RU2539033C1 - RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST - Google Patents

RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST Download PDF

Info

Publication number
RU2539033C1
RU2539033C1 RU2013146666/10A RU2013146666A RU2539033C1 RU 2539033 C1 RU2539033 C1 RU 2539033C1 RU 2013146666/10 A RU2013146666/10 A RU 2013146666/10A RU 2013146666 A RU2013146666 A RU 2013146666A RU 2539033 C1 RU2539033 C1 RU 2539033C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strain
rhodococcus rhodochrous
biocatalyst
synthesis
acrylamides
Prior art date
Application number
RU2013146666/10A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Константин Валерьевич Лавров
Андрей Дмитриевич Новиков
Людмила Евгеньевна Рябченко
Татьяна Васильевна Герасимова
Александр Степанович Яненко
Original Assignee
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") filed Critical Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика")
Priority to RU2013146666/10A priority Critical patent/RU2539033C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2539033C1 publication Critical patent/RU2539033C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnologies.
SUBSTANCE: invention relates to recombinant bacterium strain Rhodococcus rhodochrous RNCIM Ac1960, which has a constitutive acylating activity and is obtained by replacement in a chromosome of strain Rhodococcus rhodochrous RCM Ac-1515D of a gene coding nitril hydrase with a gene coding acylamidase from strain Rhodococcus erythropolis 37 RNCIM Ac-1793, as well as to a synthesis method of N-replaced acrylamides from acrylamide and amines using it as a biocatalyst.
EFFECT: invention allows efficient production of concentrated solutions of N-replaced acrylamides.
2 cl, 1 dwg, 1 tbl, 5 ex

Description

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Rhodococcus rhodochrous, а также способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.The claimed group of inventions relates to biotechnology and relates to a recombinant strain of Rhodococcus rhodochrous, as well as a method for the synthesis of N-substituted acrylamides, in particular N-isopropylacrylamide or N-dimethylaminopropylacrylamide using cells of this strain as a biocatalyst.

N-замещенные алифатические акриламиды являются производными акриламида - мономера для синтеза широкой гаммы полимеров, которые применяются практически во всех областях промышленности. Развитие технологии производства полимеров в последние годы привело к разработке новых видов полимеров, в состав которых наряду с основным мономером - акриламидом - входят также различные производные, в том числе N-замещенные акриламиды. Эти мономеры выполняют роль модификаторов физико-химических свойств полимеров, существенно расширяя круг их применения. Одной из значительных областей применения N-замещенных акриламидов является синтез водорастворимых полимеров, применяемых в качестве адсорбентов, флокулянтов и структурообразователей во многих отраслях промышленности и сельского хозяйства (Полиакриламид. - М., 1992).N-substituted aliphatic acrylamides are derivatives of acrylamide - a monomer for the synthesis of a wide range of polymers, which are used in almost all industries. The development of polymer production technology in recent years has led to the development of new types of polymers, which along with the main monomer - acrylamide - also include various derivatives, including N-substituted acrylamides. These monomers play the role of modifiers of the physicochemical properties of polymers, significantly expanding the scope of their application. One of the significant applications of N-substituted acrylamides is the synthesis of water-soluble polymers used as adsorbents, flocculants and structure-forming agents in many industries and agriculture (Polyacrylamide. - M., 1992).

На сегодняшний день промышленным путем N-замещенные акриламиды получают традиционным способом - путем химического синтеза, основанного на ацилировании алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M. Decker, 1973). Реагенты, используемые для такого синтеза, крайне ядовиты, и, с учетом возрастающих потребностей в N-замещенных акриламидах, производство по традиционной технологии становится все более опасным для окружающей среды и персонала.To date, N-substituted acrylamides are produced industrially in the traditional way — by chemical synthesis based on the acylation of aliphatic amines with acid chlorides of acrylic and methacrylic acids (MacWilliams DS Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M. Decker, 1973) . The reagents used for this synthesis are extremely toxic, and, given the increasing demand for N-substituted acrylamides, production by traditional technology is becoming increasingly dangerous for the environment and personnel.

Принципиально другим способом получения N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез, проводимый в водной среде.A fundamentally different way to obtain N-substituted acrylamides is biocatalytic synthesis carried out in an aqueous medium.

Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с помощью биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU2399672), обусловленной наличием в них фермента ациламидазы.A known method of biocatalytic synthesis of N-substituted acrylamides using a biocatalyst - cells of the strain Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793, having acylating activity (RU2399672), due to the presence of the acylamidase enzyme in them.

Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) рассмотрим в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) - в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.The strain Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 (RU2399672) will be considered as the closest analogue of the claimed strain, and the method of biocatalytic synthesis of N-substituted acrylamides using the Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 strain strain (RU2399672) as the closest analogue as the biocatalyst.

Недостатком штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 является то, что его ацилирующая активность является индуцибельной, то есть требует наличия в среде культивирования дорогостоящего индуктора - ацетанилида. Это повышает стоимость и снижает конкурентоспособность способа - ближайшего аналога, основанного на использовании штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 в качестве биокатализатора.The disadvantage of the strain Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 is that its acylating activity is inducible, that is, it requires the presence of an expensive inducer, acetanilide, in the culture medium. This increases the cost and reduces the competitiveness of the method, the closest analogue based on the use of the Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 strain as a biocatalyst.

Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала способов биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов.The task of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of methods for biocatalytic synthesis of N-substituted acrylamides.

Задача решена путем:The problem is solved by:

- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, обладающего конститутивной ацилирующей активностью и полученного путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д (RU 2053300) гена, кодирующего структурную часть фермента нитрилгидратазы на ген, кодирующий структурную часть фермента ациламидазы из штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 при сохранении промотора гена нитрилгидратазы в качестве промотора гена ациламидазы у заявляемого штамма;- designing a recombinant strain of bacteria Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960, which has constitutive acylating activity and obtained by substituting on the chromosome of the strain Rhodococcus rhodochrous VKM AC-1515D (RU 2053300) a gene encoding the structural part of the nitrile hydratase enzyme to the gene encoding the structural part of Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 while maintaining the promoter of the nitrile hydratase gene as a promoter of the acylamidase gene in the claimed strain;

- разработки способа синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.- development of a method for the synthesis of N-substituted acrylamides using the inventive bacterial strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960 as a biocatalyst.

Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, в хромосому которого интегрирован ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, приобретает конститутивную ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. При смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии клеток Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 (используемого в качестве биокатализатора) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности, N-изопропилакриламида (или N-диметиламинопропилакриламида).The strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960, into the chromosome of which the acylamidase gene from Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 is integrated, acquires constitutive acylating activity and the ability to synthesize N-substituted aliphatic acrylamides. When aqueous solutions of acrylamide and amines are mixed in the presence of Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960 cells (used as a biocatalyst), N-substituted acrylamides, in particular, N-isopropyl acrylamide (or N-dimethylaminopropyl acrylamide), are synthesized.

Характеристика заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960Characterization of the claimed strain of Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960

Морфологические свойства. Клетки штамма неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам.Morphological properties. The cells of the strain are motionless and Gram stained. They do not form a dispute, non-acid resistant. At the age of 18-20 hours, the cells form long (up to 20 microns) weakly branching filaments, which after 48-72 hours break up into rod-shaped and coccoid elements. In old cultures, pleomorphic cells are observed in the form of flasks, pears, clubs. Cell division occurs according to the splitting and bending types.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер) через 48 ч роста штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.Cultural properties. On solid nutrient media (MPA, Hottinger) after 48 h of growth, the strain forms round smooth colonies with a diameter of 1 mm, colored from pale pink to pink-orange. With growth, a film and a precipitate form on the meat-peptone broth. Litmus milk does not change.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует. Аденин не утилизирует. Клетки не выдерживают нагревания в снятом молоке при 72°C в течение 15 мин. Штамм растет при pH 6-9, температуре 5-45°C. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, a-кетоглутарат. В клеточной стенке штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков.Physiological properties. Obligate aerob. Reduces nitrates. Test with methyl red, the Voges-Proskauer reaction is negative. Forms hydrogen sulfide. The oxidase-negative strain, catalase- and phosphatase-positive. Starch and cellulose do not hydrolyze; twins 60 and 80 hydrolyze. Adenine is not disposed of. Cells cannot withstand heat in skim milk at 72 ° C for 15 minutes. The strain grows at a pH of 6-9, a temperature of 5-45 ° C. The acid is formed from the following sugars and alcohols: glucose, fructose, maltose, sucrose, sorbitol, mannitol and glycerol. No gas formation was detected on any sugar. Ammonium compounds, nitrates and urea are used as the sole source of nitrogen. It uses maltose, beckoning, sorbitol, glucose, glycerin, lactate, pyruvate, benzoate, n- and m-hydroxybenzoate, tyrosine as the sole carbon source; does not use rhamnose, galactose, inositol, a-ketoglutarate. The cell wall of the strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960 contains meso-diaminopimelic acid, arabinose and galactose, which is typical for cinnamiform bacteria with type IV cell wall. Cells also contain lipid A (LCN), characteristic of Rhodococcus.

Отличительная особенность заявляемого штамма состоит в высоком уровне стабильности ацилирующей активности в неселективных условиях, т.е. в отсутствии в среде антибиотиков. Уровень утраты гена ациламидазы после роста в неселективных условиях для штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-1960 составляет менее 0.1%.A distinctive feature of the claimed strain is a high level of stability of acylating activity in non-selective conditions, i.e. in the absence of antibiotics in the environment. The level of acylamidase gene loss after growth under non-selective conditions for the strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960 is less than 0.1%.

Получение биокатализатора.Obtaining a biocatalyst.

Для получения клеток заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 в больших количествах и с высокой активностью ациламидазы штамм выращивают при 25-30°C в течение 48-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахара или спирты в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота соединения аммония, нитраты или мочевину в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C.To obtain cells of the inventive strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960 in large quantities and with high acylamidase activity, the strain is grown at 25-30 ° C for 48-72 hours on synthetic media containing sugars or alcohols in a concentration of 0.1-4 as a carbon source %, and as a source of nitrogen, ammonium compounds, nitrates or urea in concentrations of 0.4-2%. The resulting cells are separated from the culture fluid by centrifugation at 5-16 thousand rpm, resuspended in 10 mm phosphate buffer pH 7.0-8.0 to a concentration of 20-40 g dry weight / l and stored in this form at 4 ° C.

Ацилирующую активность штаммов определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике.The acylating activity of the strains is determined by the rate of synthesis of N-isopropylacrylamide according to the following procedure.

Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (pH 10), 450 мкл культуры. Инкубируют при 37°C 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.Mix 300 μl of a 10% aqueous solution of acrylamide, 250 μl of a 10% aqueous solution of isopropylamine (pH 10), 450 μl of culture. Incubated at 37 ° C for 2 hours, cells are separated by centrifugation for 1 minute at 10 thousand rpm, the content of N-isopropylacrylamide is determined by gas chromatography.

Активность культуры выражают в мМ ИПАА, синтезированного за 1 час на л культуры.Culture activity is expressed in mm IPAA synthesized in 1 hour per liter of culture.

Способ синтеза N-замещенных акриламидов в общем видеThe method of synthesis of N-substituted acrylamides in General

Синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина в концентрациях от 1% до 10% с суспензией биокатализатора (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°C, предпочтительнее от 25 до 30°C) и последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин) в течение 1-48 час. Значение pH варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11.The synthesis of N-substituted acrylamides, in particular N-isopropylacrylamide or N-dimethylaminopropylacrylamide, is carried out by mixing aqueous solutions of acrylamide and aliphatic primary amines, in particular isopropylamine and dimethylaminopropylamine in concentrations from 1% to 10% with a suspension of biocatalyst (from 1 to 10 g dry weight per 1 l of the reaction mixture) in a thermostatic vessel (at a temperature of from 20 to 40 ° C, preferably from 25 to 30 ° C) and subsequent stirring (from 100 to 250 rpm) for 1-48 hours. The pH value ranges from 8.5 to 11, more preferably from 9 to 11.

Содержание конечного продукта - N-замещенного акриламида определяют с помощью газовой хроматографииThe content of the final product, N-substituted acrylamide, is determined by gas chromatography.

Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 1 до 30 г/л N-замещенных акриламидов.The inventive method allows to obtain solutions containing from 1 to 30 g / l of N-substituted acrylamides.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.The invention is illustrated by the following figures.

Фигура 1. Структура плазмиды pRY1-H1-aam-H2. H1 - фрагмент промоторной области кластера генов нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; aam - ген, кодирующий ациламидазу из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793; H2 - фрагмент ДНК с геном nhmG из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; bla - ген, кодирующий бета-лактамазу (маркер устойчивости к ампициллину); tsr - ген, кодирующий 23 S рРНК метилтрансферазу (маркер устойчивости к тиострептону); oriR E. coli - область, ответственная за репликацию плазмиды pUC19 в E. coli; oriT - область, ответственная за конъюгативный перенос плазмиды.Figure 1. The structure of the plasmid pRY1-H1-aam-H2. H1 — fragment of the promoter region of the cluster of nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous VKM AC-1515D; aam — gene encoding acylamidase from Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793; H2 — DNA fragment with the nhmG gene from Rhodococcus rhodochrous VKM AC-1515D; bla - a gene encoding beta-lactamase (a marker of resistance to ampicillin); tsr is a gene encoding 23 S rRNA methyltransferase (a marker of resistance to thiostrepton); E. coli oriR — region responsible for the replication of pUC19 plasmid in E. coli; oriT is the region responsible for conjugative plasmid transfer.

Пример 1. Конструирование интеграционной касеты для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д на ген ациламидазы Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793Example 1. Construction of an integration cassette for the replacement of nitrile hydratase genes on the Rhodococcus rhodochrous BKM AC-1515D chromosome with the Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 acylamidase gene

Интеграционная кассета состоит из гена ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, фланкированного фрагментами хромосомы из штамма Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д, обозначенными H1 и Н2. Фрагмент H1 содержит участок ДНК, гомологичный регуляторной области нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Фрагмент Н2 содержит участок ДНК, гомологичный гену nhmG в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Рекомбинантная плазмида для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме состоит из интеграционной кассеты, клонированной на плазмиде pRY1 (Рябченко Л.Е., Полякова И.Н., Яненко А.С. Мобилизуемые плазмидные векторы, способные к конъюгативному переносу между клетками Е. coli и Rhodococcus, и их использование для конструирования штаммов Rhodococcus. Биотехнология, 2005, N5, с.6-13). Эта плазмида не способна автономно поддерживаться в штамме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. При наличии в составе плазмиды участка, гомологичного хромосоме хозяина, плазмида способна интегрировать в хромосому по гомологичным участкам.The integration cassette consists of the acylamidase gene from Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1793 flanked by fragments of the chromosome from the strain Rhodococcus rhodochrous BKM AC-1515D, designated H1 and H2. Fragment H1 contains a DNA region homologous to the regulatory region of nitrile hydratase on the chromosome Rhodococcus rhodochrous BKM AC-1515D. Fragment H2 contains a DNA region homologous to the nhmG gene on the Rhodococcus rhodochrous BKM AC-1515D chromosome. The recombinant plasmid for replacing the nitrile hydratase genes on the chromosome consists of an integration cassette cloned on the plasmid pRY1 (Ryabchenko L.E., Polyakova I.N., Yanenko A.S. Mobilizable plasmid vectors capable of conjugative transfer between E. coli and Rhodococcus cells , and their use for the construction of strains of Rhodococcus. Biotechnology, 2005, N5, s.6-13). This plasmid is not able to autonomously be maintained in the strain Rhodococcus rhodochrous BKM AC-1515D. If a plasmid contains a region homologous to the host chromosome, the plasmid is able to integrate into the chromosome through homologous regions.

Ген ациламидазы и фрагменты H1 и Н2 наработаны с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием соответствующих праймеров и ДНК-матриц, перечисленных в таблице 1.The acylamidase gene and fragments H1 and H2 were obtained using the polymerase chain reaction (PCR), using the appropriate primers and DNA matrices listed in table 1.

Таблица 1Table 1 Список праймеров и ДНК-матриц, использованных для наработки фрагментов интеграционной кассеты H1, aam и Н2.List of primers and DNA templates used to generate fragments of the integration cassette H1, aam and H2. Фрагмент Fragment Название праймераPrimer Name Последовательность праймера Primer sequence ДНК-матрица DNA matrix H1H1 Прямой Straight 5'-GGGGGATCCCCGGAGTCTTCATCCTGTTTTGGGATGCG-3'5'-GGGGGATATCCCCGGAGTCTTCATCCTGTTTTGGGATGCG-3 ' Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д Chromosomal DNA from R. rhodochrous BKM AC-1515D Обратный Back 5'-GATCCATGGCCTCATTCCTTTCATCGGAGC 5'-GATCCATGGCCTCATTCCTTTCATCGGAGC aamaam Прямой Straight 5'-GTCCCATGGCCGAACAGAATCTGC5'-GTCCCATGGCCGAACAGAATCTGC Хромосомная ДНК из R. erythropolis ВКПМ Ас-1793 Chromosomal DNA from R. erythropolis VKPM Ac-1793 Обратный Back 5'-GGGGAGCTCGATTCAGACGTCATCACAC5'-GGGGAGCTCGATTCAGACGTCATCACAC

CAATCTAGCC-3'CAATCTAGCC-3 ' Н2H2 ПрямойStraight 5'-GGGGAGCTCGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG-3'5'-GGGGAGCTCGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG-3 ' Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д Chromosomal DNA from R. rhodochrous BKM AC-1515D ОбратныйBack 5'-GGGGAATTCAGTACCCACCGAGCCGAATTAGGAACCACCG-3'5'-GGGGAATTCAGTACCCACCGAGCCGAATTAGGAACCACCG-3 '

В последовательности праймеров внесены сайты рестриктаз BamHI, Ncol, Sad, EcoRI, необходимые для соединения фрагментов друг с другом и введения кассеты в плазмиду pRY1. Схема плазмиды, содержащей интеграционную кассету, представлена на фиг.1.The primer sequences contain restriction enzyme sites BamHI, Ncol, Sad, EcoRI, which are necessary for connecting fragments to each other and introducing the cassette into plasmid pRY1. The scheme of the plasmid containing the integration cassette is presented in figure 1.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960Example 2. Construction of the claimed strain of Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960

Для конструирования заявляемого штамма плазмиду с интеграционной кассетой вводят в штамм R. rhodochrous BKM AC-1515 Ac помощью конъюгации. Для передачи плазмиды в R. rhodochrous BKM АС-1515Д используют вспомогательный штамм Е. coli S17-1, способный обеспечивать конъюгативный перенос производных плазмиды pRY1 в реципиентные штаммы Rhodococcus. Для осуществления конъюгативного переноса плазмиду pRY1-H1-aam-H2 вводят в штамм Е. coli S17-1 путем химической трансформации ДНК. Конъюгационные скрещивания между Е. coli S17-1 и R. rhodochrous BKM АС-1515Д проводят путем смешивания экспоненциально растущих культур обоих штаммов, инкубации их на твердой среде в отсутствие селектирующих агентов в течение ночи, а затем инкубации в течение 4 суток в присутствии антибиотиков тиострептона (селекция против клеток R. rhodochrous BKM АС-1515Д, не получивших плазмиду) и налидиксовой кислоты (селекция против клеток Е. coli S17-1). Устойчивые к тиострептону клоны R. rhodochrous BKM АС-1515Д содержат плазмиду pRY1-H1-aam-H2, интегрированную в хромосому. Исключение плазмиды из хромосомы в некоторых случаях приводит к замещению гена нитрилгидратазы на ген ациламидазы. При этом клетка приобретает чувствительность к тиострептону, но сохраняет ацилирующую активность. Так, получен штамм, содержащий в хромосоме ген ациламидазы, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» как Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.To construct the inventive strain, a plasmid with an integration cassette is introduced into the R. rhodochrous BKM AC-1515 Ac strain using conjugation. To transfer the plasmid to R. rhodochrous BKM AC-1515D, an auxiliary E. coli S17-1 strain is used, which is capable of providing conjugative transfer of plasmid derivatives pRY1 to Rhodococcus recipient strains. To carry out conjugative transfer, plasmid pRY1-H1-aam-H2 is introduced into E. coli S17-1 strain by chemical transformation of DNA. Conjugation crosses between E. coli S17-1 and R. rhodochrous BKM AC-1515D are carried out by mixing exponentially growing cultures of both strains, incubating them on solid medium in the absence of selective agents overnight, and then incubating for 4 days in the presence of thiostrepton antibiotics (selection against R. rhodochrous BKM AC-1515D cells that did not receive the plasmid) and nalidixic acid (selection against E. coli S17-1 cells). Thiostrepton-resistant clones of R. rhodochrous BKM AC-1515D contain the plasmid pRY1-H1-aam-H2 integrated into the chromosome. The exclusion of a plasmid from the chromosome in some cases leads to the replacement of the nitrile hydratase gene with the acylamidase gene. In this case, the cell acquires sensitivity to thiostrepton, but retains acylating activity. So, we obtained a strain containing the acylamidase gene on the chromosome, which was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the Federal State Unitary Enterprise GosNIIgenetika as Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac-1960.

Пример 3. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960Example 3. Obtaining a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960

В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,5; мочевина - 0,06; MgSO4 - 0.05; CoCl2 - 0.004; FeSO4 - 0,0005; вода - остальное, добавляют 0,5 мл культуры (109 кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенного на той же среде. Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°C в течение 72 час. Полученная таким образом культура обладает ацилирующей активностью 25 мМ ИПАА/л*ч. Полученную биомассу штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.In an Erlenmeyer flask (750 ml), containing 50 ml of a synthetic MS nutrient medium of the following composition, wt.%: Glucose - 2.5; urea - 0.06; MgSO 4 - 0.05; CoCl 2 - 0.004; FeSO 4 - 0.0005; water - the rest, add 0.5 ml of culture (10 9 cells / ml) of the inventive strain, previously grown on the same medium. The flask was then incubated with stirring (200 rpm) at 30 ° C for 72 hours. Thus obtained culture has an acylating activity of 25 mm IPAA / l * h The resulting biomass of the strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960 is separated by centrifugation at 5 thousand rpm and stored at + 4 ° C.

Пример 4. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960Example 4. Synthesis of N-isopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960

Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси составляют 6% и 3%, соответственно. Концентрация биокатализатора в смеси составляет 8 г по сухой массе/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин). Концентрацию N-изопропилакриламида в реакционной смеси определяют с помощью газовой хроматографии. Концентрация N-изопропилакриламида в полученном образце составляет 32 г/л.Aqueous solutions of acrylamide and isopropylamine (pH 10) are mixed, then a suspension of cells of the strain Rhodococcus rhodochrous Ac1960, obtained as in Example 3, is added to the reaction mixture. The concentrations of acrylamide and isopropylamine in the mixture are 6% and 3%, respectively. The concentration of the biocatalyst in the mixture is 8 g on a dry weight / L basis. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 7 hours. Then the cells are separated by centrifugation (5 thousand rpm). The concentration of N-isopropylacrylamide in the reaction mixture was determined by gas chromatography. The concentration of N-isopropylacrylamide in the resulting sample is 32 g / L.

Пример 5. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960Example 5. Synthesis of N-dimethylaminopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960

Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси в качестве биокатализатора добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси составляют 6% и 2.5%, соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 8 г/л.Aqueous solutions of acrylamide and dimethylaminopropylamine (pH 10) are mixed, then a suspension of Rhodococcus rhodochrous Ac1960 strain obtained as in Example 3 is added to the reaction mixture as a biocatalyst. The concentrations of acrylamide and dimethylaminopropylamine in the mixture are 6% and 2.5%, respectively. The concentration of cells in the mixture is 8 g dry weight / L. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 24 hours. Then the cells are separated by centrifugation (5 thousand rpm) and the amount of the final product is determined by gas chromatography. The concentration of the resulting solution of N-dimethylaminopropylacrylamide is 8 g / L.

Таким образом,In this way,

- сконструирован штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac1960, обладающий конститутивной ацилирующей активностью и, в отличие от штамма ближайшего аналога, не нуждающийся в индукторе ацилирующей активности и способный расти на минеральной синтетической среде;- a strain of Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960 was constructed, which has constitutive acylating activity and, unlike the closest analogue strain, does not need an acylating activity inducer and is able to grow on a synthetic mineral medium;

- заявляемый способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма позволяет получать концентрированные (8-30 г/л) растворы N-замещенных акриламидов, что превосходит способ - ближайший аналог в 1,5 раза.- the claimed method for the synthesis of N-substituted acrylamides using the inventive strain as a biocatalyst allows to obtain concentrated (8-30 g / l) solutions of N-substituted acrylamides, which exceeds the method closest to 1.5 times.

Claims (2)

1. Рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960, обладающий конститутивной ацилирующей активностью и полученный путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1515Д гена, кодирующего нитрилгидратазу на ген, кодирующий ациламидазу из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793.1. Recombinant bacterial strain Rhodococcus rhodochrous VKPM Ac1960, which has constitutive acylating activity and is obtained by substituting on the chromosome of the strain Rhodococcus rhodochrous VKM Ac-1515D a gene encoding nitrile hydratase with a gene encoding acylamidase from strain Rhodococcuscus erythrocytes 37. 2. Способ синтеза N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов с использованием в качестве биокатализатора штамма бактерий по п.1. 2. A method for the synthesis of N-substituted acrylamides from acrylamide and amines using a bacterial strain as a biocatalyst according to claim 1.
RU2013146666/10A 2013-10-21 2013-10-21 RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST RU2539033C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013146666/10A RU2539033C1 (en) 2013-10-21 2013-10-21 RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013146666/10A RU2539033C1 (en) 2013-10-21 2013-10-21 RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2539033C1 true RU2539033C1 (en) 2015-01-10

Family

ID=53288249

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013146666/10A RU2539033C1 (en) 2013-10-21 2013-10-21 RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2539033C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010268A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 三菱ケミカル株式会社 Method for producing n-substituted amide compound/amide compound copolymer

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2053300C1 (en) * 1993-12-17 1996-01-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Strain of bacterium rhodococcus rhodochrous - a producer of nitrile hydratase
KR20010047310A (en) * 1999-11-19 2001-06-15 이상현 Gene coding for nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous M33 VKM Ac-1515D and transformant containing the same
JP2008182986A (en) * 2007-01-31 2008-08-14 Sumitomo Chemical Co Ltd Aminoacylase gene
RU2399672C1 (en) * 2009-04-29 2010-09-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof
RU2439154C1 (en) * 2010-12-03 2012-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Acylamidase enzyme, dna fragment coding said enzyme, and biocatalytic method for synthesis of n-substituted acrylamides using acylamidase

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2053300C1 (en) * 1993-12-17 1996-01-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Strain of bacterium rhodococcus rhodochrous - a producer of nitrile hydratase
KR20010047310A (en) * 1999-11-19 2001-06-15 이상현 Gene coding for nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous M33 VKM Ac-1515D and transformant containing the same
JP2008182986A (en) * 2007-01-31 2008-08-14 Sumitomo Chemical Co Ltd Aminoacylase gene
RU2399672C1 (en) * 2009-04-29 2010-09-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof
RU2439154C1 (en) * 2010-12-03 2012-01-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Acylamidase enzyme, dna fragment coding said enzyme, and biocatalytic method for synthesis of n-substituted acrylamides using acylamidase

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010268A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 三菱ケミカル株式会社 Method for producing n-substituted amide compound/amide compound copolymer

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2433180C2 (en) Microorganism, which has possibility to produce putrescine in high concentration, method of said microorganism obtaining and method of putrescine production with application of said microorganism
CN103215291B (en) For the production of the carrier of C4H9NO2, engineering strain and method
JP7088551B2 (en) Biotechnology techniques for the production of acrylamide and related novel strains
RU2053300C1 (en) Strain of bacterium rhodococcus rhodochrous - a producer of nitrile hydratase
CN106434510B (en) One plant of fermentation produces the genetic engineering bacterium of L-Aspartic acid
EA011232B1 (en) Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
JP6690747B2 (en) Improved nitrile hydratase
AU2009224346B2 (en) Method for stabilization of aqueous acrylamide solution
MXPA06006233A (en) Process for producing polymers
RU2546239C1 (en) RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST
WO2018037833A1 (en) Method of producing poly-gamma-glutamic acid
RU2539033C1 (en) RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST
RU2304165C1 (en) Method for production of acrylic monomers and bacterium strain rhodococcus rhodochrous producing the same
WO2011102510A1 (en) Stable aqueous acrylamide solution
WO2003080680A1 (en) Aqueous acrylamide solution containing saccharide
JP2019176835A (en) Method for producing amide compound
RU2745093C1 (en) Methylococcus capsulatus bf 19-07 methane-oxidizing bacteria strain - producer for obtaining microbial protein mass
RU2399672C1 (en) Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof
RU2731289C2 (en) Method for constructing a biocatalyst strain based on bacteria of the genus rhodococcus, having nitrilase activity and high operational stability, recombinant strain of rhodococcus rhodochrous bacteria produced by such method, a method for synthesis of acrylic acid using this strain as a biocatalyst
RU2522804C2 (en) METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS)
JP5925355B2 (en) Method for stabilizing amide compound having unsaturated bond
RU2620942C2 (en) Plasmid-free recombinant escherichia coli strain, with constitutive aspartase activity and method for l-asparagin acid synthesis using this strain as biocatalyst
CN117625436B (en) Acetylmicrobacterium for degrading dimethylacetamide, and culture method and application thereof
JP6098510B2 (en) Method for producing acrylamide aqueous solution
KR20150125631A (en) Thermococcus mutant having improved hydrogen production from formate and methods of hydrogen production by using thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PC43 Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions

Effective date: 20170327

PD4A Correction of name of patent owner