RU2539092C1 - RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID - Google Patents
RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539092C1 RU2539092C1 RU2013143698/10A RU2013143698A RU2539092C1 RU 2539092 C1 RU2539092 C1 RU 2539092C1 RU 2013143698/10 A RU2013143698/10 A RU 2013143698/10A RU 2013143698 A RU2013143698 A RU 2013143698A RU 2539092 C1 RU2539092 C1 RU 2539092C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactic acid
- strain
- schizosaccharomyces pombe
- yeast
- producent
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента молочной кислоты.The invention relates to microbiology and biotechnology and relates to a strain of the yeast Schizosaccharomyces pombe - producer of lactic acid.
Молочная кислота (МК) широко используется в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Предполагается, что нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.Lactic acid (MK) is widely used in the food industry for preserving and flavoring and in the production of biodegradable plastic - polylactate. Another area of use of lactic acid is the production of a biodegradable solvent of ethyl lactate, which is used in the manufacture of electrical engineering, varnishes and paints, textiles, lubricants, adhesives, etc. It is estimated that non-toxic lactic acid esters can potentially replace more than 80% of the currently used solvents in the world. In this regard, it becomes urgent to develop effective methods for the production of lactic acid.
Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.Traditionally, microbiological methods of preparation based on the cultivation of bacterial strains of lactic acid bacteria are used to obtain MK. The disadvantage of bacterial strains producing lactic acid is their sensitivity to low pH and high concentrations of lactic acid, which leads to a slowdown in culture growth, a decrease in the rate of synthesis of lactic acid, and, as a result, premature termination of the fermentation process.
В связи с этим особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH и высоким концентрациям молочной кислоты.In this regard, the construction of strains of microorganisms that are less sensitive to low pH and high concentrations of lactic acid is of particular interest for creating producers of lactic acid.
Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [1] и, в отличие от бактерий, не требуют для своего роста сложных по составу сред.A promising object for the production of lactic acid is, in particular, yeast, many of which are capable of growing and fermenting under conditions of high acidity [1] and, unlike bacteria, do not require media of complex composition for their growth.
В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [2]. При этом в качестве реципиента используют такие дрожжи, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка, человека)Normally, yeast does not produce significant amounts of lactic acid, however, expression of the lactate dehydrogenase (ldh) gene in yeast cells allows strains producing lactic acid in amounts comparable to the production level to be obtained [2]. Moreover, yeast such as Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. and Hansenula sp., and as a source of the lactate dehydrogenase gene - lactic acid bacteria (Lactobacillus), fungi (Rhizopus oryzae) and mammalian tissue (ldh gene from muscle cells of a bovine, human)
Так, дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л [3].Thus, the yeast Pichia stipitis, carrying the lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus helveticus, is able to produce lactic acid in an amount of 41 g / l [3].
Продукция штамма Saccharomyces cerevisiae JnvScI, содержащего ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27), составляет 35-40 г/л молочной кислоты, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале pH 3,5-6,0.The production of the Saccharomyces cerevisiae JnvScI strain containing the lactate dehydrogenase gene from the fungus Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27) is 35-40 g / l of lactic acid, and its distinctive ability is a constant rate of formation lactic acid in the range of pH 3.5-6.0.
Известен [4] штамм Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует 58 г/л молочной кислоты при pH 3,6.A known [4] strain of Saccharomyces cerevisiae, carrying the lactate dehydrogenase gene from bacteria Lactobacillus plantarum, which produces 58 g / l of lactic acid at pH 3.6.
Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты ингибируется ее высокими концентрациями, что отрицательно влияет на эффективность процесса получения молочной кислоты.The main disadvantage of Saccharomyces cerevisiae yeast is that the process of lactic acid synthesis is inhibited by its high concentrations, which negatively affects the efficiency of the process of producing lactic acid.
В соответствии с [5] высокой устойчивостью к низким значениям pH среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Данные дрожжи хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред, удобны для промышленной ферментации и являются перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.According to [5], Schizosaccharomyces pombe yeast is highly resistant to low pH and high lactic acid concentrations. These yeasts are well genetically studied, do not require complex organic media for their growth, are convenient for industrial fermentation, and are a promising object for creating lactic acid producers.
Так, дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [5], продуцируют 58 г/л молочной кислоты. Однако данный штамм не подходит для промышленного применения, т.к. культивирование осуществляется в две стадии и требует тщательной отмывки клеток, что неосуществимо в промышленных масштабах. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.Thus, Schizosaccharomyces pombe yeast containing the lactate dehydrogenase gene from Rhizopus oryzae fungi [5] produces 58 g / l of lactic acid. However, this strain is not suitable for industrial use, because cultivation is carried out in two stages and requires thorough washing of the cells, which is not feasible on an industrial scale. In addition, the cultivation time to achieve the specified amount of lactic acid is very long and is 8 days.
В работе [6] показано, что Schizosaccharomyces pombe ATCC №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л. Однако для успешного культивирования ферментационная среда должна содержать экзотическую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).It was shown in [6] that Schizosaccharomyces pombe ATCC No. 2476, which carries the mammalian lactate dehydrogenase gene (Homo sapiens), produces lactic acid in an amount of 88 g / l. However, for successful cultivation, the fermentation medium must contain an exotic additive - proteolipids (protein-lipid compounds extracted with organic solvents from brain tissue).
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.The task of the invention is to expand the arsenal of recombinant microorganisms that produce lactic acid.
Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 - продуцента молочной кислоты.The problem was solved by constructing a recombinant strain of the yeast Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041, a producer of lactic acid.
Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 получен путем трансформации штамма-реципиента Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-3106 плазмидной ДНК pcDNA-Km-leu1-pla, полученной путем клонирования в полилинкер коммерческого вектора pUC19 гена лактатдегидрогеназы ldh1 молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum (pla), гена лейцина (leu1) - генетического локуса для эффективной интеграции гена лактатдегидрогеназы ldh1 в хромосому S. pombe и гена устойчивости к антибиотику канамицину (Km) - селективного маркера.The strain Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041 was obtained by transforming the recipient strain Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-3106 plasmid DNA pcDNA-Km-leu1-pla, obtained by cloning into the polylinker of the lactate (leu1), a genetic locus for efficient integration of the ldh1 lactate dehydrogenase gene into the S. pombe chromosome and the kanamycin antibiotic resistance gene (Km), a selective marker.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) по адресу: 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1 и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-4041.The resulting strain was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika (VKPM) at the address: 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1 and has a registration number VKPM Y-4041.
Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 характеризуется следующими признаками.The strain Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041 is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признакиCultural and morphological features
Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды “Malt extract”, “Malt agar” и картофельно-кукурузный агар [7].Cultural morphological characters were described using Malt extract, Malt agar, and potato-corn agar [7].
После трех дней культивирования на среде “Malt extract” культура образует клетки округлые, эллипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.After three days of cultivation on Malt extract medium, the culture forms round, ellipsoidal and cylindrical cells (3.0-5.0) × (5.0-15.0-24.0) microns. A precipitate forms.
На среде “Malt agar” на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.On the environment, “Malt agar” on the 5th day forms medium-sized colonies of a white or slightly creamy hue. The surface of the colonies is smooth, the edge is even. Vegetative propagation - cell division in half.
Аски со спорами формируются на картофельно-кукурузном агаре. Конъюгация вегетативных клеток предшествует образованию асков, содержащих от 2-х до 4-х эллипсоидальных аскоспор. Свободные аскоспоры могут объединяться в небольшие группы.Askeys with spores form on potato corn agar. Conjugation of vegetative cells precedes the formation of asks containing from 2 to 4 ellipsoidal ascospores. Free ascospores can be combined into small groups.
Физиолого-биохимические признакиPhysiological and biochemical characteristics
Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.The culture is able to ferment glucose, sucrose, maltose and raffinose. Unable to ferment galactose, lactose and melibiosis. Assimilates sucrose, maltose, and raffinose as the sole carbon source. It does not assimilate galactose, cellobiose, trehalose, lactose, xylose, arabinose, ribose, rhamnose, erythritol, ribitol, mannitol, starch, succinic, citric acid, inositol culture does not assimilate nitrates, is not able to grow on a medium without vitamins.
Оптимальные условия для размножения штамма.Optimum conditions for the propagation of the strain.
Температура 30°C, pH 6, полная дрожжевая среда [8].Temperature 30 ° C, pH 6, complete yeast medium [8].
Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.The strain is stored in lyophilized form or in pairs of liquid nitrogen.
Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.The obtained strain of Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041 retains the ability to form lactic acid after 18 consecutive transfers in a complete medium.
Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости.The inventive strain when grown in flasks is capable of producing lactic acid in an amount of 50 g / l of culture fluid.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:The invention is illustrated by the following figures of a graphic image:
Фиг.1 Зависимость накопления молочной кислоты от времени культивированияFigure 1 The dependence of the accumulation of lactic acid from the time of cultivation
Фиг.2 Хроматограмма супернатанта культуральной жидкости штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041Figure 2 Chromatogram of the supernatant of the culture fluid of the strain Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041
Пример 1. Получение штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041Example 1. Obtaining a strain of Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041
Трансформацию Schizosaccharomyces pombe осуществляют методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).The transformation of Schizosaccharomyces pombe is carried out by electroporation (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).
Штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106, используемый для трансформации, предварительно выращивают в среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 100 нг ДНК плазмиды pcDNA-Km-leu1-pla, линеаризованной рестриктазой BglII, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.The strain Schizosaccharomyces pombe Y-3106 used for transformation is preliminarily grown in YPD medium (wt.%: Yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) to a concentration of 1 × 10 8 cells per 1 ml. The cells are centrifuged, washed in ice-cold sterile water, and then in an ice-cold solution of 1M sorbitol. Cells are incubated in a 25 mM dithiothreitol solution for 15 minutes, then washed in an ice-cold solution of 1M sorbitol. Cells are resuspended in an ice-cold solution of 1M sorbitol at a concentration of 1-5 × 10 9 cells per 1 ml. An aliquot of 40 μl of the cell suspension was transferred to chilled eppendorf, 100 ng of the DNA of the plasmid pcDNA-Km-leu1-pla linearized with BglII restriction enzyme was added and incubated in ice for 5 minutes. The mixture of cells and DNA is transferred to a pre-cooled cell for electroporation. Electroporation is carried out under the following conditions: 1.5 kV, 400 Ohms, 25uF. After poreing, add 1 ml of ice-cold 1M sorbitol solution.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной минимальной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2 мас.%) в течение 5 суток при температуре 30°C. В качестве селективного агента добавляют генетицин в количестве 20 мг/мл.The selection of transformants is carried out on agarized minimal medium YNB (Himedia) with the addition of glucose (2 wt.%) For 5 days at a temperature of 30 ° C. Geneticin in an amount of 20 mg / ml is added as a selective agent.
Продукцию молочной кислоты трансформантами первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас.%: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и мела (0,5 мас.%). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.Lactic acid production by transformants was initially evaluated in a cup test with the addition of chalk in the zones of hydrolysis. The test uses LA agar medium (wt.%: Yeast extract - 0.5, peptone - 1, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt.%) And chalk (0.5 wt.%). As a control, a Schizosaccharomyces pombe Y-3106 strain is used.
Трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, культивируют в жидкой среде в пробирке. Ферментацию проводят при 30°C на качалке с 150 об/мин в питательной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 20 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.Transformants that showed the greatest ratio of the diameter of the hydrolysis zone to the diameter of the colony on the cups with chalk, cultivated in a liquid medium in vitro. Fermentation is carried out at 30 ° C on a shaker with 150 rpm in a YPD medium with the addition of glucose (2 wt.%) In test tubes (50 ml) with a working volume of 20 ml. Sowing is carried out by a bacteriological loop. Fermentation is continued for 48 hours.
Концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ [9].The concentration of lactic acid in the culture fluid is determined by HPLC [9].
По результатам ферментации отобран трансформант №24, который при культивировании в пробирках позволяет получить молочную кислоту в количестве 19 г/л культуральной жидкости.According to the fermentation results, transformant No. 24 was selected, which, when cultured in test tubes, allows the production of lactic acid in an amount of 19 g / l of culture fluid.
Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe (pcDNA-Km-leul-pla) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4041.The resulting Schizosaccharomyces pombe strain (pcDNA-Km-leul-pla) was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under registration number VKPM Y-4041.
Пример 2. Культивирование штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4041Example 2. Cultivation of a strain of Schizosaccharomyces pombe VKPM Y-4041
Посевную культуру выращивают при 30°C в течение 1 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD (мас.%: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас.%).The seed culture is grown at 30 ° C for 1 day on Petri dishes on YPD agar medium (wt.%: Yeast extract - 1, peptone - 2, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt.%).
Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (240 об/мин) при 30°C в течение 24 ч.To obtain an inoculum, tubes (50 ml) with 10 ml of YPD liquid culture medium are seeded with a seed culture. The tubes are incubated on a shaker (240 rpm) at 30 ° C for 24 hours.
Колбу, объемом 750 мл, содержащую 95 мл среды YPD с добавлением глюкозы (15 мас.%) засевают 5 мл инокулята.A 750 ml flask containing 95 ml of glucose-supplemented YPD medium (15% by weight) was seeded with 5 ml of inoculum.
Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 100 об/мин при температуре 30°C в течение 48 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Штамм ВКПМ Y-4041 секретирует молочную кислоту в количестве 50 г/л культуральной жидкости (фиг.1).The cultivation is carried out on a rocking chair at a speed of 100 rpm at a temperature of 30 ° C for 48 hours. Samples are taken every 12 hours sterilely in 1 ml to determine the concentration of biomass and lactic acid in the culture fluid, as well as to control sterility. Strain VKPM Y-4041 secrets lactic acid in an amount of 50 g / l of culture fluid (figure 1).
Пример 3. Определение молочной кислоты в культуральной жидкости методом ВЭЖХExample 3. Determination of lactic acid in the culture fluid by HPLC
После окончания ферментации биомассу осаждают цетрифугированием, при этом доля супернатанта в культуральной жидкости составляет 60-75%.After fermentation, the biomass is precipitated by centrifugation, while the proportion of supernatant in the culture fluid is 60-75%.
Супернатант разводят водой Super - Q в 10 раз, центрифугируют при 18000 об/мин в течение 2 мин и анализируют методом ВЭЖХ на хроматографе системы “alliance” (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).The supernatant was diluted 10-fold with Super-Q water, centrifuged at 18,000 rpm for 2 minutes and analyzed by HPLC on an alliance system chromatograph (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).
Для проведения ВЭЖХ 5 мкл модельной смеси вводят в хроматограф, снабженный фотометрическим детектором с длинной волны 210 нм. Разделение ведут на колонке, ReproSil-Pur C18-AQ, 5 µm, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. В качестве элюента используют систему с содержанием 0,5% метанола, 0,5% ацетонитрила, H3PO4 (85%) 1 мл/л. Температура хроматографической колонки - 30°C. Объемная скорость элюента 1,0 мл/мин. Разделение молочной кислоты от остальных органических кислот при выбранном режиме хроматографического анализа проходит полностью. Наложения пиков и пиков «всадников» не отмечается. Время выхода стандарта молочной кислоты составляет 7 минут.For HPLC, 5 μl of the model mixture is introduced into a chromatograph equipped with a 210 nm wavelength photometric detector. Separation is carried out on a ReproSil-Pur C18-AQ column, 5 μm, 250 mm long and 4.6 mm inner diameter. As an eluent, a system with a content of 0.5% methanol, 0.5% acetonitrile, H 3 PO 4 (85%) 1 ml / l is used. The temperature of the chromatographic column is 30 ° C. The volumetric rate of the eluent is 1.0 ml / min. The separation of lactic acid from other organic acids in the selected mode of chromatographic analysis is complete. The imposition of peaks and peaks of the "riders" is not noted. The lactic acid standard has a release time of 7 minutes.
Результаты хроматографического анализа содержания молочной кислоты в супернатанте представлены на фиг.2. Наличие в культуральной жидкости молочной кислоты подтверждается присутствием доминантного пика, время выхода которого составляет 7 минут, что соответствует времени выхода стандарта молочной кислоты.The results of chromatographic analysis of the content of lactic acid in the supernatant are presented in figure 2. The presence of lactic acid in the culture fluid is confirmed by the presence of a dominant peak, the exit time of which is 7 minutes, which corresponds to the exit time of the standard of lactic acid.
Использованные источники информацииInformation Sources Used
[1] Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М. 2004.[1] Babieva I.P., Chernov I.Yu. Yeast Biology, KMK Partnership of Scientific Publications, M. 2004.
[2] Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. 16 years research on lactic acid production with yeast - ready for the market? // Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V.27. - №1. - Р.229-256.[2] Sauer M., Porro D., Mattanovich D., Branduardi P. 16 years research on lactic acid production with yeast - ready for the market? // Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V.27. - No. 1. - R.229-256.
[3] Ilmen M., Koivuranta К., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis // Appl Environ Microbiol. - 2007. - V.73. - P.117-123.[3] Ilmen M., Koivuranta K., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis // Appl Environ Microbiol. - 2007. - V.73. - P.117-123.
[4] Colombie S., Dequin S., Sablayrolles J.M. Control of lactate production by Saccharomyces cerevisiae expressing a bacterial LDH gene // Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V.33. - №1. - P.38-46.[4] Colombie S., Dequin S., Sablayrolles J.M. Control of lactate production by Saccharomyces cerevisiae expressing a bacterial LDH gene // Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V.33. - No. 1. - P.38-46.
[5] Синеокий С.П., Вустин М.М., Юзбашев Т.В. и др. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe для его осуществления // Патент RU 2268304, C12P 7/56, 2004.[5] Sineokiy S.P., Vustin M.M., Yuzbashev T.V. and other Method of microbiological synthesis of lactic acid and a recombinant strain of the yeast Schizosaccharomyces pombe for its implementation // Patent RU 2268304, C12P 7/56, 2004.
[6] Futoshi H., Hideki Т., Yuko H., Chihiro H. Transformant And Process For Production Thereof, And Process For Production Of Lactic Acid // Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012.[6] Futoshi H., Hideki T., Yuko H., Chihiro H. Transformant And Process For Production Thereof, And Process For Production Of Lactic Acid // Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012.
[7] The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p.421.[7] The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p. 421.
[8] Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр.144.[8] Zakharov A. et al. Collection of techniques for the genetics of saccharomycetes yeast. - L., Science, 1984, p. 144.
[9] П.Н. Нестеренко, П.А. Кебе Определение молочной кислоты методом ионоэксклюзионной хроматографии на сульфированном сверхсшитом полистироле // ВЕСТНИК МОСК. УН-ТА, сер. 2. химия. - 2002. - т.43 - №1 - стр.34-36.[9] P.N. Nesterenko, P.A. Kebe Determination of lactic acid by ion-exclusion chromatography on sulfonated hypercrosslinked polystyrene // VESTNIK MOSCOW. UN-TA, ser. 2. chemistry. - 2002. - t. 43 - No. 1 - p. 34-36.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013143698/10A RU2539092C1 (en) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013143698/10A RU2539092C1 (en) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2539092C1 true RU2539092C1 (en) | 2015-01-10 |
Family
ID=53288283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013143698/10A RU2539092C1 (en) | 2013-09-27 | 2013-09-27 | RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2539092C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614233C1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-03-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Yeast transformant schizosaccharomyces pombe, producing lactic acid (versions) method for production thereof (versions), method for lactic acid microbiological synthesis using this transformant |
| RU2650669C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Schizosaccharomyces pombe strain - lactic acid producer |
| RU2652877C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for modification of yeast schizosaccharomyces pombe by means of the cre-lox system of bacteriophage p1, transformant that is obtained in such a method and the method of microbiological synthesis of dairy acid |
| CN109504630A (en) * | 2018-12-17 | 2019-03-22 | 吉林中粮生化有限公司 | A method of recombination D-ALPHA-Hydroxypropionic acid produces lactobacillus plantarum strain and produces D-ALPHA-Hydroxypropionic acid using the bacterial strain |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050112737A1 (en) * | 2003-11-20 | 2005-05-26 | A. E. Staley Manufacturing Co. | Lactic acid producing yeast |
| RU2268304C1 (en) * | 2004-06-24 | 2006-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Method for microbiological synthesis of lactic acid and recombinant strain of yeast schizosaccharomyces pombe for its realization |
| WO2011021629A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
-
2013
- 2013-09-27 RU RU2013143698/10A patent/RU2539092C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050112737A1 (en) * | 2003-11-20 | 2005-05-26 | A. E. Staley Manufacturing Co. | Lactic acid producing yeast |
| RU2268304C1 (en) * | 2004-06-24 | 2006-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Method for microbiological synthesis of lactic acid and recombinant strain of yeast schizosaccharomyces pombe for its realization |
| WO2011021629A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
| US20120214214A1 (en) * | 2009-08-21 | 2012-08-23 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614233C1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-03-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Yeast transformant schizosaccharomyces pombe, producing lactic acid (versions) method for production thereof (versions), method for lactic acid microbiological synthesis using this transformant |
| RU2650669C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Schizosaccharomyces pombe strain - lactic acid producer |
| RU2652877C1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for modification of yeast schizosaccharomyces pombe by means of the cre-lox system of bacteriophage p1, transformant that is obtained in such a method and the method of microbiological synthesis of dairy acid |
| RU2652877C9 (en) * | 2016-12-21 | 2018-06-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for modification of yeast schizosaccharomyces pombe by means of the cre-lox system of bacteriophage p1, transformant that is obtained in such a method |
| CN109504630A (en) * | 2018-12-17 | 2019-03-22 | 吉林中粮生化有限公司 | A method of recombination D-ALPHA-Hydroxypropionic acid produces lactobacillus plantarum strain and produces D-ALPHA-Hydroxypropionic acid using the bacterial strain |
| CN109504630B (en) * | 2018-12-17 | 2022-03-11 | 吉林中粮生化有限公司 | Lactobacillus plantarum strain produced by recombinant D-lactic acid and method for producing D-lactic acid by using strain |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Żymańczyk-Duda et al. | Yeast as a versatile tool in biotechnology | |
| US9725745B2 (en) | Process for biodiesel production from a yeast strain | |
| CN107406821B (en) | Mutant host cells for the production of 3-hydroxypropionic acid | |
| US11345937B2 (en) | Construction of Mucor circinelloides cell factory for producing stearidonic acid and fermentation technology thereof | |
| RU2539092C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN OF YEASTS Schizosaccharomyces pombe - PRODUCENT OF LACTIC ACID | |
| Walker | Yeasts | |
| EP3027733A1 (en) | 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts expressing an insect aspartate 1-decarboxylase | |
| US11414650B2 (en) | Construction method of Mucor circinelloides cell factory for producing dihomo-gamma-linolenic acid and fermentation technology | |
| JP5435657B2 (en) | Aggregating yeast and method for producing the same | |
| US9944957B2 (en) | Recombinant Escherichia coli for producing D-lactate and use thereof | |
| CN107548418A (en) | Separation and the method for purifying ambrox | |
| Amza et al. | High cell density cultivation of Lipomyces starkeyi for achieving highly efficient lipid production from sugar under low C/N ratio | |
| CN111471602B (en) | Construction method and application of mucor circinelloides engineering strain for efficiently synthesizing gamma-linolenic acid by using cellulose | |
| CN110760453B (en) | Genetically engineered yeast strain for high-yield phenylethyl acetate, construction method thereof and method for producing phenylethyl acetate | |
| RU2713124C2 (en) | Method for increasing production of isocitric acid in yeast yarrowia lipolytica, yeast of yarrowia lipolytica type, capable of producing isocitric acid | |
| CN101338291B (en) | Method for preparing coronatine and special strain thereof | |
| RU2652877C9 (en) | Method for modification of yeast schizosaccharomyces pombe by means of the cre-lox system of bacteriophage p1, transformant that is obtained in such a method | |
| Morita et al. | Convenient transformation of anamorphic basidiomycetous yeasts belonging to genus Pseudozyma induced by electroporation | |
| RU2650669C1 (en) | Schizosaccharomyces pombe strain - lactic acid producer | |
| JP2008035732A (en) | Method for producing organic acid | |
| Jeon et al. | Development of a Saccharomyces cerevisiae strain for the production of 1, 2-propanediol by gene manipulation | |
| RU2268304C1 (en) | Method for microbiological synthesis of lactic acid and recombinant strain of yeast schizosaccharomyces pombe for its realization | |
| JP2007082490A (en) | Production method by extraction/fermentation of organic acid and organic acid-producing yeast used for the production method | |
| CN1800349B (en) | Synthesis of polyhydroxyalkanoates in the cytosol of yeast | |
| RU2614233C1 (en) | Yeast transformant schizosaccharomyces pombe, producing lactic acid (versions) method for production thereof (versions), method for lactic acid microbiological synthesis using this transformant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |