средства состава 2 в сравнении с эффектом его активных компонентов по отдельности
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	12681±420
ЛПОНП	8113±1698
Кортизол	10286±1671
Заявленное средство состава 2	7927±1671*
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,05)

Проведенный анализ связывания ЛПОНП с кортизолом в составе заявленного противоопухолевого средства показал, что оно варьирует в пределах 12-18% от суммарного содержания кортизола; связывание кортикостерона с ЛПОНП варьирует в пределах 8-16%. Это очень высокие цифры. Константа связывания для кортизола составляет (5±0,1)·10⁶ M^-1, для кортикостерона (8±0,1)·10⁶ М^-1. Полученные данные показывают, что образование комплекса каждого из этих гормонов с ЛПОНП в составе заявленного противоопухолевого средства обеспечивает синергизм их действия на скорость биосинтеза ДНК в культуре опухолевых клеток

Пример 2. Цитостатическое действие заявленного противоопухолевого средства в культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха.

Асцитная карцинома Эрлиха представляет собой спонтанную карциному молочной железы мышей.

Мышам линии ICR внутрибрюшинно перевивали клетки асцитной карциномы Эрлиха из расчета 3,0 млн клеток на мышь. Клетки перитонеального экссудата получали на десятые сутки после пассажа опухоли для последующего культивирования. Свежевыделенные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с L-глутамином, содержащей 20 мМ HEPES/NaOH (pH 7,4), 2 мМ L-глутатиона, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5.6 mM глюкозы, 10 нМ инсулина. Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха при влажности 85%. Конечная плотность клеток 5×10⁶ на мм². Продолжительность инкубации 24 часа. Пролиферативная активность клеток оценивали по скорости включения ³Н-тимидина в ДНК.

Для оценки противоопухолевого эффекта на культуре опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro использовали заявленное средство двух составов.

Заявленное средство состава 3, включающее терагидрокортизол (31,4 мкг %), липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства 1 мг%; физиологический раствор буферный раствор. Заявленное средство 3 вводили в культуру клеток в объеме 200 мкл на мл инкубационной среды.

Заявленное средство состава 4, включающее кортизол (0.3 мкг %), липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства 1 мг %; физиологический раствор. Заявленное средство состава 4 вводили в культуру клеток в объеме 200 мкл на мл инкубационной среды.

Показано, что заявленное средство состава 3 снижало скорость биосинтеза ДНК в опухолевых клетках асцитной карциномы Эрлиха в 1,7 раза (Табл.3), эффект его активных компонентов по отдельности достоверно не отличался от контроля.

Сходные результаты получены при оценке цитостатического действия заявленного противоопухолевого средства состава 4 (таблица 4).

Таблица 3.
Изменение скорости биосинтеза ДНК в сокультуре клеток асцитной карциномы Эрлиха под влиянием заявленного противоопухолевого средства 3 в сравнении с эффектом его активных компонентов по отдельности
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	7805±447
ЛПОНП	5002±298
Тетрагидрокортизол	5939±236
Заявленное средство состава 3	4176±376*
* - достоверное различив по сравнению с контролем (р<0,05)

Таблица 4.
Изменение скорости биосинтеза ДНК в сокультуре клеток асцитной карциномы Эрлиха под влиянием заявленного противоопухолевого средства 4 в сравнении с эффектом его активных компонентов по отдельности
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	4304±473
ЛПОНП	1892±427
Кортизол	223U611
Заявленное средство состава 4	1382±144*
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,05)

Представленные данные аналогичны тем, которые получены на клетках асцитной НА-1 гепатомы, и подтверждают, что противоопухолевая активность заявленного противоопухолевого средства на культуре опухолевых клеток проявляется в указанном выше диапазоне (0,3 мкг % - 40 мкг %) долевого содержания гормона из группы глюкокортикоидов (кортизола и его производных) в его составе.

Данные электрофоретического анализа ДНК в образцах клеток асцитной карциномы Эрлиха подтверждают результаты по включению ³Н-тимидина (фиг.2). Значительное снижение содержания ДНК в образцах культуры опухолевых клеток указывает на резкое снижение пролиферации и гибель клеток асцитной карциномы Эрлиха.

Электронно-микроскопический анализ изменения структуры клеток выявил потерю микроворсин, секвестрацию цитоплазмы в среду инкубации и фрагментацию ядер (фиг.3). Отмечается фрагментация ядер, появление в структуре апоптотических телец. Обнаруженные признаки позволяют отнести механизм гибели опухолевых клеток под влиянием заявленного противоопухолевого средства к апоптозу. Отсутствие выраженного эффекта подавления пролиферативной активности опухолевых клеток под влиянием ЛПОНП или кортизола по отдельности свидетельствует о кооперативном механизме действия этих компонентов в составе средства, т.е. синергизме их действия.

Пример 3. Цитостатическое действие заявленного противоопухолевого средства в клетках асцитной карциномы Эрлиха в условиях in vivo.

Мышам линии ICR внутрибрюшинно перевивали клетки асцитной карциномы Эрлиха из расчета 3,0 млн. клеток на мышь. Через 10 суток начинали вводить ЛПОНП или заявленное противоопухолевое средство состава 5: кортизол в количестве 40 мкг %, липопротеины очень низкой плотности - в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства 2 мг %; физиологический раствор. Заявленное средство (опыт) или физиологический раствор (контроль) вводили мышам внутрибрюшинно или внутривенно в объеме 0,02 мл на 1 г массы животного.

Одной группе мышей препарат вводили внутривенно, другой - внутрибрюшинно. Делали 3 инъекции в течение 8-9 суток. Затем животных забивали щадящим способом под легким наркозом. Измеряли общий объем асцитической жидкости в брюшной полости, являющейся показателем степени (стадии) развития опухолевого процесса, и количество опухолевых клеток с помощью камеры Горяева.

Полученные опухолевые клетки инкубировали in vitro в присутствии ¹⁴C-лейцина в дозе 2 мкКи/мл. Продолжительность инкубации - 24 часа. Радиоактивность выражали в имп/мин на мг белка. Оказалось, что в контроле объем асцитической жидкости на одно животное составлял в среднем 11 мл с общим содержанием опухолевых клеток на одно животное 600 млн; в опытных группах - 5,7 мл асцитической жидкости и 300 млн опухолевых клеток соответственно. При этом заявленное средство состава 5 значительно (на 54%) подавлял скорость синтеза белка в общей культуре опухолевых клеток in vitro. ЛПОНП в отдельности, напротив, повышали скорость синтеза белка, что обусловлено повышенным захватом и использованием ЛПОНП опухолевыми клетками в качестве строительного материала (Табл.5, 6).

Как следует из таблиц 5 и 6, внутривенное введение заявленного противоопухолевого средства несколько менее эффективно, чем внутрибрюшинное введение, если судить по скорости включения ¹⁴С-лейцина в белок. Однако сопоставление объема асцитической жидкости (3 мл) и количества в нем клеток (300 млн. клеток) позволяет заключить, что подавляющее действие заявленного средства на рост опухолевых клеток достаточно сильно выражено и при внутривенном введении.

Таблица 5.
Скорость биосинтеза белка в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха при внутрибрюшинном введении заявленного противоопухолевого средства состава 5
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	99254±1577
ЛПОНП	131277±3772^#
Заявленное средство состава 5	45424±1578∗
∗ - достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,001)
^# - достоверное различие по сравнению с комплексом кортизол-ЛПОНП (р<0,001)

Таблица 6.
Скорость биосинтеза белка в общей культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха при внутривенном введении заявленного противоопухолевого средства состава 5
Условия инкубации	Имп/мин/мг белка М±m, n=6
Контроль	103726±4163
Заявленное средство состава 5	80750±3614∗
∗ - достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,05)

Морфологический анализ признаков апоптоза опухолевых клеток под влиянием заявленного противоопухолевого средства в проведенных экспериментах позволил выявить ряд ведущих морфологических признаков апоптоза опухолевых клеток: фрагментация ядра, потеря микроворсин клетками и секвестрация цитоплазматических образований в среду инкубации (фиг.4).

Мыши, получавшие противоопухолевое средство, значительно отличались от нелеченых: леченые мыши имели более здоровый вид, потребляли больше пищи и после трех инъекций заявленного средства практически не содержали асцитической жидкости (фиг.5).

Таким образом, на мышах с асцитной НА-1 гепатомой, а также с карциномой Эрлиха в результате введения заявленного противоопухолевого средства получено снижение численности популяции опухолевых клеток, а также уменьшение объема асцитической жидкости. Морфологически обнаружена полная картина апоптоза опухолевых клеток, включающая секвестрацию цитоплазмы, фрагментацию ядер, подавление синтеза нуклеиновых кислот и белка.

Список использованных источников

1. Vitols S., Gahrton G., Ost A., Peterson C. Elevated low density lipoprotein receptor activity in leukemic cells with monocytic differentiation. // Blood. 1984. 63(5). P.1186-1193.

2. Lundberg B. Assembly of prednimustine low-density-lipoprotein complexes and their cytotoxic activity in tissue culture. // Cancer Chemother Pharmacol. 1992. 29(3). P.241-247.

3. Kader A., Pater A. Loading anticancer drugs into HDL as well as LDL has little affect on properties of complexes and enhances cytotoxicity to human carcinoma cells // J. Control Release. 2002. 80 (1-3). P.29-44.

4. De Smidt P.С., van Berkel T.J. Characteristics of association of oleoyl derivatives of 5-fluorodeoxyuridine and methotrexate with low-density lipoproteins (LDL) // Pharm Res. 1992. 9(4). P.565-569.

5. Rodrigues D.G., Covolan C.C., Coradi S.T., Barboza R., Maranhão R.C. Use of a cholesterol-rich emulsion that binds to low-density lipoprotein receptors as a vehicle for paclitaxel // J. Pharm. Pharmacol. 2002. 54(6). P.765-772.

6. Pires LA, Hegg R, Valduga CJ, Graziani SR, Rodrigues DG, Maranhão RC. Use of cholesterol-rich nanoparticles that bind to lipoprotein receptors as a vehicle to paclitaxel in the treatment of breast cancer: pharmacokinetics, tumor uptake and a pilot clinical study // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. 63(2):281-7. doi:10.1007/s00280-008-0738-2. Epub 2008.

7. Petrelli F., Borgonovo K., Barni S. Targeted delivery for breast cancer therapy: the history of nanoparticle-albumin-bound paclitaxe // Expert Opin Pharmacother. 2010. 11(8). P.1413-1432.

8. Международная заявка WO 2008144747, приоритет от 21.05.2007 г., кл. МПК C07K 5/00, опубл. 27.11.2008 г.

9. Патент на изобретение РФ №2451509, приоритет от 31.03.2011 г., кл. МПК A61K 31/337, A61K 9/19, опубл. 27.05.2012 г., БИ №15.

10. Патент США №7902147, приоритет от 05.11.2007 г., кл. МПК A61K 31/437, опубл. 08.03.2011 г.

11. Panin L.E., Kunitsyn V.G., Polyakov L.E. Structural Changes in Blood Plasma Lipoproteins in the Physiological Temperature Range and their Interaction with Steroid Hormones. Ed. Lauren M. Haggerty. Protein Structure. New York, Nova Science Publishers Inc. 2011. P.123-153.

12. Nikanjam M., Blakely E., Bjornstad K., Shu X, Budinger T, Forte Т Synthetic nano-low density lipoprotein as targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme // Int J Pharm. 2007 Jan 2; 328(1): 86-94. Epub 2006 Jul 31.

13. Yang M.L., Xie Y.H., Guyton J.R., Vlasik T.N., Fruchart J.C., Gotto A.M. Human very low density lipoprotein structure - interaction of the C-apolipoproteins with apolipoprotein B-100 // J. Lipid Res. 1993. V.34. P.1311-1321.

14. Суханова Г.А., Акбашева О.Е. Апоптоз. ТПУ, Томск, 2006. 170 С.

15. Кузьменко Д.И. Сфингмиелиновый цикл. Сфинголипиды и внутриклеточная сигнализация. В книге «Ожирение и нарушение метаболизма липидов». ТПУ, Томск, 2008. с.291-335.

16. Князев Р.А. Роль аполипопротеина A-I и аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов. Автореф. Канд. Дис., Новосибирск, 2007.

17. Sundelin JP, Ståhlman M, Lundqvist A, Levin M, Parini P, Johansson ME, Borén J. Increased expression of the very low-density lipoprotein receptor mediates lipid accumulation in clear-cell renal cell carcinoma // PLoS One. 2012; 7(11): e48694. doi : 10.1371/joumal.pone.0048694. Epub 2012 Nov 19

18. Dlugosz E.M., Harris B.N., Saltsman W., Chappel M.A. Glucocorticoids, Aerobic Physiology, and Locomotor Behavior in California Mice. Physiological and Biochemical Zoology. 2012. 85(6). P.671-683.

19. Thorne C.J. in: Techniques in Protein and Enzymol, Part 1, Section b 104, Elsevir-North Holland. 1978.

Claims

1. Противоопухолевое средство, включающее гормон и липопротеины очень низкой плотности, отличающееся тем, что для подавления роста опухоли путем запуска апоптоза опухолевых клеток оно включает глюкокортикоидный гормон в количестве 0,3 мкг % - 40 мкг %, липопротеины очень низкой плотности в количестве, обеспечивающем содержание аполипопротеина Е в составе средства не менее 1 мг %; средство дополнительно включает физиологически приемлемый растворитель.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что в качестве глюкокортикоидов оно включает кортизол или его аналоги.