RU2535872C2 - СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ - Google Patents
СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2535872C2 RU2535872C2 RU2013113997/10A RU2013113997A RU2535872C2 RU 2535872 C2 RU2535872 C2 RU 2535872C2 RU 2013113997/10 A RU2013113997/10 A RU 2013113997/10A RU 2013113997 A RU2013113997 A RU 2013113997A RU 2535872 C2 RU2535872 C2 RU 2535872C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- activator
- days
- activity
- peptone
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения протеиназы - активатора протеина С плазмы крови предусматривает твердофазное культивирование штамма гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D на питательной среде. При этом питательная среда содержит при определенном соотношении следующие компоненты: твердый субстрат или носитель, глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, NaCl, KH2PO4, MgSO4·7H2O, воду. В качестве твердого субстрата или носителя используют вермикулит, пенополиуретан, силикагель или пшеничные отруби. Изобретение позволяет получить целевой продукт с повышенной активностью. Активность протеиназы составляет до 300 Е/мл. 5 табл., 15 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека.
Активаторы протеина С используются в медицине для диагностики содержания протеина С в плазме крови человека. При недостатке протеина С в крови снижается активность его активированной формы, что обусловливает возникновение тромбоэмболических осложнений с возможным летальным исходом [1]. В связи с этим актуальным является диагностика содержания протеина С в крови [2], которую осуществляют с использованием в диагностических препаратах (Protac® фирмы PENTHAPHARM (Швейцария)) специфических протеиназ - активаторов протеина С [3].
Известен способ получения активатора протеина С из яда щитомордника Agkistrodon contortrix contortrix [4]. Недостатками его являются крайняя сложность добывания и ограниченность яда щитомордника как источника активатора протеина С.
Известен способ получения активатора протеина С с использованием глубинного культивирования штаммов микроскопических грибов Aspergillus ochraceus 1, Penicillium claviforme 2, P. granulatum 7, Alternaria sp.10, [5] и штамма Aspergillus ochraceus 513, культуральная жидкость которых обладает антикоагулянтными свойствами [6].
Наиболее близким к предлагаемому способу, который следует принять за ближайший аналог, является способ получения активатора протеина С путем культивирования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D или Aspergillus ochraceus ВКМ F-4105D, или Aspergillus ochraceus BKM F-4106D, или Aspergillus ochraceus BKM F-4107D в течение 2-х суток при 28°С на посевной среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон и в течение 2 суток на качалке на ферментационной среде, содержащей (в %): глюкоза - 3,2-3,8, крахмал - 0,1-0,5, гидролизат рыбной муки - 0,5-1,0, пептон - 0,1-0,5, NaCl - 0,1-0,2, KH2PO4 - 0,04-0,06, MgSO4·7H2O - 0,04-0,06, воду до 100%, начальный рН 6,5 (патент РФ №2468081). Этот способ позволяет получить культуральную жидкость, содержащею протеиназу - активатор протеина С с активностью 79,8-89,9 Е/мл, где единица активности - количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль·10-3 п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин [7].
Недостатком ближайшего аналога является низкий выход фермента.
Задачей настоящего изобретения является повышение выхода активатора протеина С и разработка стандартных условий для его получения.
Задача решается:
1) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D - продуцента активатора протеина С;
2) разработкой нового способа получения активаторов протеина С, предусматривающего культивирование в течение 3-7 суток продуцирующего его штамма микроскопического гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D на ферментационной среде, содержащей глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния, воду, отличающегося тем, что ферментационная среда содержит твердый сыпучий субстрат или твердый сыпучий носитель, в качестве которых используют пшеничные отруби, силикагель, вермикулит или пенополиуретан.
3) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
вермикулит - 14,0-20,0,
глюкоза - 2,5-3,0,
крахмал - 0,4- 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
KH2PO4 - 0,035-0,040,
MgSO4·7H2O- 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
4) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
пенополиуретан - 7,0-15,0,
глюкоза - 3,0-3,3,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6-0,7,
пептон - 0,25-0,30,
NaCl - 0,09-0,13,
KH2PO4 - 0,04-0,05,
MgSO4·7H2O - 0,04-0,05,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
5) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
силикагель - 35,0-45,0,
глюкоза- 1,9-2,3,
крахмал - 0,3-0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,40-0,50,
пептон - 0,20-0,30,
NaCl - 0,08-0,10,
KH2PO4 - 0,03-0,04,
MgSO4·7H2O - 0,03-0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
6) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
пшеничные отруби - 22,0,-28,0,
глюкоза - 2,5-2,8,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6,
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
KH2PO4 - 0,035-0,040,
MgSO4·7H2O - 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
По завершению культивирования 0,05 М Трис-HCl буфером (рН 8,2) проводят экстракцию активаторов протеина С из среды на орбитальной качалке. Жидкую фракцию отделяют от биомассы и остатков компонентов среды с помощью фильтрования (центрифугирования).
Выделение внеклеточных ферментов с активаторным к протеину С действием из жидкой фракции проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в 0,005 М Трис-HCl буфере (рН 8,2) или дистилированной воде, удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°С против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 [5]. Полученный раствор протеиназы - активатора протеина С хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения.
Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D выделен А.В. Кураковым, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов и является активным продуцентом внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С [8].
Пример 1.
Посевной материал Aspergillus ochraceus BKM F-4104D получают путем культивирования в пробирках скошенного сусло-агара 4-5° Балинга. К заспоровавшейся культуре 6-8 суточного возраста добавляют стерильный 0,0005% раствор Твин-80 и путем смыва готовят споровую суспензию продуцента. Засев проводят 1 мл суспензии в конические колбы объемом 250 мл с 30,0 г ферментационной среды следующего состава (в%):
вермикулит - 17,0
глюкоза - 2,6,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,4,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Вермикулит (по 5,0 г) и жидкую среду (25,0 мл) стерилизуют раздельно и затем смешивают в колбах.
Твердофазное культивирование проводят в стационарных условиях при 28°С.
По истечении 7 суток культивирования проводят экстракцию ферментов - активаторов протеина С. В колбы добавляют 35 мл 0,05 М Трис-HCl буфера (рН 8,2) и помещают на орбитальную качалку (200 об/мин) на 40-60 мин. Далее проводят отделение жидкой фракции от биомассы с помощью фильтрования (центрифугирования).
В полученном фильтрате (надосадочной жидкости) определяют активаторную к протеину С активность по методике [9] с использованием хромогенного пептидного субстрата pGlu-Pro-Arg-pNA (пироглутамил-пролил-аргинил-пара-нитроанилид) [10, 11]. Активированный протеин С плазмы крови специфично отщепляет п-нитроанилин (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA. За единицу активности активатора протеина С принимают то количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль·10-3 п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин в 1 мл при рН 8,2 и 37°С.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 300 Е/мл ферментационной среды (без учета веса вермикулита).
Пример 2.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):
вермикулит - 20,0.
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
KH2PO4 - 0,040,
MgSO4·7H2O - 0,035-0,040.
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Для этого в конических колбах объемом 250 мл смешивают 4,0 г вермикулита и 16,0 мл жидкой среды.
Активность активатора протеина С при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D на данной среде составляет 290 Е/мл ферментационной среды.
Пример 3.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):
вермикулит - 14,0.
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
KH2PO4 - 0,040,
MgSO4·7H2O - 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Для этого в конических колбах объемом 250 мл смешивают 4,0 г вермикулита и 24,0 мл ферментационной среды.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 235 Е/мл ферментационной среды.
Пример 4.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание проводят в течение 5 суток и используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан -11,0,
глюкоза - 3,2,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,11,
KH2PO4 - 0,04,
MgSO4·7H2O - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 131,8 Е/мл ферментационной среды.
Пример 5.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 4, но используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан - 15,0,
глюкоза - 3,3,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,7,
пептон - 0,30,
NaCl - 0,13,
KH2PO4 - 0,05,
MgSO4·7H2O - 0.05,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 125,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 6.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 4, но используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан - 7,0,
глюкоза - 3,0,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
KH2PO4 - 0,04,
MgSO4·7H2O - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 126,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 7.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 4 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
силикагель - 35,0,
глюкоза - 1.9,
крахмал - 0,3,
гидролизат рыбной муки - 0,40,
пептон - 0,20,
NaCl - 0,08,
KH2PO4 - 0,03,
MgSO4·7H2O - 0,03,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 185,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 8.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 4 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
силикагель - 45,0,
глюкоза - 2,3,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,50,
пептон - 0,30,
NaCl - 0,10,
KH2PO4 - 0,04,
MgSO4·7H2O - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 191,1 Е/мл ферментационной среды.
Пример 9.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 6 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 22,0,
глюкоза - 2,5,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,5,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 100,9 Е/мл ферментационной среды.
Пример 10.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 6 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 28,0,
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
KH2PO4 - 0,040,
MgSO4·7H2O - 0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 99,1 Е/мл ферментационной среды.
Пример 11.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с вермикулитом в качестве носителя по примеру 1. Активность активатора протеина С определяют ежесуточно со 2-х до 8-х суток (табл.1).
| Таблица 1 | |||||||
| Носитель | Активаторная к протеину С активность, Е/мл | ||||||
| 2 сут | 3 сут | 4 сут | 5 сут | 6 сут | 7 сут | 8 сут | |
| Вермикулит | 98,1 | 104,7 | 110,4 | 148,2 | 180,3 | 300,0 | 256,9 |
| коэффициент вариации данных - 4% | |||||||
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D растет от 98,1 Е /мл (2-е сутки) и достигает наибольших значений 148,2-300 Е/мл ферментационной среды на 5-7 сутки, а снижается при более длительном культивировании (256,9 Е /мл на 8 сутки).
Пример 12.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с пенополиуретаном в качестве носителя по примеру 4, но продолжительность выращивания составляет 2, 3, 4, 5 и 6 суток. Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 3-5 сутки, 111,0-131,8 Е/мл ферментационной среды (табл.2).
| Таблица 2 | |||||
| Носитель | Активаторная к протеину С активность, Е/мл | ||||
| 2 сут | 3 сут | 4 сут | 5 сут | 6 сут | |
| Пенополиуретан | 88,7 | 111,0 | 118,4 | 131,8 | 94,6 |
| коэффициент вариации данных - 2% | |||||
Пример 13.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с силикагелем в качестве носителя по примеру 7, но выращивание ведут в течение 2-х, 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти и 7-ми суток и используют среду следующего состава (в %):
силикагель - 40,0
глюкоза - 2,1,
крахмал - 0,35,
гидролизат рыбной муки - 0,45,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 3-5 сутки с максимумом 200,0 Е /мл ферментационной среды на 4 сутки (табл.3).
| Таблица 3 | ||||||
| Носитель | Активаторная к протеину С активность, Е/мл | |||||
| 2 сут | 3 сут | 4 сут | 5 сут | 6 сут | 7 сут | |
| Силикагель | 148,3 | 152,7 | 200,0 | 156,3 | 146,3 | 135,4 |
| коэффициент вариации данных - 3% | ||||||
Пример 14.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с пшеничными отрубями по примеру 9, но выращивание ведут в течение 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти и 7-ми суток и используют среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 25,0,
глюкоза - 2,7,
крахмал - 0,45,
гидролизат рыбной муки - 0,55,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,07
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 4-6 сутки, 98,3-102,0 Е /мл ферментационной среды (табл.4).
| Таблица 4 | |||||
| Твердый субстрат | Активаторная к протеину С активность, Е/мл | ||||
| 3 сут | 4 сут | 5 сут | 6 сут | 7 сут | |
| Пшеничные отруби | 84,4 | 98,3 | 116,3 | 102,0 | 80,4 |
| коэффициент вариации данных - 2% | |||||
Пример 15. Сравнение предлагаемого способа и ближайшего аналога
Сравнение активаторной к протеину С активности в культуральной жидкости штамма A. ochraceus BKM F-4104D при культивировании 7 суток по предлагаемому способу на среде, содержащей (в %):
вермикулит - 17,0
глюкоза - 2,6,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,4,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5;
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 4 суток на среде, содержащей (в %):
силикагель - 40,0
глюкоза - 2,1,
крахмал - 0,35,
гидролизат рыбной муки - 0,45,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5;
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 5 суток на среде, содержащей (в %):
пенополиуретан - 11,0,
глюкоза - 3,2,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0.11,
KH2PO4 - 0,04,
MgSO4·7H2O - 0,04,
вода остальное,
начальный рН 6,5.
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 4 суток на среде, содержащей (в %):
пшеничные отруби - 25,0,
глюкоза - 2,7,
крахмал - 0,45,
гидролизат рыбной муки - 0,55,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,07
KH2PO4 - 0,035,
MgSO4·7H2O - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5.
и при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D по ближайшему аналогу, на ферментационной среде с начальным рН 6,5, содержащей (в %):
глюкоза - 3,5,
крахмал - 0,1,
гидролизат рыбной муки - 1,0,
пептон - 0,1,
NaCl - 0,2,
KH2PO4 - 0,05,
MgSO4·7H2O - 0,05,
воду до 100%,
начальный рН 6,5;
показывает, что по предлагаемому способу твердофазного культивирования получают более высокую активаторную к протеину С активность (на 13-250%) в зависимости от твердого субстрата или носителя в ферментационной среде (табл.5).
| Таблица 5 | |
| Вариант | Активаторная к протеину С активность, Е/мл |
| Способ - ближайший аналог глубинного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D | 86,1 |
| Предлагаемый способ твердофазного культивирования A ochraceus BKM F-4104D с вермикулитом в ферментационной среде | 300,0 |
| Предлагаемый способ твердофазного культивирования A ochraceus BKM F-4104D с силикагелем в ферментационной среде | 200.0 |
| Предлагаемый способ твердофазного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D с пенополиуретаном в ферментационной среде | 131,8 |
| Предлагаемый способ твердофазного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D с пшеничными отрубями в ферментационной среде | 116,3 |
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить культуральную жидкость с более высокой активностью протеиназы - активатора протеина С.
Литература
1. Коган А.Е., Струкова С.М. 1993. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтного действия. Биохимия, 58, 6, 827-844.
2. Gempeler-Messina P.M., Volz К., Buhler В., Muller С.2001. Protein С activators from snake venoms and their diagnostic use. Haemostasis, 31, 266-272.
3. Martinoli J.L., Stoker K. 1986. Fast functional protein С assay using Protac®, a novel protein С activator. Thromb. Res., 43, 253-256.
4. Stoker К., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L., 1987. Characterization of the protein С activator Protac® from the venom of southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake. Toxicon, 25, 3, 239-252.
5. Ландау Н.С., Кураков А.В., Гуликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С.1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами. Микробиология, 67, 2, 215-220.
6. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С.2001. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология. 70, 5, 602-606.
7. Патент РФ №2468081.
8. Патент РФ №2461614.
9. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Кураков А.В., Баранова Н.А., Егоров Н.С. 2012. Микромицеты Aspergillus ochraceus - продуценты внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С плазмы крови. Прикладная биохимия и микробиология, 48, 5, 537-542.
10. Sakata Т., Hatsuyama H., Kitamura Т., Hekida К., Katayama J., Matsumata T. Study of chromogenic substrate on protein С activity assay - in patients treated with narfarin. Rinsho Byori. 1990. V.38, №8, P.937-941.
11. Dang Q.D., Cera E.D., 1997. Chromogenic Substrates selective for activated protein C. Blood, 89, 2220-2221.
Claims (1)
- Способ получения протеиназы - активатора протеина С плазмы крови, путем культивирования штамма микроскопического гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, отличающийся тем, что проводят твердофазное культивирование на ферментационной среде при следующем составе компонентов, %:
вермикулит - 14,0-20,0,
глюкоза - 2,5-3,0,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6,
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
KH2PO4 - 0,035-0,040,
MgSO4·7H2O - 0,035-0,040,
вода - до 100%;
или при следующем соотношении компонентов, %:
пенополиуретан - 7,0-15,0,
глюкоза - 3,0-3,3,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6-0,7,
пептон - 0,25-0,30,
NaCl - 0,09-0,13,
KH2PO4 - 0,04-0,05,
MgSO4·7H2O - 0,04-0,05,
вода - до 100%;
или при следующем соотношении компонентов, %:
силикагель - 35,0-45,0,
глюкоза - 1,9-2,3,
крахмал - 0,3-0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,40-0,50,
пептон - 0,20-0,30,
NaCl - 0,08-0,10,
KH2PO4 - 0,03-0,04,
MgSO4·7H2O - 0,03-0,04,
вода - до 100%;
или при следующем соотношении компонентов, %:
пшеничные отруби - 22,0,-28,0,
глюкоза - 2,5-2,8,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6,
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
KH2PO4 - 0,035-0,040,
MgSO4·7H2O - 0,035-0,040,
вода - до 100%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013113997/10A RU2535872C2 (ru) | 2013-03-29 | 2013-03-29 | СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013113997/10A RU2535872C2 (ru) | 2013-03-29 | 2013-03-29 | СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013113997A RU2013113997A (ru) | 2013-10-20 |
| RU2535872C2 true RU2535872C2 (ru) | 2014-12-20 |
Family
ID=49357024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013113997/10A RU2535872C2 (ru) | 2013-03-29 | 2013-03-29 | СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2535872C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819794C1 (ru) * | 2023-11-09 | 2024-05-24 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"(НИУ "БелГУ") | Способ получения фракции виолацеина при поверхностном твердофазном культивировании штамма Janthinobacterium lividum B-3705D |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2184976C1 (ru) * | 2000-11-30 | 2002-07-10 | ООО фирма "Технология-Стандарт" | Способ получения активатора протеина с |
| RU2461614C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-09-20 | Александр Андреевич Осмоловский | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека |
| RU2468081C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-11-27 | Александр Андреевич Осмоловский | Способ получения протеиназы - активатора протеина с плазмы крови |
-
2013
- 2013-03-29 RU RU2013113997/10A patent/RU2535872C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2184976C1 (ru) * | 2000-11-30 | 2002-07-10 | ООО фирма "Технология-Стандарт" | Способ получения активатора протеина с |
| RU2461614C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-09-20 | Александр Андреевич Осмоловский | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека |
| RU2468081C2 (ru) * | 2011-03-09 | 2012-11-27 | Александр Андреевич Осмоловский | Способ получения протеиназы - активатора протеина с плазмы крови |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BATOMUNKUEVA B.P. ET AL. Isolation, purification and resolution of the extracellular proteinase complex of Aspergillus ochraceus 513 with fibrinolytic and anticoagulant activities // Microbiology, vol. 70, no. 5, 2001, pp. 519-522. HASSANEIN W.A. ET AL. Fibrinolysis and anticoagulant potential of a metallo protease produced by Bacillus subtilis K42 // J. Biosci. 36(5), 2011, pp. 1-7 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819794C1 (ru) * | 2023-11-09 | 2024-05-24 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"(НИУ "БелГУ") | Способ получения фракции виолацеина при поверхностном твердофазном культивировании штамма Janthinobacterium lividum B-3705D |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013113997A (ru) | 2013-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shieh et al. | Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto | |
| Chan et al. | Interaction of antagonistic yeasts against postharvest pathogens of apple fruit and possible mode of action | |
| Das et al. | Isolation, purification & mass production of protease enzyme from Bacillus subtilis | |
| Niyonzima et al. | Screening and optimization of cultural parameters for an alkaline protease production by Aspergillus terreus gr. under submerged fermentation | |
| CN109971657B (zh) | 一种高产糖化酶的米根霉及其应用 | |
| RU2461614C2 (ru) | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека | |
| Yegin et al. | Production of extracellular aspartic protease in submerged fermentation with Mucor mucedo DSM 809 | |
| Paranthaman et al. | Optimization of various culture media for tannase production in submerged fermentation by Aspergillus flavus | |
| RU2468081C2 (ru) | Способ получения протеиназы - активатора протеина с плазмы крови | |
| CN101134951B (zh) | 一种纤溶酶的培制方法 | |
| Ahmad et al. | Isolation and identification fibrinolytic protease endophytic fungi from Hibiscus leaves in Shah Alam | |
| RU2535872C2 (ru) | СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ | |
| CN103391997A (zh) | 来自布尔弗雷德耳霉（conidiobolus brefeldianus）的酶及其制备方法 | |
| RU2664468C2 (ru) | Способ получения протеиназ с фибринолитической и фибриногенолитической активностями | |
| Prabhavathy et al. | Identification of industrially important alkaline protease producing Bacillus subtilis by 16s rRNA sequence analysis and its applications | |
| KR20050106303A (ko) | 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｃｈｋｊ1339균주 | |
| CN105754975A (zh) | 一种耐盐性蛋白酶的提取及缩短鱼露发酵时间的应用方法 | |
| Sani et al. | Production and screening of Streptomyces-extracellular chitinase | |
| RU2461616C2 (ru) | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека | |
| Irfan et al. | Exploitation of Different Agro-residues for Acid protease Production by Rhizopus sp. in Koji Fermentation | |
| RU2310685C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров | |
| RU2460772C2 (ru) | Штамм aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы - активатора протеина с плазмы крови человека | |
| Oyeleke et al. | Production of bacterial amylase by Bacillus species isolated from rice husk dumpsites in Sokoto metropolis, Nigeria | |
| RU2687344C1 (ru) | Способ получения протеиназы - активатора x фактора плазмы крови | |
| Kazi et al. | Keratinolytic activity exhibited in an indigenous non-dermatophytic fungus strain Cochliobolus lunatus isolated from Khairpur Sindh Pakistan |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150330 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20160527 |