RU2491342C1 - ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN - Google Patents

ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN Download PDF

Info

Publication number
RU2491342C1
RU2491342C1 RU2011149819/10A RU2011149819A RU2491342C1 RU 2491342 C1 RU2491342 C1 RU 2491342C1 RU 2011149819/10 A RU2011149819/10 A RU 2011149819/10A RU 2011149819 A RU2011149819 A RU 2011149819A RU 2491342 C1 RU2491342 C1 RU 2491342C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
cell
nucleic acid
proteins
cells
Prior art date
Application number
RU2011149819/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2011149819A (en
Inventor
Константин Анатольевич Лукьянов
Екатерина Олеговна Серебровская
Сергей Анатольевич Лукьянов
Original Assignee
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГБОУ ВПО "НижГМА" МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГБОУ ВПО "НижГМА" МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ) filed Critical ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГБОУ ВПО "НижГМА" МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ)
Priority to RU2011149819/10A priority Critical patent/RU2491342C1/en
Publication of RU2011149819A publication Critical patent/RU2011149819A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2491342C1 publication Critical patent/RU2491342C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention relates to field of molecular biology and genetic engineering. Invention can be used as instrument of targeted photoinactivation of proteins, nucleic acids and cells for medical purposes.
EFFECT: claimed is isolated nucleic acid, encoding intramolecular Killer Red dimer, operatively fused with histone, as well as expression cassette with said nucleic acid, cell, containing it, and protein, which it encodes.
4 cl, 2 dwg, 6 tbl

Description

Данное изобретение относится к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на флуоресцентные белки.This invention relates to the field of biology and chemistry. In particular, the invention is directed to fluorescent proteins.

Флуоресцентные белки, включая зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP), его мутанты и гомологи, в настоящее время широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science, 2003 300 (5616):87-91.Fluorescent proteins, including green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein, GFP), its mutants and homologs, are now widely known for their intensive use as in vivo fluorescent markers in biomedical research, as discussed in detail by Lippincott-Schwartz and Patterson in Science, 2003 300 (5616): 87-91.

Флуоресцентные белки - это белки, которые способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.Fluorescent proteins are proteins that are capable of fluorescence when irradiated with light of a suitable wavelength. The fluorescence properties of these proteins are due to the interaction of two or more amino acid residues that form the chromophore, and not the fluorescence of any one amino acid residue.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria), описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol, 1962, 60:85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет.кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована Prasher et al. (Gene, 1992, 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи, в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.GFP hydromedusa Aequorea aequorea (synonym for A. victoria), described by Johnson et al. in J Cell Comp Physiol, 1962, 60: 85-104, as part of a bioluminescent jellyfish system, where GFP acts as a secondary emitter that converts blue light from an equorin photo protein to green light. The cDNA encoding A. victoria GFP was cloned by Prasher et al. (Gene, 1992, 111 (2): 229-33). It turned out that this gene can be heterologically expressed in almost any organism due to the unique ability of GFP to autocatalytically form a chromophore (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805). This information has opened up broad prospects for the use of GFP in cell biology as a genetically encoded fluorescent label.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci., 1994, 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology, 1995, 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters, 1995, 369: 267-271).GFP has been used in a wide variety of applications, including gene expression studies and protein localization (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805, and Heim et al. In Proc. Nat. Acad. Sci., 1994, 91: 12501 -12504), as a tool for visualizing the intracellular distribution of organelles (Rizzuto et al., Curr. Biology, 1995, 5: 635-642), for visualizing the transport of proteins along the secretory pathway (Kaether and Gerdes, FEBS Letters, 1995, 369: 267 -271).

Проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas, et al., Current Biology, 1996, 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373, 1995, 663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.Numerous studies have been carried out to improve the properties of avGFP (Aequorea victoria GFP) and to obtain GFP variants suitable and optimized for various research purposes. The avGFP (codon usage) genetic code was optimized to increase expression in mammalian cells (“humanized” GFP, Haas, et al., Current Biology, 1996, 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). Various GFP mutants have been prepared, including the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) having two amino acid substitutions: F64L and S65T (Heim et al., Nature 373, 1995, 663-664). Other mutants are blue, blue, and yellow-green spectral variants of avGFP and contain substitutions of amino acid residues that form the chromophore and / or residues that form the environment of the chromophore.

В 1999 г., гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol, 1999, 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием и включали циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays, 2002, 24(10): 953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol, 2004, 21(5): 841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее, чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.In 1999, GFP homologues were cloned from non-bioluminescent Anthozoa species (Matz et al., Nature Biotechnol, 1999, 17: 969-973). This discovery has demonstrated that these proteins are not necessarily a component of the bioluminescent system. GFP-like proteins from Anthozoa had a large spectral diversity and included cyanic, green, yellow, red fluorescent proteins and violet-blue non-fluorescent chromoproteins (CPs) (Matz et al., Bioessays, 2002, 24 (10): 953-959). Subsequently, cDNAs of GFP-like proteins were cloned from a number of hydroid jellyfish and from copepods (Shagin et al., Mol Biol Evol, 2004, 21 (5): 841-850). Today, the family of GFP-like proteins includes hundreds of fluorescent and stained GFP homologues. The similarity of these proteins to GFP varies from 80-90% to less than 25% amino acid sequence identity.

Получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science, 1996, 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb), 2003, 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem, 2005, 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry, 2005, 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry, 2005, 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой, представляющей собой так называемый бочонок из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry, 1993, 32, 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.The crystal structures of wild-type avGFP, GFP S65T mutant, and a number of GFP homologues were obtained (Ormo et al. Science, 1996, 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) 2003, 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al J Biol Chem, 2005, 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry, 2005, 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry, 2005, 44: 5774-5787). It was postulated that all members of the family have a common 3D structure, which is the so-called barrel of 11 beta layers, forming a compact antiparallel structure, inside which there is an alpha helix containing a chromophore. The chromophore is formed by oxidative cyclization of three conserved amino acid residues in the central region of the alpha helix (Cody et al., Biochemistry, 1993, 32, 1212-1218). The position of the amino acid residues forming the chromophore corresponds to the Ser65-Tyr66-Gly67 region of avGFP. These amino acid residues can easily be identified in any GFP-like protein by aligning its sequence with the avGFP sequence.

Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. Proc Nati Acad Sci USA. 1994; 91:12501-12504; Ormo et al. Science, 1996;273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol, 1996, 14: 1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA, 199, 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Stmct Biol, 1997, 4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem, 2001, 2:6; Gross et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2000, 97:11990-11995; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Nati Acad Sci USA. 2001, 98:462-467; Pakhomov, A.A. and Martynov, V.I. Chem. Biol, 2008, 15, 755-764; Quillinet al, 2005 Biochemistry, 44, 5774-5787; Yampolsky et al, 2005, Biochemistry, 44, 5788-5793; Shu et al. 2006, Biochemistry 45, 9639-9647; Kikuchi et al, 2008, Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009,48 (33), p.8077).The process of autocatalytic formation of a chromophore of proteins with different spectral properties is described in detail in several articles and includes several chemical reactions (Heim et al. Proc Nati Acad Sci USA. 1994; 91: 12501-12504; Ormo et al. Science, 1996; 273: 1392- 1395; Yang et al. Nat Biotechnol, 1996, 14: 1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA, 199, 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Stmct Biol, 1997, 4: 361 -365; Gurskaya et al., BMC Biochem, 2001, 2: 6; Gross et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2000, 97: 11990-11995; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7: 1133-1138 ; Yarbrough et al., J. Proc Nati Acad Sci USA. 2001, 98: 462-467; Pakhomov, AA and Martynov, VI Chem. Biol, 2008, 15, 755-764; Quillinet al, 2005 Biochemistry, 44, 5774 -5787; Yampolsky et al, 2005, Biochemistry, 44, 5788-5793; Shu et al. 2006, Biochemistry 45, 9639-9647; Kikuchi et al , 2008, Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009.48 (33), p.8077).

Показано, что флуоресцентный белок KillerRed обладает фототоксическими свойствами, что позволяет использовать его для прицельного уничтожения клеток и биологических молекул (белков, ДНК) непосредственно в живых организмах (Bulina et al., Nat Biotechnol, 2006, Jan, 24(1): 95-9; Bulina et al., Nat Protoc, 2006, 1(2): 947-53).It has been shown that the fluorescent protein KillerRed has phototoxic properties, which allows it to be used for targeted destruction of cells and biological molecules (proteins, DNA) directly in living organisms (Bulina et al., Nat Biotechnol, 2006, Jan, 24 (1): 95- 9; Bulina et al., Nat Protoc, 2006, 1 (2): 947-53).

Пространственная организация мономера KillerRed представляет собой типичный для флуоресцентных белков β-бочонок, образованный 11-ю β-сегментами, с центральной α-спиралью, содержащей хромофор, полученный в результате посттрансляционной модификации хромофор-образующей последовательности Gln65-Ty66-Gly67 (Pletnev et al., J Biol Chem, 2009, 284(46): 32028-32039). В белке KillerRed GFP-подобный домен (β-бочонок) составляют аминокислотные остатки в положениях с 6 по 225, соответствующие положениям с 6 по 229 последовательности avGFP.The spatial organization of the KillerRed monomer is a β-barrel, typical of fluorescent proteins, formed by 11 β-segments, with a central α-helix containing a chromophore obtained as a result of post-translational modification of the chromophore-forming sequence Gln65-Ty66-Gly67 (Pletnev et al. J Biol Chem, 2009, 284 (46): 32028-32039). In the KillerRed protein, the GFP-like domain (β-barrel) is composed of amino acid residues at positions 6 through 225, corresponding to positions 6 through 229 of the avGFP sequence.

Хромофор KillerRed в активной флуоресцентной форме представляет собой планарную бициклическую систему сопряженных двойных связей, состоящую из пятичленного имидазолинонового и фенольного циклов. Фенольный цикл Туr66б принимает цис- ориентацию по отношению к связи Сα-N(66), отвечающую активному флуоресцентному состоянию белка. Эта ориентация стабилизируется двумя водородными связями с Asn145 и через молекулу воды с Thr201. В процессе формирования хромофора Сα атом первого остатка Gln65 принимает sp2 гибридизацию, характеризующуюся плоским тригональным расположением примыкающих связей. При этом, образующаяся частично двойная N-ацилиминная связь N=Cα (Gln65) приводит к расширению сопряженной π-электронной системы, вызывающему сдвиг максимумов длин волн возбуждения и эмиссии в красную область спектра. Ближайшее окружение хромофора сформировано из боковых цепей 17-ти остатков, включая каталитические Arg94 и Glu218. Большинство этих остатков вовлечено в развитую систему водородных связей, как непосредственно, так и через молекулы воды.The KillerRed chromophore in active fluorescence form is a planar bicyclic conjugated double bond system consisting of five-membered imidazolinone and phenolic rings. The phenol cycle of Tur66b assumes a cis orientation with respect to the C α -N bond (66), which corresponds to the active fluorescent state of the protein. This orientation is stabilized by two hydrogen bonds with Asn145 and through a water molecule with Thr201. In the process of the formation of the C α chromophore, the atom of the first Gln65 residue accepts sp 2 hybridization, characterized by a flat trigonal arrangement of adjacent bonds. In this case, the partially formed double N-acylimine bond N = C α (Gln65) leads to the expansion of the conjugated π-electron system, causing a shift of the maxima of the excitation and emission wavelengths to the red region of the spectrum. The immediate environment of the chromophore is formed from the side chains of 17 residues, including catalytic Arg94 and Glu218. Most of these residues are involved in a developed system of hydrogen bonds, both directly and through water molecules.

Уникальной особенностью пространственной структуры KillerRed является наличие заполненного водой канала, идущего от торца (3-цилиндрической архитектуры белка к центральной области хромофора. Этот канал может облегчать доступ кислорода к хромофору, способствовать выходу активных форм кислорода из белка наружу, а также служить проводником протонов или электронов при фотовозбуждении хромофора. Эта особенность, по-видимому, является одним из ключевых структурных факторов наблюдаемых фототоксических свойств белка.A unique feature of the KillerRed spatial structure is the presence of a channel filled with water from the end (3-cylindrical architecture of the protein to the central region of the chromophore. This channel can facilitate the access of oxygen to the chromophore, facilitate the release of reactive oxygen species from the protein to the outside, and also serve as a conductor of protons or electrons during photoexcitation of the chromophore.This feature is apparently one of the key structural factors of the observed phototoxic properties of the protein.

Белок KillerRed имеет ряд недостатков, затрудняющих его широкое использование. Так, KillerRed является димерным белком. В то же время известно, что димеризация флуоресцентных белков может негативно сказываться на функционировании связанных с ними (закодированных в одной рамке считывания) химерных белков. Таким образом, это свойство ограничивает использование белка KillerRed как инструмента прицельной фотоинактивации химерных белков, а также опосредованной химерными белками фотоинактивации нуклеиновых кислот. Кроме того, фототоксичность KillerRed существенно уступает фототоксичности известных химических фотосенсибилизаторов.KillerRed protein has several disadvantages that make it difficult to use it widely. So, KillerRed is a dimeric protein. At the same time, it is known that the dimerization of fluorescent proteins can adversely affect the functioning of chimeric proteins associated with them (encoded in the same reading frame). Thus, this property limits the use of the KillerRed protein as a tool for targeted photoinactivation of chimeric proteins, as well as photoinactivation of nucleic acids mediated by chimeric proteins. In addition, the phototoxicity of KillerRed is significantly inferior to the phototoxicity of known chemical photosensitizers.

Предлагаемый в настоящей заявке подход направлен на решение этих проблем.The approach proposed in this application is aimed at solving these problems.

Предлагаемое изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие химерные белки, включающие два оперативно слитых белка, по существу сходных с белком KillerRed (так называемый KillerRed-tandem). Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют химерные белки, обладающие фототоксическими свойствами.The present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding chimeric proteins, including two operatively fused proteins, essentially similar to the KillerRed protein (the so-called KillerRed-tandem). Nucleic acids of the present invention obtained using recombinant technologies. In preferred embodiments, the nucleic acids of the present invention encode chimeric proteins having phototoxic properties.

Белок, состоящий из двух тандемно соединенных копий белка по существу сходных с белком KillerRed, проявляет свойства мономера и, следовательно, может быть использован для мечения широкого круга целевых белков. Это, в свою очередь, делает возможным осуществление непосредственного контакта KillerRed с клеточными структурами, чувствительными к воздействию окислительного стресса.A protein consisting of two tandem linked copies of a protein substantially similar to the KillerRed protein exhibits monomer properties and, therefore, can be used to label a wide range of target proteins. This, in turn, makes it possible to directly contact KillerRed with cellular structures that are sensitive to oxidative stress.

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют два белка, по существу сходных с белком KillerRed, которые соединены между собой с помощью белкового линкера (KillerRed-tandem).The isolated nucleic acids of the present invention encode two proteins that are essentially similar to the KillerRed protein, which are interconnected using a protein linker (KillerRed-tandem).

В некоторых воплощениях, KillerRed-tandem оперативно слит с гистоном. В преимущественных воплощениях, это гистон Н2 В. При экспрессии, белки, слитые с гистоном, локализуются в ядре клетки-хозяина, включаются в состав хроматина и при облучении светом оказывают на него повреждающее действие.In some embodiments, KillerRed-tandem is operatively fused to histone. In preferred embodiments, this is histone H2 B. Upon expression, proteins fused to the histone are localized in the nucleus of the host cell, are incorporated into chromatin and, when exposed to light, have a damaging effect on it.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая гистон (например, H2B), соединена своим 3'-концом с 5'-концом последовательности, кодирующей два белка, по существу сходных с белком KillerRed. В некоторых воплощениях, между нуклеотидными последовательностями, кодирующими гистон H2B и два белка, по существу сходные с белком KillerRed, присутствует линкерная последовательность, кодирующая несколько аминокислотных остатков.The nucleotide sequence encoding a histone (e.g., H2B) is connected at its 3 ′ end to the 5 ′ end of a sequence encoding two proteins substantially similar to the KillerRed protein. In some embodiments, between the nucleotide sequences encoding the H2B histone and two proteins substantially similar to the KillerRed protein, a linker sequence encoding several amino acid residues is present.

В некоторых воплощениях, обеспечивается выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют химерные белки показанные в SEQ ID NO:02, 04, 06 и 08. В некоторых воплощениях, обеспечивается выделенные нуклеиновые кислоты, которые имеют последовательность SEQ ID NO:01, SEQ ID NO:03, SEQ ID NO:05 и SEQ ID NO:07.In some embodiments, isolated nucleic acids are provided that encode chimeric proteins shown in SEQ ID NO: 02, 04, 06 and 08. In some embodiments, isolated nucleic acids are provided that have the sequence of SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 03 , SEQ ID NO: 05 and SEQ ID NO: 07.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода так же входят в рамки настоящего изобретения.Nucleic acid molecules that differ from the presented nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code are also included in the scope of the present invention.

В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.In other embodiments, vectors comprising the nucleic acid of the present invention are also provided. In addition, the present invention provides expression cassettes comprising the nucleic acid of the present invention and the regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in a selected host cell. In addition, cells, stable cell lines, transgenic animals and transgenic plants including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention are also provided.

В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные белки настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше.In other embodiments, the functional fluorescent proteins of the present invention are provided, which are encoded by the nucleic acids indicated above.

Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты или векторы или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения.In addition, a kit is provided comprising nucleic acids or vectors or expression cassettes comprising said nucleic acids of the present invention.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На рис.1 показано выравнивание белка KillerRed (Kill_R, SEQ ID NO:09) и других флуоресцентных белков - хромобелка anm2CP (SEQ ID NO:10) из антомедузы, на основе которого был получен KillerRed, красного флуоресцентного белка DsRed (SEQ ID NO:11) из кораллового полипа Discosoma, и зеленого флуоресцентного белка avGFP (SEQ ID NO:12) из медузы Aequorea victoria. Аминокислотные остатки, формирующие хромофор, подчеркнуты. Аминокислотные остатки, чьи боковые цепи погружены внутрь белковой глобулы, показаны на сером фоне.Figure 1 shows the alignment of the KillerRed protein (Kill_R, SEQ ID NO: 09) and other fluorescent proteins - the anm2CP chromosome protein (SEQ ID NO: 10) from the anti-medusa, on the basis of which KillerRed, the red fluorescent protein DsRed (SEQ ID NO: 11) from Discosoma coral polyp, and avGFP green fluorescent protein (SEQ ID NO: 12) from Aequorea victoria jellyfish. The amino acid residues forming the chromophore are underlined. Amino acid residues whose side chains are embedded inside a protein globule are shown against a gray background.

На рис.2 показана схема строения химерных белков. Вверху - тандемный KillerRed (tKR), внизу - гистон H2B, слитый с тандемным KillerRed (H2B-tKR). N- и С-концы белков обозначены буквами N и С. Линией обозначены линкерные последовательности.Figure 2 shows the structure of chimeric proteins. Above is the tandem KillerRed (tKR), below is the H2B histone fused to the tiller KillerRed (H2B-tKR). The N- and C-ends of the proteins are indicated by the letters N and C. The line indicates linker sequences.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Как указано выше, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные белки, включающие два оперативно слитых белка, по существу сходных с белком KillerRed. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют химерные белки, обладающие фототоксическими свойствами, которые превышают фототоксические свойства белка KillerRed. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.As indicated above, the present invention is directed to nucleic acid molecules that encode chimeric proteins comprising two operatively fused proteins substantially similar to the KillerRed protein. Nucleic acids of the present invention obtained using recombinant technologies. In preferred embodiments, the nucleic acids of the present invention encode chimeric proteins having phototoxic properties that exceed the phototoxic properties of the KillerRed protein. Also provided are vectors and expression cassettes comprising the nucleic acid of the present invention. In addition, provided are cells, stable cell lines, transgenic animals and transgenic plants, including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention.

В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные белки настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, указанными выше.In other embodiments, the functional fluorescent proteins of the present invention are provided, which are encoded by the nucleic acids indicated above.

Указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, в приложениях прицельного уничтожения клеток или блокирования пролиферации клеток с помощью облучения светом определенной длины волны. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.These protein and nucleotide compositions are used in many different applications and methods, in particular in applications for targeted cell killing or blocking cell proliferation by irradiation with light of a certain wavelength. Finally, kits are provided for their use in such methods and applications.

ОпределенияDefinitions

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.Various terms relating to the biological molecules of the present invention are used above and also in the description and in the claims.

Используемый здесь, термин "флуоресцентный белок" означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство этих белков представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Используетмый здесь, термин "avGFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).Used herein, the term "fluorescent protein" means a protein belonging to the family of GFP-like proteins, which has the ability to fluorescence; for example, it may exhibit low, medium, or intense fluorescence when irradiated with light at a suitable wavelength for excitation. The fluorescent property of these proteins is such a property, which is the result of the work of a chromophore formed by autocatalytic cyclization of three or more amino acid residues in a polypeptide chain. As such, the fluorescent proteins of the present invention do not include proteins that exhibit fluorescence due to individual fluorescent residues such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine. As used herein, the term "avGFP" refers to a green fluorescent protein from Aequorea victoria jellyfish, including avGFP variants known in the art, designed to provide greater fluorescence or fluorescence in other color areas. The wild-type avGFP sequence has been disclosed in Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).

Термин "гуманизированный" относится к изменению нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка, сделанной для оптимизации генетического кода кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (Yang et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593).The term “humanized” refers to a change in the nucleotide sequence of a fluorescent protein made to optimize the genetic code of codons for expression in mammalian cells (Yang et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593).

Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.As used here, the term "isolated" means a molecule or cell that is in an environment other than the environment in which the molecule or cell is in vivo.

Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делегированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.As used herein, the term “mutant” or “derivative” refers to a protein disclosed in the present invention in which one or more amino acids are added and / or substituted and / or deleted (delegated) and / or inserted (inserted) at the N-terminus and / or C-terminus and / or within the native amino acid sequences of the proteins of the present invention. As used here, the term "mutant" refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein. In addition, the term “mutant” refers to any variant that is shorter or longer than a protein or nucleic acid.

Как здесь используется, "гомология" это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.As used herein, “homology” is a term used to describe the relationship of nucleotide or amino acid sequences to other nucleotide or amino acid sequences, which is determined by the degree of identity and / or similarity between said compared sequences.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности "по существу сходны" или "по существу такие же как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%б 97%б 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны.As used herein, an amino acid or nucleotide sequence is “substantially similar” or “substantially the same as a reference sequence if the amino acid or nucleotide sequence has at least 85% identity with the specified sequence within the region to be compared. Thus, substantially similar sequences include those that have, for example, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, or at least 96% and 97% b 98% or 99% identity Two sequences that are identical to one another are also essentially similar.

Для целей настоящего изобретения длина сравниваемых последовательностей флуоресцентных белков соответствует длине GFP-домена. GFP-домен может быть идентифицирован с помощью анализа кристаллической структуры флуоресцентного белка или с помощью выравнивания аминокислотной последовательности белка с avGFP. GFP-домен может быть идентифицирован так же с помощью программ для анализа доменной организации белков, таких как Conserved Domain Database (CDD) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stmcture/cdd/) и SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de/). Было показано, что в состав домена, формирующего "бочонок" входят аминокислотные остатки, соответствующие положениям с 6 по 229 последовательности avGFP, где позиции соответствующих аминокислотных остатков определяются с помощью выравнивания аминокислотной последовательности белка с avGFP (рис.1). Для белка KillerRed в состав домена входят аминокислотные остатки, соответствующие положениям с 6 по 225. Было показано, что аминоксилотные фрагменты, не входящие в состав GFP-домена, могут содержать делеции, инсерции и замены аминокислотных остатков; при этом не происходит существенного изменения спектральных свойств флуоресцентного белка (Shimozono et al., Biochemistry, 2006,45, 6267-6271; Crameri et al., Nat Biotechnol, 1996, 14: 315-319). Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, pp.403-10). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.For the purposes of the present invention, the length of the compared sequences of fluorescent proteins corresponds to the length of the GFP domain. The GFP domain can be identified by analyzing the crystal structure of the fluorescent protein or by aligning the amino acid sequence of the protein with avGFP. A GFP domain can also be identified using protein domain analysis programs such as the Conserved Domain Database (CDD) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stmcture/cdd/) and SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de/). It was shown that the barrel-forming domain includes amino acid residues corresponding to positions 6 through 229 of the avGFP sequence, where the positions of the corresponding amino acid residues are determined by aligning the amino acid sequence of the protein with avGFP (Fig. 1). For the KillerRed protein, the domain includes amino acid residues corresponding to positions 6 to 225. It was shown that amino acid fragments that are not part of the GFP domain may contain deletions, insertions, and substitutions of amino acid residues; however, there is no significant change in the spectral properties of the fluorescent protein (Shimozono et al., Biochemistry, 2006.45, 6267-6271; Crameri et al., Nat Biotechnol, 1996, 14: 315-319). The percentage of sequence identity is determined based on the reference sequence. Algorithms for sequence analysis are known in the art, such as BLAST described in Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, pp. 403-10). For the purposes of the present invention, nucleotide and amino acid sequence comparisons performed using the Blast software package provided by the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) using alignment breaks with standard parameters can be used to determine the level of identity and similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences.

Как здесь используется, термин "подобные флуоресцентные белки" или "по существу сходные флуоресцентные белки" относится к флуоресцентным белкам, которые имеют GFP-домены, идентичные, по крайней мере, на 85%, как правило, идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные, по крайней мере, на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).As used herein, the term “similar fluorescent proteins” or “substantially similar fluorescent proteins” refers to fluorescent proteins that have GFP domains that are at least 85% identical, typically 90% or more identical, more often total identical, at least 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%).

В некоторых воплощениях, термин "подобные флуоресцентные белки" или "по существу сходные флуоресцентные белки" относится к флуоресцентным белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка идентичные, по крайней мере, на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).In some embodiments, the term “similar fluorescent proteins” or “substantially similar fluorescent proteins” refers to fluorescent proteins that have the amino acid sequences of the whole protein at least 85% identical, typically 90% or more identical, most often identical at least 95% or more (for example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%).

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания KillerRed и химерного белка настоящего изобретения, означает, что белок имеет фототоксические свойства.As used here, the term "functional" means that the nucleotide or amino acid sequence can function for the specified test or task. The term “functional”, used to describe the KillerRed and chimeric protein of the present invention, means that the protein has phototoxic properties.

Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.As used herein, “biochemical properties” refer to protein folding (folding) and maturation rate, half-life, aggregation ability, oligomerization ability, pH and temperature stability, and other similar properties.

Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или "спектральные свойства " относятся к коэффициенту молярной экстинкции, при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресцентции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния, и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например, интенсивность флуоресцентции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.As used herein, “fluorescence properties” or “spectral properties” refer to a molar extinction coefficient, at a suitable wavelength, to a fluorescence quantum yield, a shape of a fluorescence excitation spectrum or an emission spectrum, a wavelength corresponding to a maximum of fluorescence excitation, and a wavelength corresponding to the maximum emission, the ratio of the amplitude of the excitation of fluorescence at two different wavelengths, the ratio of the amplitude of the emission at two different wavelengths, the lifetime of the excited thawing, and anisotropy of optical properties. The measured difference can be defined as the amount of any quantitative fluorescence property, for example, the fluorescence intensity at a specific wavelength, or the integral fluorescence over the entire emission spectrum.

Как здесь используется, термины "фототоксические свойства" или "фототоксичность" относятся к способности белка вызывать повреждение близлежащих молекул, например близлежащих белков, нуклеиновых кислот, и/или липидов, что в свою очередь может вызывать гибель клеток, остановку клеточных делений или нарушение клеточной дифференцировки и/или пролиферации. Для сравнения фототоксических свойств может быть использована бактериальная система. Например, белки могут быть экспрессированы в клетках бактерий (например, Е.coli) путем транефекции подходящими экспрессирующими векторами, кодирующими указанные белки под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию белка в данных бактериальных клетках. Колонии выращивают в течение ночи при 37°C и далее чашки инкубируют при 4°C до полного созревания белков. Для каждого белка отбирают единичную колонию, которую суспендируют в 0.1 мл буфера PBS, после чего половину объема 30 мин облучают активирующим светом определенной интенсивности, а половину оставляют в темноте в качестве контроля. Полученные суспензии клеток высеивают на чашки Петри в различных разведениях и после ночного роста при 37°С подсчитывают число выросших колоний.As used here, the terms “phototoxic properties” or “phototoxicity” refer to the ability of a protein to damage nearby molecules, such as nearby proteins, nucleic acids, and / or lipids, which in turn can cause cell death, cell division arrest or impaired cell differentiation and / or proliferation. A bacterial system can be used to compare phototoxic properties. For example, proteins can be expressed in bacterial cells (e.g., E. coli) by transfecting with suitable expression vectors encoding the proteins under the control of a promoter that provides protein expression in these bacterial cells. The colonies are grown overnight at 37 ° C and then the plates are incubated at 4 ° C until the proteins mature completely. A single colony was selected for each protein, which was suspended in 0.1 ml of PBS buffer, after which half of the volume was irradiated with activating light of a certain intensity for 30 minutes, and half was left in the dark as a control. The resulting cell suspensions were plated on Petri dishes in various dilutions and, after overnight growth at 37 ° C, the number of colonies grown was counted.

Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегация" должна быть отличаема от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например, с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации.As used herein, “aggregation” refers to the tendency or ability of an expressed protein to form an insoluble precipitate (aggregates). "Aggregation" should be distinguishable from "oligomerization". In particular, mutants with reduced ability to aggregate, for example, with increased solubility, do not necessarily have a reduced ability to oligomerization.

Как здесь используется, "олигомеризация" относится к сколонности или способности экпрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например, в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, триммеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях, хотя, как здесь описано, флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, pН, нежели pН при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация или иным способом известным в данной области.As used herein, “oligomerization” refers to the propensity or ability of an expressed protein to form complexes (oligomers) as a result of the specific interaction of two or more polypeptides. The specified specific interaction is observed under special conditions, for example, in physiological conditions, and is relatively stable under these conditions. A reference to the “ability” of proteins to oligomerize means that proteins can form dimers, trimmers, tetramers, or similar complexes under special conditions. Typically, fluorescent proteins are capable of oligomerization under physiological conditions, although, as described here, fluorescent proteins can also oligomerize under conditions other than, for example, pH than pH under physiological conditions. The conditions under which fluorescent proteins form oligomers or show a tendency to oligomerization can be determined using well-known methods such as gel filtration or otherwise known in the art.

Ссылка на нуклеотидную последовательность "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидная последовательности кодирующие полипептид включают последовательности, содержащие интроны.Reference to the nucleotide sequence of the "coding" polypeptide means that the polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of mRNA. In this case, both a coding chain identical to mRNA and usually used in the list of sequences can be indicated, as well as a complementary chain that is used as a template for transcription. As is obvious to any person skilled in the art, the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding a polypeptide include sequences containing introns.

Термин "оперативно связанный" или ему подобный при описании химерных белков относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, белок KillerRed или KillerRed-тандем настоящего изобретения может быть сшит с представляющим интерес партнером слияния. В этом случае химерный белок сохраняет фототоксические свойства белка KillerRed, а представляющий интерес полипептид (например гистон H2 B) сохраняет его оригинальную биологическую активность. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют 'сбойки' рамки считывания и стоп-кодоны.The term “operably linked” or the like when describing chimeric proteins refers to polypeptide sequences that are in physical and functional relationship with one another. In the most preferred embodiments, the functions of the polypeptide components of the chimeric molecule are not changed compared with the functional properties of the isolated polypeptide components. For example, the KillerRed or KillerRed tandem protein of the present invention can be crosslinked with a fusion partner of interest. In this case, the chimeric protein retains the phototoxic properties of the KillerRed protein, and the polypeptide of interest (e.g. histone H2 B) retains its original biological activity. As is obvious to any person skilled in the art, nucleotide sequences encoding a chimeric protein including “operably linked” components (proteins, polypeptides, linker sequences, protein domains, etc.) consist of fragments encoding these components, where these the fragments are covalently linked in such a way that a full-sized chimeric protein is produced during translation and transcription of the nucleotide sequence. In other words, the fragments are connected in such a way that there are no “failures” in the reading frame and stop codons at their junctions.

Молекулы нуклеиновых кислотNucleic acid molecules

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот кодирующие химерный белок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:02, 04, 06 и 08 и его варианты.The present invention provides nucleic acid molecules encoding a chimeric protein having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 02, 04, 06 and 08 and its variants.

Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующие области.As used herein, a nucleic acid molecule is a DNA molecule, such as a genomic DNA or cDNA molecule, or an RNA molecule, such as an mRNA molecule. As used here, the term "cDNA" refers to nucleic acids that possess the arrangement of sequence elements found in native mature types of mRNA, where sequence elements are exons and 5 'and 3' non-coding regions.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный белок согласно данному изобретению может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов. Метод хорошо описан в известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот (например, SEQ ID NO:02, 04, 06 или 08.) или информации о нуклеотидной последовательности (например, SEQ ID NO:01, 03, 05 или 07) дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот, несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода может быть синтезировано. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.A nucleic acid molecule encoding a chimeric protein according to this invention can be synthesized from suitable nucleoside triphosphates. The method is well described in protocols known in the art. For example, the availability of amino acid sequence information (e.g., SEQ ID NO: 02, 04, 06, or 08.) or nucleotide sequence information (e.g., SEQ ID NO: 01, 03, 05, or 07) makes it possible to produce isolated nucleic acid molecules the present invention using oligonucleotide synthesis. In the case of amino acid sequence information, several nucleic acids that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code can be synthesized. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art.

Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фргменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method, and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art, such as high performance liquid chromatography (HPLC) or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and according to the instructions described in, for example, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. The long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized in the following stages: several smaller fragments with the necessary complementarity, which contain suitable ends capable of cohesion with the neighboring fragment, can be. Neighboring enzymes can be crosslinked using a DNA ligase or PCR based method.

В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует химерный белок настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии белка в клетке-хозяине. Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которых они находятся в естественных условиях.In some embodiments, the nucleic acid molecule of the present invention is a DNA (or cDNA) molecule containing an open reading frame that encodes a chimeric protein of the present invention and is capable of being used under suitable conditions (e.g., physiological intracellular conditions) for expression of the protein in the host cell . The present invention also encompasses nucleic acids that are homologous, substantially similar, identical, or derived from nucleic acids encoding the proteins of the present invention. These nucleic acids are located in a medium different from the environment in which they are found in vivo, for example, they are isolated, present in an increased amount, are or are expressed in vitro systems or in cells or organisms other than those in which they are located in vivo.

Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высокосходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей таких, как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.Changes or differences in the nucleotide sequence between superior nucleotide sequences can represent nucleotide substitutions in the sequence that occur during normal replication or duplication. Other substitutions can be specifically calculated and inserted into the sequence for specific purposes, such as changing the codons of certain amino acids or the nucleotide sequence of a regulatory region. Such special substitutions can be made in vitro using various mutagenesis technologies or obtained in host organisms under specific breeding conditions that induce or select these changes. Such specially prepared sequence variants may be called “mutants” or “derivatives” of the original sequence.

Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный белок, в состав которой входит последовательность, кодирующая интромолекулярный димер мутантного белка KillerRed также обеспечивается настоящим изобретением. Для нужд данного изобретения мутантный вариант белка KillerRed должен обладать фототоксичностью, не меньшей, чем белок KillerRed, и обладать сходными способностями к олигомеризации. В большинстве случаев, мутантный вариант белка KillerRed имеет GFP-домен, который по крайней мере на 85% идентичен (чаще по крайней мере на 90% идентичен, как правило по крайней мере на 95% идентичен) GFP-домену белка KillerRed. Например указанный GFP-домен может быть по крайней мере на 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичен GFP-домену белка KillerRed.A nucleic acid encoding a chimeric protein, which comprises a sequence encoding an intromolecular dimer of a mutant KillerRed protein, is also provided by the present invention. For the needs of this invention, a mutant version of the KillerRed protein must have phototoxicity no less than the KillerRed protein and have similar oligomerization abilities. In most cases, a mutant version of the KillerRed protein has a GFP domain that is at least 85% identical (more often at least 90% identical, usually at least 95% identical) to the Giller domain of the KillerRed protein. For example, the indicated GFP domain may be at least 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the Giller domain of the KillerRed protein.

Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques, 1993, 14: 22; Barany, Gene, 1985, 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet, 1985, 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации. В некоторых воплощениях флуоресцентные белки, кодируемые мутантными или производными нуклеиновыми кислотами имеют те же самые флуоресцентные или биохимические свойства как флуоресцентный белок дикого типа. В других воплощениях, мутантные или производные нуклеиновые кислоты кодируют флуоресцентные белки с измененными свойствами.Mutant or derivative nucleic acids can be obtained on a matrix nucleic acid selected from the above nucleic acids, by modifying, deleting or adding one or more nucleotides in a matrix sequence or a combination thereof, to obtain a variant of the matrix nucleic acid. Modifications, additions or deletions can be performed by any method known in the art (see, for example, Gustin et al., Biotechniques, 1993, 14:22; Barany, Gene, 1985, 37: 111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet, 1985, 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, CSH Press, pp. 15.3-15.108), including error prone PCR, shuffling , oligonucleotide-directed mutagenesis, assembly PCR, paired PCR mutagenesis, in vivo mutagenesis, cassette mutagenesis, recursive multiple mutagenesis, exponential multiple mutagenesis, site-specific mutagenesis, random mutagenesis, gene rea gene reassembly, gene site-saturating mutagenesis (GSSM), artificial ligation rearrangement (SLR), or combinations thereof. Modifications, additions or deletions can also be performed by a method including recombination, recursive recombination of sequences, phosphotioate-modified DNA mutagenesis, mutagenesis on a uracil-containing matrix, double-pass mutagenesis, mismatch spot recovery mutagenesis, strain mutagenesis, recovery-deficient mutagenesis, radioactive mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction-selective mutagenesis, restriction mutagenesis with purification, synthesis of artificial g new, multiple mutagenesis, creation of multiple chimeric nucleic acids, and combinations thereof. In some embodiments, fluorescent proteins encoded by mutant or derived nucleic acids have the same fluorescent or biochemical properties as wild-type fluorescent protein. In other embodiments, mutant or derivative nucleic acids encode fluorescent proteins with altered properties.

Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (челвека) (Yang et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой. Примеры вырожденных вариантов, представляющих интерес, описаны более подробно в экспериментальной части, ниже.In addition, degenerate nucleic acid variants that encode the proteins of the present invention are also provided. Degenerate nucleic acid variants include substitutions of nucleic acid codons with other codons encoding the same amino acids. In particular, degenerate nucleic acid variants are created to increase expression in the host cell. In this embodiment, nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the genes of the host cell are replaced by codons that are abundantly represented in the coding sequences of the genes in the host cell, where said replaced codons encode the same amino acid. Of particular interest are humanized versions of the nucleic acids of the present invention. As used herein, the term “humanized” refers to substitutions made in a nucleic acid sequence to optimize codons for protein expression in mammalian (human) cells (Yang et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). See also US Patent No. 5,795,737, which describes the humanization of proteins, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Examples of degenerate variants of interest are described in more detail in the experimental part below.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие укороченные и удлиненные варианты белков настоящего изобретения так же входят в рамки настоящего изобретения. Как здесь используется, эти варианты белков содержат аминокислотные последовательности с измененными С-, N-, или обоими концами. В удлиненных вариантах, С- или N-конец белка может содержать дополнительные аминокислотные остатки. В укороченных вариантах одна или более (обычно до 11, чаще до 7 и преимущественно до 5) аминокислотных остатков могут быть удалены из последовательности или заменены на любые другие аминокислотные остатки. Такие модификации не изменяют по существу свойства белков, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например, полупериод распада. В некоторых воплощениях, эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.Nucleic acids encoding truncated and elongated variants of the proteins of the present invention are also included in the scope of the present invention. As used here, these protein variants contain amino acid sequences with altered C-, N-, or both ends. In extended embodiments, the C- or N-terminus of the protein may contain additional amino acid residues. In shortened versions, one or more (usually up to 11, more often up to 7 and mostly up to 5) amino acid residues can be removed from the sequence or replaced with any other amino acid residues. Such modifications do not essentially alter the properties of the proteins, but can facilitate protein folding in the host cell, reduce the ability to aggregate, or modulate other biochemical properties of the proteins, for example, half-life. In some embodiments, these modifications do not alter the biochemical properties of the protein. All types of modifications and mutations mentioned above are carried out at the nucleic acid level.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть, фланкированы одним или более нуклеотидов, - с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.The claimed nucleic acids can be isolated and obtained essentially in purified form. Essentially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, usually at least about 90% pure and usually are “recombinant”, that is, flanked by one or more nucleotides — with which it usually does not bound in the chromosome found naturally in its natural host organism.

Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и много таких векторов доступны коммерчески. Для приготовления конструкции, полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.Also provided are a vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids. Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, etc., of the nucleic acid sequence of the present invention in a suitable host. The selection of a suitable vector is understandable to a person skilled in the art, and many such vectors are commercially available. To prepare the construct, a full-length nucleic acid or part thereof is usually inserted into the vector by attachment of the DNA ligase to the restriction enzyme cleaved site in the vector. Alternatively, the desired nucleotide sequence can be inserted by in vivo homologous recombination, typically by attaching homologous regions to a vector on the flanks of the desired nucleotide sequence. Homologous regions are added by ligation of oligonucleotides or by polymerase chain reaction using primers including, for example, both homologous regions and part of the desired nucleotide sequence.

Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных хромогенных или флуоресцентных белков или химерных белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В экспрессионном векторе, указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистом, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).Also provided are expression cassettes or systems used inter alia to produce the claimed chromogenic or fluorescent proteins or chimeric proteins based on them or to replicate the claimed nucleic acid molecules. The expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the genome of a cell by introducing said expression cassette into the cell. For expression, the gene product encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast, insects, amphibians, or mammalian cells. In an expression vector, said nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inducers. Methods for making expression cassettes or systems for expressing a desired product are known to those skilled in the art. Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (e.g., co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain the gene included in the genome).

Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е.coli, В.subtilis, S.cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, CHO, ооциты Xenopus и т.д.The above expression systems can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts. To obtain the protein, host cells, such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of a higher organism, such as vertebrates, for example, COS 7 cells, HEK 293, CHO, can be used Xenopus oocytes, etc.

Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.If any of the aforementioned host cells or other suitable host cells or organisms are used to replicate and / or express the nucleic acids of the invention, the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as a product of the host cell or organism. The product may be isolated by a suitable method known in the art.

Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для экспрессии гена химерного белка в клетке-хозяине. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотиднвх последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип.Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью указывает на экспрессию гена в образце.The nucleic acid molecules of the present invention can also be used to express a chimeric protein gene in a host cell. A method in which cells are examined for the presence of specific nucleotide sequences, such as genomic DNA or RNA, is well established in the art. Briefly, DNA or mRNA is isolated from a cell sample. mRNA can be amplified by RT-PCR using reverse transcriptase to form a complementary strand of DNA, followed by amplification using a polymerase chain reaction using primers specific for the declared DNA sequences. Alternatively, the mRNA sample is separated by gel electrophoresis, transferred to a suitable carrier, for example, nitrocellulose, nylon, etc., and then tested with a fragment of the claimed DNA as a sample. Other methods may also be used, such as oligonucleotide crosslinking assays, in situ hybridization, and hybridization with DNA probes immobilized onto a solid chip. Detection of mRNA hybridizing with the claimed sequence indicates gene expression in the sample.

БелкиSquirrels

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют химерные белки. Заявленные химерные белки состоят из нескольких оперативно слитых белков, соединенных линкерными последовательностями. Структура химерного белка схематически изображена на рисунке 2. Методы получения химерных белков хорошо известны в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы, могут быть встроены в полилинкер вектора, таким образом, что между различными частями не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов.The nucleic acids of the present invention encode chimeric proteins. The claimed chimeric proteins consist of several operatively fused proteins connected by linker sequences. The structure of the chimeric protein is shown schematically in Figure 2. Methods for producing chimeric proteins are well known in the art. For example, parts of a nucleic acid encoding different elements can be inserted into the polylinker of the vector so that there will be no stop codons between the different parts in the reading frame and there will be no reading frame failures. Alternatively, the desired nucleotide sequence may be assembled from fragments using DNA ligase or PCR with primers containing parts complementary to the terminal sequences of the fragments to be joined.

Химерный белок по данному изобретению включает интрамолекулярный димер (тандем) белка, по существу сходного с белком KillerRed. В состав тандема входят два одинаковых белка, каждый из которых имеет по крайней мере 85% идентичности (например, по крайней мере 90% идентичности, по крайней мере 95% идентичности или более, например 96%, 97%, 98% или 100%) с белком KillerRed и проявляет сходные или усиленные фототоксические свойства. При экспрессии указанных белков в клетках, они способны к интрамолекулярной димеризации.The chimeric protein of the present invention includes an intramolecular dimer (tandem) of a protein substantially similar to the KillerRed protein. The tandem consists of two identical proteins, each of which has at least 85% identity (for example, at least 90% identity, at least 95% identity or more, for example 96%, 97%, 98% or 100%) with KillerRed protein and exhibits similar or enhanced phototoxic properties. When these proteins are expressed in cells, they are capable of intramolecular dimerization.

Интрамолекулярный димер формируется за счет димеризации входящих в его состав белков, по существу сходных с белком KillerRed. Как результат, полученный интрамолекулярный димер проявляет свойства мономера. Например, при анализе очищенного белка вытеснительной хроматографией (гель-фильтрацией) интрамолекулярный димер имеет ту же подвижность, что и исходный белок, формирующий межмолекулярный димер, что показывает отсутствие межмолекулярной олигомеризации в случае оперативно слитого тандемного белка. Также, тандем белков, по существу сходных с белком KillerRed, может быть успешно использован для создания белков слияния с целевыми клеточными белками, чувствительными к олигомеризации флуоресцентного белка, такими как бета-актин, гистоны, коннексины и др. Правильная внутриклеточная локализация и функционирование таких химерных белков показывает, что тандемный белок проявляет свойства мономера.The intramolecular dimer is formed due to the dimerization of its constituent proteins, essentially similar to the KillerRed protein. As a result, the resulting intramolecular dimer exhibits monomer properties. For example, when analyzing a purified protein by size exclusion chromatography (gel filtration), an intramolecular dimer has the same mobility as the original protein forming an intermolecular dimer, which indicates the absence of intermolecular oligomerization in the case of an operatively fused tandem protein. Also, a tandem of proteins essentially similar to the KillerRed protein can be successfully used to create fusion proteins with target cell proteins that are sensitive to the oligomerization of a fluorescent protein, such as beta-actin, histones, connexins, etc. Proper intracellular localization and functioning of such chimeric protein indicates that the tandem protein exhibits monomer properties.

Две входящие в состав интрамолекулярного димера белка связаны друг с другом, как показано на рис.2 с помощью полипептидного линкера. Длина и состав аминокислот линкера может быть различен. Например, длина линкера может быть от 1 аминокислотного основания до 100 аминокислотных оснований, чаще 10-50 аминокислотных оснований, например 20, 25, 30,33, 35, 40, 45 аминокислотных оснований. Последовательность аминокислот линкера может варьировать в широких пределах, так как в большинстве случаев не влияет на функционирование интрамолекулярного димера. Примеры линкерных последовательностей показаны в SEQ ID NO:13 и 14.Two of the intramolecular protein dimers included in the composition are linked to each other, as shown in Fig. 2 using a polypeptide linker. The length and composition of the amino acids of the linker may vary. For example, the length of the linker can be from 1 amino acid base to 100 amino acid bases, more often 10-50 amino acid bases, for example 20, 25, 30,33, 35, 40, 45 amino acid bases. The amino acid sequence of the linker can vary within wide limits, since in most cases it does not affect the functioning of the intramolecular dimer. Examples of linker sequences are shown in SEQ ID NO: 13 and 14.

В некоторых воплощениях, химерный белок по данному изобретению также включает функциональный гистон. Гистоны - это небольшие (120-140 аминокислотных остатков), сильно основные, высококонсервативные белки, находящиеся в ядре клетки и участвующие в укладке геномной ДНК. Гистоны образуют основной элемент организации хроматина - нуклеосомы, вокруг которых закручивается ДНК. Существует пять различных типов гистонов, названных H1/H5, H2A, H2B, H3, H4. Основу нуклеосомы составляют гистоны H2A, H2B, H3, и H4 (по две копии каждого на нуклеосому). Эти гистоны сходны между собой по структуре, представляющей собой характерный мотив «спираль-поворот-спираль-поворот-спираль». Для нужд данного изобретения гистон обеспечивает локализацию химерного белка в ядрах клеток и его связывание с геномной ДНК. Нуклеиновая кислота, кодирующая гистон, оперативно связана с последовательностью, кодирующей интрамолекулярный димер KillerRed с помощью линкерной последовательности, представляющей собой короткий полипептид. Длина линкера может быть от 1 аминокислотного остатка до 50 аминокислотных остатков, чаще 2-20 аминокислотных остатков, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 аминокислотных остатков. Последовательность аминокислот линкера может варьировать в широких пределах, так как в большинстве случаев она не влияет на функционирование входящих в состав химерного белка компонентов. Химерный белок, включающий гистон, обладает способностью локализоваться в ядрах клеток-хозяев и связываться с ядерной ДНК. До перехода в активированное состояние, химерный белок по данному изобретению обладает низкой токсичностью в клетках-хозяевах. До перехода в активированное состояние, химерный белок по данному изобретению обладают способностью к детектируемой флуоресценции. Во многих воплощениях, химерный белок обладают красной или дальне-красной флуоресценцией, то есть имеет максимум возбуждения флуоресценции в диапазоне от приблизительно 450 нм до 700 нм, обычно от приблизительно 470 нм до 650 нм и чаще всего от приблизительно 500 до 600 нм, например, от 550 до 595 нм; тогда как максимум эмиссии заявленного белка лежит в диапазоне от приблизительно 530 до 700 нм, обычно от приблизительно 550 нм до 670 нм и чаще всего от приблизительно 560 до 650 нм, например, от 574 до 637 нм.In some embodiments, the chimeric protein of the present invention also includes functional histone. Histones are small (120-140 amino acid residues), highly basic, highly conserved proteins located in the cell nucleus and involved in the laying of genomic DNA. Histones form the main element of chromatin organization - nucleosomes around which DNA is twisted. There are five different types of histones called H1 / H5, H2A, H2B, H3, H4. The basis of the nucleosome are histones H2A, H2B, H3, and H4 (two copies of each per nucleosome). These histones are similar in structure, which is a characteristic motif of "spiral-rotation-spiral-rotation-spiral." For the needs of this invention, histone provides the localization of a chimeric protein in the nuclei of cells and its binding to genomic DNA. A histone encoding nucleic acid is operably linked to a sequence encoding the KillerRed intramolecular dimer using a linker sequence, which is a short polypeptide. The length of the linker can be from 1 amino acid residue to 50 amino acid residues, usually 2-20 amino acid residues, for example 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 amino acid residues. The amino acid sequence of the linker can vary within wide limits, since in most cases it does not affect the functioning of the components of the chimeric protein. A chimeric protein including histone has the ability to localize in the nuclei of host cells and bind to nuclear DNA. Prior to the transition to an activated state, the chimeric protein of the present invention has low toxicity in host cells. Before transitioning to an activated state, the chimeric protein of the present invention is capable of detectable fluorescence. In many embodiments, the chimeric protein has red or far red fluorescence, that is, has a maximum fluorescence excitation in the range from about 450 nm to 700 nm, usually from about 470 nm to 650 nm, and most often from about 500 to 600 nm, for example from 550 to 595 nm; while the maximum emission of the claimed protein lies in the range from about 530 to 700 nm, usually from about 550 nm to 670 nm, and most often from about 560 to 650 nm, for example, from 574 to 637 nm.

Заявленный белок обычно имеет максимальный коэффициет экстинкции в диапазоне от приблизительно 30,000 до 150,000 и обычно от приблизительно 60,000 до 120,000, например, от 90,000 до 120,000. В некоторых воплощениях, флуоресценция заявленного химерного белка может быть обнаружена обычными способами (например, визуальный скрининг, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, FACS приборами, и т.д.) Яркость флуоресценции белка определяется его квантовым выходом, умноженным на максимальный коэффициент экстинкции и деленным на 1000. В некоторых воплощениях, заявленный белок обладает яркостью флуоресценции в диапазоне от приблизительно 10 до 90, обычно приблизительно от 40 до 80, и чаще всего приблизительно от 50 до 75.The claimed protein usually has a maximum extinction coefficient in the range of from about 30,000 to 150,000 and usually from about 60,000 to 120,000, for example, from 90,000 to 120,000. In some embodiments, the fluorescence of the claimed chimeric protein can be detected by conventional methods (e.g., visual screening, spectrophotometry, spectrofluorimetry, fluorescence microscopy, FACS devices, etc.) The brightness of the protein fluorescence is determined by its quantum yield multiplied by the maximum extinction coefficient and divided by per 1000. In some embodiments, the claimed protein has a fluorescence brightness in the range from about 10 to 90, usually from about 40 to 80, and most often from about 50 d about 75.

Химерный белок по данному изобретению переходит в активированное состояние под действием света определенной длины волны (активирующего света). В некоторых воплощениях, длина волны активирующего света находится в диапазоне приблизительно от 500 до 610 нм, обычно приблизительно от 520 до 590 нм, и чаще всего приблизительно от 540 до 580 нм.The chimeric protein of the present invention goes into an activated state under the influence of light of a specific wavelength (activating light). In some embodiments, the wavelength of the activating light is in the range of about 500 to 610 nm, usually about 520 to 590 nm, and most often about 540 to 580 nm.

В активированном состоянии химерный белок по данному изобретению обладает выраженной токсичностью по отношению к клеткам. В некоторых воплощениях, в активированном состоянии химерный белок по данному изобретению теряет способность к флуоресценции. В некоторых воплощениях, в активированном состоянии химерный белок по данному изобретению способен к продукции активных форм кислорода.In the activated state, the chimeric protein of the present invention has pronounced toxicity to cells. In some embodiments, in the activated state, the chimeric protein of this invention loses its fluorescence ability. In some embodiments, when activated, the chimeric protein of the invention is capable of producing reactive oxygen species.

В некоторых воплощениях, химерный белок по данному изобретению быстро созревает после экспрессии в клетке-хозяине. Под быстрым созреванием понимается то, что белок достигает своей третичной структуры, которая обеспечивает его спектральные и фототоксические свойства, за короткий период времени. В этих воплощениях, белок укладывается в течение периода времени, который в общем случае не превышает приблизительно 36 ч, обычно не превышает приблизительно 48 ч и чаще не превышает приблизительно 24 ч (например, полупериод укладки может быть 3-5 часов).In some embodiments, the chimeric protein of the present invention matures rapidly after expression in the host cell. By rapid maturation is meant that the protein reaches its tertiary structure, which provides its spectral and phototoxic properties, in a short period of time. In these embodiments, the protein is laid over a period of time that generally does not exceed about 36 hours, usually does not exceed about 48 hours, and more often does not exceed about 24 hours (for example, a half-period of laying may be 3-5 hours).

Специфические белки, представляющие интерес, включают химерный белок, выбранный из SEQ ID No:02, 04, 06 и 08; и его функциональные мутанты.Specific proteins of interest include a chimeric protein selected from SEQ ID No: 02, 04, 06 and 08; and its functional mutants.

Мутанты могут сохранять свойства исходного белка или могут иметь биологические свойства, отличные от форм исходного белков. Термин "биологические свойства" белков настоящего изобретения относится, но не лимитирован, спектральными свойствами, такими как максимум возбуждения флуоресценции, максимум испускания, максимальный коэффициент экстинкции, яркость (например, по сравнению с референсным белков), фотостабильность и подобные; биохимические свойства, такие как in vivo и/или in vitro стабильность (например, полупериод распада); скорость созревания, склонность к агрегации и склонность к олигомеризации и другие подобные свойства (по сравнению с референсным белком). Мутации включают единичные аминокислотные замены, делеции и инсерции одной или более аминокислот, укорочение или удлинение N-конца, укорочение или удлинение С- конца и тому подобное.Mutants may retain the properties of the parent protein or may have biological properties different from the forms of the parent protein. The term "biological properties" of the proteins of the present invention includes, but is not limited to, spectral properties, such as maximum fluorescence excitation, maximum emission, maximum extinction coefficient, brightness (for example, compared with reference proteins), photo stability and the like; biochemical properties such as in vivo and / or in vitro stability (for example, half-life); maturation rate, a tendency to aggregation and a tendency to oligomerization, and other similar properties (compared to a reference protein). Mutations include single amino acid substitutions, deletions and insertions of one or more amino acids, shortening or lengthening of the N-terminus, shortening or lengthening of the C-terminus, and the like.

Мутанты могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе "молекулы нуклеиновых кислот" выше. Примеры обеспечивают общие приемы, и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить большой ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например биохимическое, спектральное, и т.д.) свойство. Например, интенсивность флуоресценции может быть измерена с использованием спектрофлуориметра при различных длинах волн возбуждения.Mutants can be obtained using standard methods of molecular biology, as described in detail in the section "nucleic acid molecules" above. The examples provide general techniques and the use of standard methods, so that those skilled in the art can easily obtain a large number of additional mutants and check whether the biological (e.g., biochemical, spectral, etc.) property has been changed. For example, fluorescence intensity can be measured using a spectrofluorimeter at various excitation wavelengths.

Также обеспечиваются белки, которые по существу сходны с указанными выше специфическими белками, где по существу сходны означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности исходного белка, по крайней мере, на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, 90% и чаще, по крайней мере, 95%, (например 95% и выше; 96% и выше, 97% и выше; 98% и выше: 99% и выше или 100% идентичности последовательности).Also provided are proteins that are substantially similar to the above specific proteins, where substantially similar means that these proteins have an amino acid sequence identical to the sequence of the original protein, at least 85% identity, usually at least 90%, and more often, at least 95% (for example, 95% and higher; 96% and higher, 97% and higher; 98% and higher: 99% and higher or 100% sequence identity).

Белки настоящего изобретения присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они рекомбинантны. Белки настоящего изобретения могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин "по существу свободны" в этом случае означает, что меньше чем 70%, обычно меньше чем 60% и чаще меньше чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой некоторые другие биологические молекулы, чем встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях, белки присутствуют в по существу очищенной форме, где "по существу очищенная форма" означает очищенная по меньшей мере на 95%, обычно по меньшей мере на 97% и чаще по меньшей мере на 99%.The proteins of the present invention are present in an environment different from their natural environment; for example, they are recombinant. The proteins of the present invention can be in an isolated state, which means that the proteins are substantially free of other proteins and other biological molecules present in the natural environment, such as oligosaccharides, nucleic acids and fragments thereof and the like, where the term "essentially free "in this case means that less than 70%, usually less than 60% and more often less than 50% of the composition containing the isolated protein, are some other biological molecules than those found in nature. In some embodiments, the proteins are present in a substantially purified form, where “substantially purified form” means purified at least 95%, usually at least 97%, and more often at least 99%.

Заявленные белки могут быть получены искусственным путем, например, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано выше. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, афинной хроматографии и т.п.The claimed proteins can be obtained artificially, for example, by expression of a recombinant nucleic acid encoding a sequence of a protein of interest in an appropriate host, as described above. For protein purification, any conventional methodology may be employed where suitable protein purification methods are described in Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990). For example, a lysate may be prepared from a source and purified using HPLC, size exclusion chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, and the like.

Также обеспечиваются антитела, которые специфически связываются с флуоресцентным белком настоящего изобретения. Подходящие антитела могут быть получены, с использованием способов, известных в данной области. Например, поликлональные антитела могут быть получены как описано в (Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), и моноклональные антитела могут быть получены как описано в (Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3 rd edition, 1996, Academic Press). Химерные антитела, включая гуманизированные антитела, так же как одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')2 и Fab также представляют интерес.Antibodies that specifically bind to the fluorescent protein of the present invention are also provided. Suitable antibodies can be prepared using methods known in the art. For example, polyclonal antibodies can be obtained as described in (Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), and monoclonal antibodies can be obtained as described in (Coding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3 rd edition, 1996, Academic Press). Chimeric antibodies, including humanized antibodies, as well as single chain antibodies and antibody fragments such as Fv, F (ab ') 2 and Fab are also of interest.

ТрансформантыTransformants

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут использованы для получения трансформатов, включая трансгенных организмов или сайт-специфичных генных изменений в клеточных линиях. Трансгенные клетки заявленные в изобретении, содержат одну или более нуклеиновых кислот, заявленных по настоящему изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактирии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека, такими способами как технологии трансгеноза, которые известны в данной области.The nucleic acids of the present invention can be used to obtain transformers, including transgenic organisms or site-specific gene changes in cell lines. The transgenic cells of the invention comprise one or more nucleic acids of the invention as a transgene. For the purposes of the invention, any suitable host cell can be used, including prokaryotic (e.g., Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, etc.) or eukaryotic host cells. A transgenic organism of the invention may be a prokaryotic or eukaryotic organism, including bacteria, cyanobacteria, fungi, plants, and animals in which one or more cells of the body contain a heterogeneous nucleic acid of the invention, introduced by human intervention, by methods such as technologies transgenosis, which are known in the art.

Выделенная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть. ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечивается в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 nd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).The isolated nucleic acid of the present invention can be introduced into the host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or trans-conjugation. Methods for transferring a nucleic acid molecule (i.e., DNA) into such organisms are widely known and provided in references such as Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 nd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

В одном воплощении, трансгенный организм может быть прокариотическим организмом. Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons, Inc).In one embodiment, the transgenic organism may be a prokaryotic organism. Methods of transforming prokaryotic hosts are well described in the art (e.g., see Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons, Inc).

В другом воплощении, трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжами. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например см. Goodey et al Yeast biotechnology, D R Berry et al, eds, 1987, Alien and Unwin, London, p.401) и King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G Т Yarronton, eds, Blackie, Glasgow, 1989, p.107). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторых.In another embodiment, the transgenic organisms may be fungi, for example, yeast. Yeast is widely used as a carrier for expression of a heterogeneous gene (e.g. see Goodey et al Yeast biotechnology, DR Berry et al, eds, 1987, Alien and Unwin, London, p.401) and King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, EF Walton and G.T. Yarronton, eds, Blackie, Glasgow, 1989, p. 107). Several types of yeast vectors are available, including integrative vectors that require recombination with the host genome to support them, and autonomously replicating plasmid vectors.

Другой организм хозяина является животным. Трансгенные животные могут быть получены способами трансгеноза, известными в данной области и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition, 2203; San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3 rd ed, 2002; Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed.,, 2002; Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition, 2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC, и т.п.Another host organism is an animal. Transgenic animals can be obtained by transgenosis methods known in the art and are provided in references such as Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition, 2203; San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, 2002; Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed. ,, 2002; Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition, 2000). For example, transgenic animals can be obtained by homologous recombination, where the endogenous locus changes. Alternatively, the nucleic acid construct is randomly incorporated into the genome. Vectors for sustainable incorporation include plasmids, retroviruses and other animal viruses, YAC, and the like.

Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в прекурсор клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, а предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому или они являться внехромосомными реплицирующими ДНК.Nucleic acids can be introduced into a cell directly or indirectly, by introducing into a cell precursor, by intentional genetic manipulation, such as microinjection or infection with a recombinant virus or recombinant viral vector and the like. The term “genetic manipulation” does not include classical cross-fertilization or in vitro fertilization, but is preferably directed to the introduction of recombinant nucleic acid molecules. These nucleic acid molecules can be included in the chromosome or they can be extrachromosomal replicating DNA.

Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, где ген имеет желательную генетическую модификацую(ции) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекции. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих, см. Keown et al., Meth. Enzymol, 1990, 185: 527-537.DNA constructs for homologous recombination will contain at least a portion of the nucleic acid of the present invention, where the gene has the desired genetic modification (s) and includes homology regions with a target locus. DNA constructs for arbitrary incorporation do not necessarily contain a region of homology with a recombination mediator. Markers for positive and negative selection can easily be included. Methods for producing cells having targeted gene modifications through a homologous combination are known in the art. For various methods for transfecting mammalian cells, see Keown et al., Meth. Enzymol, 1990, 185: 527-537.

Для эмбриональных стволовых (ЭС) клеток могут быть использованы ЭС клеточные линии или эмбриональные клетки могут быть получены непосредственно от хозяина, такого как мышь, крыса, морская свинка и т.д. Такие клетки выращиваются на подходящем фибропласт-питающем слое или в присутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF). Трансформированные ЭС или эмбриональные клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных, с помощью подходящего способа, описанного в данной области.For embryonic stem (ES) cells, ES cell lines can be used, or embryonic cells can be obtained directly from a host, such as a mouse, rat, guinea pig, etc. Such cells are grown on a suitable fibroblast-feeding layer or in the presence of leukemia inhibition factor (LIF). Transformed ES or embryonic cells can be used to produce transgenic animals using a suitable method described in this field.

Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку, (например мышь, крыса), птица или амфибия и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п. Характерные примеры использования трансгенных животных включают те, которые описанные ниже.Transgenic animals can be any non-human animals, including a non-human mammal (e.g., mouse, rat), bird or amphibian, etc., and are used in functional research, drug screening, and the like. Representative examples of the use of transgenic animals include those described below.

Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах СИТА №№5767367; 5750870; 5739409; 5689049; 5689045; 5674731; 5656466; 5633155; 5629470; 5595896; 5576198; 5538879; 5484956, раскрытия которых включены сюда ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) 1993, p.275 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), 2002, p.719.Transgenic plants can also be obtained. Methods for producing transgenic plant cells and plants are described in CITA patents No. 5767367; 5,750,870; 5,739,409; 5,689,049; 5,689,045; 5,674,731; 5656466; 5,633,155; 5,629,470; 5,595,896; 5,576,198; 5,538,879; 5,484,956, the disclosures of which are incorporated herein by reference. Methods for producing transgenic plants are also discussed in Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) 1993, p. 275 and Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), 2002, p. 719.

Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей, экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов, возникает возможность для введения через ДНК-опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбираются, выращиваются в каллус, и в конечном счете в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами и отношениями стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины. Другие подходящие способы получения растения могут использоваться, такие, как применение "генной пушки", или Agrobacterium-опосредованная трансформация, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области.For example, embryogenic explants containing somatic cells can be used to produce a transgenic host. After collecting cells or tissues, exogenous DNA of interest is introduced into the plant cells, and a number of different methods are known for such introduction. When isolated protoplasts are present, it is possible to introduce through DNA-mediated gene transfer protocols, including incubating protoplasts with purified DNA, such as a plasmid containing the desired exogenous sequence of interest in the presence of polyvalent cations (e.g., PEG or PLO); or electroporation of protoplasts in the presence of isolated DNA, including the target exogenous sequence. Protoplasts that successfully incorporate exogenous DNA are then selected, grown in callus, and ultimately in a transgenic plant in contact with suitable amounts and ratios of stimulatory factors such as auxins and cytokines. Other suitable plant production methods may be used, such as the use of a "gene gun", or Agrobacterium-mediated transformation, which are available to those skilled in the art.

Способы примененияApplication methods

Белки настоящего изобретения являются генетически кодируемыми флуоресцентными белками - фотосенсибилизаторами, проявляющими рекордные фототоксические свойства при облучении светом, более чем в 1000 раз превышающую токсичность других известных зеленых и красных флуоресцентных белков, включая AvGFP. Они могут быть использованы для селективной инактивации интересующих белков и селективного подавления клеточных делений и пролиферации клеток с адресной доставкой с помощью вирусных векторов и других методов.The proteins of the present invention are genetically encoded fluorescent proteins, photosensitizers, exhibiting record phototoxic properties when exposed to light, more than 1000 times greater than the toxicity of other known green and red fluorescent proteins, including AvGFP. They can be used for the selective inactivation of proteins of interest and the selective suppression of cell divisions and cell proliferation with targeted delivery using viral vectors and other methods.

Для осуществления селективной инактивации интересующих белков, должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая белок KillerRed-tandem, оперативно связанный с интересующим белком (партнером слияния). Получение таких конструкций очевидно для любого специалиста в данной области. Полученная конструкция должна быть встроена в вектор, обеспечивающий временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Вектор может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток вектором и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии (химерного белка), может быть осуществлена инактивация интересующего белка путем облучения клеток или клеточных компартментов активирующим светом.For selective inactivation of the proteins of interest, a nucleic acid encoding a KillerRedtandem protein operatively linked to the protein of interest (fusion partner) must be obtained. Obtaining such designs is obvious to any person skilled in the art. The resulting construct should be integrated into a vector that provides for temporary or permanent expression of this nucleic acid in host cells. The vector may contain elements that provide targeted delivery of the structure to the cells of interest, or is part of the particles that provide targeted delivery. After transfection of the cells with the vector and after the time necessary for the expression product (chimeric protein) to accumulate in the cells, the protein of interest can be inactivated by irradiating the cells or cell compartments with activating light.

Для осуществления селективного подавления клеточных делений и пролиферации клеток, должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая белок KillerRed-tandem, оперативно связанный с гистоном (например, гистоном H2B), или другими белками или пептидами, обеспечивающими доставку химерного белка в ядра клеток. Полученная конструкция должна быть введена в клетку (например, в составе экспрессионного вектора). По истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии (химерного белка), клетки облучают активирующим светом достаточной интенсивности, чтобы вызвать блокирование клеточных делений и пролиферации. Примеры подобного использования описаны в экспериментальной части ниже.In order to selectively suppress cell division and cell proliferation, a nucleic acid encoding a KillerRed-tandem protein operatively linked to a histone (e.g., histone H2B) or other proteins or peptides providing delivery of a chimeric protein to the cell nucleus must be obtained. The resulting construct must be introduced into the cell (for example, as part of an expression vector). After the time required for the expression product (chimeric protein) in the cells to expire, the cells are irradiated with activating light of sufficient intensity to cause blocking of cell divisions and proliferation. Examples of such use are described in the experimental part below.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.The following examples are provided as illustrative but not limiting.

Пример 1Example 1

Создание интрамолекулярного димера KillerRedCreating an Intramolecular KillerRed Dimer

Для преодоления негативных последствий межмолекулярной димеризации белка KillerRed был сконструирован вектор, кодирующий две копии белка KillerRed, соединенные аминокислотным линкером (рис.2). В этом случае две копии KillerRed формируют интрамолекулярный димер (тандем), который по сути является мономерной меткой.To overcome the negative consequences of intermolecular dimerization of the KillerRed protein, a vector was constructed that encodes two copies of the KillerRed protein connected by an amino acid linker (Fig. 2). In this case, two copies of KillerRed form an intramolecular dimer (tandem), which is essentially a monomeric label.

Для создания тандема были использованы два типа линкерных последовательностей GHGTGSTGSGSSGTASSEDNNMA (SEQ ID NO:13), и короткий линкер, имеющий аминокислотную последовательность RSPG (SEQ ID NO:14). Было показано, что оба варианта созревают в клетках Е.coli и обладают фототоксическим действием.To create a tandem, two types of linker sequences GHGTGSTGSGSSGTASSEDNNMA (SEQ ID NO: 13), and a short linker having the amino acid sequence RSPG (SEQ ID NO: 14) were used. It was shown that both variants mature in E. coli cells and have a phototoxic effect.

Пример 2Example 2

Исследование фототоксических свойств тандема KillerRed (tKR) в бактериальных клеткахInvestigation of the phototoxic properties of the KillerRed tandem (tKR) in bacterial cells

Тандемные варианты KillerRed были полученны как описано в примере 1. Для сравнения фототоксичности KillerRed и tKR компетентные клетки Е.coli были трансформированы плазмидами на основе вектора pQE30 (Qiagen), обеспечивающими синтез данных белков. Колонии выращивали в течение ночи при 37°C и далее чашки инкубировали 3 дня при 4°C для полного созревания белка. По одной колонии KillerRed и tKR разбалтывали в 0.1 мл буфера PBS, после чего половину объема 30 мин облучали белым светом интенсивностью 1 Вт/см2, а половину оставляли в темноте в качестве контроля. Полученные суспензии клеток высевали на чашки Петри в различных разведениях и после ночного роста при 37°С подсчитывали число выросших колоний. Сравнение количества колоний в облученном и необлученном образцах позволяло оценить количество клеток, погибших от облучения светом. Эти эксперименты показали, что KillerRed и tKR обладают приблизительно одинаковой фототоксичностью для бактериальных клеток (в указанных условиях свет вызывал гибель около 99.9% клеток).KillerRed tandem variants were prepared as described in Example 1. To compare the phototoxicity of KillerRed and tKR, E. coli competent cells were transformed with plasmids based on the pQE30 vector (Qiagen), which provided the synthesis of these proteins. The colonies were grown overnight at 37 ° C and then the plates were incubated for 3 days at 4 ° C for complete maturation of the protein. One colony KillerRed and tKR were blotted in 0.1 ml PBS buffer, after which half of the volume was irradiated with white light at an intensity of 1 W / cm 2 for 30 minutes, and half was left in the dark as a control. The resulting cell suspensions were plated on Petri dishes in various dilutions and, after overnight growth at 37 ° C, the number of grown colonies was counted. A comparison of the number of colonies in the irradiated and unirradiated samples allowed us to estimate the number of cells that died from exposure to light. These experiments showed that KillerRed and tKR have approximately the same phototoxicity for bacterial cells (under these conditions, light caused the death of about 99.9% of the cells).

Пример 3Example 3

Использование tKR для мечения β-актинаUsing tKR for labeling β-actin

Многие клеточные белки чувствительны к олигомеризации флуоресцентных белков, используемых для их мечения. В частности, к таким белкам принадлежит β-актин. Например, при экспрессии в клетках млекопитающих β-актина, слитого с димерным белком KillerRed, наблюдается образование агрегатов. Тандемные варианты KillerRed были полученны, как описано в Примере 1. Для подтверждения мономерного состояния tKR внутри клетки был сконструированы векторы для экспрессии химерного белка tKR-β-актин. Для этого нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты tKR и нукленовая кислота KillerRed (вырезанная из коммерчески доступного вектора pKillerRed-C, Евроген) были клонированы в коммерчески доступный вектор pmKate2-actin (Евроген, Россия) вместо фрагмента нуклеиновой кислоты mKate2. Векторы были использованы для трансфекции клеток HeLa. Флуоресцентная микроскопия клеток HeLa, экспрессирующих данный вектор, показала ожидаемое внутриклеточное распределение красного флуоресцентного сигнала, соответствующее паттерну актина и полностью совпадающее с зеленым сигналом при ко-трансфекции с контрольным вектором, кодирующим химерный белок EGFP-β-актин.Many cellular proteins are sensitive to oligomerization of the fluorescent proteins used to label them. In particular, β-actin belongs to such proteins. For example, when mammalian cells express β-actin fused to the KillerRed dimeric protein, aggregation is observed. KillerRed tandem variants were prepared as described in Example 1. To confirm the monomeric state of tKR inside the cell, vectors were constructed to express the chimeric protein tKR-β-actin. For this, the nucleic acids encoding the tKR variants and the KillerRed nucleic acid (cut from the commercially available pKillerRed-C vector, Eurogen) were cloned into the commercially available pmKate2-actin vector (Eurogen, Russia) instead of the mKate2 nucleic acid fragment. Vectors were used to transfect HeLa cells. Fluorescence microscopy of HeLa cells expressing this vector showed the expected intracellular distribution of the red fluorescent signal, corresponding to the actin pattern and completely coinciding with the green signal when co-transfected with a control vector encoding the chimeric protein EGFP-β-actin.

Пример 4Example 4

Использование tKR для мечения гистона H2BUsing tKR for labeling histone H2B

Для мечения гистона Н2 В были сконструированы векторы, кодирующие химерные белки, в которых С-конец Н2 В слит с последовательностью KillerRed или tKR через аминокислотный линкер DPPVATLEAT (SEQ ID NO:15), названные соответственно H2B-KillerRed и H2B-tKR (рис.2). Флуоресцентная микроскопия клеток млекопитающих (линии НЕК293, HeLa, HeLa Kyoto), временно трансфицированных вектором H2B-KillerRed, показала, что красный сигнал обладает ожидаемым внутриклеточным распределением, характерным для гистона Н2 В: были окрашены ядра клеток с паттерном интерфазного хроматина. Вместе с тем, флуоресцентных клеток, находящихся на различных стадиях митоза, обнаружено не было. Длительные наблюдения за клетками показали, что клетки, несущие H2B-KillerRed, не способны к делению. Это, очевидно, является следствием нарушения структуры хроматина из-за димеризации KillerRed в составе химерного белка H2B-KillerRed.To label histone H2 B, vectors encoding chimeric proteins were constructed in which the C-terminus of H2 B is fused to the KillerRed or tKR sequence via the amino acid linker DPPVATLEAT (SEQ ID NO: 15), named H2B-KillerRed and H2B-tKR, respectively (Fig. 2). Fluorescence microscopy of mammalian cells (HEK293, HeLa, HeLa Kyoto lines) temporarily transfected with the H2B-KillerRed vector showed that the red signal had the expected intracellular distribution characteristic of histone H2 B: cell nuclei with an interphase chromatin pattern were stained. However, no fluorescent cells at various stages of mitosis were detected. Long-term observation of cells showed that cells carrying H2B-KillerRed are not capable of division. This, obviously, is a consequence of the violation of the chromatin structure due to the dimerization of KillerRed in the composition of the chimeric protein H2B-KillerRed.

Напротив, при экспрессии вектора H2B-tKR нарушений митоза выявлено не было. Так, при временной трансфекции этим вектором клеток млекопитающих (линии НЕК293, HeLa, HeLa Kyoto) наблюдался ожидаемый паттерн внутриклеточной локализации красного флуоресцентного сигнала, соответствующий не только интерфазному хроматину, но и различным стадиям митотического деления. Подсчет количества митозов за определенный промежуток времени (с помощью флуоресцентной микроскопии) показал, что трансфицированные клетки с H2B-tKR делятся приблизительно с той же частотой, что и нетрансфицированные. Таким образом, H2B-tKR не обладает существенной цитотоксичностью (в темновых условиях).In contrast, mitosis was not detected in the expression of the H2B-tKR vector. So, during transient transfection of mammalian cells with this vector (HEK293, HeLa, HeLa Kyoto lines), the expected pattern of intracellular localization of the red fluorescent signal was observed, which corresponded not only to interphase chromatin, but also to various stages of mitotic division. Counting the number of mitoses over a given period of time (using fluorescence microscopy) showed that transfected cells with H2B-tKR divide at approximately the same frequency as non-transfected ones. Thus, H2B-tKR does not have significant cytotoxicity (in dark conditions).

Пример 5Example 5

Приготовление стабильно-трансфицированных линий клеток млекопитающихPreparation of stably transfected mammalian cell lines

Линия клеток HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующая химерный белок H2B-tKR, была получена с помощью лентивирусной трансдукции. Для этого открытая рамка считывания H2B-tKR было клонирована в лентивирусный вектор pRRLSIN.EFl.WPRE. Трансдукция была проведена согласно стандартным протоколам. Популяция клеток с наибольшей интенсивностью красной флуоресценции была отобрана с помощью проточного флуоресцентного клеточного сортера MoFlo (Dako). Полученная линия стабильно экспрессировала H2B-tKR. Флуоресцентная микроскопия показала ожидаемый паттерн внутриклеточной локализации красного флуоресцентного сигнала, соответствующий интерфазному хроматину и различным стадиям митотического деления. Анализ распределения клеток по стадиям клеточного цикла (G1, S и G2/M) с помощью окраски ДНК йодидом пропидия и проточной цитофлуориметрии показал нормальное количество делящихся клеток в линии HeLa Kyoto H2B-tKR, сходное с таковым в исходной линии HeLa Kyoto.The HeLa Kyoto cell line stably expressing the chimeric H2B-tKR protein was obtained by lentiviral transduction. For this, the open reading frame of H2B-tKR was cloned into the lentiviral vector pRRLSIN.EFl.WPRE. Transduction was performed according to standard protocols. The population of cells with the highest intensity of red fluorescence was selected using a flow-through fluorescent cell sorter MoFlo (Dako). The resulting line stably expressed H2B-tKR. Fluorescence microscopy showed the expected pattern of intracellular localization of the red fluorescence signal, corresponding to interphase chromatin and various stages of mitotic division. Analysis of the distribution of cells by the stages of the cell cycle (G1, S and G2 / M) using DNA staining with propidium iodide and flow cytometry showed a normal number of dividing cells in the HeLa Kyoto H2B-tKR line, similar to that in the original HeLa Kyoto line.

Пример 6Example 6

Анализ фототоксичности H2B-tKRH2B-tKR Phototoxicity Analysis

Фототоксический эффект H2B-tKR первоначально изучали при помощи флуоресцентной микроскопии. В первой серии экспериментов клетки линии HeLa Kyoto, временно или стабильно экспрессирующие H2B-tKR, облучали зеленым светом с помощью флуоресцентного микроскопа (540-580 нм, 0,5 Вт/см2, 2 мин),. Затем продолжали наблюдение за облученными клетками с помощью флуоресцентного микроскопа в течение 48 часов. В течение первых 24 часов наблюдалось полное блокирование клеточного деления в клетках, экспрессирующих H2B-tKR. В течение этого времени ядра клеток сохраняли интерфазную морфологию, ни одна из клеток не поделилась. В то же время, клетки, не экспрессирующие H2B-tKR, сохраняли способность к делению и количество их удвоилось в течение эксперимента. Все облученные клетки, как экспрессирующие H2B-tKR, так и контрольные, не проявляли признаков клеточной гибели (открепления от субстрата, сжатия цитоплазмы, блеббинга (пузырения) мембраны).The phototoxic effect of H2B-tKR was initially studied using fluorescence microscopy. In the first series of experiments, HeLa Kyoto cells temporarily or stably expressing H2B-tKR were irradiated with green light using a fluorescence microscope (540-580 nm, 0.5 W / cm 2 , 2 min). Then continued monitoring of the irradiated cells using a fluorescence microscope for 48 hours. During the first 24 hours, complete blocking of cell division was observed in cells expressing H2B-tKR. During this time, the cell nuclei maintained interphase morphology; not one of the cells was divided. At the same time, cells not expressing H2B-tKR retained the ability to divide and their number doubled during the experiment. All irradiated cells, both expressing H2B-tKR and control, did not show signs of cell death (detachment from the substrate, compression of the cytoplasm, membrane bleeding (blistering)).

Для того чтобы выяснить, повреждается ли ДНК при облучении клеток, экспрессирующих H2B-tKR, был использован белок XRCC1 (X-ray cross complementing factor 1), слитый с желтым флуоресцентным белком (EYFP). Белок XRCC1 является центральной платформой для сборки комплексов, осуществляющих репарацию ДНК. Ранее было показано, что XRCC1 немедленно перераспределяется к местам повреждения ДНК. Клетки HeLa Kyoto были котрансфицированы плазмидами для экспрессии EYFP-XRCC1 и H2B-tKR и анализировались с помощью флуоресцентной микроскопии до и после облучения. Как и ожидалось, до облучения флуоресцентный сигнал EYFP-XRCC1 был равномерно распределен в ядрах интерфазных клеток. Кроме того, часто наблюдались единичные яркие точки, предположительно, соответствующие активным репаративным комплексам. Вскоре после облучения зеленым светом EYFP-XRCC1 быстро (1-3 мин) перераспределялся и формировал множество ярких фокусов флуоресценции в ядрах клеток, экспрессирующих H2B-tKR. В контрольных клетках, экспрессирующих только EYFP-XRCC1, такого перераспределения не наблюдалось. Приведенные данные свидетельствуют об активации системы репарации ДНК, а следовательно, о возникновении повреждений геномной ДНК. Повреждения ДНК, в свою очередь, вероятно, вызывают активацию сверенных точек (чекпойнтов, от англ. checkpoint) клеточного цикла, вызывающих остановку клеточного цикла. После успешной репарации ДНК интерфазные клетки могут восстанавливать способность к пролиферации.In order to find out whether DNA is damaged by irradiating cells expressing H2B-tKR, the XRCC1 protein (X-ray cross complementing factor 1) fused to the yellow fluorescent protein (EYFP) was used. The XRCC1 protein is the central platform for the assembly of DNA repair complexes. It was previously shown that XRCC1 is immediately redistributed to DNA damage sites. HeLa Kyoto cells were cotransfected with plasmids for expression of EYFP-XRCC1 and H2B-tKR and analyzed using fluorescence microscopy before and after irradiation. As expected, before irradiation, the EYFP-XRCC1 fluorescent signal was evenly distributed in the nuclei of interphase cells. In addition, single bright points were often observed, presumably corresponding to active reparative complexes. Shortly after green light irradiation, EYFP-XRCC1 quickly redistributed (1-3 min) and formed many bright fluorescence foci in the nuclei of cells expressing H2B-tKR. In control cells expressing only EYFP-XRCC1, such a redistribution was not observed. These data indicate the activation of the DNA repair system, and therefore, the occurrence of damage to genomic DNA. DNA damage, in turn, is likely to cause activation of checkpoints (checkpoints, from the English. Checkpoint) of the cell cycle, causing a stop of the cell cycle. After successful DNA repair, interphase cells can restore proliferation ability.

Для изучения воздействия H2B-tKR на митоз, клетки, находящиеся на момент начала эксперимента в метафазе митоза, облучали с помощью флуоресцентного микроскопа (540-580 нм, 0,5 Вт/см2, 2 мин). Во всех случаях после этого наблюдалось нерасхождение хромосом. Интересно, что в большинстве случаях, цитокинез начинался практически без задержки (по сравнению с контрольными облученными клетками, не экспрессирующими H2B-tKR, а также по сравнению с необлученными клетками, экспрессирующими H2B-tKR). Однако клетки были неспособны нормально завершить деление. Хромосомы оставались соединенными, не наблюдалось инициации анафазы, а в дальнейшем, после начала цитокинеза, образовавшаяся перетяжка либо пропадала, либо цитокинез проходил до конца, но отделялась лишь небольшая часть деконденсированного хроматина. В конечном итоге, образовавшиеся тетраплоидные клетки возвращались к интерфазной морфологии.To study the effect of H2B-tKR on mitosis, cells that were at the beginning of the experiment in the metaphase of mitosis were irradiated using a fluorescence microscope (540-580 nm, 0.5 W / cm 2 , 2 min). In all cases after this, chromosome nondisjunction was observed. Interestingly, in most cases, cytokinesis started almost without delay (compared to control irradiated cells not expressing H2B-tKR, as well as compared to unirradiated cells expressing H2B-tKR). However, the cells were unable to complete the division normally. Chromosomes remained connected, anaphase initiation was not observed, and later, after the onset of cytokinesis, the resulting constriction either disappeared or the cytokinesis passed to the end, but only a small part of the decondensed chromatin was separated. Ultimately, the resulting tetraploid cells returned to interphase morphology.

Claims (4)

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая оперативно слитый интрамолекулярный димер белка KillerRed, оперативно слитый с гистоном, обеспечивающим локализацию химерного белка в ядрах клеток-хозяев, где химерный белок вызывает блокирование клеточных делений и пролиферации при облучении активирующим светом и имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6.1. A nucleic acid encoding an operatively fused intramolecular dimer of the KillerRed protein, operatively fused with a histone, which provides localization of the chimeric protein in the nuclei of the host cells, where the chimeric protein blocks cell divisions and proliferation when irradiated with activating light and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. 2. Кассета экспрессии, содержащая (а) регион инициации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине; (б) нуклеиновую кислоту по п.1; и (в) регион терминации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине, которая будучи интегрированной в геном клетки или при введении в клетку в виде внехромосомного элемента способна обеспечить экспрессию белка, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1.2. An expression cassette containing (a) a transcription initiation region functional in a host cell; (b) the nucleic acid according to claim 1; and (c) a transcription termination region functional in the host cell, which, when integrated into the genome of the cell or when introduced into the cell as an extrachromosomal element, is capable of providing expression of the protein encoded by the nucleic acid according to claim 1. 3. Клетка, продуцирующая химерный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, и содержащая кассету экспрессии по п.2 как часть экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки как результат внедрения указанной кассеты в указанную клетку.3. A cell producing a chimeric protein encoded by a nucleic acid according to claim 1, and containing the expression cassette according to claim 2 as part of an extrachromosomal element or integrated into the cell genome as a result of the introduction of the indicated cassette into the specified cell. 4. Химерный белок, который кодируется нуклеиновой кислотой по п.1, где указанный белок имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:6 и вызывает в клетках по п.3 блокирование клеточных делений и пролиферации при облучении. 4. The chimeric protein that is encoded by the nucleic acid according to claim 1, where the specified protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and causes the cells according to claim 3 to block cell divisions and proliferation upon irradiation.
RU2011149819/10A 2011-12-07 2011-12-07 ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN RU2491342C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011149819/10A RU2491342C1 (en) 2011-12-07 2011-12-07 ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011149819/10A RU2491342C1 (en) 2011-12-07 2011-12-07 ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011116353/10A Division RU2458129C1 (en) 2011-04-25 2011-04-25 ISOLATED KillerRed PROTEIN-CODING NUCLEIC ACID (VERSIONS), ISOLATED PROTEIN (VERSIONS), EXPRESSION CASSETTE, CELL CONTAINING EXPRESSION CASSETTE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011149819A RU2011149819A (en) 2013-06-20
RU2491342C1 true RU2491342C1 (en) 2013-08-27

Family

ID=48784939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011149819/10A RU2491342C1 (en) 2011-12-07 2011-12-07 ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2491342C1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BULINA M.E., LUKYANOV K.A., BRITANOVA O.V., ONICHTCHOUK D., LUKYANOV S., CHUDAKOV D.M. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 2006; 1(2):947-53. SEREBROVSKAYA E.O., GORODNICHEVA T.V., ERMAKOVA G.V., SOLOVIEVA E.A., SHARONOV G.V., ZAGAYNOVA E.V., CHUDAKOV D.M., LUKYANOV S., ZARAISKY A.G., LUKYANOV K.A. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Biochem J. 2011 Aprl; 435(1): 65-71. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011149819A (en) 2013-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2395581C2 (en) Novel fluorescent proteins from entacmaea quadricolor and method of obtaining said proteins
JP5465649B2 (en) Novel fluorescent protein derived from Aequorea coerulescens and method of use thereof
RU2412250C2 (en) Modified green fluorescent proteins and methods of their application
JP4480674B2 (en) Fluorescent protein derived from Copepoda species and method of using the protein
ES2254043T3 (en) FLUORESCENT PROTEINS AND CHROMOPROTEINS OF HYDROZO SPECIES THAT ARE NOT AEQUOREA AND METHODS FOR USE.
US7358336B2 (en) Fluorescent protein from Montastraea cavernosa
RU2458129C1 (en) ISOLATED KillerRed PROTEIN-CODING NUCLEIC ACID (VERSIONS), ISOLATED PROTEIN (VERSIONS), EXPRESSION CASSETTE, CELL CONTAINING EXPRESSION CASSETTE
US8206978B2 (en) Green fluorescent protein optimized for expression with self-cleaving polypeptides
RU2491342C1 (en) ISOLATED NUCLEIC ACID, ENCODING OPERATIVELY FUSED INTRAMOLECULAR DIMER OF KillerRed PROTEIN, EXPRESSION CASSETTE, CELL, WHICH PRODUCES CHIMERIC PROTEIN AND CONTAINS EXPRESSION CASSETTE, ISOLATED CHIMERIC PROTEIN
RU2493260C2 (en) Isolated nucleic acid coding fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide, expression cassette, cell that produces biosensor, isolated fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide, isolated nucleic acid that codes fluorescent biosensor, efficiently fused with nucleic acid that codes signal of intracellular localisation
RU2599443C2 (en) Modified genetically coded photosensitizer
RU2515903C2 (en) Isolated nucleic acid coding fluorescent biosensor, expression cassette, cell, producing fluorescent biosensor, isolated fluorescent biosensor
RU2535981C1 (en) Nucleic acid encoding fret-based far-red biosensor for intracellular caspase 3 activity measurement
RU2535336C1 (en) Red fluorescent biosensor for detection of hydrogen peroxide in living cells
US8563703B2 (en) Fluorescent proteins and methods for using same
RU2338785C2 (en) Fluorescing proteins and chromoproteins from kinds hydrozoa which are not concerning to aequorea, and methods of their obtaining
US7091318B2 (en) mmFP encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use thereof
RU2603060C2 (en) Modified biosensor for detecting intracellular ph
EP1908775A1 (en) Fluorescent proteins from the Ctenophora phylum and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150426

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20160620

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170426