RU2535981C1 - Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement - Google Patents
Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement Download PDFInfo
- Publication number
- RU2535981C1 RU2535981C1 RU2013137784/10A RU2013137784A RU2535981C1 RU 2535981 C1 RU2535981 C1 RU 2535981C1 RU 2013137784/10 A RU2013137784/10 A RU 2013137784/10A RU 2013137784 A RU2013137784 A RU 2013137784A RU 2535981 C1 RU2535981 C1 RU 2535981C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- caspase
- biosensor
- fluorescence
- fluorescent
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
[002] ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ[002] FIELD OF THE INVENTION
[003] Данное изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры для детекции активности каспазы 3, сконструированные на основе флуоресцентных белков.[003] This invention relates generally to the field of biology and chemistry. In particular, the invention is directed to biosensors for detecting
[004] УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ[004] BACKGROUND
[005] Процесс запрограммированной клеточной гибели, апоптоз, является одним из ключевых процессов для эмбрионального развития и поддержания тканей в здоровом состоянии, в частности противодействия опухолевому росту. В инициации и эффекторной стадии апоптоза ключевую роль играют ферменты каспазы.[005] The programmed cell death process, apoptosis, is one of the key processes for embryonic development and maintaining healthy tissues, in particular counteracting tumor growth. Caspase enzymes play a key role in the initiation and effector stage of apoptosis.
[006] Каспазы представляют собой семейство внутриклеточных специфичных цистеиновых протеаз, которые являются высококонсервативными в многоклеточных организмах. В млекопитающих было идентифицировано 14 представителей семейства каспаз, сгруппированных в 2 главные руппы, воспалительные и апототические каспазы. Связанные с апоптозом каспазы далее классифицируется на 2 группы: инициирующие каспазы (каспазы 2, 8 и 9), которые функционируют в начале каспазного сигнального пути, и эффекторные каспазы 3, 6 и 7 [Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene. 2003; 22(53):8543-8567].[006] Caspases are a family of intracellular specific cysteine proteases that are highly conserved in multicellular organisms. In mammals, 14 representatives of the caspase family were identified, grouped into 2 main groups, inflammatory and apototic caspases. Caspases associated with apoptosis are further classified into 2 groups: initiating caspases (
[007] Инициирующие каспазы 8 и 9 активицируются посредством автокаталитического расщепления, опосредуемого высокомолекулярным адапторным коплексом, известным как апоптосома. Данный комплекс обычно формируется в ответ на внутриклеточные или внеклеточные стимулы, сигнализирующие о необходимости гибели клетки [Riedl SJ, Salvesen GS. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol CelS Biol. 2007; 8(5):405-413]. Главной мишенью активированных инициирующих каспаз являются неактивные предшественники эффекторных каспаз 3, 6 и 7-прокаспазы. Расщепление каспазами 8 и 9 активирует эффекторные каспазы. Мишенями расщепления эффекторных каспаз, в частности каспазы 3, являются множество клеточных белков, что приводит к контролируемой гибели клетки. В дополнение к ключевой роли в апоптозе недавние исследования демонстрируют наличие не связанных с апоптозом функций эффекторных каспаз, включающих регулирование иммунного ответа, пролиферации, дифференцировки и подвижности клеток [Kuranaga E, Miura M. Nonapoptotic functions of caspases: caspases as regulatory molecules for immunity and cell-fate determination. Trends Cell Biol. 2007; 17(3):135-144; Yi CH, Yuan J. The Jekyll and Hyde functions of caspases. Dev Cell. 2009; 16(1):21-34].[007] The initiating
[008] Каспазы характеризуются высокой субстратной специфичностью. Они распознают специфическую последовательность в белках-мишенях. С помощью библиотек флуоресцентно меченых тетрапептидных субстратов было установлено, что каспазы 3 и 7 распознают в качестве мишени последовательность DEVD.[008] Caspases are characterized by high substrate specificity. They recognize a specific sequence in target proteins. Using libraries of fluorescently labeled tetrapeptide substrates, it was found that
[009] Как указывает ряд авторов, специфичность каспаз к субстратам, определенная in vitro с помощью указанного подхода, не является абсолютно точным отражением необходимых для расщепления условий in vivo. На специфичность расщепления каспаз in vivo влияют особенности конформации аминокислотных последовательностей, фланкирующих расщепляемый тетрапептидный мотив, которые могут контролировать молекулярный электростатический потенциал и стерическую доступность активного центра протеазы и белка-мишени [Muneef Ayyash, Hashem Tamimi, and Yaqoub Ashhab Developing a powerful In Silico tool for the discovery of novel caspase-3 substrates: a preliminary screening of the human proteome. BMC Bioinformatics. 2012; 13: 14]. Например, несмотря на одинаковую расщепляемую тетрапептидную последовательность DEVD, каспазы 3 и 7 характеризуются четким различием расщепляемых природных субстратов [Walsh JG et al. Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(35): 12815-12819]. Было показано, что кроме терапептидной расщепляемой последовательности DEVD (P4-P1) расположенные вне коровой последовательности остатки Р6, Р5, Р2' и РЗ' являются исключительно важными для идентификации белков как субстратов каспазы 3 и каспазы 7 [Demon D et al. Proteome-wide substrate analysis indicates substrate exclusion as a mechanism to generate caspase-7 versus caspase-3 specificity. Mol Cell Proteomics. 2009; 8(12):2700-2714].[009] As indicated by a number of authors, the specificity of caspases for substrates, determined in vitro using this approach, is not an absolutely accurate reflection of the necessary in vivo cleavage conditions. The specificity of the conformation of caspase cleavage in vivo is influenced by the features of the conformation of amino acid sequences flanking the cleaved tetrapeptide motif that can control the molecular electrostatic potential and steric accessibility of the active center of the protease and the target protein [Muneef Ayyash, Hashem Tamimi, and Yaqoub Ashhab Developing a powerful In Silico tool for the discovery of novel caspase-3 substrates: a preliminary screening of the human proteome. BMC Bioinformatics. 2012; 13: 14]. For example, despite the identical cleavable tetrapeptide sequence of DEVD,
[010] Описанные выше ограничения по стерической доступности, электростатическому заряду остатков на поверхности белка и влиянию определенных остатков за пределами коровой последовательности DEVD, накладываемые на мишени каспаз in vivo, делают конструирование искусственных белковых субстратов для каспаз нетривиальной задачей. При этом перенос известной расщепляемой каспазой последовательности в новый химерный полипептид, не являющийся субстратом каспазы, не гарантирует работоспособности полученного химерного полипептида в качестве субстрата каспазы.[010] The limitations described above on steric availability, electrostatic charge of residues on the surface of a protein, and the effect of certain residues beyond the DEVD core sequence, superimposed on caspase targets in vivo, make the construction of artificial protein substrates for caspases a non-trivial task. Moreover, the transfer of a known caspase cleavable sequence into a new chimeric polypeptide that is not a caspase substrate does not guarantee the operability of the obtained chimeric polypeptide as a caspase substrate.
[011] Среди эффекторных каспаз фермент каспаза 3 считается наиболее важным эффектором, расщепляющим большое количество клеточных субстратов. Инактивация каспазы 3 с использованием антител ингибирует большую часть протеолитических реакций, имеющих место при апоптозе, в то время как инактивация других эффекторных каспаз оказывает незначительный эффект на маркеры апоптоза и эффективность их протеолиза [Walsh JG et al. Executioner caspase-3 and caspase-7 are functionally distinct proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(35):12815-12819]. Исследования за последние 10 лет выявили более 200 субстратов каспазы 3 и их количество продолжает расти.[011] Among effector caspases,
[012] Определение уровня подвергающихся апоптозу клеток, например, через измерение активности каспазы 3, может быть использовано, в частности, для оценки эффективности противораковой терапии [Rossi E et al. Dynamic changes of live/apoptotic circulating tumour cells as predictive marker of response to sunitinib in metastatic renal cancer. Br J Cancer. 2012 Oct 9; 107(8): 1286-94; Yang F et al. Sunitinib induces apoptosis and growth arrest of medulloblastoma tumor cells by inhibiting STAT3 and АКТ signaling pathways. Mol Cancer Res. 2010 Jan; 8(1):35-45]. В литературе описан широко востребованный метод определения активности каспазы 3, основанный на иммунохимическом выявлении продукта активности каспазы, расщепленного цитокератина 18 (М30 CytoDEATH™, Peviva). Однако при высокой чувствительности и надежности данный метод обладает рядом недостатков, таких как невозможность отслеживать изменения активность каспаз в динамике, высокая стоимость и сложность анализа.[012] Determining the level of cells undergoing apoptosis, for example, by measuring
[013] Данных недостатков лишены анализы с использованием генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].[013] Analysis of the use of genetically encoded biosensors based on fluorescent proteins [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90 (3): 1103-63].
[014] Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616):87-91 и Chudakov et al. (Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3): 1103-63).[014] Fluorescent proteins of the GFP family (Green Fluorescent Protein, GFP), including the actual GFP from the jellyfish Aequorea victoria (avGFP), its mutants and homologs, are widely known today due to their intensive use as in vivo fluorescent markers in biomedical research, which is described in detail reviewed by Lippincott-Schwartz and Patterson in Science (2003) 300 (5616): 87-91 and Chudakov et al. (Physiol Rev. 2010 Jul; 90 (3): 1103-63).
[015] Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.[015] Fluorescent proteins are capable of fluorescence when irradiated with light of a suitable wavelength. The fluorescence properties of these proteins are due to the interaction of two or more amino acid residues that form the chromophore, and not the fluorescence of any one amino acid residue.
[016] GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет.кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.[016] GFP hydromedusa Aequorea aequorea (synonym for A. victoria) has been described by Johnson et al. at J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, as part of a jellyfish bioluminescent system, where GFP plays the role of a secondary emitter that converts blue light from an equorin photo protein to green light. The cDNA encoding A. victoria GFP was cloned by Prasher et al. (Gene (1992), 111 (2): 229-33). It turned out that this gene can be heterologically expressed in virtually any organism due to the unique ability of GFP to autocatalytically form a chromophore (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). This information has opened up broad prospects for the use of GFP in cell biology as a genetically encoded fluorescent label.
[017] GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaetherand Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).[017] GFP has been used in a wide range of applications, including the study of gene expression and protein localization (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. In Proc. Nat. Acad. Sci. (1994 ), 91: 12501-12504), as a tool for visualizing the intracellular distribution of organelles (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), for visualizing the transport of proteins along the secretory pathway (Kaetherand Gerdes, FEBS Letters ( 1995), 369: 267-271).
[018] Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих («гуманизированный« GFP, Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе «усиленный зеленый флуоресцентный белок« (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.[018] Numerous studies have been conducted to improve the properties of avGFP (Aequorea victoria GFP) and to obtain GFP variants that are suitable and optimized for various research purposes. The avGFP (codon usage) genetic code was optimized to increase expression in mammalian cells (“humanized” GFP, Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Various GFP mutants have been obtained, including the “enhanced green fluorescent protein” (EGFP) having two amino acid substitutions: F64L and S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Other mutants are blue, blue, and yellow-green spectral variants of avGFP and contain substitutions of amino acid residues that form the chromophore and / or residues that form the environment of the chromophore.
[019] В 1999 г. гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Arrthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием и включали циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.[019] In 1999, GFP homologues were cloned from non-bioluminescent species of Arrthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). This discovery has demonstrated that these proteins are not necessarily a component of the bioluminescent system. GFP-like proteins from Anthozoa had a large spectral diversity and included cyanic, green, yellow, red fluorescent proteins and violet-blue non-fluorescent chromoproteins (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24 (10): 953-959) . Subsequently, cDNAs of GFP-like proteins were cloned from a number of hydroid jellyfish and from copepods (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21 (5): 841-850). Today, the family of GFP-like proteins includes hundreds of fluorescent and stained GFP homologs. The similarity of these proteins to GFP varies from 80-90% to less than 25% amino acid sequence identity.
[020] Были получены кристаллические структуры avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.[020] Crystal structures of wild-type avGFP, GFP S65T mutant, and a number of GFP homologues were obtained (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626 -44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787) . It was postulated that all members of the family have a common 3D structure (GFP-like domain), which is the so-called “barrel” of 11 beta layers, forming a compact antiparallel structure, inside which there is an alpha helix containing a chromophore. A chromophore is formed within a GFP-like domain by oxidative cyclization of three conserved amino acid residues in the central region of the alpha helix (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). The positions of the amino acid residues forming the chromophore correspond to the Ser65-Tyr66-Gly67 region of avGFP. These amino acid residues can easily be identified in any GFP-like protein by aligning its sequence with the avGFP sequence.
[021] Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).[021] Fluorescent proteins are a unique family of structurally related proteins that are capable of forming a chromophore autocatalytically without involving external substrates or cofactors. Under the influence of inducing light, the chromophore produces fluorescence that can be easily detected using modern laboratory equipment (spectrofluorimeter, fluorescence microscope, fluorescence-activated cell sorter, flatbed fluorimeter).
[022] Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91:12501-12504; Ormo et al. Science. 1996;273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996; 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997; 4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001; 2:6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000; 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98:462-467; Pakhomov, A.A. and Martynov, V.I. Chem. Biol. 2008, 15, 755-764; Quillinet al. (2005) Biochemistry 44, 5774- 5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44, 5788- 5793; Shu et al. (2006) Biochemistry 45, 9639-9647; Kikuchi et al. (2008) Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33), p.8077-8082).[022] The process of autocatalytic formation of a chromophore of proteins with different spectral properties is described in detail in a number of articles and includes several chemical reactions (Heim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91: 12501-12504; Ormo et al. Science. 1996; 273 : 1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996; 14: 1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997; 4: 361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001; 2: 6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000; 7: 1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 462-467; Pakhomov, AA and Martynov, VI Chem. Biol. 2008, 15, 755-764; Quillinet al. (2005) Biochemistry 44, 5774-5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44, 5788-5793; Shu et al. (2006)
[023] GFP-подобные белки широко используют для создания генетически кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становится все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров.[023] GFP-like proteins are widely used to create genetically encoded biosensors. The study of intracellular processes using such genetically encoded biosensors is becoming increasingly popular, since only such sensors can provide information about changes in the parameter under study directly in a living system. Such biosensors are in demand both in basic research of the body's signaling pathways, and in testing toxic and drug preparations on model cell lines or organisms. Compared with chemical and physical methods for recording biologically active substances with biosensors requiring exogenously added dyes, substrates, or cofactors, genetically encoded nanobiosensors belong to the class of non-reagent and reusable sensors.
[024] Для наблюдения за процессами в толще тканей млекопитающих животных, характеризующихся значительным поглощением и светорассеянием при длинах волн менее 650 нм, были разработаны родственные GFP флуоресцентные белки с максимумами эмиссии в дальне-красной области. Были описаны флуоресцентный белок Katushka (максимум возбуждения 588 нм, максимум эмиссии 635 нм) [Shcherbo D et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007 Sep; 4(9):741-6], а также его вариант с увеличенной мономерностью mKate2, eqFP650 (димерный белок, максимум возбуждения 592 нм, максимум эмиссии 650 нм), NiRFP (eqFP670, димерный белок, максимум возбуждения 605 нм, максимум эмиссии 670 нм) [Shcherbo D et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010 Oct; 7(10):827-9]. eqFP650 является одним из самых ярких флуоресцентных белков с максимумом эмиссии с длиной волны более 635 нм, а eqFP670 обладает высокой фотостабильностью и является на сегодняшний день флуоресцентным белком с наиболее длинноволновым максимумом эмиссии флуоресценции среди GFP-подобных белков.[024] In order to monitor the processes in the thickness of the tissues of mammals of animals, characterized by significant absorption and light scattering at wavelengths less than 650 nm, related GFP fluorescent proteins with emission maxima in the far red region were developed. Katushka fluorescent protein has been described (maximum excitation 588 nm, maximum emission 635 nm) [Shcherbo D et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007 Sep; 4 (9): 741-6], as well as its variant with increased monomerism mKate2, eqFP650 (dimeric protein, maximum excitation 592 nm,
[025] В 2010 году был описан флуоресцентый белок, не родственный белку GFP, обладающий совершенно иной структурой и уникальными спектральными свойствами. Флуоресцентный белок с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра (iRFP) представляет собой белок на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из фотосинтетической бактерии Rhodopseudomonas palustris с максимумами поглощения и эмиссии 690 и 713 нм, соответственно. Белок был разработан для функциональных исследований с использованием флуоресценции в тканях млекопитающих животных in vivo, при котором применение большинства родственных GFP флуоресцентных белков ограничено за счет высокого поглощения света гемоглобином и меланином кожи. Для данных целей максиму поглощения и эмиссии должны находиться в близкой к инфракрасной области спектра от 650 до 900 нм, где поглощение и рассеяние света тканями является наименьшим.[025] In 2010, a fluorescent protein that was not related to the GFP protein was described, which has a completely different structure and unique spectral properties. The near-infrared emission fluorescent protein (iRFP) is a bacterial phytochrome RpBphP2 protein from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris with absorption and emission maxima of 690 and 713 nm, respectively. The protein was developed for functional studies using fluorescence in mammalian animal tissue in vivo, in which the use of most related GFP fluorescent proteins is limited due to the high light absorption of hemoglobin and skin melanin. For these purposes, the absorption and emission maxima should be close to the infrared region of the spectrum from 650 to 900 nm, where the absorption and scattering of light by tissues is the smallest.
[026] Роль флуорофора в белке играет молекула линейного тетрапиррола биливердина IXα, ковалентно присоединяющаяся к остатку цистеина полипептидной цепи. В клетках млекопитающих iRFP не требует дополнительного добавления в среду необходимого для флуоресценции кофактора биливердина, т.к. данное соединение является интермедиатом в метаболизме гема и присутствует в клетках. Белок обладает высокой яркостью флуоресценции, внутриклеточной стабильностью и фотостабильностью по сравнению с ранее известными флуоресцентными белками на основе фитохромов. По сравнению с дальне-красными флуоресцентными белками на основе GFP, iRFP характеризуется более высоким отношением сигнал/фон в тканях животных из-за эмиссии в близкой к инфракрасной области спектра.[026] The role of the fluorophore in the protein is played by the molecule of linear tetrapyrrole biliverdin IXα, covalently attached to the cysteine residue of the polypeptide chain. In mammalian cells, iRFP does not require additional addition of the biliverdin cofactor necessary for fluorescence, since this compound is an intermediate in heme metabolism and is present in cells. The protein has a high fluorescence brightness, intracellular stability and photostability compared to previously known phytochrome-based fluorescent proteins. Compared to far-red GFP-based fluorescent proteins, iRFP is characterized by a higher signal-to-background ratio in animal tissues due to emission in the near-infrared region of the spectrum.
[027] Теоретически, из-за своих спектральных свойств белок iRFP может быть использован в качестве акцептора для FRET в паре с такими донорами, как дальне-красные флуоресцентные белки семейства GFP. Теоретически, данный белок может быть использован для конструирования основанных на FRET биосенсоров с использованием таких доноров, как дальне-красные флуоресцентные белки семейства GFP, однако возможность создания таких сенсоров ранее экспериментально не проверялась.[027] Theoretically, due to its spectral properties, the iRFP protein can be used as an acceptor for FRET paired with donors such as far red fluorescent GFP family proteins. Theoretically, this protein can be used to construct FRET-based biosensors using donors such as far-red fluorescent proteins of the GFP family, however, the possibility of creating such sensors has not been previously experimentally tested.
[028] Белок представляет собой димер, что осложняет конструирование биосенсоров с его использованием. Для получения белков слияния с iRFP его разработчиками рекомендуется использовать тандемные димеры данного белка (Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, Zhang J, Kim K, Verkhusha W. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011 Jul 17; 29(8):757-61].[028] The protein is a dimer, which complicates the construction of biosensors with its use. To obtain fusion proteins with iRFP, it is recommended that its developers use tandem dimers of this protein (Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, Zhang J, Kim K, Verkhusha W. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011 Jul 17; 29 (8): 757-61].
[029] Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белок, белковый домен или полипептид, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например, изменению активности какого-либо белка фермента (такого как протеаза. например, каспаза). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, между которыми может происходить процесс Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].[029] Fluorescent protein-based biosensors are chimeric proteins that include a sensory domain — a protein, a protein domain, or a polypeptide that is sensitive to a change in a specific cell parameter, for example, a change in the activity of an enzyme protein (such as a protease, for example, caspase). As the signal part of the biosensor, GFP-like proteins or their variants are used, between which the process of Ferster resonance energy transfer (FRET) can occur [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90 (3): 1103-63].
[030] Ферстеровский перенос энергии, иначе диполь-дипольный перенос энергии; флуоресцентный резонансный перенос энергии; индуктивно-резонансный перенос энергии (FRET) - механизм переноса энергии между двумя хромофорами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. Характерной чертой данного процесса является тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции акцептора. Эффективность переноса энергии (или отношение числа событий переноса энергии к числу событий возбуждения донора) напрямую связана со скоростью переноса и зависит от расстояния между объектами (убывает как r-6). Эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50% от максимума, называют ферстеровским радиусом. Для большинства систем его величина составляет 20-50 Å.[030] Ferster energy transfer, otherwise a dipole-dipole energy transfer; fluorescent resonant energy transfer; inductive resonance energy transfer (FRET) is a mechanism of energy transfer between two chromophores (from a donor to an acceptor) that occurs without intermediate emission of photons and is the result of a dipole-dipole interaction between a donor and an acceptor. A characteristic feature of this process is the quenching of donor fluorescence and the occurrence of longer wavelength acceptor fluorescence. The energy transfer efficiency (or the ratio of the number of energy transfer events to the number of donor excitation events) is directly related to the transfer rate and depends on the distance between objects (decreases as r -6 ). The effective distance at which the transition rate is 50% of the maximum is called the Foerster radius. For most systems, its value is 20-50 Å.
[031] Эффективность переноса энергии также зависит от множества факторов, таких как расстояние между донором и акцептором, степень перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, взаимная ориентация диполей донора и акцептора [Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. - Springer, 2006].[031] The energy transfer efficiency also depends on many factors, such as the distance between the donor and the acceptor, the degree of overlap of the emission spectra of the donor and the absorption of the acceptor, the relative orientation of the dipoles of the donor and the acceptor [Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. - Springer, 2006].
[032] Таким образом, надежно предсказать эффективность FRET между известными белками-флуорофорами заранее практически невозможно, следовательно, создание работоспособного флуоресцентного биосенсора на основе FRET с новой парой флуорофоров является нестандартной и сложной задачей [Campbell RE. Fluorescent-protein-based biosensors: modulation of energy transfer as a design principle. Anal Chem. 2009 Aug 1; 81(15):5972-9.].[032] Thus, it is practically impossible to predict the effectiveness of FRET between known fluorophore proteins in advance, therefore, creating an efficient FRET-based fluorescent biosensor with a new pair of fluorophores is a non-standard and difficult task [Campbell RE. Fluorescent-protein-based biosensors: modulation of energy transfer as a design principle. Anal Chem. 2009
[033] Детекция молекулярной динамики с помощью FRET является современным и высоко востребованным методом анализа белок-белковых взаимодействий при активации внутриклеточных сигнальных путей. Исследования с использованием FRET между мечеными производными GFP молекулами показали образование комплексов между сигнальными белками в различных клеточных компартментах. Также были созданы биосенсоры на основе FRET для детекции каспазной активности [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S. Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3):1103-63].[033] Detection of molecular dynamics using FRET is a modern and highly popular method for the analysis of protein-protein interactions upon activation of intracellular signaling pathways. Studies using FRET between labeled derivatives of GFP molecules showed the formation of complexes between signaling proteins in various cell compartments. FRET-based biosensors were also created for the detection of caspase activity [Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S. Lukyanov KA. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging. Living Cells and Tissues. Physiol Rev. 2010 Jul; 90 (3): 1103-63].
[034] Например, для детекции активности каспазы 3 был сконструирован и успешно применен биосенсор на основе FRET, состоящий из двух флуоресцентных белков, являющихся производными зеленого флуоресцентного белка GFP, таких как циановый флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), и включающий распознаваемую каспазой последовательность в линкере между ними. В данной системе расщепление линкерной части активированной каспазой приводило к исчезновению FRET за счет физического расхождения двух флуорофоров. Также был получен похожий сенсор для каспазы 8 [Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC. Measuring dynamics of caspase-8 activation in a single living HeLa cell during TNFalpha-induced apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 2; 304(2):217-22].[034] For example, to detect
[035] Также описан схожий по характеристикам генетически кодируемый биосенсор активности каспазы 3 Casper3-BG (Subach ОМ et al. Chem Biol. 2008 Oct 20; 15(10): 1116-24), основанный на FRET между синим флуоресцентным белком TagBFP и зеленым флуоресцентным белком TagGFP2 из семейства GFP-подобных белков, разделенными линкером с расщепляемой каспазой 3 последовательностью DEVD. Активация каспазы 3 при апоптозе приводит к расщеплению линкерной последовательности между белками и исчезновению FRET, которое можно детектировать по ослаблению зеленой флуоресценции TagGFP2 и одновременному усилению флуоресценции TagBFP. Отмечена меньшая способность белков TagGFP2 и TagBFP по сравнению с YFP и CFP образовывать гетеродимеры, что приводит к уменьшению фонового уровня FRET биосенсора.[035] A similar genetically encoded biosensor of
[036] К числу биосенсоров каспазной активности на основе FRET также принадлежит генетически кодируемый биосенсор, состоящий из красного флуоресцентного белка TagRFP (максимум эмиссии 584 нм) в качестве донора для FRET и не флуоресцентного в условиях измерения хромобелка KFP в качестве акцептора FRET [Savitsky АР et al. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostics. 2012; 2(2):215-261.[036] The FRET-based caspase activity biosensors also include a genetically encoded biosensor consisting of a red fluorescent TagRFP protein (emission maximum 584 nm) as a donor for FRET and not fluorescent under the conditions of measurement of the KFP chromoprotein as an FRET acceptor [Savitsky AP et al. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostics. 2012; 2 (2): 215-261.
[037] Был описан биосенсор на основе FRET для одновременной детекции активности каспазы 8 и каспазы 3 CYR83, сконструированный из трех флуоресцентных белков семейства GFP: цианового флуоресцентного белка seCFP (возбуждение 420 нм, эмиссия 476 нм), желтого флуоресцентного белка Venus (возбуждение 514 нм, эмиссия 528 нм) и красного флуоресцентного белка mRFP1 (возбуждение 500 нм, эмиссия 608 нм). Белки seCFP и Venus были соединены расщепляемым каспазой 8 линкером, далее белок Venus был соединен с белком mRFP1 посредством расщепляемого каспазой 3 линкера. Детекцию активности каспазы 3 осуществляли по исчезновению FRET между Venus и mRFP1 по увеличению флуоресценции при 528 нм и падению флуоресценции при 608 нм.[037] A FRET-based biosensor has been described for the simultaneous detection of
[038] Однако все описанные генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры каспазной активности не позволяют проводить измерения в удобном для измерения флуоресценции в животных моделях диапазоне длин волн 650-900 нм. Таким образом, существует необходимость разработки новых генетически кодируемых биосенсоров активности каспазы 3 с использованием дальне-красных флуоресцентных белков, обеспечивающих аналитический флуоресцентный сигнал от биосенсора в области длин волн более 650 нм.[038] However, all the described genetically encoded fluorescence caspase biosensors do not allow measurements in the wavelength range 650-900 nm, which is convenient for measuring fluorescence in animal models. Thus, there is a need to develop new genetically encoded biosensors of
[039] До настоящего времени не создано флуоресцентных биосенсоров каспазной активности, работающих на основе FRET, с использованием дальне-красных флуоресцентных белков в качестве доноров для переноса энергии. Не описано также биосенсоров, работающих на основе FRET, сконструированных с использованием флуоресцентного белка с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра iRFP.[039] To date, no fluorescent caspase activity biosensors based on FRET have been developed using far-red fluorescent proteins as donors for energy transfer. Also not described are biosensors based on FRET designed using a fluorescent protein with emission in the near infrared region of the iRFP spectrum.
[040] Так как наличие и эффективность FRET между донорным и акцепторным флуорофорами, в частности двумя флуоресцентными белками, зависит от множества параметров, предсказать возможность создания основанного на FRET биосенсора, исходя из теоретических предпосылок о свойствах iRFP и дальне-красных мутантов GFP, не представляется возможным.[040] Since the presence and effectiveness of FRET between donor and acceptor fluorophores, in particular two fluorescent proteins, depends on many parameters, it does not seem to predict the possibility of creating a FRET biosensor based on theoretical assumptions about the properties of iRFP and far-red GFP mutants possible.
[041] Так как используемые при конструировании генетически кодируемых биосенсоров по настоящему изобретению флуоресцентные белки семейства GFP eqFP650 и eqFP670 и флуоресцентный белок iRFP in vivo представляют собой димеры, связанные нековалентными связями, биосенсоры по изобретению также представляют собой димеры или структуры более высоко порядка в системах in vivo, что может полностью стерически блокировать чувствительный к каспазе 3 линкер и препятствовать расщеплению биосесора каспазой. Данная ситуация также осложняется тем, что сам фермент каспаза 3 активна в клетке в виде димера [Savitsky АР et al. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostics. 2012; 2(2):215-26]. Так как структура белка iRFP кардинально отличается от структуры GFP-подобных белков, структуру биосенсоров по изобретению нельзя аппроксимировать из известных структур биосенсоров на основе только GFP-подобных белков.[041] Since the fluorescent proteins of the GFP family eqFP650 and eqFP670 and the fluorescent protein iRFP in vivo used in the construction of the genetically encoded biosensors of the present invention are non-covalent linked dimers, the biosensors of the invention are also higher order dimers or structures in in systems vivo, which can completely sterically block the caspase-sensitive 3 linker and inhibit the degradation of the biosensor by caspase. This situation is also complicated by the fact that the
[042] РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ[042] SUMMARY OF THE INVENTION
[043] Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентные биосенсоры для измерения активности каспазы 3, аналитический сигнал которых представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра.[043] The present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding fluorescence biosensors for measuring
[044] В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации активности каспазы 3 внутри клеток. В некоторых воплощениях указанный биосенсор при увеличении активности каспазы 3 в среде реагирует увеличением флуоресценции белка донора FRET в дальне-красной области с длиной волны более 650 нм при его возбуждении относительно флуоресценции белка iRFP. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок семейства GFP. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок mKate2, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 588 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 635 нм, предпочтительно приблизительно 650 нм. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок eqFP650, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 592 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 650 нм. В некоторых воплощениях дальне-красный флуоресцентный белок, являющийся донором для FRET, представляет собой белок eqFP670, флуоресценцию которого возбуждают светом с длиной волны приблизительно 605 нм и измеряют при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 670 нм. Предпочтительно изменения флуоресценции дальне-красного флуоресцентного белка, являющегося донором для FRET, нормируют на флуоресценцию белка iRFP при длине волны приблизительно, по меньшей мере, 713 нм при возбуждении светом с длиной волны приблизительно 690 нм.[044] In some embodiments, the nucleic acid of the present invention encodes a fluorescent biosensor to detect
[045] В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения состоит из молекулы дальне-красного флуоресцентного белка семейства GFP (SEQ ID NO:1, 2 или 3), оперативно соединенного через подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, с флуоресцентным белком iRFP с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра (SEQ ID NO:4). В некоторых воплощениях подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 или 7 (mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP или NiRFP-kasp-iRFP). В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9, 10 или 11.[045] In some embodiments, the biosensor of the present invention consists of a far-red fluorescent protein molecule of the GFP family (SEQ ID NO: 1, 2, or 3) operatively coupled via a movable linker containing a
[046] Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, так же входят в рамки настоящего изобретения.[046] Nucleic acid molecules that differ from the presented nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code are also included in the scope of the present invention.
[047] В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты, и/или векторы, и/или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения.[047] In other embodiments, vectors comprising the nucleic acid of the present invention are also provided. In addition, the present invention provides expression cassettes comprising the nucleic acid of the present invention and regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a selected host cell. In addition, cells, stable cell lines, transgenic animals and transgenic plants including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention are also provided. In other embodiments, the functional fluorescent biosensors of the present invention are provided, which are encoded by the nucleic acids indicated above. In addition, a kit comprising nucleic acids and / or vectors and / or expression cassettes comprising said nucleic acids of the present invention is provided.
[048] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ[048] BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
[049] Рисунок 1 иллюстрирует структуру биосенсоров настоящего изобретения и принцип их работы. Изображены флуоресцентные белки - донор и акцептор для FRET, разделенные содержащим последовательность DEVD линкером. Разрезание линкера каспазой 3 сопровождается исчезновением FRET.[049] Figure 1 illustrates the structure of the biosensors of the present invention and the principle of their operation. The fluorescent proteins are shown — donor and acceptor for FRET, separated by a DEVD-containing linker linker.
[050] Рисунок 2А показывает спектр возбуждения флуоресценции mKate2-kasp-iRFP до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.[050] Figure 2A shows the fluorescence excitation spectrum of mKate2-kasp-iRFP before and after the addition of
[051] Рисунок 2Б показывает спектр возбуждения флуоресценции FP650-kasp-jrfp до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.[051] Figure 2B shows the FP650-kasp-jrfp fluorescence excitation spectrum before and after the addition of
[052] Рисунок 2В показывает спектр возбуждения флуоресценции NiRFP-kasp-iRFP до и после добавления каспазы 3 при эмиссии при 740 нм.[052] Figure 2B shows the fluorescence excitation spectrum of NiRFP-kasp-iRFP before and after the addition of
[053] Рисунок 3А показывает спектры эмиссии флуоресценции mKate2-kasp-iRFP при возбуждении при 550 нм до и после добавления каспазы 3.[053] Figure 3A shows mKate2-kasp-iRFP fluorescence emission spectra upon excitation at 550 nm before and after the addition of
[054] Рисунок 3Б показывает спектры эмиссии флуоресценции FP650-kasp-iRFP при возбуждении при 580 нм до и после добавления каспазы 3.[054] Figure 3B shows the FP650-kasp-iRFP fluorescence emission spectra upon excitation at 580 nm before and after the addition of
Рисунок 3В показывает спектры эмиссии флуоресценции NiRFP-kasp-iRFP при возбуждении при 590 нм до и после добавления каспазы 3.Figure 3B shows NiRFP-kasp-iRFP fluorescence emission spectra upon excitation at 590 nm before and after the addition of
[055] ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ[055] EMBODIMENTS OF THE INVENTION
[056] Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.[056] To more fully disclose the above characteristics of the present invention, a detailed description of the invention, summarized above, in the form of references to embodiments, some of which are illustrated by additional figures, is provided below. It should be noted that the accompanying figures illustrate only typical embodiments of the present invention and, therefore, should not be construed as limiting the scope of the invention, which may allow other equally effective embodiments.
[057] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют флуоресцентные биосенсоры для измерения активности каспазы 3, аналитический сигнал которых представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра.[057] As indicated above, the present invention is directed to nucleic acid molecules that encode fluorescence biosensors for measuring
[058] Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 или 7. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.[058] the Nucleic acids of the present invention obtained using recombinant technologies. In preferred embodiments, the nucleic acids of the present invention encode proteins having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 6, or 7. Also provided are vectors and expression cassettes comprising the nucleic acid of the present invention. In addition, provided are cells, stable cell lines, transgenic animals and transgenic plants, including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention.
[059] Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах, в частности для мониторинга изменений активности каспазы 3 внутри клеток.[059] These nucleic acids are used in many different applications and methods, in particular for monitoring changes in
[060] Определения[060] Definitions
[061] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.[061] Various terms related to the biological molecules of the present invention are used above and also in the description and in the claims.
[062] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок» означает белок, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.[062] As used here, the term "fluorescent protein" means a protein that has the ability to fluorescence; for example, it may exhibit low, medium, or intense fluorescence when irradiated with light at a suitable wavelength for excitation. The fluorescent property of a fluorescent protein is such a property that is the result of the work of the chromophore. As such, the fluorescent proteins of the present invention do not include proteins that exhibit fluorescence due to individual fluorescent residues such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine.
[063] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок на основе GFP» означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.[063] As used here, the term "fluorescent protein based on GFP" means a protein belonging to the family of GFP-like proteins, which has the ability to fluorescence; for example, it may exhibit low, medium, or intense fluorescence when irradiated with light at a suitable wavelength for excitation. The fluorescent property of a fluorescent protein is such a property, which is the result of the work of a chromophore formed by autocatalytic cyclization of three or more amino acid residues in a polypeptide chain. As such, the fluorescent proteins of the present invention do not include proteins that exhibit fluorescence due to individual fluorescent residues such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine.
[064] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра iRFP» или «iRFP» означает белок на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из фотосинтетической бактерии Rhodopseudomonas palustris с максимумами поглощения и эмиссии 690 и 713 нм, обладающий аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:4.[064] As used here, the term “near-infrared emission fluorescent protein iRFP” or “iRFP” means a bacterial phytochrome RpBphP2 protein from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris with absorption and emission maxima of 690 and 713 nm, having an amino acid sequence given in SEQ ID NO: 4.
[065] Как здесь используется, термин «каспаза» относится к белкам семейства внутриклеточных специфичных цистеиновых протеаз, вовлеченных в процесс апоптоза. Более предпочтительно, термин каспаза относится к эффекторным каспазам, более предпочтительно, к каспазе 3.[065] As used here, the term "caspase" refers to proteins of the family of intracellular specific cysteine proteases involved in apoptosis. More preferably, the term caspase refers to effector caspases, more preferably
[066] Как здесь используется, термин «avGFP» относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).[066] As used here, the term "avGFP" refers to a green fluorescent protein from Aequorea victoria jellyfish, including avGFP variants known in the art, designed to provide greater fluorescence or fluorescence intensity in other color areas. The wild-type avGFP sequence has been disclosed in Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).
[067] Как здесь используется, термин «Ферстеровский перенос энергии» (FRET) означает механизм переноса энергии между двумя хромофорами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. При этом эффективность FRET может быть различной.[067] As used here, the term "Förster energy transfer" (FRET) means the mechanism of energy transfer between two chromophores (from donor to acceptor), which occurs without intermediate emission of photons and is the result of a dipole-dipole interaction between the donor and the acceptor. The effectiveness of FRET may be different.
[068] Как здесь используется, термин «дальне-красный флуоресцентный белок» относится к белкам семейства GFP с максимумом эмиссии флуоресценции при длине волны более 630 нм, предпочтительно при длине волны более 650 нм, таким как белки Katushka, mKate2, eqFP650, NiRFP (eqFP670).[068] As used here, the term “far red fluorescent protein” refers to GFP family proteins with a maximum fluorescence emission at a wavelength of more than 630 nm, preferably at a wavelength of more than 650 nm, such as Katushka, mKate2, eqFP650, NiRFP ( eqFP670).
[069] Как здесь используется, термин «выделенный» или «изолированный» означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.[069] As used here, the term "isolated" or "isolated" means a molecule or cell that is in an environment other than the environment in which the molecule or cell is in vivo.
[070] Как здесь используется, термин «мутант» или «производное» относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены, и/или замещены, и/или удалены (делегированы), и/или вставлены (инвертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин «мутант» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант« здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.[070] As used here, the term "mutant" or "derivative" refers to a protein disclosed in the present invention, in which one or more amino acids are added, and / or substituted, and / or removed (delegated), and / or inserted ( inverted) to the N-terminus and / or C-terminus and / or within the native amino acid sequences of the proteins of the present invention. As used here, the term "mutant" refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein. In addition, the term "mutant" refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.
[071] Термин «гомология» используется здесь для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.[071] The term "homology" is used here to describe the relationship of nucleotide or amino acid sequences to other nucleotide or amino acid sequences, which is determined by the degree of identity and / or similarity between these compared sequences.
[072] Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу сходны» или «по существу такие же, как референсная последовательность», если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют, по крайней мере, 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.[072] As used here, the amino acid or nucleotide sequences are "substantially similar" or "substantially the same as the reference sequence" if the amino acid or nucleotide sequences have at least 85% identity with the specified sequence within the region selected for comparison . Thus, substantially similar sequences include those that have, for example, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, or at least 96%, 97%, 98 % or 99% identity. Two sequences that are identical to one another are also essentially similar.
[073] Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, p.403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbj.nlm.njh.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.[073] The percentage of sequence identity is determined based on a reference sequence. Algorithms for sequence analysis are known in the art, such as BLAST described in Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, p. 403-10 (1990). For the purposes of the present invention, nucleotide and amino acid sequence comparisons performed using the Blast software package provided by the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbj.nlm.njh.gov/blast) using alignment breaks with standard parameters may be used to determine the level of identity and similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences.
[074] Как здесь используется, термин «подобные белки» или «по существу сходные белки» относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков или 300 аминокислотных остатков.[074] As used here, the term "similar proteins" or "essentially similar proteins" refers to proteins that have amino acid sequences that are at least 85% identical, typically 90% or more identical, most often identical at least at least 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%). In this case, the length of homologous amino acid sequences of "similar proteins" can be at least 100 amino acid residues, more often at least 200 amino acid residues or 300 amino acid residues.
[075] В некоторых воплощениях, термин «подобные белки» или «по существу сходные белки» относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).[075] In some embodiments, the term “similar proteins” or “substantially similar proteins” refers to proteins that have the amino acid sequences of a whole protein that are at least 85% identical, typically 90% or more identical, most often identical at least 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%).
[076] Как здесь используется, термин «функциональный» означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин «функциональный», используемый для описания биосенсора настоящего изобретения, означает, что он меняет спектральные характеристики при наличии активности каспазы 3 в среде.[076] As used here, the term "functional" means that the nucleotide or amino acid sequence can function for the specified test or task. The term "functional", used to describe the biosensor of the present invention, means that it changes the spectral characteristics in the presence of
[077] Как здесь используется, термин «среда» по отношению к биосенсору означает любую среду, в которой этот биосенсор может функционировать. Для выделенного белка это может быть любой буферный раствор, в котором этот сенсор сохраняет функциональность. Для белка, экспрессированного в клетке, это цитоплазма или клеточный компартмент, в котором биосенсор локализован.[077] As used here, the term "environment" in relation to a biosensor means any environment in which this biosensor can function. For an isolated protein, this can be any buffer solution in which this sensor retains functionality. For a protein expressed in a cell, it is the cytoplasm or cell compartment in which the biosensor is localized.
[078] Как здесь используется, «биохимические свойства» относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, скорости восстановления после реакции с тестируемой субстанцией, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности и другим подобным свойствам.[078] As used here, “biochemical properties” refer to protein folding (folding) and maturation rate, recovery rate after reaction with a test substance, half-life, aggregation ability, oligomerization ability, pH and temperature stability, and other similar properties.
[079] Как здесь используется, «флуоресцентные свойства» или «спектральные свойства» относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресценции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например интенсивность флуоресценции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.[079] As used herein, “fluorescence properties” or “spectral properties” refer to the molar extinction coefficient at a suitable wavelength, the quantum yield of fluorescence, the shape of the fluorescence excitation spectrum or emission spectrum, the wavelength corresponding to the maximum fluorescence excitation, and wavelength corresponding to the maximum emission, the ratio of the amplitude of the excitation of fluorescence at two different wavelengths, the ratio of the amplitude of the emission at two different wavelengths, the lifetime of the excited state and anisotropy of optical properties. The measured difference can be defined as the amount of any quantitative fluorescence property, for example, the fluorescence intensity at a specific wavelength, or the integral fluorescence over the entire emission spectrum.
[080] Как здесь используется, «агрегация» относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). «Агрегация» должна быть отличаема от «олигомеризации». В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации.[080] As used here, "aggregation" refers to the tendency or ability of an expressed protein to form an insoluble precipitate (aggregates). “Aggregation” should be distinguishable from “oligomerization”. In particular, mutants with reduced ability to aggregate, for example with increased solubility, do not necessarily have a reduced ability to oligomerization.
[081] Как здесь используется, «олигомеризация» относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на «способность» белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, триммеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях. Флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, рН, нежели рН при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации, могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация, или иным способом, известным в данной области.[081] As used here, "oligomerization" refers to the tendency or ability of an expressed protein to form complexes (oligomers) as a result of the specific interaction of two or more polypeptides. The specified specific interaction is observed under special conditions, for example, under physiological conditions, and is relatively stable under these conditions. A reference to the “ability” of proteins to oligomerize means that proteins can form dimers, trimmers, tetramers, or similar complexes under special conditions. As a rule, fluorescent proteins are capable of oligomerization under physiological conditions. Fluorescent proteins can also oligomerize under conditions other than, for example, pH than pH under physiological conditions. The conditions under which fluorescent proteins form oligomers or show a tendency to oligomerization can be determined using well-known methods, such as gel filtration, or by any other method known in the art.
[082] Ссылка на нуклеотидную последовательность, «кодирующую» полипептид, означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.[082] Reference to a nucleotide sequence encoding a polypeptide means that the polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of mRNA. In this case, both a coding strand identical to mRNA and usually used in the list of sequences can be indicated, as well as a complementary strand that is used as a template for transcription. As is obvious to any person skilled in the art, the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding a polypeptide include sequences containing introns.
[083] Термин «оперативно связанный», «оперативно встроенный» или ему подобные при описании структуры биосенсора или химерных белков на его основе относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях основные функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, дальне-красный флуоресцентный белок и белкок iRFP, входящие в состав биосенсора настоящего изобретения, сохраняют способность к флуоресценции. В случае, когда биосенсор настоящего изобретения сшит с представляющим интерес сигналом внутриклеточной локализации, химерный белок сохраняет способность реагировать на изменение активности каспазы 3, но локализуется в определенном клеточном компартменте. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий «оперативно связанные» компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют «сбойки» рамки считывания и стоп-кодоны.[083] The term “operatively linked”, “operatively integrated” or the like when describing the structure of a biosensor or chimeric proteins based on it refers to polypeptide sequences that are in physical and functional connection with each other. In the most preferred embodiments, the basic functions of the polypeptide components of the chimeric molecule are not changed compared to the functional properties of the isolated polypeptide components. For example, the far-red fluorescent protein and the iRFP protein that are part of the biosensor of the present invention retain the ability to fluorescence. In the case where the biosensor of the present invention is crosslinked with an intracellular localization signal of interest, the chimeric protein retains the ability to respond to changes in
[084] Как здесь используется, термин «активность каспазы 3» относится к способности белка фермента каспазы 3 специфично катализировать реакцию расщепления своих природных или искусственных субстратов.[084] As used here, the term "
[085] Как здесь используется, термин «сигнал биосенсора» означает детектируемое изменение спектральной характеристики биосенсора в ответ на активность каспазы 3 в среде.[085] As used here, the term "biosensor signal" means a detectable change in the spectral characteristics of the biosensor in response to the activity of
[086] МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ[086] NUCLEIC ACID MOLECULES
[087] Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для регистрации активности каспазы 3, аналитический сигнал которых представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра.[087] The present invention provides nucleic acid molecules encoding a fluorescence biosensor for detecting
[088] Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующей области.[088] As used here, a nucleic acid molecule is a DNA molecule, such as a genomic DNA or cDNA molecule, or an RNA molecule, such as an mRNA molecule. As used here, the term "cDNA" refers to nucleic acids that possess the arrangement of sequence elements found in native mature types of mRNA, where sequence elements are exons and the 5 'and 3' non-coding regions.
[089] Структура биосенсора схематически изображена на Рисунке 1. Биосенсор представляет собой химерный белок, состоящий из дальне-красного флуоресцентного белка семейства GFP (SEQ ID NO:1. 2 или 3), к которому через подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, оперативно присоединен флуоресцентный белок IRFP с эмиссией в близкой к инфракрасной области спектра (SEQ ID NO:4). В некоторых воплощениях, как показано на Рисунке 1, подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, включает последовательность DEVD. В некоторых воплощениях подвижный линкер, содержащий сайт расщепления каспазой 3, имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:5, 6 или 7 (mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-JRFP или NiRFP-kasp-iRFP). В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор настоящего изобретения, имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9, 10 или 11.[089] The biosensor structure is shown schematically in Figure 1. The biosensor is a chimeric protein consisting of a far-red fluorescent protein of the GFP family (SEQ ID NO: 1. 2 or 3), to which, through a movable linker containing a
[090] Методы получения таких химерных белков хорошо известны профессионалам в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы (например, аминокислотные последовательности дальне-красных флуоресцентных белков, линкерные последовательности, белок iRFP), могут быть встроены в определенном порядке в полилинкер вектора, таким образом, что между различными частями не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов.[090] Methods for producing such chimeric proteins are well known to those skilled in the art. For example, parts of a nucleic acid encoding various elements (for example, amino acid sequences of far-red fluorescent proteins, linker sequences, iRFP protein) can be inserted in a specific order in the polylinker of the vector, so that there are no stop codons between different parts in reading frame and there will be no malfunctioning of the reading frame. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be assembled from the fragments using DNA ligase or PCR with primers containing parts complementary to the terminal sequences of the fragments to be joined.
[091] Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов. Этот метод основан на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор, может быть выделена любым из многих известных методов.[091] A nucleic acid molecule encoding a fluorescent biosensor can be synthesized from suitable nucleoside triphosphates. This method is based on protocols well known in the art. For example, the availability of amino acid sequence information or nucleotide sequence information enables the production of isolated nucleic acid molecules of the present invention using oligonucleotide synthesis. In the case of amino acid sequence information, several nucleic acids can be synthesized that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art. Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art, such as high performance liquid chromatography (HPLC), or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and as described in, for example, United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. The long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized in the following stages: several smaller fragments with the necessary complementarity, which contain suitable ends capable of cohesion with the adjacent fragment. Neighboring fragments can be crosslinked using a DNA ligase or PCR based method. A nucleic acid encoding a biosensor can be isolated by any of many known methods.
[092] Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. [092] In addition, degenerate nucleic acid variants that encode the biosensor of the present invention are also provided. Degenerate nucleic acid variants include substitutions of nucleic acid codons with other codons encoding the same amino acids. In particular, degenerate nucleic acid variants are created to increase expression in the host cell. In this embodiment, nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the genes of the host cell are replaced by codons that are abundantly represented in the coding sequences of the genes in the host cell, where said replaced codons encode the same amino acid.
[093] Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин «гуманизированный« относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой.[093] Of particular interest are humanized versions of the nucleic acids of the present invention. As used herein, the term “humanized” refers to substitutions made in a nucleic acid sequence to optimize codons for protein expression in mammalian (human) cells (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). See also US Patent No. 5,795,737, which describes the humanization of proteins, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
[094] В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует биосенсор настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии белка в клетке-хозяине. Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которых они находятся в естественных условиях.[094] In some embodiments, the nucleic acid molecule of the present invention is a DNA (or cDNA) molecule containing an open reading frame that encodes a biosensor of the present invention and is capable of being used under suitable conditions (eg, physiological intracellular conditions) for expression of a protein in a cell - the owner. The present invention also encompasses nucleic acids that are homologous, substantially similar, identical, or derived from nucleic acids encoding the proteins of the present invention. These nucleic acids are in an environment different from the environment in which they are found in vivo, for example, they are isolated, present in an increased amount, are or are expressed in vitro systems or in cells or organisms other than those in which they are found. in vivo.
[095] Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и обычно являются «рекомбинантными«, то есть фланкированы одним или более нуклеотидов, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.[095] The claimed nucleic acids can be isolated and obtained essentially in purified form. Essentially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, usually at least about 90% pure and usually are “recombinant”, that is, flanked by one or more nucleotides to which it is not normally associated with a chromosome found naturally in its natural host organism.
[096] Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы «мутантами« или «производными» исходной последовательности.[096] Changes or differences in the nucleotide sequence between highly similar nucleotide sequences can represent nucleotide substitutions in the sequence that occur during normal replication or duplication. Other substitutions can be specifically calculated and inserted into the sequence for specific purposes, such as changing the codons of certain amino acids or the nucleotide sequence of a regulatory region. Such special substitutions can be made in vitro using various mutagenesis technologies or obtained in host organisms under specific breeding conditions that induce or select these changes. Such specially prepared sequence variants may be called “mutants” or “derivatives” of the original sequence.
[097] Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, p.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генное реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственную перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.[097] Mutant or derivative nucleic acids can be obtained on a matrix nucleic acid selected from the above nucleic acids, by modifying, deleting or adding one or more nucleotides in the matrix sequence or a combination thereof, to obtain a variant of the matrix nucleic acid. Modifications, additions or deletions can be performed by any method known in the art (see, for example, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, p.15.3-15.108), including error prone PCR ), shuffling, oligonucleotide-directed mutagenesis, assembly PCR, pairwise PCR mutagenesis, in vivo mutagenesis, cassette mutagenesis, recursive multiple mutagenesis, exponential multiple mutagenesis, site-specific mutagenesis, random mutagenesis, gene re ssemblirovanie (gene reassembly), gene site saturation mutagenesis (GSSM), synthetic ligation rearrangement (SLR) or a combination thereof. Modifications, additions or deletions can also be carried out by a method including recombination, recursive recombination of sequences, phosphothioate-modified DNA mutagenesis, mutation on a uracil-containing matrix, double-pass mutagenesis, point-mutation reductive mutagenesis, strain mutagenesis, recovery-deficient mutagenesis, radioactive mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction-selective mutagenesis, restriction mutagenesis with purification, synthesis of artificial enes, multiple mutagenesis, creation of multiple chimeric nucleic acids, and combinations thereof.
[098] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные белки, состоящие из биосенсора настоящего изобретения и сигнала определенной внутриклеточной локализации. Такие химерные белки могут быть получены путем оперативного соединения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей биосенсор, и нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации. Методы получения таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области.[098] Also provided are nucleic acids encoding chimeric proteins consisting of a biosensor of the present invention and a signal of a specific intracellular localization. Such chimeric proteins can be obtained by operatively combining a nucleic acid of the present invention encoding a biosensor and a nucleic acid encoding an intracellular localization signal. Methods for producing such nucleic acids are well known to those skilled in the art.
[099] Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и известно много таких доступны коммерчески векторов. Для приготовления конструкции полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно встраивается в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляют лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.[099] A vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids are also provided. Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, etc. the nucleic acid sequences of the present invention in a suitable host. The selection of a suitable vector is readily apparent to those skilled in the art, and many such commercially available vectors are known. To prepare the construct, a full-length nucleic acid or part thereof is usually inserted into the vector by attaching a DNA ligase to a restriction enzyme cleaved site in a vector. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be inserted by in vivo homologous recombination, usually by attaching homologous regions to a vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Homologous regions are added by ligation of oligonucleotides or by polymerase chain reaction using primers including, for example, both homologous regions and part of the desired nucleotide sequence.
[0100] Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные для получения заявленных биосенсоров или химерных белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку.[0100] Also provided are expression cassettes or systems used to produce the claimed biosensors or chimeric proteins based thereon or to replicate the claimed nucleic acid molecules. The expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the genome of a cell as a result of introducing said expression cassette into the cell.
[0101] В кассете экспрессии указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы и обеспечивает инициацию считывания РНК (транскрипции) в клетке-хозяине. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть также связана с сигналами терминации транскрипции, функциональным в клетке-хозяине. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области.[0101] In the expression cassette, the specified nucleic acid is functionally linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inducers and provides the initiation of RNA reading (transcription) in the host cell. In the expression cassette, the nucleic acid of the present invention may also be associated with transcription termination signals that are functional in the host cell. Methods for making expression cassettes or systems for expressing a desired product are known to those skilled in the art.
[0102] Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).[0102] The above expression systems can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (e.g., co-transfection with a selectable marker, such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain gene included in the genome).
[0103] Белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, может быть получен путем экспрессии в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые системы, клетки насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. Например, для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis. S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.[0103] The protein product encoded by the nucleic acid of the invention can be obtained by expression in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast systems, insect cells, amphibians, or mammalian cells. For example, host cells such as E. coli, B. subtilis can be used to produce protein. S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of a higher organism such as vertebrates, for example,
[0104] Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.[0104] If any of the aforementioned host cells or other suitable host cells or organisms are used to replicate and / or express the nucleic acids of the invention, the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as a product of the host cell or organism . The product can be isolated by a suitable method known in the art.
[0105] Белки[0105] Squirrels
[0106] Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации активности каспазы 3, аналитический сигнал которого представляет собой флуоресценцию в дальне-красной области спектра. Специфические биосенсоры, представляющие интерес, включают биосенсоры, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, свойства которых подробно описаны в экспериментальной части ниже.[0106] The nucleic acid of the present invention encodes a fluorescence biosensor for detecting
[0107] Заявленный биосенсор обладает способностью к детектируемой флуоресценции, которая может быть зарегистрирована с помощью визуального скрининга, спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции. Заявленные биосенсоры при возбуждении дальне-красного флуоресцентного белка светом с длиной волны в диапазоне 550-620 нм имеют максимум (пик) эмиссии флуоресценции в диапазоне от 630 нм до 680 нм, например, 635 нм, 650 нм или 670 нм, и пик эмиссии флуоресценции, соответствующий белку iRFP, обусловленный FRET, при 700-750 нм. Заявленные биосенсоры при возбуждении белка iRFP светом с длиной волны в диапазоне 670-690 нм имеют максимум (пик) эмиссии флуоресценции в диапазоне 700-750 нм. В преимущественных воплощениях первый пик флуоресценции и второй пик флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 550-620 нм и 670-690 нм могут быть измерены с помощью спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции.[0107] The claimed biosensor has detectable fluorescence ability, which can be detected by visual screening, spectrophotometry, spectrofluorimetry, fluorescence microscopy, using FACS or another conventional method for detecting fluorescence. The claimed biosensors upon excitation of a far-red fluorescent protein with light with a wavelength in the range of 550-620 nm have a maximum (peak) of fluorescence emission in the range from 630 nm to 680 nm, for example, 635 nm, 650 nm or 670 nm, and a peak of fluorescence emission corresponding to the iRFP protein due to FRET at 700-750 nm. The claimed biosensors upon excitation of the iRFP protein with light with a wavelength in the range of 670-690 nm have a maximum (peak) of fluorescence emission in the range of 700-750 nm. In preferred embodiments, the first fluorescence peak and the second fluorescence peak when excited with light with a wavelength of 550-620 nm and 670-690 nm can be measured using spectrophotometry, spectrofluorimetry, fluorescence microscopy, using FACS or other conventional method for recording fluorescence.
[0108] Заявленный биосенсор меняет интенсивность флуоресценции в диапазоне от 630 нм до 680 нм и в диапазоне от 700 нм до 750 нм при возбуждении светом с длиной волны 550-620 нм, при этом интенсивность флуоресценции в диапазоне от 700 нм до 750 нм при возбуждении светом с длиной волны 670-690 остается неизменной. Для нужд настоящего изобретения сигналом биосенсора является отношение интенсивности флуоресценции в диапазоне от 630 нм до 680 нм и в диапазоне от 700 нм до 750 нм при возбуждении светом с длиной волны 550-620 к интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 670-690 нм. Этот параметр не зависит от концентрации биосенсора в среде.[0108] The claimed biosensor varies the fluorescence intensity in the range from 630 nm to 680 nm and in the range from 700 nm to 750 nm when excited with light with a wavelength of 550-620 nm, while the fluorescence intensity in the range from 700 nm to 750 nm when excited light with a wavelength of 670-690 remains unchanged. For the needs of the present invention, the biosensor signal is the ratio of the fluorescence intensity in the range from 630 nm to 680 nm and in the range from 700 nm to 750 nm when excited by light with a wavelength of 550-620 to the fluorescence intensity when excited with light with a wavelength of 670-690 nm. This parameter is independent of the biosensor concentration in the medium.
[0109] В преимущественных воплощениях при наличии активности каспазы 3 в среде интенсивность флуоресценции заявленного биосенсора в диапазоне от 630 нм до 680 нм при возбуждении светом с длиной волны 550-620 нм увеличивается из-за исчезновения переноса энергии на акцептор FRET белок iRFP, a интенсивность флуоресценции заявленного биосенсора в диапазоне от 700 нм до 750 нм при возбуждении светом с длиной волны 550-620 нм уменьшается. Таким образом при наличии активности каспазы 3 в среде происходит изменение аналитического сигнала биосенсора в дальне-красной области спектра.[0109] In preferred embodiments, when
[110] Регистрация сигнала биосенсора может быть осуществлена с помощью спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции.[110] The registration of the biosensor signal can be carried out using spectrophotometry, spectrofluorimetry, fluorescence microscopy, using FACS or other generally accepted method for recording fluorescence.
[0111] Заявленный биосенсор способен регистрировать наличие активности каспазы 3 в среде, например, внутри клеток. Определение наличия активности каспазы 3 внутри клеток позволит судить о вступлении клеток в апоптоз.[0111] The claimed biosensor is capable of detecting the presence of
[0112] Способность биосенсора регистрировать активность каспазы 3 может быть определена с использованием выделенного рекомбинантного белка биосенсора, полученного методами генетической инженерии, как описано в Примерах 1 и 2, при добавлении к нему препарата очищенной активной каспазы 3, как описано в Примере 3. В данной системе каспаза 3 ферментативно гидролизует содержащий сайт DEVD линкер, что приводит к изменению флуоресценции биосенсора по сравнению с флуоресценцией образца до реакции.[0112] The ability of a biosensor to detect
[0113] Заявленный биосенсор обладает относительно небольшими размерами и состоит из 600-700 аминокислот, обычно длина биосенсора 600-650 аминокислот, например, 612 аминокислот (включая первый метионин).[0113] The claimed biosensor is relatively small and consists of 600-700 amino acids, typically a biosensor length of 600-650 amino acids, for example, 612 amino acids (including the first methionine).
[0114] Также обеспечиваются функциональные биосенсоры, которые по существу сходны с указанными выше биосенсорами, где по существу сходны означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NOs:5, 6, или 7, по крайней мере, на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, 90% и чаще, по крайней мере, 95% (например, 95% и выше; 96% и выше, 97% и выше; 98% и выше: 99% и выше или 100% идентичности последовательности).[0114] Functional biosensors are also provided that are substantially similar to the above biosensors, where substantially similar means that these proteins have an amino acid sequence identical to the sequence of SEQ ID NOs: 5, 6, or 7, at least 85% identities, usually at least 90% and more often, at least 95% (e.g. 95% or more; 96% or more, 97% or more; 98% or more: 99% or more or 100% identity sequence).
[0115] Мутанты могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе «молекулы нуклеиновых кислот« выше. Примеры обеспечивают общие приемы, и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить большой ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например, биохимическое, спектральное и т.д.) свойство. Например, интенсивность флуоресценции может быть измерена с использованием спектрофлуориметра при различных длинах волн возбуждения.[0115] Mutants can be obtained using standard methods of molecular biology, as described in detail in the section "nucleic acid molecules" above. The examples provide general techniques and the use of standard methods, so that those skilled in the art can easily obtain a large number of additional mutants and check whether the biological (e.g., biochemical, spectral, etc.) property has been changed. For example, fluorescence intensity can be measured using a spectrofluorimeter at various excitation wavelengths.
[0116] Биосенсоры настоящего изобретения присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они рекомбинантны. Белки настоящего изобретения могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин "по существу свободны" в этом случае означает, что меньше чем 70%, обычно меньше чем 60% и чаще меньше чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой некоторые другие биологические молекулы, чем встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях белки присутствуют в по существу очищенной форме, где «по существу очищенная форма« означает очищенная по меньшей мере на 95%, обычно по меньшей мере на 97% и чаще по меньшей мере на 99%.[0116] The biosensors of the present invention are present in an environment different from their natural environment; for example, they are recombinant. The proteins of the present invention can be in an isolated state, which means that the proteins are substantially free of other proteins and other biological molecules present in the natural environment, such as oligosaccharides, nucleic acids and fragments thereof and the like, where the term "essentially free "in this case means that less than 70%, usually less than 60% and more often less than 50% of the composition containing the isolated protein, are some other biological molecules than those found in nature. In some embodiments, the proteins are present in a substantially purified form, where “substantially purified form” means purified at least 95%, usually at least 97%, and more often at least 99%.
[0117] Заявленные биосенсоры могут быть получены искусственным путем, например экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано выше. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п.[0117] The claimed biosensors can be obtained artificially, for example by expression of a recombinant nucleic acid encoding a sequence of a protein of interest in an appropriate host, as described above. For protein purification, any conventional methodology may be employed where suitable protein purification methods are described in Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). For example, a lysate can be prepared from a source and purified using HPLC, size exclusion chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, and the like.
[0118] Также обеспечиваются белки слияния, включающие биосенсор настоящего изобретения, слитые с последовательностью внутриклеточной локализации (например, с сигналом локализации в ядре, в пероксисомах, аппарате Гольджи, митохондрии и т.д.). Полипептид, обеспечивающий определенную внутриклеточную локализацию, может быть оперативно присоединен к N-концу и/или С-концу биосенсора. Сигналы внутриклеточной локализации хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, Nakai K. (Advances in Protein Chemistry, Vol.54, 2000, p.277-344).[0118] Also provided are fusion proteins comprising the biosensor of the present invention fused to an intracellular localization sequence (for example, a localization signal in the nucleus, peroxisomes, Golgi apparatus, mitochondria, etc.). A polypeptide providing a certain intracellular localization can be operatively attached to the N-terminus and / or C-terminus of the biosensor. Signals of intracellular localization are well known to specialists in this field and are described, for example, by Nakai K. (Advances in Protein Chemistry, Vol. 54, 2000, p. 277-344).
ТрансформантыTransformants
[0119] Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения используют для получения трансформантов, включая трансгенных организмов или сайт-специфичных генных изменений в клеточных линиях. Трансгенные клетки, заявленные в изобретении, содержат одну или более нуклеиновых кислот, заявленных по настоящему изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli. Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактирии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека, такими способами как технологии трансгеноза, которые известны в данной области.[0119] The nucleic acids of the present invention are used to obtain transformants, including transgenic organisms or site-specific gene changes in cell lines. The transgenic cells of the invention comprise one or more nucleic acids of the invention as a transgene. For the purposes of the invention, any suitable host cell can be used, including prokaryotic (e.g., Escherichia coli. Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, etc.) or eukaryotic host cells. A transgenic organism of the invention may be a prokaryotic or eukaryotic organism, including bacteria, cyanobacteria, fungi, plants, and animals in which one or more cells of the body contain a heterogeneous nucleic acid of the invention, introduced by human intervention, by methods such as technologies transgenosis, which are known in the art.
[0120] Выделенная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть, ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечивается в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).[0120] The isolated nucleic acid of the present invention can be introduced into the host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or trans-conjugation. Methods for transferring a nucleic acid molecule (i.e., DNA) into such organisms are widely known and provided in references such as Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
[0121] В одном воплощении трансгенный организм может быть прокариотическим организмом. Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).[0121] In one embodiment, the transgenic organism may be a prokaryotic organism. Methods for transforming prokaryotic hosts are well described in the art (e.g., see Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).
[0122] В другом воплощении трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжи. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например см. Goodey et al Yeast biotechnology, D R Berry et al, eds, (1987) Alien and Unwin, London, p.401-429) и King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G Т Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989), p.107-133). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторы.[0122] In another embodiment, the transgenic organisms may be fungi, for example, yeast. Yeast is widely used as a carrier for the expression of a heterogeneous gene (e.g. see Goodey et al Yeast biotechnology, DR Berry et al, eds, (1987) Alien and Unwin, London, p.401-429) and King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, EF Walton and GT Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989), p.107-133). Several types of yeast vectors are available, including integrative vectors that require recombination with the host genome to support them, and autonomously replicating plasmid vectors.
[0123] В другом воплощении трансгенными организмами могут быть животные. Трансгенные животные могут быть получены трансгенными способами, известными в данной области, и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew P.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2 nd edition (2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC, и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в прекурсор клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, a предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому или они являться внехромосомными реплицирующими ДНК. Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать, по меньшей мере, часть нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, где ген имеет желательную генетическую модификацию(ции) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекции. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих, см. Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537.[0123] In another embodiment, the transgenic organisms may be animals. Transgenic animals can be obtained by transgenic methods known in the art and are provided in references such as Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew P.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2 nd edition (2000). For example, transgenic animals can be obtained by homologous recombination, where the endogenous locus changes. Alternatively, the nucleic acid construct is randomly incorporated into the genome. Vectors for sustainable incorporation include plasmids, retroviruses and other animal viruses, YAC, and the like. Nucleic acids can be introduced into a cell directly or indirectly, by introducing into a cell precursor, by intentional genetic manipulation, such as microinjection or infection with a recombinant virus or recombinant viral vector and the like. The term “genetic manipulation” does not include classical cross-fertilization or in vitro fertilization, but is preferably directed to the introduction of recombinant nucleic acid molecules. These nucleic acid molecules can be included in the chromosome or they can be extrachromosomal replicating DNA. DNA constructs for homologous recombination will contain at least a portion of the nucleic acid of the present invention, where the gene has the desired genetic modification (s) and includes homology regions with a target locus. DNA constructs for arbitrary incorporation do not necessarily contain a region of homology with a recombination mediator. Markers for positive and negative selection can easily be included. Methods for producing cells having targeted gene modifications through a homologous combination are known in the art. For various methods for transfecting mammalian cells, see Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 527-537.
[0124] Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку, (например мышь, крыса), птица или амфибия и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п.[0124] Transgenic animals can be any non-human animals, including a non-human mammal (eg, mouse, rat), bird or amphibian, etc., and are used in functional research, drug screening, and so on. .P.
[0125] Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах США №5767367; 5750870; 5739409; 5689049; 5689045; 5674731; 5656466; 5633155; 5629470; 5595896; 5576198; 5538879; 5484956; раскрытия которых включены сюда ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) p.275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 p. Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов возникает возможность для введения через ДНК-опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбираются, выращиваются в каллус, и в конечном счете в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами и отношениями стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины. Могут использоваться другие подходящие способы получения растения, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области, такие как применение «генной пушки«, или Agrobacterium-опосредованная трансформация.[0125] Transgenic plants can also be obtained. Methods for producing transgenic plant cells and plants are described in US patent No. 5767367; 5,750,870; 5,739,409; 5,689,049; 5,689,045; 5,674,731; 5656466; 5,633,155; 5,629,470; 5,595,896; 5,576,198; 5,538,879; 5,484,956; disclosures of which are incorporated herein by reference. Methods for producing transgenic plants are also discussed in Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) p. 275-295 and Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), ( 2002) 719 p. For example, embryogenic explants containing somatic cells can be used to produce a transgenic host. After collecting cells or tissues, exogenous DNA of interest is introduced into the plant cells, and a number of different methods are known for this introduction. In the presence of isolated protoplasts, it becomes possible to introduce through DNA-mediated gene transfer protocols, including incubating protoplasts with purified DNA, such as a plasmid containing the desired exogenous sequence of interest in the presence of polyvalent cations (eg, PEG or PLO); or electroporation of protoplasts in the presence of isolated DNA, including the target exogenous sequence. Protoplasts that successfully incorporate exogenous DNA are then selected, grown in callus, and ultimately in a transgenic plant in contact with suitable amounts and ratios of stimulatory factors such as auxins and cytokines. Other suitable plant production methods that are available to those skilled in the art can be used, such as using a “gene gun” or Agrobacterium-mediated transformation.
Способы примененияApplication methods
[0126] Биосенсоры настоящего изобретения являются генетически кодируемыми флуоресцентными белками, меняющими спектральные свойства в присутствии активной каспазы 3 в среде. Они могут быть использованы для регистрации изменения активности каспазы 3 внутри клеток, например, при вступлении клеток в апоптоз, например, под действием химиотерапевтического агента.[0126] The biosensors of the present invention are genetically encoded fluorescent proteins that change spectral properties in the presence of
[0127] Для осуществления настоящего применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор. Получение таких конструкций очевидно для любого специалиста в данной области. Полученная конструкция должна быть встроена в кассету экспрессии (или вектор), обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Вектор или кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток вектором и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлена регистрация изменения активности каспазы 3 внутри клеток.[0127] For the implementation of the present application, a nucleic acid encoding a biosensor must be obtained. Obtaining such designs is obvious to any person skilled in the art. The resulting construct must be integrated into the expression cassette (or vector), providing temporary or permanent expression of this nucleic acid in the host cells. The expression vector or cassette may contain elements that provide targeted delivery of the construct to cells of interest, or is part of particles that provide targeted delivery. After transfection of the cells with the vector and after the time required for the expression product to develop in the cells, the change in
[0128] Биосенсоры настоящего изобретения могут быть сшиты с сигналами различной внутриклеточной локализации для направления биосенсоров в определенные клеточные компартменты и регистрации активности каспазы 3 в этих клеточных компартментах.[0128] The biosensors of the present invention can be stitched with signals of different intracellular localization to direct biosensors to specific cell compartments and register
[0129] Следующие примеры приведены в иллюстративных целях и не должны ограничивать объем изобретения.[0129] The following examples are provided for illustrative purposes and should not limit the scope of the invention.
[0130][0130]
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Получение вариантов биосенсора.Example 1. Obtaining variants of the biosensor.
[0131] Нуклеиновую кислоту, кодирующую белок IRFP, получали путем ПЦР с плазмиды iRFP-pBAD, любезно предоставленной д.б.н Верхушей В.В., с помощью ген-специфических праймеров и клонировали в pQE-30 (Qiagen, Германия) по стандартной технологии.[0131] Nucleic acid encoding an IRFP protein was obtained by PCR from the iRFP-pBAD plasmid, kindly provided by Dr. B. Verkhushey, using gene-specific primers and cloned into pQE-30 (Qiagen, Germany) by standard technology.
[0132] Нуклеиновые кислоты, кодирующие флуоресцентные белки mKate2, FP650 и NiRFP, амплифицировали методом ПЦР с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве матрицы плазмиды mKate2-N, FP650-N, NiRFP-N (Евроген, Россия). С помощью праймеров в процессе реакции ПЦР на 3' концах клонируемых молекул нуклеиновых кислот добавляли последовательности, кодирующие линкер, содержащий узнаваемую каспазой 3 последовательность DEVD. Полученные фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие красные флуоресцентные белки, клонировали в рамку считывания в плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок IRFP.[0132] Nucleic acids encoding the fluorescent proteins mKate2, FP650 and NiRFP were amplified by PCR using gene-specific primers using mKate2-N, FP650-N, NiRFP-N plasmids as a template (Eurogen, Russia). Using primers during the PCR reaction at the 3 'ends of the cloned nucleic acid molecules, sequences coding for a linker containing the
[0133] Для этого соответствующие фрагменты ДНК mKate2, FP650 и NiRPP амплифицировали с ген-специфических праймеров, где обратные праймеры дополнительно содержали последовательность, кодирующую расщепляемый каспазой 3 линкер, и очищали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Последовательность линкера соответствовала последовательности расщепляемого каспазой 3 линкера из плазмиды Casper3-BG (Евроген, Россия). Амплификацию проводили на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reserch, Германия). Каждая реакционная проба так же содержала праймеры (0,5 мкМ), эквимолярную смесь dNTP (0,5 мкМ), матричную ДНК (10-100 нг), Tersus полимеразу (Евроген). Для доведения смеси до нужного объема использовали стерильную деионизованную воду. Использовали следующий режим амплификации: денатурация 95°С -12 сек; отжиг 65°С - 4 мин; элонгация 72°С - 1 мин, 10 циклов ПЦР. Конструкцию клонировали в pQE-30 (Qiagen) по стандартной технологии и использовали для трансформации клеток E.coli.[0133] For this, the corresponding mKate2, FP650 and NiRPP DNA fragments were amplified from gene-specific primers, where the reverse primers additionally contained a sequence encoding a caspase-
[0134] Таким образом были созданы конструкции mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP, где kasp - линкер, содержащий узнаваемую каспазой 3 последовательность (Рис.1).[0134] Thus, the constructions mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP were created, where kasp is a linker containing a sequence recognized by caspase 3 (Fig. 1).
Пример 2. Экспрессия вариантов биосенсора и выделение белков биосенсоров по изобретению.Example 2. Expression of biosensor variants and isolation of biosensor proteins of the invention.
[0135] Для бактериальной экспрессии был использован штамм E.coli BW25113, коэкспрессирующий одну из экспрессионных плазмид mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP, полученных, как описано выше, кодирующих биосенсор по изобретению, и плазмиду, кодирующую гем-оксигеназу (pwa23-HO [Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM. Zhang J, Kirn K, Verkhusha W. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011 Jul 17;29(8):757-61]).[0135] For bacterial expression, E. coli strain BW25113 was used, co-expressing one of the expression plasmids mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP, obtained as described above, encoding the biosensor of the invention, and plasmid encoding heme oxygenase (pwa23-HO [Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM. Zhang J, Kirn K, Verkhusha W. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011 Jul 17; 29 ( 8): 757-61]).
[0136] Трансформированные согласно стандартному протоколу бактерии E.coli BW25113 высевали на чашки Петри, содержащие питательную среду LB-агар с арабинозой (150 мг/мл), рамнозой (0,0024% по массе), канамицином (0,1 мг/мл), ампициллином (0,5 мг/мл) и предшественником гема - δ-аминолевулиновой кислотой (0,2 мМ).[0136] E. coli BW25113 bacteria transformed according to the standard protocol were seeded onto Petri dishes containing LB agar medium with arabinose (150 mg / ml), ramnose (0.0024% by weight), kanamycin (0.1 mg / ml ), ampicillin (0.5 mg / ml) and the heme precursor, δ-aminolevulinic acid (0.2 mM).
[0137] Чашки с трансформантами инкубировали при 37°С в течение 24 ч.[0137] Cups with transformants were incubated at 37 ° C for 24 hours
[0138] Белок выделяли из биомассы бактерий, собранных с 5 чашек Петри с помощью TALON (Clontech. США), по стандартному протоколу производителя с элюцией в PBS-имидазоле (0.25М).[0138] The protein was isolated from the biomass of bacteria collected from 5 Petri dishes using TALON (Clontech. USA), according to the manufacturer's standard protocol with elution in PBS-imidazole (0.25M).
Пример 3. Изменение спектральных характеристик биосенсоров mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP под действие выделенной каспазы 3 in vitro.Example 3. The change in the spectral characteristics of the biosensors mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP, NiRFP-kasp-iRFP under the action of
[0139] Биосенсоры mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP и NiRFP-kasp-iFP, нуклеиновые кислоты которых были получены, как описано в Примере 1, были выделены из бактерий, как описано в Примере 2, и использованы для тестирования их чувствительности к каспазе 3. [0139] The biosensors mKate2-kasp-iRFP, FP650-kasp-iRFP and NiRFP-kasp-iFP, the nucleic acids of which were obtained as described in Example 1, were isolated from bacteria, as described in Example 2, and used to test them sensitivity to
[0140] Для этого в спектрофотометрическую кювету внесли выделенный белок в PBS-имидазоле. Количество белка в различных пробах отличалось, поскольку сигнал сенсора не должен зависеть от его концентрации. Далее сняли спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции:[0140] For this, the isolated protein in PBS imidazole was added to the spectrophotometric cell. The amount of protein in different samples was different, because the sensor signal should not depend on its concentration. Next, excitation and fluorescence emission spectra were taken:
[0141] Для mKate2-kasp-iRFP: спектр возбуждения при эмиссии 740 нм, спектры эмиссии флуоресценции при 550 нм и 650 нм.[0141] For mKate2-kasp-iRFP: excitation spectrum at 740 nm emission, fluorescence emission spectra at 550 nm and 650 nm.
[0142] Для FP650-kasp-iRFP: спектр возбуждения при эмиссии 740 нм, спектры эмиссии флуоресценции при 580 нм и 670 нм.[0142] For FP650-kasp-iRFP: excitation spectrum at 740 nm emission, fluorescence emission spectra at 580 nm and 670 nm.
[0143] Для NiRFP-kasp-iRFP: спектр возбуждения при эмиссии 740 нм, спектры эмиссии флуоресценции при 590 нм и 670 нм.[0143] For NiRFP-kasp-iRFP: excitation spectrum at 740 nm emission, fluorescence emission spectra at 590 nm and 670 nm.
[0144] Далее в систему внесли следующие компоненты реакционной среды: 50 мМ HEPES буфер (рН 7.5), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% сахарозу (масса/объем), 0,1% CHAPS, 10 мМ ДТТ и каспазу 3, инкубировали 1 час на 37°С.[0144] Next, the following reaction medium components were introduced into the system: 50 mM HEPES buffer (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% sucrose (mass / volume), 0.1% CHAPS, 10 mM DTT and
[0145] Расщепление каспазой сенсора регистрировали по изменению видов графика возбуждения при эмиссии 740 нм (рис.2А, 2Б, 2В) и графика эмиссии флуоресценции при возбуждении 550, 580 и 590 нм, соответственно, для каждого из трех сенсоров (рис.3А, 3Б, 3В). Таким образом, определяли зависимость сигнала сенсора (соотношение интенсивностей возбуждения в области 588, 592, 605 нм, соответственно, на спектре возбуждения до и после реакции; соотношение интенсивностей флуоресценции в области 633, 650, 670 нм, соответственно, - и 710 нм на спектре флуоресценции до и после реакции) от добавления каспазы к сенсору.[0145] Caspase cleavage of the sensor was recorded by changing the types of excitation graphs at 740 nm emission (Fig. 2A, 2B, 2C) and fluorescence emission graphs at
Для всех трех вариантов наблюдали уменьшение интенсивности возбуждения при эмиссии на 740 нм: в области 588, 592, 605 нм, соответственно, что может объясняться уменьшением FRET из-за расщепления сенсора каспазой. Для графика флуоресценции при возбуждении 650, 670 и 670 нм, соответственно, в области 740 нм при добавлении каспазы изменений не наблюдали. Все три варианта после добавления каспазы при возбуждении светом 550, 580, 590 нм демонстрировали увеличение интенсивности флуоресценции в области 633, 650, 670 нм - с одновременным уменьшением интенсивности флуоресценции в области 713 нм, что также свидетельствует об уменьшении FRET от донора к акцептору. Варианты FP650-kasp-iRFP и NiRFP-kasp-iRFP после обработки каспазой демонстрировали более значительные изменения, чем mKate2-kasp-IRFP.For all three variants, a decrease in the excitation intensity was observed upon emission at 740 nm: in the region of 588, 592, 605 nm, respectively, which can be explained by a decrease in FRET due to the splitting of the sensor by caspase. For the fluorescence plot with excitation of 650, 670 and 670 nm, respectively, in the region of 740 nm, no changes were observed with the addition of caspase. After adding caspase upon excitation with light of 550, 580, and 590 nm, all three variants showed an increase in the fluorescence intensity in the region of 633, 650, 670 nm, with a simultaneous decrease in the fluorescence intensity in the region of 713 nm, which also indicates a decrease in FRET from donor to acceptor. The FP650-kasp-iRFP and NiRFP-kasp-iRFP variants after caspase treatment showed more significant changes than mKate2-kasp-IRFP.
Все публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена посредством ссылки. Цитирование любой публикации приводится в соответствии с контекстом и интерпретацией по настоящему изобретению и не должно истолковываться как признание любой такой публикации прототипом данного изобретения.All publications and patent applications cited in the present description, are introduced into the present description by reference, as if each individual publication or patent application was specifically and separately introduced by reference. The citation of any publication is in accordance with the context and interpretation of the present invention and should not be construed as recognition of any such publication as a prototype of the present invention.
SEQ ID NO:1 Аминокислотная последовательность дальне-красного флуоресцентного белка mKate SEQ ID NO: 1 Amino Acid Sequence of Far Red Fluorescent mKate Protein
prtprt
MVSELIKENMHMKLYMEGTVMVSELIKENMHMKLYMEGTV
NNHHFKCTSEGEGKPYEGTQNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQ
TMRIKAVEGGPLPFAFDILATMRIKAVEGGPLPFAFDILA
TSFMYGSKTFINHTQGIPDFTSFMYGSKTFINHTQGIPDF
FKQSFPEGFTWERVTTYEDGFKQSFPEGFTWERVTTYEDG
GVLTATQDTSLQDGCLIYNVGVLTATQDTSLQDGCLIYNV
KIRGVNFPSNGPVMQKKTLGKIRGVNFPSNGPVMQKKTLG
WEASTETLYPADGGLEGRADWEASTETLYPADGGLEGRAD
MALKLVGGGHLICNLKTTYRMALKLVGGGHLICNLKTTYR
SKKPAKNLKMPGVYYVDRRLSKKPAKNLKMPGVYYVDRRL
ERIKEADKETYVEQHEVAVAERIKEADKETYVEQHEVAVA
RYCDLPSKLGHRRYCDLPSKLGHR
SEQ ID NO:2 Аминокислотная последовательность дальне-красного флуоресцентного белка FP650 SEQ ID NO: 2 Amino Acid Sequence of Far-Red Fluorescent FP650 Protein
prtprt
MGEDSELISENMHMKLYMEGMGEDSELISENMHMKLYMEG
TVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEG
TQTAKIKVVEGGPLPFAFDITQTAKIKVVEGGPLPFAFDI
LATSFMYGSKTFINHTQGIPLATSFMYGSKTFINHTQGIP
DFFKQSFPEGFTWERITTYEDFFKQSFPEGFTWERITTYE
DGGVLTATQDTSLQNGCLIYDGGVLTATQDTSLQNGCLIY
NVKINGVNFPSNGPVMQKKTNVKINGVNFPSNGPVMQKKT
LGWEASTEMLYPADSGLRGHLGWEASTEMLYPADSGLRGH
SQMALKLVGGGYLHCSLKTTSQMALKLVGGGYLHCSLKTT
YRSKKPAKNLKMPGFYFVDRYRSKKPAKNLKMPGFYFVDR
KLERIKEADKETYVEQHEMAKLERIKEADKETYVEQHEMA
VARYCDLPSKLGHSVARYCDLPSKLGHS
SEQ ID NO:3 Аминокислотная последовательность дальне-красного флуоресцентного белка FP670 SEQ ID NO: 3 Amino Acid Sequence of Far-Red Fluorescent FP670 Protein
prtprt
MGEDSELISENMHTKLYMEGMGEDSELISENMHTKLYMEG
TVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEG
TQTCKIKVVEGGPLPFAFDITQTCKIKVVEGGPLPFAFDI
LATSFMYGSKTFINHTQGIPLATSFMYGSKTFINHTQGIP
DFFKQSFPEGFTWERITTYEDFFKQSFPEGFTWERITTYE
DGGVLTATQDTSLQNGCLIYDGGVLTATQDTSLQNGCLIY
NVKINGVNFPSNGPVMQKKTNVKINGVNFPSNGPVMQKKT
LGWEANTEMLYPADSGLRGHLGWEANTEMLYPADSGLRGH
NQMALKLVGGGYLHCSLKTTNQMALKLVGGGYLHCSLKTT
YRSKKPAKNLKMPGFYFVDRYRSKKPAKNLKMPGFYFVDR
KLERIKEADKETYVEQHEMAKLERIKEADKETYVEQHEMA
VARYCDLPSKLGHSVARYCDLPSKLGHS
SEQ ID NO:4 Аминокислотная последовательность флуоресцентного белка iRFPSEQ ID NO: 4 Amino Acid Sequence of iRFP Fluorescent Protein
prtprt
MASMTGGQQMGRDLYDDDDKMASMTGGQQMGRDLYDDDDK
DPSSRSMTEGSVARQPDLLTDPSSRSMTEGSVARQPDLLT
CDDEPIHIPGAIQPHGLLLACDDEPIHIPGAIQPHGLLLA
LAADMTIVAGSDNLPELTGLLAADMTIVAGSDNLPELTGL
AIGALIGRSAADVFDSETHNAIGALIGRSAADVFDSETHN
RLTIALAEPGAAVGAPITVGRLTIALAEPGAAVGAPITVG
FTMRKDAGFIGSWHRHDQLIFTMRKDAGFIGSWHRHDQLI
FLELEPPQRDVAEPQAFFRRFLELEPPQRDVAEPQAFFRR
TNSAIRRLQAAETLESACAATNSAIRRLQAAETLESACAA
AAQEVRKITGFDRVMIYRFAAAQEVRKITGFDRVMIYRFA
SDFSGEVIAEDRCAEVESKLSDFSGEVIAEDRCAEVESKL
GLHYPASTVPAQARRLYTINGLHYPASTVPAQARRLYTIN
PVRIIPDINYRPVPVTPDLNPVRIIPDINYRPVPVTPDLN
PVTGRPIDLSFAILRSVSPVPVTGRPIDLSFAILRSVSPV
HLEFMRNIGMHGTMSISILRHLEFMRNIGMHGTMSISILR
GERLWGLIVCHHRTPYYVDLGERLWGLIVCHHRTPYYVDL
DGRQACELVAQVLAWQIGVMDGRQACELVAQVLAWQIGVM
EEEe
SEQ ID NO:5 Аминокислотная последовательность флуоресцентного биосенсора mKate2-kasp-iRFP SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence of the mKate2-kasp-iRFP fluorescent biosensor
prtprt
MVSELIKENMHMKLYMEGTVMVSELIKENMHMKLYMEGTV
NNHHFKCTSEGEGKPYEGTQNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQ
TMRIKAVEGGPLPFAFDILATMRIKAVEGGPLPFAFDILA
TSFMYGSKTFINHTQGIPDFTSFMYGSKTFINHTQGIPDF
FKQSFPEGFTWERVTTYEDGFKQSFPEGFTWERVTTYEDG
GVLTATQDTSLQDGCLIYNVGVLTATQDTSLQDGCLIYNV
KIRGVNFPSNGPVMQKKTLGKIRGVNFPSNGPVMQKKTLG
WEASTETLYPADGGLEGRADWEASTETLYPADGGLEGRAD
MALKLVGGGHLICNLKTTYRMALKLVGGGHLICNLKTTYR
SKKPAKNLKMPGVYYVDRRLSKKPAKNLKMPGVYYVDRRL
ERIKEADKETYVEQHEVAVAERIKEADKETYVEQHEVAVA
RYCDLPSKLGHRELGTEFGGRYCDLPSKLGHRELGTEFGG
SGSDEVDKLGGSGSMASMTGSGSDEVDKLGGSGSMASMTG
GQQMGRDLYDDDDKDPSSRSGQQMGRDLYDDDDKDPSSRS
MTEGSVARQPDLLTCDDEPIMTEGSVARQPDLLTCDDEPI
HIPGAIQPHGLLLALAADMTHIPGAIQPHGLLLALAADMT
IVAGSDNLPELTGLAIGALIIVAGSDNLPELTGLAIGALI
GRSAADVFDSETHNRLTIALGRSAADVFDSETHNRLTIAL
AEPGAAVGAPITVGFTMRKDAEPGAAVGAPITVGFTMRKD
AGFIGSWHRHDQLIFLELEPAGFIGSWHRHDQLIFLELEP
PQRDVAEPQAFFRRTNSAIRPQRDVAEPQAFFRRTNSAIR
RLQAAETLESACAAAAQEVRRLQAAETLESACAAAAQEVR
KITGFDRVMIYRFASDFSGEKITGFDRVMIYRFASDFSGE
VIAEDRCAEVESKLGLHYPAVIAEDRCAEVESKLGLHYPA
STVPAQARRLYTINPVRIIPSTVPAQARRLYTINPVRIIP
DINYRPVPVTPDLNPVTGRPDINYRPVPVTPDLNPVTGRP
IDLSFAILRSVSPVHLEFMRIDLSFAILRSVSPVHLEFMR
NIGMHGTMSISILRGERLWGNIGMHGTMSISILRGERLWG
LIVCHHRTPYYVDLDGRQACLIVCHHRTPYYVDLDGRQAC
ELVAQVLAWQIGVMEEELVAQVLAWQIGVMEE
SEQ ID NO:6 Аминокислотная последовательность флуоресцентного биосенсора FP650-kasp-iRFP SEQ ID NO: 6 Amino Acid Sequence of FP650-kasp-iRFP Fluorescent Biosensor
prtprt
MGEDSELISENMHMKLYMEGMGEDSELISENMHMKLYMEG
TVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEG
TQTAKIKVVEGGPLPFAFDITQTAKIKVVEGGPLPFAFDI
LATSFMYGSKTFINHTQGIPLATSFMYGSKTFINHTQGIP
DFFKQSFPEGFTWERITTYEDFFKQSFPEGFTWERITTYE
DGGVLTATQDTSLQNGCLIYDGGVLTATQDTSLQNGCLIY
NVKINGVNFPSNGPVMQKKTNVKINGVNFPSNGPVMQKKT
LGWEASTEMLYPADSGLRGHLGWEASTEMLYPADSGLRGH
SQMALKLVGGGYLHCSLKTTSQMALKLVGGGYLHCSLKTT
YRSKKPAKNLKMPGFYFVDRYRSKKPAKNLKMPGFYFVDR
KLERIKEADKETYVEQHEMAKLERIKEADKETYVEQHEMA
VARYCDLPSKLGHSELGTEFVARYCDLPSKLGHSELGTEF
GGSGSDEVDKLGGSGSMASMGGSGSDEVDKLGGSGSMASM
TGGQQMGRDLYDDDDKDPSSTGGQQMGRDLYDDDDKDPSS
RSMTEGSVARQPDLLTCDDERSMTEGSVARQPDLLTCDDE
PIHIPGAIQPHGLLLALAADPIHIPGAIQPHGLLLALAAD
MTIVAGSDNLPELTGLAIGAMTIVAGSDNLPELTGLAIGA
LIGRSAADVFDSETHNRLTILIGRSAADVFDSETHNRLTI
ALAEPGAAVGAPITVGFTMRALAEPGAAVGAPITVGFTMR
KDAGFIGSWHRHDQLIFLELKDAGFIGSWHRHDQLIFLEL
EPPQRDVAEPQAFFRRTNSAEPPQRDVAEPQAFFRRTNSA
IRRLQAAETLESACAAAAQEIRRLQAAETLESACAAAAQE
VRKITGFDRVMIYRFASDFSVRKITGFDRVMIYRFASDFS
GEVIAEDRCAEVESKLGLHYGEVIAEDRCAEVESKLGLHY
PASTVPAQARRLYTINPVRIPASTVPAQARRLYTINPVRI
IPDINYRPVPVTPDLNPVTGIPDINYRPVPVTPDLNPVTG
RPIDLSFAILRSVSPVHLEFRPIDLSFAILRSVSPVHLEF
MRNIGMHGTMSISILRGERLMRNIGMHGTMSISILRGERL
WGLIVCHHRTPYYVDLDGRQWGLIVCHHRTPYYVDLDGRQ
ACELVAQVLAWQIGVMEEACELVAQVLAWQIGVMEE
SEQ ID NO:7 Аминокислотная последовательность флуоресцентного биосенсора NiRFP-kasp-iRFP SEQ ID NO: 7 Amino Acid Sequence of NiRFP-kasp-iRFP Fluorescent Biosensor
prtprt
MGEDSELISENMHTKLYMEGMGEDSELISENMHTKLYMEG
TVNGHHFKCTSEGEGKPYEGTVNGHHFKCTSEGEGKPYEG
TQTCKIKVVEGGPLPFAFDITQTCKIKVVEGGPLPFAFDI
LATSFMYGSKTFINHTQGIPLATSFMYGSKTFINHTQGIP
DFFKQSFPEGFTWERITTYEDFFKQSFPEGFTWERITTYE
DGGVLTATQDTSLQNGCLIYDGGVLTATQDTSLQNGCLIY
NVKINGVNFPSNGPVMQKKTNVKINGVNFPSNGPVMQKKT
LGWEANTEMLYPADSGLRGHLGWEANTEMLYPADSGLRGH
NQMALKLVGGGYLHCSLKTTNQMALKLVGGGYLHCSLKTT
YRSKKPAKNLKMPGFYFVDRYRSKKPAKNLKMPGFYFVDR
KLERIKEADKETYVEQHEMAKLERIKEADKETYVEQHEMA
VARYCDLPSKLGHSELGTEFVARYCDLPSKLGHSELGTEF
GGSGSDEVDKLGGSGSMASMGGSGSDEVDKLGGSGSMASM
TGGQQMGRDLYDDDDKDPSSTGGQQMGRDLYDDDDKDPSS
RSMTEGSVARQPDLLTCDDERSMTEGSVARQPDLLTCDDE
PIHIPGAIQPHGLLLALAADPIHIPGAIQPHGLLLALAAD
MTIVAGSDNLPELTGLAIGAMTIVAGSDNLPELTGLAIGA
LIGRSAADVFDSETHNRLTILIGRSAADVFDSETHNRLTI
ALAEPGAAVGAPITVGFTMRALAEPGAAVGAPITVGFTMR
KDAGFIGSWHRHDQLIFLELKDAGFIGSWHRHDQLIFLEL
EPPQRDVAEPQAFFRRTNSAEPPQRDVAEPQAFFRRTNSA
IRRLQAAETLESACAAAAQEIRRLQAAETLESACAAAAQE
VRKITGFDRVMIYRFASDFSVRKITGFDRVMIYRFASDFS
GEVIAEDRCAEVESKLGLHYGEVIAEDRCAEVESKLGLHY
PASTVPAQARRLYTINPVRIPASTVPAQARRLYTINPVRI
IPDINYRPVPVTPDLNPVTGIPDINYRPVPVTPDLNPVTG
RPIDLSFAILRSVSPVHLEFRPIDLSFAILRSVSPVHLEF
MRNIGMHGTMSISILRGERLMRNIGMHGTMSISILRGERL
WGLIVCHHRTPYYVDLDGRQWGLIVCHHRTPYYVDLDGRQ
ACELVAQVLAWQIGVMEEACELVAQVLAWQIGVMEE
SEQ ID NO:8 Аминоксилотная последовательность расщепляемого каспазой линкера SEQ ID NO: 8 Aminoxyl sequence of a caspase cleavable linker
prtprt
EFGGSGSDEVDKLGGSGSEFGGSGSDEVDKLGGSGS
SEQ ID NO:9 Последовательность нуклеотидов флуоресцентного биосенсора mKate2-kasp-iRFP SEQ ID NO: 9 The nucleotide sequence of the mKate2-kasp-iRFP fluorescent biosensor
dnadna
atggtgagcgagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtgatggtgagcgagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtg
aacaaccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccagaacaaccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccag
accatgagaatcaaggcggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggctaccatgagaatcaaggcggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggct
accagcttcatgtacggcagcaaaaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttcaccagcttcatgtacggcagcaaaaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttc
tttaagcagtccttccccgagggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaagacgggtttaagcagtccttccccgagggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaagacggg
ggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtc
aagatcagaggggtgaacttcccatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggcaagatcagaggggtgaacttcccatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggc
tgggaggcctccaccgagaccctgtaccccgctgacggcggcctggaaggcagagccgactgggaggcctccaccgagaccctgtaccccgctgacggcggcctggaaggcagagccgac
atggccctgaagctcgtgggcgggggccacctgatctgcaacttgaagaccacatacagaatggccctgaagctcgtgggcgggggccacctgatctgcaacttgaagaccacatacaga
tccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcgtctactatgtggacagaagactgtccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcgtctactatgtggacagaagactg
gaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgaggtggctgtggccgaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgaggtggctgtggcc
agatactgcgacctccctagcaaactggggcacagagagctcggtaccgaattcggtggtagatactgcgacctccctagcaaactggggcacagagagctcggtaccgaattcggtggt
tctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatgactggttctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatgactggt
ggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcgagatctggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcgagatct
atgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctcttgacctgcgacgatgagccgatcatgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctctttgacctgcgacgatgagccgatc
catatccccggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgacatgacgcatatccccggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgacatgacg
atcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgccctgatcatcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgccctgatc
ggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatcgccttgggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatcgccttg
gccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcgaaaggacgccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcgaaaggac
gcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctcgagcctgcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctcgagcct
ccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgccatccgcccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgccatccgc
cgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagaggtgcggcgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagaggtgcgg
aagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagcggcgaaaagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagcggcgaa
gtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactatcctgccgtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactatcctgcc
tcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatcattccctcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatcattccc
gatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccgggcggccggatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccgggcggccg
attgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattcatgcgcattgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattcatgcgc
aacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactgtggggaaacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactgtgggga
ttgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaagcctgcttgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaagcctgc
gagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagaggagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagag
SEQ ID NO:10 Последовательность нуклеотидов флуоресцентного биосенсора FP650-kasp-iRFP SEQ ID NO: 10 FP650-kasp-iRFP Fluorescent Biosensor Nucleotide Sequence
dnadna
atgggagaggatagcgagctgatctccgagaacatgcacatgaaactgtacatggagggcatgggagaggatagcgagctgatctccgagaacatgcacatgaaactgtacatggagggc
accgtgaacggccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcaccgtgaacggccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggc
acccagaccgctaagatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcacccagaccgctaagatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatc
ctggctaccagcttcatgtacggcagcaaaacctttatcaaccacacccagggcatccccctggctaccagcttcatgtacggcagcaaaacctttatcaaccacacccagggcatcccc
gacttctttaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagaggatcaccacatacgaagacttctttaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagaggatcaccacatacgaa
gacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccagaacggctgcctcatctacgacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccagaacggctgcctcatctac
aacgtcaagatcaacggggtgaacttcccatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacaaacgtcaagatcaacggggtgaacttcccatccaacggccccctgtgatgcagaagaaaaca
ctcggctgggaggccagcaccgagatgctgtaccccgctgacagcggcctgagaggccatctcggctgggaggccagcaccgagatgctgtaccccgctgacagcggcctgagaggccat
agtcagatggccctgaagctcgtgggcgggggctacctgcactgctccctcaagaccacaagtcagatggccctgaagctcgtgggcgggggctacctgcactgctccctcaagaccaca
tacagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcttctacttcgtggacaggtacagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcttctacttcgtggacagg
aaactggaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgagatggctaaactggaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgagatggct
gtggccaggtactgcgacctgcctagcaaactggggcacagcgagctcggtaccgaattcgtggccaggtactgcgacctgcctagcaaactggggcacagcgagctcggtaccgaattc
ggtggttctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatgggtggttctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatg
actggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcgactggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcg
agatctatgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctcttgacctgcgacgatgagagatctatgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctcttgacctgcgacgatgag
ccgatccatatccccggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgacccgatccatatccccggggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgac
atgacgatcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgccatgacgatcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgcc
ctgatcggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatcctgatcggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatc
gccttggccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcgagccttggccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcga
aaggacgcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctcaaggacgcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctc
gagcctccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgccgagcctccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgcc
atccgccgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagagatccgccgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagag
gtgcggaagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagcgtgcggaagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagc
ggcgaagtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactatggcgaagtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactat
cctgcctcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatccctgcctcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatc
attcccgatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccgggattcccgatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccggg
cggccgattgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattccggccgattgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattc
atgcgcaacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactgatgcgcaacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactg
tggggattgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaatggggattgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaa
gcctgcgagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagaggcctgcgagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagag
SEQ ID NO:11 Последовательность нуклеотидов флуоресцентного биосенсора NiRFP-kasp-iRFP SEQ ID NO: 11 The nucleotide sequence of the fluorescent biosensor NiRFP-kasp-iRFP
dnadna
atgggagaggatagcgagctgatctccgagaacatgcacacgaaactgtacatggagggcatgggagaggatagcgagctgatctccgagaacatgcacacgaaactgtacatggagggc
accgtgaacggccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcaccgtgaacggccaccacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggc
acccagacctgtaagatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcacccagacctgtaagatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatc
ctggctaccagcttcatgtacggcagcaaaacctttatcaaccacacccagggcatccccctggctaccagcttcatgtacggcagcaaaacctttatcaaccacacccagggcatcccc
gacttctttaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagaggatcaccacatacgaagacttctttaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagaggatcaccacatacgaa
gacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccagaacggctgcctcatctacgacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccagaacggctgcctcatctac
aacgtcaagatcaacggggtgaacttcccatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacaaacgtcaagatcaacggggtgaacttcccatccaacggccccctgtgatgcagaagaaaaca
ctcggctgggaggccaacaccgagatgctgtaccccgctgacagcggtctgagaggccatctcggctgggaggccaacaccgagatgctgtaccccgctgacagcggtctgagaggccat
aatcagatggccctgaagctcgtgggcgggggctacctgcactgctccctcaagaccacaaatcagatggccctgaagctcgtgggcgggggctacctgcactgctccctcaagaccaca
tacagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcttctacttcgtggaccgttacagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcccggcttctacttcgtggaccgt
aaactggaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgagatggctaaactggaaagaatcaaggaggccgacaaagagacctacgtcgagcagcacgagatggct
gtggccaggtactgcgacctgcctagcaaactggggcacagcgagctcggtaccgaattcgtggccaggtactgcgacctgcctagcaaactggggcacagcgagctcggtaccgaattc
ggtggttctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatgggtggttctggttctgatgaagttgataagcttggtggttctggttctatggctagcatg
actggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcgactggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccgagctcg
agatctatgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctcttgacctgcgacgatgagagatctatgacagaaggatccgtcgccaggcagcctgacctcttgacctgcgacgatgag
ccgatccatatccccggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgacccgatccatatccccggggtgccatccaaccgcatggactgctgctcgccctcgccgccgac
atgacgatcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgccatgacgatcgttgccggcagcgacaaccttcccgaactcaccggactggcgatcggcgcc
ctgatcggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatcctgatcggccgctctgcggccgatgtcttcgactcggagacgcacaaccgtctgacgatc
gccttggccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcgagccttggccgagcccggggcggccgtcggagcaccgatcactgtcggcttcacgatgcga
aaggacgcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctcaaggacgcaggcttcatcggctcctggcatcgccatgatcagctcatcttcctcgagctc
gagcctccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgccgagcctccccagcgggacgtcgccgagccgcaggcgttcttccgccgcaccaacagcgcc
atccgccgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagagatccgccgcctgcaggccgccgaaaccttggaaagcgcctgcgccgccgcggcgcaagag
gtgcggaagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagcgtgcggaagattaccggcttcgatcgggtgatgatctatcgcttcgcctccgacttcagc
ggcgaagtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactatggcgaagtgatcgcagaggatcggtgcgccgaggtcgagtcaaaactaggcctgcactat
cctgcctcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatccctgcctcaaccgtgccggcgcaggcccgtcggctctataccatcaacccggtacggatc
attcccgatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccgggattcccgatatcaattatcggccggtgccggtcaccccagacctcaatccggtcaccggg
cggccgattgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattccggccgattgatcttagcttcgccatcctgcgcagcgtctcgcccgtccatctggaattc
atgcgcaacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactgatgcgcaacataggcatgcacggcacgatgtcgatctcgattttgcgcggcgagcgactg
tggggattgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaatggggattgatcgtttgccatcaccgaacgccgtactacgtcgatctcgatggccgccaa
gcctgcgagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagaggcctgcgagctagtcgcccaggttctggcctggcagatcggcgtgatggaagag
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013137784/10A RU2535981C1 (en) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013137784/10A RU2535981C1 (en) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2535981C1 true RU2535981C1 (en) | 2014-12-20 |
Family
ID=53286199
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013137784/10A RU2535981C1 (en) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2535981C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022001520A1 (en) * | 2020-06-30 | 2022-01-06 | 浙江大学 | Method, device and application for second near-infrared region fluorescence imaging using near-infrared fluorescent protein derivative or analog |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2338785C2 (en) * | 2002-11-12 | 2008-11-20 | Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" | Fluorescing proteins and chromoproteins from kinds hydrozoa which are not concerning to aequorea, and methods of their obtaining |
US20120034643A1 (en) * | 2003-12-03 | 2012-02-09 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | Fluorescent protein |
EP2430156A1 (en) * | 2009-05-11 | 2012-03-21 | Evrogen Jsc | Modified fluorescent proteins and methods for using same |
-
2013
- 2013-08-13 RU RU2013137784/10A patent/RU2535981C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2338785C2 (en) * | 2002-11-12 | 2008-11-20 | Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" | Fluorescing proteins and chromoproteins from kinds hydrozoa which are not concerning to aequorea, and methods of their obtaining |
US20120034643A1 (en) * | 2003-12-03 | 2012-02-09 | Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. | Fluorescent protein |
EP2430156A1 (en) * | 2009-05-11 | 2012-03-21 | Evrogen Jsc | Modified fluorescent proteins and methods for using same |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CHUDAKOV DM et.al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues, Physiol Rev. 2010 Jul;90(3):1103-63. doi: 10.1152/physrev.00038.2009. * |
LUO KQ et.al. Measuring dynamics of caspase-8 activation in a single living HeLa cell during TNFalpha-induced apoptosis, Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 2;304(2):217-22, abstract. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022001520A1 (en) * | 2020-06-30 | 2022-01-06 | 浙江大学 | Method, device and application for second near-infrared region fluorescence imaging using near-infrared fluorescent protein derivative or analog |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2395581C2 (en) | Novel fluorescent proteins from entacmaea quadricolor and method of obtaining said proteins | |
RU2412250C2 (en) | Modified green fluorescent proteins and methods of their application | |
US20130344591A1 (en) | Modified Fluorescent Proteins and Methods for Using Same | |
RU2345137C2 (en) | Fluorescing proteins from copepodas crustaceas and their application | |
US11008369B2 (en) | Bright monomeric near-infrared fluorescent proteins engineered from bacterial phytochromes and methods for making same | |
US7951923B2 (en) | Fluorescent proteins and chromoproteins from non-Aequorea hydrozoa species and methods for using same | |
US7972834B2 (en) | Modified fluorescent proteins and methods for using same | |
RU2535981C1 (en) | Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement | |
RU2493260C2 (en) | Isolated nucleic acid coding fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide, expression cassette, cell that produces biosensor, isolated fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide, isolated nucleic acid that codes fluorescent biosensor, efficiently fused with nucleic acid that codes signal of intracellular localisation | |
RU2535336C1 (en) | Red fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide in living cells | |
RU2458129C1 (en) | ISOLATED KillerRed PROTEIN-CODING NUCLEIC ACID (VERSIONS), ISOLATED PROTEIN (VERSIONS), EXPRESSION CASSETTE, CELL CONTAINING EXPRESSION CASSETTE | |
RU2515903C2 (en) | Isolated nucleic acid coding fluorescent biosensor, expression cassette, cell, producing fluorescent biosensor, isolated fluorescent biosensor | |
US8563703B2 (en) | Fluorescent proteins and methods for using same | |
RU2603060C2 (en) | Modified biosensor for detecting intracellular ph | |
RU2338785C2 (en) | Fluorescing proteins and chromoproteins from kinds hydrozoa which are not concerning to aequorea, and methods of their obtaining | |
RU2599443C2 (en) | Modified genetically coded photosensitizer | |
RU2491342C1 (en) | ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180814 |