RU2537141C1 - Method for assessment of marrow cell fissility - Google Patents
Method for assessment of marrow cell fissility Download PDFInfo
- Publication number
- RU2537141C1 RU2537141C1 RU2013151934/15A RU2013151934A RU2537141C1 RU 2537141 C1 RU2537141 C1 RU 2537141C1 RU 2013151934/15 A RU2013151934/15 A RU 2013151934/15A RU 2013151934 A RU2013151934 A RU 2013151934A RU 2537141 C1 RU2537141 C1 RU 2537141C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- sample
- hours
- probe
- taken
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности клинической биохимии, цитологии, патоморфологии, и может быть использовано для определения способности клеток костного мозга (ККМ) к делению.The invention relates to medicine, in particular clinical biochemistry, cytology, pathomorphology, and can be used to determine the ability of bone marrow cells (BMC) to divide.
Известен способ определения колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток костного мозга для оценки их жизнеспособности, основанный на культивировании на различных полувязких и полутвердых питательных средах (метилцеллюлоза, коллаген, агар) с обязательным добавлением экзогенных ростовых факторов [С. Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Human Hematopoietic Colonies in Health and Disease. Acta Haemotologica (ISSN 0001-5792), V.113, №1, 2005]. Культуральные среды предназначены для поддержания оптимального режима жизнедеятельности изолированных клеток, фрагментов тканей и органов в искусственно создаваемых системах. Однако чаще всего используемые в качестве питательных сред агар и метилцеллюлоза влияют на пролиферацию и дифференцировку ККМ.There is a method of determining the colony forming ability of hematopoietic bone marrow stem cells to assess their viability, based on cultivation on various semi-viscous and semi-solid nutrient media (methyl cellulose, collagen, agar) with the mandatory addition of exogenous growth factors [C. Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Human Hematopoietic Colonies in Health and Disease. Acta Haemotologica (ISSN 0001-5792), V.113, No. 1, 2005]. Cultural media are designed to maintain an optimal mode of life of isolated cells, fragments of tissues and organs in artificially created systems. However, most often used as nutrient media agar and methylcellulose affect the proliferation and differentiation of CMC.
Известен модифицированный метод лимитирующих разведении (LDA) [Takaue Y., Reading C.L., Roome A.J., Dicke K.A., Tindle S., Chandran, M., Devaraj B. Limiting-Dilution Analysis of the Effects of Colony-Stimulating Factors, Phytohemagglutinin, and Hydrocortisone on Hematopoietic Progenitor Cell Growth. Blood, V.70, №5, 1987, P. 1611-1618], основанный на выращивании гемопоэтических клеток-предшественников в жидкой среде и позволяющий исключить влияние агара и метилцеллюлозы на колониеобразующую способность. Применение метода LDA позволило исследовать воздействие фитогемагглютенина, гидрокортизона и различных цитокинов на гемопоэтические клетки-предшественники.A known limiting dilution (LDA) method is known [Takaue Y., Reading CL, Roome AJ, Dicke KA, Tindle S., Chandran, M., Devaraj B. Limiting-Dilution Analysis of the Effects of Colony-Stimulating Factors, Phytohemagglutinin, and Hydrocortisone on Hematopoietic Progenitor Cell Growth. Blood, V.70, No. 5, 1987, P. 1611-1618], based on the cultivation of hematopoietic progenitor cells in a liquid medium and eliminating the effect of agar and methyl cellulose on colony forming ability. The use of the LDA method allowed us to study the effect of phytohemagglutenin, hydrocortisone and various cytokines on hematopoietic progenitor cells.
Для изучения пролиферативной активности клеток используют метод с применением оксимочевины, которая подавляет синтез ДНК через действие на рибонуклеотидредуктазу. Клетки выделяют, отмывают и инкубируют с оксимочевиной, снова отмывают и переносят в питательную среду, инкубируют 7-9 дней (в контроле без оксимочевины) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992, под ред. д.м.н. Новицкого, 272 с.].To study the proliferative activity of cells, a method using oxyurea is used, which inhibits DNA synthesis through action on ribonucleotide reductase. Cells are isolated, washed and incubated with oxyurea, washed again and transferred to a nutrient medium, incubated for 7-9 days (in the control without oxyurea) [Goldberg ED, Dygay A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology. Tomsk, 1992, under the editorship of doctor of medical sciences Novitsky, 272 p.].
Общими недостатками приведенных способов являются:Common disadvantages of the above methods are:
- влияние ростовой среды на деление и дифференцировку клеток;- the influence of the growth medium on cell division and differentiation;
- добавление экзогенных колониестимулирующих факторов маскирует эффект собственных ростовых факторов и не позволяет оценить спонтанную способность клеток к делению;- the addition of exogenous colony-stimulating factors masks the effect of their own growth factors and does not allow us to assess the spontaneous ability of cells to divide;
- методическая сложность и длительность (результаты получают через 7-14 дней).- methodological complexity and duration (results are obtained after 7-14 days).
Техническим результатом заявленного изобретения является определение спонтанной способности ККМ к делению, обусловленной эффектом собственных ростовых факторов, а также упрощение способа, сокращение времени получения результатов.The technical result of the claimed invention is to determine the spontaneous ability of KKM to divide, due to the effect of their own growth factors, as well as simplifying the method, reducing the time to obtain results.
Указанный технический результат достигается в способе определения способности клеток костного мозга к делению, в котором клетки хранят в стандартном растворе стабилизатора при комнатной температуре, отбирают из суспензии первую исходную пробу и через 3-3,5 часа хранения суспензии отбирают вторую пробу, пробы обрабатывают флуоресцентным потенциалчувствительным витальным зондом иодид 2-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (2-Di-1-ASP), измеряют интенсивность флуоресценции зонда в клетках, рассчитывают долю клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. в каждой пробе, и при увеличении доли клеток с интенсивностью флуоресценции более 100 усл.ед. более чем в 1,5 раза во второй пробе по сравнению с первой, судят о способности клеток костного мозга к делению.The specified technical result is achieved in a method for determining the ability of bone marrow cells to divide, in which the cells are stored in a standard stabilizer solution at room temperature, the first initial sample is taken from the suspension, and after 3-3.5 hours of storage of the suspension, the second sample is taken, the samples are treated with a fluorescent potential-sensitive with a vital probe iodide 2- (p-dimethylaminostyryl) -1-methylpyridinium (2-Di-1-ASP), measure the fluorescence intensity of the probe in the cells, calculate the proportion of cells with fluorescence intensity entsii over 100 conv in each sample, and with an increase in the proportion of cells with fluorescence intensity of more than 100 conventional units more than 1.5 times in the second sample compared with the first, they judge the ability of bone marrow cells to divide.
Популяция ККМ чрезвычайно гетерогенна и содержит большое количество форменных элементов крови и клеток-предшественников разной степени зрелости. [Воробьев А.И., Дризе Н.И., Чертков И.Л. Схема кроветворения. Пробл. Гематологии, 1995, т.1, №1, с.7-14]. Среди клеток-предшественников выделяют стволовые и прогениторные клетки, которые дают начало зрелым клеткам крови - колониеобразующие единицы (КОЭ). Стромальные клетки костного мозга вырабатывают фактор стволовых клеток (ФСК), который стимулирует пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток.The CMC population is extremely heterogeneous and contains a large number of blood cells and progenitor cells of varying degrees of maturity. [Vorobiev A.I., Drize N.I., Chertkov I.L. Blood formation scheme. Prob. Hematology, 1995, v. 1, No. 1, pp. 7-14]. Among the progenitor cells, stem and progenitor cells are distinguished, which give rise to mature blood cells - colony forming units (CFU). Bone marrow stromal cells produce stem cell factor (FCS), which stimulates the proliferation and differentiation of hematopoietic cells.
Ранее авторами было установлено, что флуоресцентный потенциалчувствительный витальный зонд катионного типа 2-Di-1-ASP проникает в живые ККМ и флуоресцирует в них, причем его флуоресценция чувствительна к изменению энергетического потенциала ККМ [RU №2488826, опубл. 27.07.2013, бюл. №21].Previously, the authors found that the fluorescent potential-sensitive vital probe of the cationic type 2-Di-1-ASP penetrates into living CMCs and fluoresces in them, and its fluorescence is sensitive to changes in the energy potential of CMCs [RU No. 2488826, publ. 07/27/2013, bull. No. 21].
При разработке заявленного способа были исследованы образцы суспензии нативных ККМ в стандартном растворе стабилизатора 20 доноров, которые хранились при комнатной температуре (примерно 25°С). Исходно доля живых клеток в образцах составляла 80-92% (тест с трипановым синим [Phelan M.C. Basic techniques for mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 0:1.1.1-1.1.10. 1998]).When developing the inventive method, samples of a suspension of native CMC in a standard solution of a stabilizer of 20 donors were studied, which were stored at room temperature (approximately 25 ° C). Initially, the proportion of living cells in the samples was 80-92% (trypan blue test [Phelan M.C. Basic techniques for mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 0: 1.1.1-1.1.10. 1998]).
В качестве стандартного раствора стабилизатора был использован препарат фирмы «Terumo Corporation, Tokyo, Japan», содержащий в 100 мл:As a standard solution of the stabilizer was used the drug company "Terumo Corporation, Tokyo, Japan", containing in 100 ml:
Из образцов отбирали пробы клеток исходно (0 часов) и через 1 час, 2 часа, 3 часа, 5 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа хранения. Пробы инкубировали с 2-Di-1-ASP при 37°С, готовили препараты клеток, исследовали их на люминесцентном микроскопе и определяли среднюю интенсивность флуоресценции
Статистическую обработку данных экспериментов проводили по t критерию Стьюдента [Бейли И.Н. Статистические методы в биологии. М., наука, 1963, 272 с.] и по коэффициенту корреляции рангов Спирмена [Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., Медицина, 1973, 142 с.].Statistical processing of these experiments was carried out according to t student criterion [Bailey I.N. Statistical methods in biology. M., science, 1963, 272 pp.] And according to the Spearman rank correlation coefficient [Gubler EV, Genkin AA Application of nonparametric statistical criteria in biomedical research. L., Medicine, 1973, 142 pp.].
В результате статистической обработки полученных данных было установлено, что через 3-3,5 часа хранения наблюдался рост
Способ может быть осуществлен, например, следующим образом.The method can be carried out, for example, as follows.
Получение суспензии ККМ проводят по опубликованной методике [Фрегатова Л.М., Зубаровская Л.С., Эстрина М.А., Головачева А.А., Бабенко Е.В., Платонова Г.Г., Зуева Е.Е., Афанасьев Б.В. Методы получения стволовых клеток у больных и доноров для их последующей трансплантации. СПб, Изд. СПб ГМУ, кафедра гематологии, трансфузиологии, трансплантологии ФПО, 2004]. Полученные клетки помещают в стандартный раствор стабилизатора и хранят при комнатной температуре.The suspension of KKM is carried out according to the published method [Fregatova L.M., Zubarovskaya L.S., Estrina M.A., Golovacheva A.A., Babenko E.V., Platonova G.G., Zueva E.E., Afanasyev B.V. Methods of obtaining stem cells in patients and donors for their subsequent transplantation. SPb, Publ. St. Petersburg State Medical University, Department of Hematology, Transfusiology, Transplantology FPO, 2004]. The resulting cells are placed in a standard stabilizer solution and stored at room temperature.
Суспензию клеток с концентрацией (~2-3)×107 объемом 0,9-1,0 мл хранят в пробирках типа Эппендорф емкостью 1,5 мл при комнатной температуре. Сразу после помещения клеток в пробирку суспензию перемешивают и отбирают из нее пробу объемом 30,0 мкл, помещают ее в пробирку типа Эппендорф емкостью 0,6 мл, добавляют раствор 2-Di-1-ASP в конечной концентрации 1·10-5-1·10-4 М и инкубируют в течение 45-90 мин при 37°С. После инкубации из суспензии окрашенных клеток берут каплю (3 мкл) суспензии, помещают на обезжиренное предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют препарат клеток на люминесцентном микроскопе Люмам-И2 (ЛОМО, Россия). Флуоресценцию зонда возбуждают ртутной лампой ДРШ-250-2 с длиной волны 405-436 нм. Для регистрации флуоресценции используют фотометрическую насадку ФМЭЛ-1 и интерференционный фильтр с максимумом пропускания 585 нм. Длина волны возбуждения 470 нм, интенсивность флуоресценции определяют при длине волны 560 нм. Регистрируют величину интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки. В каждом препарате определяют флуоресценцию массива 80-100 клеток, рассчитывают NF>100 в исходном образце (время хранения - 0 часов).A cell suspension with a concentration of (~ 2-3) × 10 7 with a volume of 0.9-1.0 ml is stored in 1.5 ml Eppendorf tubes at room temperature. Immediately after placing the cells in a test tube, the suspension is mixed and a sample of 30.0 μl is taken from it, placed in a 0.6 ml Eppendorf tube, a 2-Di-1-ASP solution is added at a final concentration of 1 · 10 -5 -1 · 10 -4 M and incubated for 45-90 minutes at 37 ° C. After incubation from the suspension of stained cells, a drop (3 μl) of the suspension is taken, placed on a defatted glass slide, covered with a coverslip and the cell preparation is examined using a Lumam-I2 fluorescence microscope (LOMO, Russia). The fluorescence of the probe is excited by a DRSh-250-2 mercury lamp with a wavelength of 405-436 nm. To register fluorescence, an FMEL-1 photometric nozzle and an interference filter with a transmission maximum of 585 nm are used. The excitation wavelength is 470 nm, the fluorescence intensity is determined at a wavelength of 560 nm. The fluorescence intensity of each individual cell is recorded. In each preparation, the fluorescence of an array of 80-100 cells is determined, N F> 100 is calculated in the original sample (storage time - 0 hours).
Через 3-3,5 часа хранения суспензии ККМ из пробирки емкостью 1,5 мл после перемешивания отбирают вторую пробу объемом 30,0 мкл, помещают ее в пробирку емкостью 0,6 мл, добавляют раствор 2-Di-1-ASP, инкубируют при 37°С и, после приготовления препарата окрашенных клеток, исследуют его на люминесцентном микроскопе, рассчитывают NF>100. При возрастании NF>100 через 3-3,5 часа хранения ККМ более чем в 1,5 раза по сравнению с исходной величиной судят о способности ККМ к делению.After 3-3.5 hours of storage of the CCM suspension from a test tube with a capacity of 1.5 ml, a second sample of 30.0 μl was taken after stirring, placed in a test tube with a capacity of 0.6 ml, a solution of 2-Di-1-ASP was added, incubated at 37 ° C and, after preparation of the preparation of stained cells, examine it on a luminescent microscope, calculate N F> 100 . With an increase in N F> 100 after 3-3.5 hours of storage, the CMC is more than 1.5 times compared with the initial value, the ability of the CMC to divide is judged.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.The method is illustrated by the following clinical examples.
Пример 1. Донор 1. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли
Полученные данные показывают, что в пробе, отобранной через 3 часа хранения, NF>100 возрастает по сравнению с исходной в 2,5 раза, что коррелирует с нарастанием
Таким образом, увеличение NF>100 через 3 часа хранения ККМ в 2,5 раза свидетельствует об их способности к делению.Thus, an increase in N F> 100 after 3 hours of storage of CMC by 2.5 times indicates their ability to divide.
Пример 2. Донор 2. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли
Из данных таблицы 2 видно, что через 3,5 часа хранения NF>100 возрастает по сравнению с исходной в 1,7 раза (
Из данного примера видно, что увеличение NF>100 через 3,5 часа хранения ККМ в 1,7 раза свидетельствует об их способности к делению.From this example, it can be seen that an increase in N F> 100 after 3.5 hours of storage of CMC by 1.7 times indicates their ability to divide.
Пример 3. Донор 3. ККМ хранили в среде стандартного стабилизатора при комнатной температуре. Через определенные временные интервалы отбирали пробы клеток, инкубировали их с 2-Di-1-ASP при 37°С, определяли
Из таблицы 3 видно, что через 3 часа хранения в данном препарате NF>100 возрастает в 1,2, а
Данный пример показывает, что отсутствие увеличения NF>100 через 3 часа хранения ККМ в 1,5 раза свидетельствует о неспособности клеток к делению.This example shows that the absence of an increase in N F> 100 after 3 hours of storage of CMC by 1.5 times indicates the inability of cells to divide.
Использование заявленного способа позволяет оценить спонтанную способность ККМ к делению, обусловленную эффектом собственных ростовых факторов, и исключает причины, влияющие на деление и дифференцировку клеток. Способ методически прост и позволяет получить результаты через 3-3,5 часа.Using the claimed method allows to evaluate the spontaneous ability of CMC to dividing, due to the effect of their own growth factors, and eliminates the reasons that affect cell division and differentiation. The method is methodologically simple and allows you to get results in 3-3.5 hours.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013151934/15A RU2537141C1 (en) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Method for assessment of marrow cell fissility |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013151934/15A RU2537141C1 (en) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Method for assessment of marrow cell fissility |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2537141C1 true RU2537141C1 (en) | 2014-12-27 |
Family
ID=53287585
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013151934/15A RU2537141C1 (en) | 2013-11-20 | 2013-11-20 | Method for assessment of marrow cell fissility |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2537141C1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2186579C2 (en) * | 1994-09-30 | 2002-08-10 | ПРО-НЕЙРОН, Инк. | Inhibitor of stem cell proliferation and method for its application |
RU2433174C2 (en) * | 2006-04-28 | 2011-11-10 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Method of induction of pluripotent stem cells differentiation into cardiomyocytes |
RU2439147C1 (en) * | 2010-10-11 | 2012-01-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН НИИ фармакологии СО РАМН | Method of stimulation in vitro pluripotent hemopoetic stem cells |
-
2013
- 2013-11-20 RU RU2013151934/15A patent/RU2537141C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2186579C2 (en) * | 1994-09-30 | 2002-08-10 | ПРО-НЕЙРОН, Инк. | Inhibitor of stem cell proliferation and method for its application |
RU2433174C2 (en) * | 2006-04-28 | 2011-11-10 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Method of induction of pluripotent stem cells differentiation into cardiomyocytes |
RU2439147C1 (en) * | 2010-10-11 | 2012-01-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН НИИ фармакологии СО РАМН | Method of stimulation in vitro pluripotent hemopoetic stem cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ГОЛЬДБЕРГ Е.Д. и др. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992, под ред. д.м.н. Новицкого, 272 с. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Arakaki et al. | Microtechnique for culturing leukocytes from whole blood | |
Walsh et al. | Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues | |
Swamydas et al. | Isolation of mouse neutrophils | |
EP0266196A2 (en) | Cell growth rate determination | |
Kim et al. | In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix | |
Bucchieri et al. | Functional characterization of a novel 3D model of the epithelial-mesenchymal trophic unit | |
Lupia et al. | Thrombopoietin modulates cardiac contractility in vitro and contributes to myocardial depressing activity of septic shock serum | |
Ferrell et al. | Application of physiological shear stress to renal tubular epithelial cells | |
Britt et al. | Protein accumulation in early chick embryos grown under different conditions of explantation | |
JP7199427B2 (en) | An ex vivo model of inflamed human skin and its use for screening anti-inflammatory compounds | |
Strowitzki et al. | Carbon dioxide sensing by immune cells occurs through carbonic anhydrase 2–dependent changes in intracellular pH | |
Bahramsoltani et al. | Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis in vivo, ex vivo and in vitro–an overview | |
Luthfi | A simple and practical method for rat epididymal sperm count (Rattus norvegicus) | |
RU2537141C1 (en) | Method for assessment of marrow cell fissility | |
Blot et al. | Modifications to the classical rat aortic ring model to allow vascular degeneration studies | |
Iyyathurai et al. | Calcium wave propagation triggered by local mechanical stimulation as a method for studying gap junctions and hemichannels | |
Cotter et al. | Introduction to Histology | |
CN114958953A (en) | Screening method for anti-aging efficacy of in-vitro 3D whole skin model of cosmetic raw materials | |
Chonwerawong et al. | Analysis of innate immune responses to Helicobacter pylori | |
RU2247987C2 (en) | Method for detecting bactericide activity of blood serum | |
Bourgeois et al. | In vitro systems for studying the interaction of fungal pathogens with primary cells from the mammalian innate immune system | |
Wang et al. | Proteomics method for identification of pseudopodium phosphotyrosine proteins | |
RU2712946C1 (en) | Method for assessing the balance of the immune, inflammatory and anti-inflammatory reaction of alveolar macrophages recovered from resected parts of the lung of patients suffering pulmonary tuberculosis, depending on the degree of mycobacterium tuberculosis macrophages infection | |
RU2488826C1 (en) | Method for assessing marrow cell activity | |
Dreier et al. | Detecting release of bacterial dsDNA into the host cytosol using fluorescence microscopy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151121 |