RU2539094C2

RU2539094C2 - Method of obtaining organic solvents from nonfood renewable natural raw material

Info

Publication number: RU2539094C2
Application number: RU2012146273/10A
Authority: RU
Inventors: Елена Николаевна Ефременко; Ольга Витальевна Сенько; Илья Владимирович Лягин; Николай Алексеевич Степанов; Ольга Васильевна Маслова
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2015-01-10
Also published as: RU2012146273A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. Method of obtaining complex of organic solvents, which includes acetone, butanol and ethanol, from renewable natural vegetable cellulose-containing raw material includes milling to particles with size 20-80 mcm. Preliminary saccharification of milled raw material is performed for 1-5 h at 45-55°C. The following simultaneous saccharification of carbohydrates and fermentation of obtained hydrolysates are carried out at 28-34°C for 45-50 h under impact of biocatalyst. Said biocatalyst represents cells of bacteria acetobutylicum B-4786, immobilised in cryogel of polyvinyl alcohol in form of cylindrical granules, which have diameter and height 3-5 mm.

EFFECT: method makes it possible to increase productivity of process to 0,464 g/l/h and the total concentration of organic solvents to 23,3 g/l.

4 cl, 9 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к микробиологическим способам получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол.The invention relates to biotechnology, in particular, to microbiological methods for producing a complex of organic solvents, including acetone, butanol and ethanol.

В современном мире актуально использование непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья (ЦСС) вместо крахмалосодержащего сырья, имеющего пищевую ценность, для гидролиза и производства из получаемых гидролизатов полисахаридов различных коммерчески значимых продуктов. Интерес к ЦСС в виде сельскохозяйственных и лесотехнических отходов продиктован возможностью получения из них ценных продуктов одновременно с решением ряда экологических проблем. В частности, глюкоза, получаемая путем гидролиза ЦСС, может быть конвертирована под действием бактерий рода Clostridium в такие полупродукты, полезные для химического синтеза, как ацетон, бутанол, этанол [Qureshi N., Saha B.C., Dien В., Hector R.E.,. Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part I - use of barley straw hydrolysate // Biomass Bioenergy, V.34, P.559-565; Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Dien В., Hughes S., Liu S., Iten L., Bowman M.J., Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part II - use of corn stover and switchgrass hydrolysates // Biomass Bioenergy, V.34, P.566-571].In the modern world, the use of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials (CSS) instead of starch-containing raw materials having nutritional value for the hydrolysis and production of various commercially significant polysaccharides from the resulting hydrolysates is relevant. The interest in the CSS in the form of agricultural and forestry wastes is dictated by the possibility of obtaining valuable products from them at the same time as solving a number of environmental problems. In particular, glucose obtained by hydrolysis of CSS can be converted under the influence of bacteria of the genus Clostridium into such intermediates useful for chemical synthesis as acetone, butanol, ethanol [Qureshi N., Saha B.C., Dien B., Hector R.E.,. Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part I - use of barley straw hydrolysate // Biomass Bioenergy, V.34, P.559-565; Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Dien B., Hughes S., Liu S., Iten L., Bowman M.J., Cotta M.A. (2010) Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: part II - use of corn stover and switchgrass hydrolysates // Biomass Bioenergy, V.34, P.566-571].

Бутанол является важным органическим сырьем, используемым при производстве пластиков или их растворителей, красок, лаков, пластификаторов, фармацевтических препаратов, а также он все чаще используется как перспективный энергоноситель, который может быть использован в качестве компонента моторного топлива.Butanol is an important organic raw material used in the production of plastics or their solvents, paints, varnishes, plasticizers, pharmaceuticals, and it is also increasingly being used as a promising energy carrier that can be used as a component of motor fuel.

Этанол также является одним из перспективных энергоносителей и применяется как добавка к топливу, в том числе для ракетных двигателей. Вместе с этим этанол традиционно широко применяется в химической промышленности, медицине, парфюмерной и пищевой промышленностях.Ethanol is also one of the promising energy carriers and is used as an additive to fuel, including for rocket engines. Along with this, ethanol is traditionally widely used in the chemical industry, medicine, perfumery and food industries.

Ацетон используется как растворитель в химической промышленности (в производстве лаков, взрывчатых веществ, лекарственных препаратов и др.). Наряду с этим широко применяется при синтезе поликарбонатов, полиуретанов и эпоксидных смол.Acetone is used as a solvent in the chemical industry (in the manufacture of varnishes, explosives, drugs, etc.). In addition, it is widely used in the synthesis of polycarbonates, polyurethanes and epoxies.

Интерес к биологическим способам получения этих растворителей обусловлен мягкими условиями их реализации (низкими температурами, отсутствием необходимости использования высоких давлений и металлических катализаторов, получение которых требует отдельных затрат), возможностью переработки ЦСС-содержащих отходов и решением экологических задач, а также возможностью одновременного получения всех трех органических растворителей в комплексе в одном процессе, катализируемом клетками рода Clostridium. Бактериальные клетки рода Clostridium являются единственными катализаторами «ацетон-бутанол-этанольной» (АБЭ) ферментации, сопровождающейся конверсией в ацетон, этиловый и бутиловый спирты потребляемых клетками моносахаридов, содержащихся в гидролизатах ЦСС [Shapovalov O.I., Ashkinazi L.A (2008) Biobutanol: biofuel of second generation. / Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Zverlov V.V., Schwarz W.H. (2007) Biofuels from microbes // Appl.Microbiol.Biotechnol, V.77, P.23-35].The interest in biological methods for the preparation of these solvents is due to the mild conditions for their implementation (low temperatures, the absence of the need to use high pressures and metal catalysts, the preparation of which requires separate costs), the possibility of processing CSS-containing waste and solving environmental problems, as well as the possibility of simultaneously obtaining all three organic solvents in a complex in one process catalyzed by cells of the genus Clostridium. Bacterial cells of the genus Clostridium are the only catalysts for “acetone-butanol-ethanol” (ABE) fermentation, which is accompanied by the conversion of monosaccharides contained in hydrolysates of the central nervous system consumed by cells into acetone, ethyl and butyl alcohols [Shapovalov OI, Ashkinazi LA (2008) Biobutanol: generation. / Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Zverlov V.V., Schwarz W.H. (2007) Biofuels from microbes // Appl. Microbiol. Biotechnol, V.77, P.23-35].

Одними из наиболее эффективных способов получения органических растворителей с использованием клеток рода Clostridium являются способы, объединяющие технологическую стадию гидролитической предобработки сырья с помощью ферментов и получение моносахаридов со стадией их конверсии в целевые продукты [Shan M.M., Lee Y.Y. (1992) Simultaneous saccharification and extractive fermentation for acetone/butanol production from pretreated hardwood // Appl. Biochem. Biotech., V.34-35, P.557-567; Shan M.M., Song S.K., Lee Y.Y., Torget M. (1991) Effect of pretreatment on simultaneous saccharification and fermentation of hardwood into acetone/butanol // Appl. Biochem. Biotechnol., V.28-29, P.99-109].One of the most effective methods for producing organic solvents using cells of the genus Clostridium are methods that combine the technological stage of hydrolytic pretreatment of raw materials using enzymes and the production of monosaccharides with the stage of their conversion to target products [Shan M.M., Lee Y.Y. (1992) Simultaneous saccharification and extractive fermentation for acetone / butanol production from pretreated hardwood // Appl. Biochem. Biotech., V.34-35, P.557-567; Shan M.M., Song S.K., Lee Y. Y., Torget M. (1991) Effect of pretreatment on simultaneous saccharification and fermentation of hardwood into acetone / butanol // Appl. Biochem. Biotechnol., V.28-29, P.99-109].

Такие способы получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации сырья позволяют соединить ферментативный гидролиз ЦСС с конверсией образующихся сахаров в органические растворители в одном и том же реакторе в одно и то же время, сократив общую длительность всего процесса и экономические расходы, связанные с установкой и обслуживанием одного реактора вместо двух. В таких способах достигается общий сдвиг химического равновесия в сторону образования конечных продуктов (растворителей), поскольку ферменты гидролиза целлюлозы ингибируются накапливающимися сахарами, а при объединении стадии ферментативного гидролиза с ферментацией клетки конвертируют образующиеся простые сахара в органические растворители, не давая накопиться сахарам в концентрациях, ингибирующих ферментативный гидролиз. В целом такой подход позволяет увеличить степень гидролиза и потребления субстрата, а также повысить продуктивность процесса в целом по накапливающимся органическим растворителям. Следует заметить, что совместить стадию осахаривания и ферментации ЦСС можно только в том случае, если гидролиз ЦСС осуществляется с использованием ферментов, а не кислот, поскольку кислотный гидролиз негативно действуют на клетки, продуцирующие органические растворители, из-за низких значений рН и высоких температур (выше 100°С), которые используются в случае кислотного гидролиза. Вместе с этим целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет высокоупорядоченную (кристаллическую) структуру, и во многих случаях ЦСС содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнин), которые служат естественной защитой растений, затрудняющей доступ ферментов к гликозидным связям полисахаридного субстрата. В этой связи необходимо увеличение реакционной способности ЦСС, которое может быть достигнуто за счет специальной обработки сырья перед контактом с ферментами. Известна предобработка целлюлозы химическим путем, основанным на кислотном гидролизе полисахаридов, проведении делигнификации разбавленными щелочами, обычно NaOH или аммиаком. Однако такая предобработка имеет ряд недостатков, главными из которых является отсутствие полного разрушения целлюлозы и наличие отходов производства, утилизация которых представляет довольно серьезную проблему. Большое развитие получили методы предобработки, основанные на взрывной дефибрации ЦСС по декомпрессионному принципу (парового взрыва) [De Bari I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO2 - catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V.46, P.7711-7720]. ЦСС подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением в присутствии или в отсутствие SO₂ или CO₂ и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв материала. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз. Однако недостатком такого метода является, с одной стороны, большой расход энергии и пара, а, с другой - образование трудно утилизируемых отходов (модифицированного лигнина). Поэтому большее предпочтение отдается физико-механическим методам, основанным на измельчении ЦСС на различных видах мельниц.Such methods for producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of raw materials allow combining the enzymatic hydrolysis of CSS with the conversion of the resulting sugars into organic solvents in the same reactor at the same time, reducing the total duration of the whole process and the economic costs associated with the installation and maintenance of one reactor instead of two. In such methods, a general shift of the chemical equilibrium towards the formation of final products (solvents) is achieved, since cellulose hydrolysis enzymes are inhibited by accumulating sugars, and when the enzymatic hydrolysis stage is combined with fermentation, the cells convert the simple sugars into organic solvents, preventing sugars from accumulating in concentrations that inhibit enzymatic hydrolysis. In general, this approach allows to increase the degree of hydrolysis and consumption of the substrate, as well as to increase the productivity of the process as a whole for the accumulating organic solvents. It should be noted that the stage of saccharification and fermentation of CSS can be combined only if hydrolysis of CSS is carried out using enzymes rather than acids, since acid hydrolysis negatively affects cells producing organic solvents due to low pH and high temperatures ( above 100 ° C), which are used in the case of acid hydrolysis. At the same time, cellulose-containing materials are very resistant to enzymatic action, since the cellulose in them has a highly ordered (crystalline) structure, and in many cases the CSS contains in its composition accompanying substances (primarily lignin), which serve as a natural plant protection that impedes the access of enzymes to glycosidic bonds of the polysaccharide substrate. In this regard, it is necessary to increase the reactivity of the CSS, which can be achieved through special processing of raw materials before contact with enzymes. Known pretreatment of cellulose in a chemical way based on acid hydrolysis of polysaccharides, delignification with dilute alkalis, usually NaOH or ammonia. However, this pre-treatment has a number of disadvantages, the main of which is the lack of complete destruction of pulp and the presence of production waste, the disposal of which is a rather serious problem. The pretreatment methods based on the explosive defibration of the CSS according to the decompression (steam explosion) method have been widely developed [De Bari I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO2 - catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V.46, P.7711-7720]. The CSS is subjected to short-term exposure to superheated steam under pressure in the presence or absence of SO ₂ or CO ₂ and then the pressure is released, which causes a vapor explosion of the material. Under such conditions, lignin melts, partially collapses, and leaves the cellulose structure; in addition, under the action of a steam explosion, partial disintegration of cellulose occurs, as well as hydrolysis of hemicelluloses. However, the disadvantage of this method is, on the one hand, the high consumption of energy and steam, and, on the other hand, the formation of difficult to recycle waste (modified lignin). Therefore, greater preference is given to physicomechanical methods based on grinding DSS in various types of mills.

Так известен способ получения органических растворителей [Патент РФ №2405827, МПК⁶: С12Р 7/00], который включает одновременное осахаривание предварительно измельченного растительного сырья и ферментацию полученных сахаров в питательной среде с помощью бактерий Clostridium acetobutylicum ВКМ В-2531 D, а также выделение органических растворителей из ферментационной среды, чтобы снизить уровень ингибирования клеток растворителями. Процесс осуществляют в одну стадию, причем выделение органических растворителей осуществляется путем диффузионного испарения через мембрану, представляющую собой синтетическое (силиконовое) или растительное масло, с использованием вакуума. Процесс осуществляют при рН среды 4,2 и температуре 35°С в течение 48 ч. В качестве растительного сырья используют древесные опилки, в том числе опилки хвойных пород, в которых предварительно осуществляют экстракцию смолы, солому пшеницы и др. Предобработка ЦСС заключается в помоле на мельницах до размера частиц 1-5 мкм с одновременной сушкой сырья. В качестве ферментов для гидролиза используют лиофильно высушенную культуральную жидкость, полученную культивированием мицелиального гриба Penicillium funiculosum ВКМ F-3887 D, в концентрации 2,5 г/кг сырья. Во время процесса в реакторе постоянно поддерживается концентрация сахаров в пределах 20 г/л. Продуктивность процесса по растворителям составляет 8-8,3 г/л/сут (то есть 0,333-0,346 г/л/ч).So known is a method of producing organic solvents [RF Patent No. 2405827, IPC ⁶ : С12Р 7/00], which includes the simultaneous saccharification of pre-ground plant materials and fermentation of the obtained sugars in a nutrient medium using bacteria Clostridium acetobutylicum VKM B-2531 D, as well as isolation organic solvents from the fermentation medium to reduce solvent inhibition of cells. The process is carried out in one stage, and the selection of organic solvents is carried out by diffusion evaporation through a membrane, which is a synthetic (silicone) or vegetable oil, using vacuum. The process is carried out at a pH of 4.2 and a temperature of 35 ° C for 48 hours. As a plant material, wood sawdust is used, including softwood sawdust, in which resin, wheat straw, etc. are preliminarily extracted. The pretreatment of CSS is grinding in mills to a particle size of 1-5 microns with simultaneous drying of raw materials. Freeze dried culture fluid obtained by culturing Penicillium funiculosum VKM F-3887 D mycelium fungus at a concentration of 2.5 g / kg of raw material is used as hydrolysis enzymes. During the process, the concentration of sugars in the reactor is constantly maintained within 20 g / l. The solvent productivity of the process is 8-8.3 g / l / day (i.e. 0.333-0.346 g / l / h).

Главным недостатком получения комплекса органических растворителей с использованием суспензионных клеток бактерий рода Clostridium являются сами растворители, накапливающиеся в культуральной жидкости, так как они являются токсичными для бактериальных клеток [Воробьева Л.И. Промышленная микробиология: учеб. пособие / М.: изд-во МГУ, 1989. - 294 с.]. В этой связи в процесс необходимо использование технических устройств, позволяющих отделять растворители от культуральной жидкости. Применение селективных мембран для этих целей, которые способны отделить бутанол или этанол от воды, приводит к их быстрому засорению измельченным сырьем и суспензионными клетками, необходимости замены этих дорогостоящих мембран, а в целом к существенному удорожанию процесса.The main disadvantage of obtaining a complex of organic solvents using suspension cells of bacteria of the genus Clostridium are the solvents themselves, which accumulate in the culture fluid, since they are toxic to bacterial cells [Vorobyova L.I. Industrial Microbiology: Textbook. allowance / M .: publishing house of Moscow State University, 1989. - 294 p.]. In this regard, the process requires the use of technical devices to separate the solvents from the culture fluid. The use of selective membranes for these purposes, which are able to separate butanol or ethanol from water, leads to their fast clogging with crushed raw materials and suspension cells, the need to replace these expensive membranes, and in general to a significant increase in the cost of the process.

Для преодоления ингибирующего воздействия растворителей на клетки используются генно-модифицированные штаммы бактерий рода Clostridium [Thirmal С., Dahman Y. (2011) Different physical and chemical pretreatments of wheat straw for enhanced biobutanol production in simultaneous saccharification and fermentation // Int J Energ Environ., V.2 (4), P.615-626}. Так известен способ получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием клеток С. beijerinckii P260 [Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Hughes S., Cotta M.A. (2008) Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Clostridium beijerinckii: part I-batch fermentation // Biomass Bioenergy, V.32, P.168-175]. В качестве ЦСС данный способ использует измельченную пшеничную солому, предобработанную 1% раствором серной кислоты при 121°С в течение 1 ч. В качестве инокулята используются клетки бактерий Clostridium beijerinckii P260. Процесс ведут при температуре 35°С в течение 72 ч. В полученную смесь добавляют раствор целлюлаз (0,21 мл/г субстрата), состоящий из коммерческих препаратов целлюлаз Celluclast 1.5L, β-глюкозидазы Novozyme 188 и ксиланазы Viscostar 150L. Помимо пшеничной соломы (86 г/л) в реакционную среду дополнительно добавляют дрожжевой экстракт (1 г/л) и глюкозу (0,3 г/л), раствор витаминов и минеральных солей. В ходе процесса из среды периодически выделяют органические растворители, чтобы снять их ингибирующее влияние на клетки. В результате процесса концентрация растворителей, накапливающаяся в реакционной среде, составляет 21,4 г/л, что соответствует продуктивности процесса по растворителям 0,297 г/л/ч.To overcome the inhibitory effect of solvents on cells, genetically modified strains of bacteria of the genus Clostridium are used [Thirmal C., Dahman Y. (2011) Different physical and chemical pretreatments of wheat straw for enhanced biobutanol production in simultaneous saccharification and fermentation // Int J Energ Environ. , V.2 (4), P.615-626}. So known is a method of producing organic solvents by simultaneous saccharification and fermentation of CSSs under the action of C. beijerinckii P260 cells [Qureshi N., Saha B.C., Hector R.E., Hughes S., Cotta M.A. (2008) Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Clostridium beijerinckii: part I-batch fermentation // Biomass Bioenergy, V.32, P.168-175]. As a CSS, this method uses crushed wheat straw pretreated with 1% sulfuric acid solution at 121 ° C for 1 hour. The bacterial cells Clostridium beijerinckii P260 are used as inoculum. The process is carried out at a temperature of 35 ° C for 72 hours. A cellulase solution (0.21 ml / g of substrate) consisting of commercial preparations of cellulases Celluclast 1.5L, β-glucosidase Novozyme 188 and Viscostar 150L xylanase is added to the resulting mixture. In addition to wheat straw (86 g / l), yeast extract (1 g / l) and glucose (0.3 g / l), a solution of vitamins and mineral salts are additionally added to the reaction medium. During the process, organic solvents are periodically isolated from the medium to remove their inhibitory effect on cells. As a result of the process, the concentration of solvents accumulating in the reaction medium is 21.4 g / l, which corresponds to a solvent productivity of 0.297 g / l / h.

К недостаткам данного способа относится необходимость введения в реакционную среду помимо основного субстрата добавок в виде раствора глюкозы, дрожжевого экстракта, минеральных солей и витаминов, что приводит к дополнительным экономическим затратам. Кроме того, после предобработки пшеничной соломы разбавленной серной кислотой, в реакционной среде содержатся вещества, ингибирующие каталитическую активность целлюлаз и клеток бактерий, такие как фурфурол и уксусная кислота. Кроме того, все способы получения органических растворителей на основе генно-модифицированных штаммов обладают рядом значительных недостатков, среди которых необходимость введения индукторов в среды для биосинтеза в клетках необходимых ферментов, антибиотиков для подавления развития посторонних микроорганизмов, необходимость решения вопросов по утилизации биомассы генно-модифицированных клеток и т.п. Поэтому огромен интерес к природным штаммам-продуцентам, чье применение в этой области биотехнологии более актуально.The disadvantages of this method include the need for introducing into the reaction medium, in addition to the main substrate, additives in the form of a solution of glucose, yeast extract, mineral salts and vitamins, which leads to additional economic costs. In addition, after pretreatment of wheat straw with dilute sulfuric acid, the reaction medium contains substances that inhibit the catalytic activity of cellulases and bacterial cells, such as furfural and acetic acid. In addition, all methods for producing organic solvents based on genetically modified strains have a number of significant drawbacks, including the need for introducing inducers into the cells for biosynthesis of necessary enzymes in cells, antibiotics to suppress the development of extraneous microorganisms, and the need to resolve issues related to the utilization of biomass of genetically modified cells etc. Therefore, there is great interest in natural producer strains, whose use in this area of biotechnology is more relevant.

Эффективным подходом к увеличению устойчивости клеток природных штаммов рода Clostridium к воздействию растворителей является их иммобилизация, позволяющая значительно увеличить устойчивость клеток к воздействию растворителей и делающая возможным их неоднократное использование для получения органических растворителей [Shapovalov О.I., Ashkinazi L.A. (2008) Biobutanol: biofuel of second generation // Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Патент Международный WO/2010/151706, Integrated system and process for bioproduct production. МПК⁶ С12Р 7/16, C12M 1/10, C12N 1/22]. Использование иммобилизованных бактериальных клеток также позволяет технически упростить стадию отделения иммобилизованных клеток от культуральной жидкости, содержащей органические растворители, создать высокие концентрации бактериальных клеток в реакторе с равномерным распределением их по всему объему и использовать одни и те же иммобилизованные клетки многократно, увеличив продуктивность процесса по бутанолу в сравнении со свободными клетками.An effective approach to increasing the resistance of cells of natural strains of the genus Clostridium to solvents is their immobilization, which significantly increases the resistance of cells to solvents and makes it possible to use them repeatedly to obtain organic solvents [Shapovalov O.I., Ashkinazi LA (2008) Biobutanol: biofuel of second generation // Rus J Appl Chem., V.81 (12), P.2232-2236; Patent International WO / 2010/151706, Integrated system and process for bioproduct production. IPC ⁶ C12P 7/16, C12M 1/10, C12N 1/22]. The use of immobilized bacterial cells also makes it possible to technically simplify the stage of separation of immobilized cells from a culture fluid containing organic solvents, create high concentrations of bacterial cells in the reactor with uniform distribution throughout the volume, and use the same immobilized cells many times, increasing the productivity of the butanol process in comparison with free cells.

Однако несмотря на привлекательность использования иммобилизованных клеток на сегодняшний день известен только один способ получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС, в котором применяются иммобилизованные клетки рода Clostridium [Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskaya A., Maslova O., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738]. Это связано с тем, что предлагаемые к использованию только на стадии АБЭ-ферментации носители для клеток не обладают необходимой химической и физической стабильностью или проявляют подверженность биодеградации, что практически исключает возможность их применения при одновременном осахаривании и ферментации ЦСС, где используются сложные по составу среды, содержащие измельченные образцы ЦСС, ферменты и бактериальные клетки, различные сахара и накапливающиеся органические растворители.However, despite the attractiveness of using immobilized cells, only one method for producing organic solvents by simultaneous saccharification and fermentation of CSSs is known, in which immobilized cells of the genus Clostridium are used [Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskaya A., Maslova O ., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738] . This is due to the fact that the carriers for the cells proposed for use only at the stage of ABE fermentation do not possess the necessary chemical and physical stability or exhibit biodegradation, which practically excludes the possibility of their use with simultaneous saccharification and fermentation of CSSs, where complex media are used, containing ground samples of CSS, enzymes and bacterial cells, various sugars and accumulating organic solvents.

Целесообразным является использование в качестве носителя для клеток, продуцирующих органические растворители, криогеля поливинилового спирта (ПВС) [Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Никольская А.Н., Сенько О.В., Спричева О.В., Варфоломеев С.Д. (2010) Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола // Катализ в пром-ти, т.5, с.70-76] - синтетического полимера, формирующего криогель при замораживании и последующем оттаивании его водного раствора [В.И. Лозинский (2002) Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, т.71, с.559-585]. Порообразователем при этом в матрице такого криогеля служат кристаллы замораживаемой воды. Высокая пористость образующейся матрицы криогеля ПВС обеспечивает незатрудненную диффузию субстратов и продуктов к и от клеток, находящихся в полимерной матрице [Лозинский В.И., Дамшкалн Л.Г., Шаскольский Б.Л., Бабушкина Т.А., Курочкин И.Н., Курочкин И.И.It is advisable to use polyvinyl alcohol (PVA) cryogel as the carrier for cells producing organic solvents [Efremenko EN, Stepanov NA, Nikolskaya AN, Senko OV, Spricheva OV, Varfolomeev S.D. (2010) Biocatalysts based on immobilized cells of microorganisms in the processes of obtaining bioethanol and biobutanol // Catalysis in industry, v.5, p.70-76] - a synthetic polymer that forms a cryogel during freezing and subsequent thawing of its aqueous solution [B. AND. Lozinsky (2002) Cryogels based on natural and synthetic polymers: production, properties and applications. // Advances in Chemistry, vol. 71, p. 559-585]. In this case, crystals of frozen water serve as a pore-forming agent in the matrix of such a cryogel. The high porosity of the resulting PVA cryogel matrix provides easy diffusion of substrates and products to and from cells located in the polymer matrix [Lozinsky V.I., Damshkaln L.G., Shaskolsky B.L., Babushkina T.A., Kurochkin I.N. ., Kurochkin I.I.

Изучение криоструктурирования полимерных систем. 27. Физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта и особенности их макропористой морфологии. // Колоидн. журн. 69 (6) 798-816 (2007)]. Кроме того, этот носитель обладает высокой износостойкостью, химической стабильностью и не подвержен биодеструкции.The study of cryostructuring of polymer systems. 27. Physico-chemical properties of polyvinyl alcohol cryogels and features of their macroporous morphology. // Colloid journal 69 (6) 798-816 (2007)]. In addition, this carrier has high wear resistance, chemical stability and is not subject to biodegradation.

В этой связи известен способ получения органических растворителей [Efremenko E., Stepanov N., Senko О., Nikolskaya A., Maslova О., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738] путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованных в криогель ПВС. В качестве субстрата способ предполагает использование образцов рисовой и пшеничной соломы, кукурузных стеблей, осиновых и сосновых опилок, измельченных до размера частиц 300-800 мкм. Предварительно ЦСС осахаривают при 50-55°С в течение 8 ч, для чего в среду с ЦСС вводят ферментные препараты, содержащие целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазу, в общей концентрации по белку 6 г/л. Далее в эту среду, содержащую частично предобработанное (осахаренное) ЦСС и гидролитические ферменты, вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками, которые предварительно формируют методом замораживания - оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. Гранулы имеют цилиндрическую форму с диаметром и высотой 4 и 8 мм соответственно. Также в эту же среду вносят глюкозу (30 г/л) и дрожжевой экстракт (1 г/л). Далее процесс одновременного осахаривания и ферментации ведут при 37°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса в зависимости от различных типов ЦСС составляет соответственно: для пшеничной соломы - 18,2 г/л и 0,364 г/л/ч, для рисовой соломы - 20,2 г/л и 0,404 г/л/ч, для кукурузных стеблей - 18,5 г/л и 0,370 г/л/ч, для осиновых опилок - 12,0 г/л и 0,240 г/л/ч, для сосновых опилок - - 11,5 г/л и 0,230 г/л/ч. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса составляет 500 ч.In this regard, a method for producing organic solvents is known [Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskaya A., Maslova O., Zorov I., Sinitsyn A. (2011) Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 6-9 June, P.1735-1738] by simultaneous saccharification and fermentation of CSSs under the action of bacterial cells Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel. As a substrate, the method involves the use of samples of rice and wheat straw, corn stalks, aspen and pine sawdust, crushed to a particle size of 300-800 microns. Preliminarily, CSS is saccharified at 50-55 ° С for 8 h, for which enzymatic preparations containing cellulases, xylanases, and β-glucosidase are introduced into the medium with CSSs at a total protein concentration of 6 g / L. Then, PVA cryogel granules with cells immobilized in them are introduced into this medium, which contains partially pre-processed (saccharified) CSSs and hydrolytic enzymes, which are preliminarily formed by freezing and thawing a suspension of cell biomass (7% wt.) In a 10% (wt.) Solution PVA. The granules have a cylindrical shape with a diameter and a height of 4 and 8 mm, respectively. Glucose (30 g / l) and yeast extract (1 g / l) are also added to the same medium. Next, the process of simultaneous saccharification and fermentation is carried out at 37 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process, depending on the different types of CSS, are respectively: for wheat straw - 18.2 g / l and 0.364 g / l / h, for rice straw - 20.2 g / l and 0.404 g / l / h, for corn stalks - 18.5 g / l and 0.370 g / l / h, for aspen sawdust - 12.0 g / l and 0.240 g / l / h, for pine sawdust - 11.5 g / l and 0.230 g / l / h. The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a periodic regimen of the process is 500 hours.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол, путем одновременного ферментативного осахаривания (гидролиза) углеводов, входящих в состав непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed method of obtaining a complex of organic solvents, including acetone, butanol and ethanol, by simultaneous enzymatic saccharification (hydrolysis) of carbohydrates that are part of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials, and fermentation of the resulting hydrolysates in the target products under the influence of bacterial cells of Clostridium acetobutylicum immobilized in polyvinyl alcohol cryogel, it was taken as a prototype.

К существенным недостаткам прототипа относится обязательное внесение в реакционную среду помимо основного субстрата (ЦСС) добавок глюкозы и дрожжевого экстракта (дополнительные источники углерода и азота). В этой связи накопление органических растворителей в среде происходит не только за счет сахаров, образующихся при гидролизе ЦСС, но и за счет того количества глюкозы, которое дополнительно вносится в среду. Это не только экономически затратно, но и делает невозможным проведение оценки эффективности конверсии основного сырья, то есть искажает адекватность получаемых параметров процесса, а также создает опасность контаминации процесса посторонними микроорганизмами, так как глюкоза и дрожжевой экстракт являются прекрасными субстратами для роста многих микроорганизмов. В этой связи требуется строгое соблюдение условий стерильности при проведении процесса, а это ухудшает его экономическую сторону, так как требует применения специального оборудования и затрат времени и энергии на стерилизацию не только оборудования и сред, но и всех коммуникаций. Кроме того, длительность последовательного использования иммобилизованных клеток в таком процессе (500 ч) не является удовлетворительной и требует увеличения. Увеличение длительности эффективного использования одних и тех же адаптированных к условиям процесса иммобилизованных клеток существенно улучшает экономику процесса, так как позволяет избежать необходимости накопления биомассы медленно растущих анаэробных клеток бактерий перед каждым рабочим циклом с последующим решением вопросов по утилизации отработанной биомассы свободных клеток.Significant disadvantages of the prototype include the mandatory addition of glucose and yeast extract (additional sources of carbon and nitrogen) to the reaction medium in addition to the main substrate (CSS). In this regard, the accumulation of organic solvents in the medium occurs not only due to sugars formed during the hydrolysis of CSS, but also due to the amount of glucose that is additionally introduced into the medium. This is not only economically costly, but also makes it impossible to evaluate the conversion efficiency of the main raw materials, that is, it distorts the adequacy of the obtained process parameters, and also creates the danger of contamination of the process by foreign microorganisms, since glucose and yeast extract are excellent substrates for the growth of many microorganisms. In this regard, strict adherence to sterility conditions during the process is required, and this worsens its economic side, since it requires the use of special equipment and the time and energy required to sterilize not only equipment and environments, but also all communications. In addition, the duration of the sequential use of immobilized cells in such a process (500 h) is not satisfactory and requires an increase. An increase in the duration of the effective use of the same immobilized cells adapted to the process conditions significantly improves the process economy, since it avoids the need for biomass accumulation of slowly growing anaerobic bacterial cells before each working cycle with the subsequent solution of issues related to the disposal of spent biomass of free cells.

Задачей заявляемого технического решения является создание усовершенствованного способа получения органических растворителей, характеризующегося устранением перечисленных выше недостатков, присущих прототипу.The objective of the proposed technical solution is to create an improved method for producing organic solvents, characterized by the elimination of the above disadvantages inherent in the prototype.

Технический результат заключается в улучшении показателей процесса (продуктивности и суммарно накапливающейся концентрации растворителей) при снижении энергетических и экономических затрат, необходимых на реализацию самого процесса, за счет снижения температуры процесса и устранения необходимости введения в реакционные среды дополнительных питательных компонентов сред в виде глюкозы и дрожжевого экстракта, а также за счет сокращения времени ферментативного предгидролиза сырья наряду с увеличением срока эффективного использования одних и тех же иммобилизованных клеток-продуцентов целевых продуктов.The technical result consists in improving process indicators (productivity and total accumulating concentration of solvents) while reducing the energy and economic costs required to implement the process itself by reducing the process temperature and eliminating the need to introduce additional nutrient components of the media into the reaction medium in the form of glucose and yeast extract as well as by reducing the time of enzymatic prehydrolysis of raw materials along with an increase in the effective use I have the same immobilized cells producing desired products.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения комплекса органических растворителей, включающего ацетон, бутанол и этанол из возобновляемого растительного целлюлозосодержащего сырья путем одновременного ферментативного осахаривания углеводов, входящих в состав сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием биокатализатора на основе клеток бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, согласно изобретению, перед ферментативным осахариванием углеводов и ферментацией получаемых гидролизатов осуществляют измельчение сырья до размера частиц 20-80 мкм и проводят предварительное ферментативное осахаривание измельченного сырья в течение 1-5 ч при температуре 45-55°С, при этом последующий процесс одновременного ферментативного осахаривания углеводов и ферментации получаемых гидролизатов ведут при температуре 31±3°С в течение времени, обеспечивающем получение органических растворителей. Измельчение может быть проведено на шаровой мельнице. Предварительное ферментативное осахаривание измельченного сырья проводят в присутствии смеси гидролитических ферментов из целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазы. Наилучший результат достигается при использовании биокатализатора в виде цилиндрических гранул, имеющих диаметр и высоту 3-5 мм. Процесс одновременного ферментативного осахаривания углеводов и ферментации получаемых гидролизатов ведут в течение 45-50 часов, при этом биокатализатор после окончания технологического цикла может быть отделен от реакционной среды для повторного использования в технологическом цикле, при этом период эффективного действия биокатализатора составляет от 1000-1200 ч.The problem is solved in that in the method for producing a complex of organic solvents, including acetone, butanol and ethanol from renewable plant cellulose-containing raw materials by simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates included in the raw material, and fermentation of the resulting hydrolysates into target products under the action of a biocatalyst based on Clostridium bacteria cells acetobutylicum B-4786 immobilized in polyvinyl alcohol cryogel according to the invention before enzymatic saccharification of carbohydrates and fe The product hydrolysates are grinded by grinding the raw materials to a particle size of 20-80 μm and preliminary enzymatic saccharification of the crushed raw materials is carried out for 1-5 hours at a temperature of 45-55 ° C, while the subsequent process of simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates and fermentation of the resulting hydrolysates is carried out at a temperature of 31 ± 3 ° C during the time providing organic solvents. Grinding can be carried out in a ball mill. Preliminary enzymatic saccharification of crushed raw materials is carried out in the presence of a mixture of hydrolytic enzymes from cellulase, xylanase and β-glucosidase. The best result is achieved by using a biocatalyst in the form of cylindrical granules having a diameter and a height of 3-5 mm. The process of simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates and fermentation of the resulting hydrolysates is carried out for 45-50 hours, while the biocatalyst after the end of the technological cycle can be separated from the reaction medium for reuse in the technological cycle, while the effective period of the biocatalyst is from 1000-1200 hours.

Для эффективного контакта гидролитических ферментов и субстрата в заявляемом техническом решении проводят измельчение образцов ЦСС, например, на шаровой мельнице активаторного типа так, чтобы размер частиц составлял 20-80 мкм. Для этого образец ЦСС помещают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и при центробежном ускорении 300 м/с² и скорости вращения барабанов 1290 об/мин в течение 5 мин осуществляют измельчение сырья. Шаровая мельница активаторного типа, используемая для измельчения ЦСС, обеспечивает в заданном режиме не только значительное измельчение, но и способствует механоактивации сырья, в результате чего происходит разрыв множественных химических, а именно водородных связей между линейными молекулами целлюлозы, что сопровождается заменой кристаллической структуры полимера на аморфную, а также частичной деполимеризацией молекул целлюлозы. В ходе процесса измельчения локально повышается температура частиц сырья, при этом остаточная вода в волокнах растительной биомассы выполняет функцию катализатора кислотного гидролиза. Таким образом, при механической дезинтеграции (физической обработке) ЦСС на шаровой мельнице активаторного типа происходят его физико-химические изменения, то есть достигается частичная физико-химическая трансформация исходного сырья без дополнительного применения химических реагентов. При относительной технологической простоте реализации (без применения химреагентов, высоких температур и повышенного давления), экологичности и благоприятности для основного процесса, физико-химическая предобработка биосырья, осуществляемая в момент механического измельчения ЦСС на шаровой мельнице в установленных условиях, обеспечивает эффективную подготовку целлюлозосодержащего сырья к его ферментативной обработке (осахариванию).For effective contact of hydrolytic enzymes and the substrate in the claimed technical solution, grinding of CSS samples is carried out, for example, in an activator-type ball mill so that the particle size is 20-80 microns. For this, a CSS sample is placed in an activator-type planetary ball mill drum, and with centrifugal acceleration of 300 m / s ² and a drum rotation speed of 1290 rpm for 5 minutes, the raw material is crushed. The ball mill of the activator type used for grinding DSS provides not only significant grinding in a given mode, but also contributes to the mechanical activation of the raw material, resulting in the breaking of multiple chemical, namely hydrogen bonds between linear cellulose molecules, which is accompanied by the replacement of the crystalline structure of the polymer by an amorphous one as well as partial depolymerization of cellulose molecules. During the grinding process, the temperature of the particles of raw materials rises locally, while the residual water in the fibers of plant biomass acts as a catalyst for acid hydrolysis. Thus, during the mechanical disintegration (physical processing) of the CSS in an activator type ball mill, its physicochemical changes occur, that is, a partial physicochemical transformation of the feedstock is achieved without the additional use of chemical reagents. With the relative technological simplicity of implementation (without the use of chemicals, high temperatures and high pressure), environmental friendliness and favorableness for the main process, the physicochemical pretreatment of bio-materials, carried out at the time of mechanical grinding of the CSS in a ball mill under the established conditions, ensures the efficient preparation of cellulose-containing raw materials for it enzymatic processing (saccharification).

Получаемый диапазон размера частиц разных типов ЦСС, измельчаемых в указанном режиме работы шаровой мельницы в предлагаемом техническом решении, составляет 20-80 мкм. Именно такой диапазон частиц получается при задаваемом режиме работы шаровой мельницы. Изменение режима работы мельницы приводит либо к увеличению размера частиц более 80 мкм и изменению показателей процесса в сторону прототипа, а уменьшение размера частиц (менее 20 мкм) приводит к появлению сложностей при работе с такими частицами (при их смачивании, взвешивании, пересыпании, и др.) ввиду их большой «летучести» (легкости).The resulting range of particle sizes of different types of CSSs, crushed in the specified mode of operation of the ball mill in the proposed technical solution, is 20-80 microns. It is this range of particles that is obtained with a given operating mode of a ball mill. Changing the operating mode of the mill leads either to an increase in particle size of more than 80 μm and a change in process parameters towards the prototype, and a decrease in particle size (less than 20 μm) leads to difficulties when working with such particles (when they are wetted, weighed, poured, etc. .) in view of their great “volatility” (lightness).

В заявляемом техническом решении перед началом основного процесса получения органических растворителей путем одновременного осахаривания и ферментации ЦСС под действием ферментов, как и в прототипе, проводят предварительное осахаривание сырья в присутствии той же смеси гидролитических ферментов, взятых в такой же концентрации (6 г общего белка/л), что и в прототипе. Это необходимо для накопления в среде начальной концентрации сахаров, способных обеспечить условия, необходимые для начала функционирования клеток бактерий рода Clostridium, конвертирующих сахара, в частностиIn the claimed technical solution, before starting the main process for producing organic solvents by simultaneous saccharification and fermentation of CSSs under the action of enzymes, as in the prototype, preliminary saccharification of raw materials is carried out in the presence of the same mixture of hydrolytic enzymes taken in the same concentration (6 g of total protein / l ), as in the prototype. This is necessary for the accumulation in the medium of an initial concentration of sugars capable of providing the conditions necessary for the start of the functioning of cells of bacteria of the genus Clostridium that convert sugar, in particular

глюкозу, в органические растворители. В случае отсутствия в среде глюкозы и введения в нее клеток бактерий последние оказываются лимитированы по наличию в среде биодоступного субстрата и, будучи склонными к спорообразованию в неблагоприятных условиях культивирования, коим и является отсутствие субстрата, клетки переходят из активного метаболического состояния в состояние покоя, что приводит к остановке процесса получения органических растворителей. Таким образом, перед внесением клеток в среду с ЦСС и ферментами, необходимо обеспечить наличие в среде субстрата для клеток. С этой целью проводят предварительное осахаривание ЦСС в присутствии смеси гидролитических ферментов при температуре 45-55°С, являющейся оптимальной для действия целлюлолитических ферментов. glucose into organic solvents. In the absence of glucose in the medium and the introduction of bacterial cells into it, the latter are limited by the presence of a bioavailable substrate in the medium and, being prone to spore formation under adverse cultivation conditions, which is the absence of substrate, the cells pass from an active metabolic state to a resting state, which leads to to stop the process of obtaining organic solvents. Thus, before introducing cells into the medium with DSS and enzymes, it is necessary to ensure the presence of a substrate for cells in the medium. To this end, a preliminary saccharification of CSS is carried out in the presence of a mixture of hydrolytic enzymes at a temperature of 45-55 ° C, which is optimal for the action of cellulolytic enzymes.

В отличие от прототипа предварительное осахаривание ЦСС проводят не 8 ч, а 1-5 ч в тех же условиях, что и в прототипе. Снижение длительности этой стадии оказывается возможным за счет предлагаемого в заявляемом техническом решении использования частиц ЦСС меньшего размера, позволяющим за существенно более короткий промежуток времени провести предварительное осахаривание ЦСС с накоплением необходимого количества сахаров, являющихся субстратом для клеток бактерий. Длительность предварительного осахаривания ЦСС в заявляемом способе (1-5 ч) определяется только типом ЦСС, используемым для получения органических растворителей.In contrast to the prototype, the preliminary saccharification of the CSS is carried out not for 8 hours, but for 1-5 hours under the same conditions as in the prototype. Reducing the duration of this stage is possible due to the use of smaller CSS particles in the claimed technical solution, which allows preliminary saccharification of CSSs for a significantly shorter period of time with the accumulation of the required amount of sugars, which are a substrate for bacterial cells. The duration of the preliminary saccharification of the CSS in the present method (1-5 hours) is determined only by the type of CSS used to obtain organic solvents.

В составе смеси ферментов, осуществляющих гидролиз ЦСС, в заявляемом техническом решении используют те же ферменты, что и в прототипе, а именно целлюлазы, ксиланазы и β-глюкозидазу. Использование различных ферментных препаратов позволяет осуществлять более глубокий гидролиз целлюлозы.As part of a mixture of enzymes that perform hydrolysis of CSS, in the claimed technical solution, the same enzymes are used as in the prototype, namely cellulase, xylanase and β-glucosidase. The use of various enzyme preparations allows for deeper hydrolysis of cellulose.

В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, в среду, содержащую частично предобработанное (осахаренное) ЦСС и гидролитические ферменты, вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые предварительно формируют методом замораживания-оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. В техническом решении, как и в прототипе, используются для иммобилизации в криогель ПВС клетки Clostridium acetobutylicum B-4786. Гранулы, как и в прототипе, имеют цилиндрическую форму, но уменьшенный размер - диаметр и высота гранул в заявляемом техническом решении составляют соответственно не 4 и 8 мм, как в прототипе, а имеют диаметр и высоту гранул по 3-5 мм. Уменьшение размера гранул происходит за счет того, что объем аликвоты, используемой для формирования гранул, уменьшают в 2 раза по сравнению с прототипом. Так в заявляемом, техническом решении для формирования гранул нужной величины готовят суспензию клеток бактерий в растворе полимера, распределяют полученную суспензию в виде аликвот объемом 0,5 мл по лункам 96-луночной плашки, которую помещают в морозильную камеру при -20°С, замораживают содержимое плашки, выдерживают при этой температуре в течение 24 ч и размораживают при +8°С. Полученные в результате такой операции гранулы с иммобилизованными в криогель ПВС клетками используют для получения органических растворителей. Снижение размера гранул направлено на улучшение массообменных процессов для клеток, находящихся внутри гранул. Снижение размера гранул более чем в 2 раза по сравнению с прототипом, приводит к необходимости уменьшения объема суспензии клеток в растворе полимера, используемого для формирования гранул, что приводит к определенным техническим сложностям ввиду высокой вязкости суспензии, распределяемой по лункам плашки. Меньшее снижение размера гранул не позволяет существенно улучшить метаболическую активность клеток, незначительно изменив массообменные процессы в их микроокружении.In the claimed technical solution, as in the prototype, PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into the medium containing partially pre-processed (saccharified) CSSs and hydrolytic enzymes, which are preliminarily formed by freezing and thawing a suspension of cell biomass (7% of the mass. ) in a 10% (mass.) solution of PVA. In the technical solution, as in the prototype, cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 are used to immobilize PVO cells into the cryogel PVA. The granules, as in the prototype, have a cylindrical shape, but the reduced size — the diameter and height of the granules in the claimed technical solution are not 4 and 8 mm, respectively, as in the prototype, but have a diameter and height of granules of 3-5 mm. The reduction in the size of the granules occurs due to the fact that the volume of the aliquot used to form the granules is reduced by 2 times compared with the prototype. So in the claimed technical solution for the formation of granules of the desired size, a suspension of bacterial cells in a polymer solution is prepared, the suspension obtained is distributed in the form of 0.5 ml aliquots into the wells of a 96-well plate, which is placed in a freezer at -20 ° C, the contents are frozen dies, maintained at this temperature for 24 hours and thawed at + 8 ° C. The granules obtained as a result of such an operation with cells immobilized into PVA cryogel are used to produce organic solvents. Reducing the size of the granules is aimed at improving the mass transfer processes for cells inside the granules. Reducing the size of the granules by more than 2 times compared with the prototype, leads to the need to reduce the volume of the cell suspension in the polymer solution used to form the granules, which leads to certain technical difficulties due to the high viscosity of the suspension distributed over the wells of the plate. A smaller decrease in the size of the granules does not significantly improve the metabolic activity of cells, slightly changing the mass transfer processes in their microenvironment.

Сформированные гранулы с иммобилизованными клетками помещают как и в прототипе, в той же концентрации в среду с предварительно осахаренным ЦСС и смесью гидролитических ферментов, которую, в отличие от прототипа, предварительно охлаждают не до 37°С, а до 31±3°С для одновременного осахаривания и ферментации ЦСС с целью получения органических растворителей. При этом в среду, в отличие от прототипа, не вносят никаких дополнительных питательных компонентов (глюкозы и дрожжевого экстракта) для клеток.The formed granules with immobilized cells are placed, as in the prototype, in the same concentration in a medium with pre-saccharinated CSS and a mixture of hydrolytic enzymes, which, unlike the prototype, are pre-cooled not to 37 ° C, but to 31 ± 3 ° C for simultaneous saccharification and fermentation of CSSs in order to obtain organic solvents. In this case, on Wednesday, unlike the prototype, do not make any additional nutrient components (glucose and yeast extract) for the cells.

Снижение температуры процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС, предлагаемое в заявляемом техническом решении, позволяет замедлить метаболическую активность клеток и снизить скорость потребления иммобилизованными клетками сахаров, накапливающихся в среде под действием ферментов. В этих условиях устраняется необходимость введения в среду дополнительного количества глюкозы, которая есть в прототипе, поскольку скорости накопления сахаров под действием ферментов и потребления их клетками становятся соизмеримыми, а процесс более сбалансированным. Кроме того, снижение температуры позволяет существенно снизить расходы на поддержание необходимой температуры процесса в течение 50 ч. Снижение температуры процесса ниже 31±3°С приводит к существенному замедлению процесса в целом и, в частности, ферментативного гидролиза ЦСС, а использование температуры выше 31±3°С для проведения процесса не приводит к уравниванию скоростей ферментативного гидролиза ЦСС и ферментации сахаров под действием клеток, и, как следствие, остается необходимость внесения в среду дополнительного количества глюкозы в качестве субстрата для клеток.Reducing the temperature of the process of simultaneous saccharification and fermentation of CSS, proposed in the claimed technical solution, allows to slow down the metabolic activity of cells and to reduce the rate of consumption by immobilized cells of sugars that accumulate in the medium under the action of enzymes. Under these conditions, the need to introduce additional glucose into the medium, which is in the prototype, is eliminated, since the rates of sugar accumulation under the action of enzymes and their consumption by cells become comparable, and the process is more balanced. In addition, lowering the temperature can significantly reduce the cost of maintaining the required process temperature for 50 hours. Lowering the temperature of the process below 31 ± 3 ° C leads to a significant slowdown of the process as a whole and, in particular, enzymatic hydrolysis of CSS, and the use of temperature above 31 ± 3 ° C for the process does not equalize the rates of enzymatic hydrolysis of CSSs and fermentation of sugars under the influence of cells, and, as a result, there remains the need to introduce additional gluco into the medium s as a substrate for the cells.

При той же длительности процесса, что и в прототипе (50 ч), заявляемое техническое решение позволяет улучшить технологические показатели процесса, в частности поднять суммарную концентрацию органических растворителей, накапливающихся в среде, и продуктивность процесса на 15-30% в зависимости от типа ЦСС (см. Примеры).With the same process duration as in the prototype (50 h), the claimed technical solution allows to improve the technological parameters of the process, in particular, to increase the total concentration of organic solvents accumulating in the medium and the productivity of the process by 15-30% depending on the type of CSS ( see Examples).

Заявляемое техническое решение, обеспечивающее создание для иммобилизованных клеток более эффективных условий их использования при получении органических растворителей, обеспечивает возможность их более длительного использования для проведения процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС (1000-1200 ч), чем в прототипе (500 ч). К условиям, позволяющим получить такой результат, относится снижение температуры процесса, которое приводит к существенному замедлению термоинактивации собственных ферментов клеток при их длительном экспонировании в средах для накопления органических растворителей. Кроме того, уменьшение размера гранул приводит к более эффективному массообмену и своевременному доступу субстрата к клеткам, включенным в криогель ПВС, а также к более эффективному удалению из микроокружения клеток продуктов метаболизма. Сбалансированность скоростей накопления сахаров и их потребления клетками при заявляемых условиях приводит к тому, что в среде не накапливается высоких концентраций сахаров, способных привести к субстратному ингибированию клеток, с одной стороны, а с другой клетки оказываются обеспеченными необходимой концентрацией сахаров.The claimed technical solution, which ensures the creation for immobilized cells of more effective conditions for their use in the preparation of organic solvents, provides the possibility of their longer use for the process of simultaneous saccharification and fermentation of CSS (1000-1200 h) than in the prototype (500 h). The conditions allowing to obtain such a result include a decrease in the temperature of the process, which leads to a significant slowdown in the thermal inactivation of the cell’s own enzymes during their long exposure in media for the accumulation of organic solvents. In addition, a decrease in granule size leads to more efficient mass transfer and timely access of the substrate to cells included in the PVA cryogel, as well as to more efficient removal of metabolic products from the microenvironment of cells. Balancing the rates of sugar accumulation and their consumption by cells under the claimed conditions leads to the fact that high concentrations of sugars are not accumulated in the medium, which can lead to substrate inhibition of cells, on the one hand, and on the other, the cells are provided with the necessary sugar concentration.

Таким образом, в результате выполнения предлагаемой последовательности действий при заявляемых условиях реализуется способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания (гидролиза) углеводов, входящих в состав целлюлозосодержащего сырья, и ферментации получаемых гидролизатов в целевые продукты под действием клеток бактерий Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС, в котором, в сравнении с прототипом:Thus, as a result of the implementation of the proposed sequence of actions under the claimed conditions, a method for producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification (hydrolysis) of carbohydrates that are part of the cellulose-containing raw material and fermentation of the resulting hydrolysates into the target products under the action of bacteria cells Clostridium acetobutylicum immobilized in PVA cryogel in which, in comparison with the prototype:

- проводится измельчение ЦСС на шаровой мельнице активаторного типа до получения частиц с меньшим в 10-15 раз размером (вместо частиц размером 300-800 мкм получают частицы размером 20-80 мкм), что обеспечивает лучший контакт ферментов с субстратом, делая его более биодоступным для гидролиза и увеличивая, таким образом, скорость и эффективность гидролиза,- grinding of CSSs on an activator-type ball mill is carried out to obtain particles with a size 10-15 times smaller (instead of particles of 300-800 microns in size, particles with a size of 20-80 microns are obtained), which provides better contact of enzymes with the substrate, making it more bioavailable hydrolysis and thus increasing the speed and efficiency of hydrolysis,

- сокращена длительность предварительного осахаривания ЦСС в присутствии смеси гидролитических ферментов с 8 ч до 1-5 ч при 45-55°С за счет улучшения контакта фермента с субстратом,- reduced the duration of preliminary saccharification of the CSS in the presence of a mixture of hydrolytic enzymes from 8 hours to 1-5 hours at 45-55 ° C due to improved contact of the enzyme with the substrate,

- упразднено введение в среду дополнительных питательных компонентов среды (30 г/л глюкозы и 1% дрожжевого экстракта), поскольку более эффективен гидролиз основного субстрата (ЦСС),- eliminated the introduction into the environment of additional nutrient components of the medium (30 g / l glucose and 1% yeast extract), since hydrolysis of the main substrate (CSS) is more effective,

- снижена температура проведения процесса одновременного осахаривания и ферментации ЦСС с 37°С до 31±3°С, который реализуется на протяжении 50 ч, что делает процесс более экономически выгодным, так как снижены, таким образом, энергетические затраты,- the temperature of the process of simultaneous saccharification and fermentation of the central heating system is reduced from 37 ° C to 31 ± 3 ° C, which is carried out over 50 hours, which makes the process more economically profitable, since, thus, reduced energy costs,

- улучшены показатели процесса (продуктивности и суммарно накапливающейся концентрации растворителей) при использовании разных типов ЦСС,- improved process indicators (productivity and total accumulating concentration of solvents) when using different types of CSSs,

- уменьшен размер гранул с иммобилизованными клетками при их формировании в 2 раза, что способствует улучшению массообменных процессов внутри гранул и обеспечивает увеличение эффективности их использования, приводящее к повышению срока эффективного использования иммобилизованных клеток-продуцентов органических растворителей от 500 до 1000-1200 суток для разных источников ЦСС, представленных в более широком спектре, чем в прототипе. Последнее достижение в виде увеличенного срока эффективного использования иммобилизованных клеток, отличающее заявляемое техническое решение от прототипа, позволяет решить важную экологическую и экономическую проблему, связанную с необходимостью утилизации отработанных иммобилизованных клеток за счет их в 2 раза более длительного использования.- reduced the size of granules with immobilized cells during their formation by 2 times, which improves the mass transfer processes inside the granules and provides an increase in the efficiency of their use, leading to an increase in the effective use of immobilized cells producing organic solvents from 500 to 1000-1200 days for different sources DSS, presented in a wider spectrum than in the prototype. The latest achievement in the form of an extended period of effective use of immobilized cells, distinguishing the claimed technical solution from the prototype, allows us to solve an important environmental and economic problem associated with the need to utilize spent immobilized cells due to their 2 times longer use.

Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.The following are specific examples illustrating the claimed technical solution.

Пример 1. Способ получения органических, растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде пшеничной соломы, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВС.Example 1. A method of producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of wheat straw carried out by bacteria cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel.

Образец пшеничной соломы (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают в течение 5 мин при центробежном ускорении 300 м/с² и скорости вращения барабанов 1290 об/мин. Получаемый размер частиц измельченной пшеничной соломы составляет 20 мкм. Измельченный образец пшеничной соломы суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, содержащем в общей концентрации по белку 6 г/л целлюлаз, ксиланаз и β-глюкозидазу, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание пшеничной соломы проводят при 50°С в течение 2 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 30°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые предварительно формируют методом замораживания оттаивания суспензии биомассы клеток (7% масс.) в 10% (масс.) растворе ПВС. Гранулы имеют цилиндрическую форму с диаметром и высотой по 4±1 мм. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 30°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для пшеничной соломы - 22 г/л и 0,44 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 21%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием пшеничной соломы составляет 1200 ч.A sample of wheat straw (120 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and crushed for 5 minutes with a centrifugal acceleration of 300 m / s ² and a drum rotation speed of 1290 rpm. The resulting particle size of the crushed wheat straw is 20 μm. The crushed sample of wheat straw is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution containing a total protein concentration of 6 g / l of cellulases, xylanase and β-glucosidase, prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.0) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Preliminary saccharification of wheat straw is carried out at 50 ° С for 2 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 30 ° С and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are preliminarily formed by freezing thawing of a biomass suspension cells (7% wt.) in a 10% (wt.) solution of PVA. The granules are cylindrical in shape with a diameter and a height of 4 ± 1 mm. The process of simultaneous saccharification and fermentation of the CSS is carried out at 30 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process is 22 g / l and 0.44 g / l / h for wheat straw, which exceeds the prototype level by 21%. The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using wheat straw is 1200 hours

Пример 2. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде рисовой соломы, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 2. A method of producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of rice straw carried out by bacterial cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец рисовой соломы (112 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченной рисовой соломы составляет 30 мкм. Измельченный образец рисовой соломы суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,5) и помещают в термостатируемый при 55°С реактор. Предварительное осахаривание рисовой соломы проводят при 55°С в течение 1 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 28°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 28°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для рисовой соломы - 23,3 г/л и 0,464 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 15%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием рисовой соломы составляет 1160 ч.A sample of rice straw (112 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and crushed as described in Example 1. The resulting particle size of the crushed rice straw is 30 μm. The crushed rice straw sample is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1, prepared on the basis of acetate buffer (pH 5.5) and placed in a temperature-controlled reactor at 55 ° C. Pre-saccharification of rice straw is carried out at 55 ° C for 1 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 28 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of the CSSs is carried out at 28 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for rice straw is 23.3 g / l and 0.464 g / l / h, which exceeds the level of the prototype by 15%. The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using rice straw is 1160 hours.

Пример 3. Способ получена органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде кукурузных стеблей, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 3. The method obtained organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of corn stalks, carried out by bacteria cells Clostridium acetobutylicum B-4786, immobilized in PVA cryogel

Образец кукурузных стеблей (115 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных кукурузных стеблей составляет 50 мкм. Измельченный образец кукурузных стеблей суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,3) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание кукурузных стеблей проводят при 50°С в течение 3 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для кукурузных стеблей - 20,5 г/л и 0,41 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 19,5%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием кукурузных стеблей составляет 1150 ч.A sample of corn stalks (115 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the ground corn stalks is 50 μm. The crushed sample of corn stalks is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1 prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.3) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Preliminary saccharification of corn stalks is carried out at 50 ° C for 3 hours. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 32 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of the CSSs is carried out at 32 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for corn stalks is 20.5 g / l and 0.41 g / l / h, which exceeds prototype level by 19.5%. The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using corn stalks is 1150 hours.

Пример 4. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде осиновых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 4. A method of producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of aspen sawdust carried out by bacteria cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец осиновых опилок (125 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных осиновых опилок составляет 70 мкм. Измельченный образец осиновых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 45°С реактор. Предварительное осахаривание осиновых опилок проводят при 45°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 31°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично Примеру 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ЦСС ведут при 31°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для осиновых опилок - 14,5 г/л и 0,29 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 20,8%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием осиновых опилок составляет 1050 ч.A sample of aspen sawdust (125 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the ground aspen sawdust is 70 μm. The crushed sample of aspen sawdust is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1, prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.0) and placed in a temperature-controlled reactor at 45 ° C. Preliminary saccharification of aspen sawdust is carried out at 45 ° C for 5 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 31 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained analogously to Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of the CCS are carried out at 31 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for aspen chips is 14.5 g / l and 0.29 g / l / h, which exceeds the prototype level by 20.8 % The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using aspen sawdust is 1050 hours.

Пример 5. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде сосновых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 5. A method of obtaining organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of pine sawdust carried out by bacterial cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец сосновых опилок (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных сосновых опилок составляет 80 мкм. Измельченный образец сосновых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,5) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание сосновых опилок проводят при 50°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации ведут ЦСС при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для сосновых опилок - 15,0 г/л и 0,30 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 30,4%. Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием сосновых опилок составляет 1000 ч.A sample of pine sawdust (120 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the ground pine sawdust is 80 μm. The crushed sample of pine sawdust is suspended in a concentration of 100 g dry. in / in a enzyme solution similar to Example 1, prepared on the basis of acetate buffer (pH 5.5) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Preliminary saccharification of pine sawdust is carried out at 50 ° С for 5 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 32 ° С and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation is carried out by the CSS at 32 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for pine sawdust is 15.0 g / l and 0.30 g / l / h, which exceeds prototype level by 30.4%. The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using pine sawdust is 1000 hours.

Пример 6. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде свекловичного жома, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 6. A method of obtaining organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of beet pulp, carried out by bacterial cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец свекловичного жома (115 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченного свекловичного жома составляет 60 мкм. Измельченный образец свекловичного жома суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе ацетатного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 45°С реактор. Предварительное осахаривание свекловичного жома проводят при 45°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 34°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации свекловичного жома ведут при 34°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для свекловичного жома - 21,5 г/л и 0,43 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием свекловичного жома составляет 1100 ч.A sample of beet pulp (115 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the ground beet pulp is 60 μm. The crushed sample of beet pulp is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1, prepared on the basis of acetate buffer (pH 5.0) and placed in a temperature-controlled reactor at 45 ° C. Pre-saccharification of beet pulp is carried out at 45 ° C for 5 hours. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 34 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of beet pulp is carried out at 34 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for beet pulp is 21.5 g / l and 0.43 g / l / h (similar there is no data in the prototype). The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using beet pulp is 1100 hours.

Пример 7. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде яблочных выжимок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогель ПВСExample 7. A method of producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of apple pomace, carried out by bacteria cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец яблочных выжимок (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных яблочных выжимок составляет 80 мкм. Измельченный образец яблочных выжимок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание яблочных выжимок проводят при 50°С в течение 3 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации яблочных выжимок ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для яблочных выжимок - 17,0 г/л и 0,34 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием яблочных выжимок составляет 1100 ч.A sample of apple pomace (120 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the crushed apple pomace is 80 μm. The crushed sample of apple pomace is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1 prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.0) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Preliminary saccharification of apple pomace is carried out at 50 ° С for 3 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 32 ° С and 200 g / L of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of apple squeezes is carried out at 32 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and the productivity of the process for apple squeezes is 17.0 g / l and 0.34 g / l / h (similar there is no data in the prototype). The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using apple pomace is 1100 hours.

Пример 8. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде топинамбура, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum B-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВСExample 8. A method of obtaining organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose) raw materials in the form of Jerusalem artichoke, carried out by bacteria cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец топинамбура (120 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченного топинамбура составляет 80 мкм. Измельченный образец топинамбура суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание топинамбура проводят при 50°С в течение 1 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 30°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации топинамбура ведут при 30°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для топинамбура - 20,8 г/л и 0,416 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием топинамбура составляет 1420 ч.A Jerusalem artichoke sample (120 g dry. In-in) is placed in an activator-type planetary ball mill drum and ground as described in Example 1. The resulting particle size of ground Jerusalem artichoke is 80 μm. The ground Jerusalem artichoke sample is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1 prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.0) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Preliminary saccharification of Jerusalem artichoke is carried out at 50 ° C for 1 h. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 30 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained in the same way as described in Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of Jerusalem artichoke is carried out at 30 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and process productivity for Jerusalem artichoke is 20.8 g / l and 0.416 g / l / h (there are no similar data in the prototype) . The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under the periodic regime of the process using Jerusalem artichoke is 1420 hours.

Пример 9. Способ получения органических растворителей путем одновременного ферментативного осахаривания и ферментации непищевого возобновляемого растительного (целлюлозосодержащего) сырья в виде березовых опилок, осуществляемой клетками бактерий Clostridium acetobutylicum В-4786, иммобилизованными в криогелъ ПВСExample 9. A method for producing organic solvents by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation of non-food renewable plant (cellulose-containing) raw materials in the form of birch sawdust carried out by bacteria cells of Clostridium acetobutylicum B-4786 immobilized in PVA cryogel

Образец березовых опилок (110 г сух. в-в) закладывают в барабан планетарной шаровой мельницы активаторного типа и измельчают как описано в Примере 1. Получаемый размер частиц измельченных березовых опилок составляет 30 мкм. Измельченный образец березовых опилок суспендируют в концентрации 100 г сух. в-в/л в ферментном растворе, аналогичном Примеру 1, приготовленном на основе цитратного буфера (рН 5,0) и помещают в термостатируемый при 50°С реактор. Предварительное осахаривание березовых опилок проводят при 50°С в течение 5 ч. Далее температуру среды в реакторе снижают до 32°С и вводят в нее 200 г/л гранул криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками бактерий, которые получают аналогично Примеру 1. Процесс одновременного осахаривания и ферментации березовых опилок ведут при 32°С в течение 50 ч. Суммарная концентрация органических растворителей и продуктивность процесса составляет для березовых опилок - 14,0 г/л и 0,28 г/л/ч (аналогичных данных в прототипе нет). Общая длительность последовательного использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием березовых опилок составляет 1020 ч.A sample of birch sawdust (110 g dry. In-in) is placed in the drum of an activator-type planetary ball mill and ground as described in Example 1. The resulting particle size of the shredded birch sawdust is 30 μm. The crushed sample of birch sawdust is suspended in a concentration of 100 g dry. w / w in an enzyme solution similar to Example 1 prepared on the basis of citrate buffer (pH 5.0) and placed in a thermostatic reactor at 50 ° C. Pre-saccharification of birch sawdust is carried out at 50 ° C for 5 hours. Next, the temperature of the medium in the reactor is reduced to 32 ° C and 200 g / l of PVA cryogel granules with bacterial cells immobilized in them are introduced into it, which are obtained analogously to Example 1. The process of simultaneous saccharification and fermentation of birch sawdust is carried out at 32 ° C for 50 hours. The total concentration of organic solvents and process productivity for birch sawdust is 14.0 g / l and 0.28 g / l / h (there are no similar data in the prototype). The total duration of the sequential use of cells immobilized in PVA cryogel under the indicated conditions under a batch process using birch sawdust is 1020 hours.

Claims

1. The method of obtaining a complex of organic solvents, including acetone, butanol and ethanol, from renewable plant cellulose-containing raw materials by simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates included in the raw material, and fermentation of the resulting hydrolysates in the target products under the action of a biocatalyst based on bacterial cells Clostridium acetobutylicum B-478686 immobilized in the cryogel of polyvinyl alcohol, and before the simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates and fermentation of the resulting hydrolysates they grind the raw materials to a particle size of 20-80 microns and conduct preliminary enzymatic saccharification of the crushed raw materials for 1-5 hours at a temperature of 45-55 ° C, while the process of subsequent simultaneous enzymatic saccharification of carbohydrates and fermentation of the resulting hydrolysates is carried out at a temperature of 28-34 ° C for 45-50 hours, and the biocatalyst is used in the form of cylindrical granules having a diameter and height of 3-5 mm.

2. The method according to claim 1, characterized in that the grinding is carried out on a ball mill.

3. The method according to claim 1, characterized in that the preliminary enzymatic saccharification of the crushed raw materials is carried out in the presence of a mixture of hydrolytic enzymes from cellulase, xylanase and β-glucosidase.

4. The method according to claim 1, characterized in that the biocatalyst after the end of the technological cycle is separated from the reaction medium for reuse in the technological cycle, while the effective period of the biocatalyst is 1000-1200 hours