RU2531502C2 - Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue - Google Patents
Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue Download PDFInfo
- Publication number
- RU2531502C2 RU2531502C2 RU2011133305/10A RU2011133305A RU2531502C2 RU 2531502 C2 RU2531502 C2 RU 2531502C2 RU 2011133305/10 A RU2011133305/10 A RU 2011133305/10A RU 2011133305 A RU2011133305 A RU 2011133305A RU 2531502 C2 RU2531502 C2 RU 2531502C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- stromal cells
- tissue
- cell
- alpha
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии и может быть использовано для восстановления тканей, поврежденных в результате травм и развития патологии, связанной с ишемией. Предлагается способ усиления регенеративной способности стромальных клеток жировой ткани при их введении в область поврежденной ткани, путем прекондиционирования этих клеток в присутствии провоспалительного агента, фактора некроза опухолей-альфа.The present invention relates to the field of cell biology, cell transplantology and tissue engineering and can be used to repair tissue damaged by trauma and the development of pathology associated with ischemia. A method is proposed for enhancing the regenerative ability of stromal cells of adipose tissue when they are introduced into the area of damaged tissue by preconditioning these cells in the presence of a pro-inflammatory agent, tumor necrosis factor-alpha.
Уровень техникиState of the art
Одно из интенсивно развивающихся направлений современной медицины связано с использованием стволовых и мезенхимальных клеток для частичного или полного восстановления морфологической и функциональной целостности тканей организма, поврежденных вследствие травмы или развития патологического процесса (например, ишемии).One of the rapidly developing areas of modern medicine is the use of stem and mesenchymal cells to partially or completely restore the morphological and functional integrity of body tissues damaged due to trauma or the development of a pathological process (for example, ischemia).
В настоящее время все большее развитие для целей клеточной терапии приобретает введение в поврежденную область стромальных клеток жировой ткани.Currently, the introduction of adipose tissue into the damaged area of stromal cells is gaining more and more development for the purpose of cell therapy.
Применение для этих целей стромальных клеток жировой ткани связано с рядом преимуществ ввиду относительной простоты их выделения и легкой доступности источника, - жировой ткани (Madonna et al., Adipose tissue-derived stem cells: characterization and potential for cardiovascular repair. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009; 29(11): 1723-1729).The use of adipose stromal cells for these purposes has several advantages in view of the relative simplicity of their isolation and the easy accessibility of the source, adipose tissue (Madonna et al., Adipose tissue-derived stem cells: characterization and potential for cardiovascular repair. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009; 29 (11): 1723-1729).
Клеточный материал, используемый в регенеративной медицине для введения в пораженную область, должен удовлетворять ряду требований:Cellular material used in regenerative medicine for introduction into the affected area must satisfy a number of requirements:
1. Легкая приживаемость, отсутствие реакции отторжения.1. Easy survival, lack of rejection reaction.
2. Способность к миграции в поврежденную область и пролиферация.2. The ability to migrate to the damaged area and proliferation.
3. Способность к дифференцировке в клетки, аналогичные клеточной популяции поврежденной ткани.3. The ability to differentiate into cells similar to the cell population of damaged tissue.
4. Способность к секреции факторов, способствующих ранозаживлению, в т.ч. ангиогенных факторов.4. The ability to secrete factors contributing to wound healing, including angiogenic factors.
Наличие или отсутствие отторжения организмом хозяина во многом определяется иммуномодулирующими свойствами стромальных клеток. В настоящее время известно, что стромальные клетки имеют ряд механизмов, позволяющих им, по крайней мере, локально подавлять функцию иммунных и иммунокомпетентных клеток (Shi et al., Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression and tissue repair. Cell Res. 2010; 20(5): 510-518).The presence or absence of host rejection is largely determined by the immunomodulatory properties of stromal cells. It is now known that stromal cells have a number of mechanisms that allow them to at least locally suppress the function of immune and immunocompetent cells (Shi et al., Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression and tissue repair. Cell Res. 2010; 20 (5): 510-518).
Способность стромальных клеток к миграции определяется градиентом концентрации хемокина, секретируемого клетками поврежденной ткани, а также наличием специфических рецепторов к хемокинам на поверхности мигрирующих клеток (Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells. 2007; 25(7): 1737-1745). Стромальные клетки жировой ткани имеют на своей поверхности рецепторы к некоторым ростовым факторами хемокинам, что определяет специфический характер их миграции (Amos et al., Functional binding of human adipose-derived stromal cells: effects of extraction method and hypoxia pretreatment. Ann Plast Surg. 2008; 60(4): 437-444). Кроме того, для осуществления миграции необходима адгезия (прикрепление) клеток к субстрату, роль которого играют белковые компоненты внеклеточного матрикса.The ability of stromal cells to migrate is determined by the concentration gradient of the chemokine secreted by the cells of the damaged tissue, as well as by the presence of specific chemokine receptors on the surface of the migrating cells (Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells. 2007; 25 (7): 1737-1745). Adipose stromal cells on their surface have receptors for certain growth factors chemokines, which determines the specific nature of their migration (Amos et al., Functional binding of human adipose-derived stromal cells: effects of extraction method and hypoxia pretreatment. Ann Plast Surg. 2008 ; 60 (4): 437-444). In addition, the migration requires the adhesion (attachment) of cells to a substrate, the role of which is played by the protein components of the extracellular matrix.
Исследования, проведенные на культуре стромальных клеток, показали, что они способны дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях (Balwierz et al., Human adipose tissue stromal vascular fraction cells differentiate depending on distinct types of media. Cell Prolif. 2008; 41(3): 441-459). Вместе с тем способность к дифференцировке в условиях введения в область повреждения имеет ограниченный характер и не всегда определяет регенеративный потенциал стромальных клеток.Studies on stromal cell culture have shown that they are capable of differentiating in adipogenic, osteogenic and chondrogenic directions (Balwierz et al., Human adipose tissue stromal vascular fraction cells differentiate depending on distinct types of media. Cell Prolif. 2008; 41 (3 ): 441-459). At the same time, the ability to differentiate under conditions of introduction into the lesion area is limited and does not always determine the regenerative potential of stromal cells.
Очень важную роль в ранозаживлении играет способность стромальных клеток к секреции ряда трофных агентов, в особенности регуляторов ангиогенеза (Rehman et al., Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109(10): 1292-1298). Это связано с формированием новых сосудов (реваскуляризацией) поврежденной ткани. Образование капилляров и более крупных сосудов способствует доставке в ткань кислорода и питательных веществ и в немалой степени стимулируется развитием гипоксии, неизбежной при повреждении ткани и являющейся важным регулятором процессов ее последующего восстановления (Amos et al., The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 2008; 26(10): 2682-2690).The ability of stromal cells to secrete a number of trophic agents, especially angiogenesis regulators (Rehman et al., Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109 (10): 1292-1298) plays a very important role in wound healing. . This is due to the formation of new vessels (revascularization) of the damaged tissue. The formation of capillaries and larger vessels promotes the delivery of oxygen and nutrients to the tissue and is to a large extent stimulated by the development of hypoxia, which is inevitable in the event of tissue damage and is an important regulator of the processes of its subsequent restoration (Amos et al., The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype. Stem Cells. 2008; 26 (10): 2682-2690).
Первичной реакцией на повреждение является развитие процесса воспаления (Costa et al., Angiogenesis and chronic inflammation: cause or consequence? Angiogenesis. 2007; 10(3): 149-166), связанное с привлечением в ткань воспалительных клеток, секрецией ими провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) и вырабатываемых под влиянием этого цитокина ИЛ-1-бета, ИЛ-6 и некоторых других (Jackson et al., The codependence of angiogenesis and chronic inflammation. FASEB J. 1997; 11(6): 457-65; Smolen et al., Pro-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis: pathogenetic and therapeutic aspects. Clin Rev Allergy Immunol 28: 239-248).The primary response to damage is the development of the inflammation process (Costa et al., Angiogenesis and chronic inflammation: cause or consequence? Angiogenesis. 2007; 10 (3): 149-166), associated with the involvement of inflammatory cells in the tissue, their secretion of pro-inflammatory cytokines - tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and produced under the influence of this cytokine IL-1-beta, IL-6 and some others (Jackson et al., The codependence of angiogenesis and chronic inflammation. FASEB J. 1997; 11 (6 ): 457-65; Smolen et al., Pro-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis: pathogenetic and therapeutic aspects. Clin Rev Allergy Immunol 28: 239-248).
Секретируемый воспалительными клетками ФНО-альфа, обладающий множественным воздействием на клеточную физиологию, способен, среди прочих активностей, оказывать ангиогенное действие, способствуя формированию новых сосудов в ткани (Sainson et al., TNF primes endothelial cells for angiogenic sprouting by inducing a tip cell phenotype. Blood. 2008; 111(10): 4997-5007). Имеются также сведения о том, что ФНО-альфа усиливает миграцию мезенхимальных клеток и стромальных клеток костного мозга (Fu et al., Migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by tumor necrosis factor-alpha and its possible role in wound healing. Wound Repair Regen. 2009; 17(2): 185-191; Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchimal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells 2007; 25: 1737-1745).Secreted by inflammatory cells, TNF-alpha, which has multiple effects on cellular physiology, is capable, among other activities, of exerting an angiogenic effect, promoting the formation of new vessels in the tissue (Sainson et al., TNF primes endothelial cells for angiogenic sprouting by inducing a tip cell phenotype. Blood. 2008; 111 (10): 4997-5007). There is also evidence that TNF-alpha enhances the migration of mesenchymal cells and bone marrow stromal cells (Fu et al., Migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by tumor necrosis factor-alpha and its possible role in wound healing. Wound Repair Regen. 2009; 17 (2): 185-191; Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchimal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells 2007; 25: 1737-1745 )
Стромальные клетки жировой ткани представляют собой популяцию, сходную по своему фенотипу и экспрессионному профилю с мезенхимальными клетками костного мозга (Gronthos et al., Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol, 2001; 189(1): 54-63). Наличие на поверхности стромальных клеток рецепторов к некоторым факторам роста (PDGF-ВВ, EGF и ряда других) сближает их с перицитами - клетками сосудистой стенки и позволяет предположить, что они обладают способностью мигрировать по градиенту концентрации этих факторов, а также некоторых хемокинов, рецепторы которых обнаруживаются на поверхности мезенхимальных клеток (Fu et al., Migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by tumor necrosis factor-alpha and its possible role in wound healing. Wound Repair Regen. 2009; 17(2): 185-191; Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchimal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells 2007; 25: 1737-1745). Кроме того, стромальные клетки жировой ткани способны секретировать факторы, препятствующие клеточному апоптозу и способствующие повышению жизнеспособности клеток (Hong et al., Therapeutic potential of adipose-derived stem cells in vascular growth and tissue repair. Curr Opin Organ Transplant. 2010; 15(1): 86-91). Сходство с перицитами позволяет надеяться на способность стромальных клеток жировой ткани к образованию контактов с эндотелием, способствующему формированию сосудов (Merfeld-Clauss et al., Adipose tissue progenitor cells directly interact with endothelial cells to induce vascular network formation. Tissue Eng Part A. 2010; 16(9): 2953-2966).Adipose stromal cells are a population similar in phenotype and expression profile to bone marrow mesenchymal cells (Gronthos et al., Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol, 2001; 189 (1): 54 -63). The presence on the surface of stromal cells of receptors for certain growth factors (PDGF-BB, EGF and several others) brings them closer to pericytes - cells of the vascular wall and suggests that they have the ability to migrate along the concentration gradient of these factors, as well as some chemokines whose receptors found on the surface of mesenchymal cells (Fu et al., Migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by tumor necrosis factor-alpha and its possible role in wound healing. Wound Repair Regen. 2009; 17 (2): 185-191; Ponte et al., The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchimal stem cells: comparison of chemokine and growth facto r chemotactic activities. Stem Cells 2007; 25: 1737-1745). In addition, adipose stromal cells are capable of secreting factors that inhibit cell apoptosis and promote cell viability (Hong et al., Therapeutic potential of adipose-derived stem cells in vascular growth and tissue repair. Curr Opin Organ Transplant. 2010; 15 (1 ): 86-91). The similarity with pericytes allows us to hope for the ability of stromal cells of adipose tissue to form contacts with endothelium that promotes vascular formation (Merfeld-Clauss et al., Adipose tissue progenitor cells directly interact with endothelial cells to induce vascular network formation. Tissue Eng Part A. 2010; 16 (9): 2953-2966).
Одним из основных процессов, способствующих репарации поврежденных тканей, является воспаление. Привлекаемые в область повреждения воспалительные клетки и секретируемые ими цитокины являются важным фактором, способствующим ранозаживлению. Наиболее мощным цитокином, секретируемым лейкоцитами, является фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа), многие эффекты которого опосредуются активацией провоспалительного фактора транскрипции, NFkB (Schütze et al., Mechanisms of tumor necrosis factor action. Semin Oncol. 1992; 19(2 Suppl 4): 16-24). В связи с этим представляется перспективным усиление миграционной и секреторной активности стромальных клеток жировой ткани путем их предобработки (прекондиционирования) в присутствии ФНО-альфа с последующим их использованием в качестве материала для внесения в поврежденную ткань.One of the main processes that contribute to the repair of damaged tissues is inflammation. The inflammatory cells involved in the area of damage and the cytokines secreted by them are an important factor contributing to wound healing. The most potent cytokine secreted by leukocytes is tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), many of which are mediated by activation of the pro-inflammatory transcription factor, NFkB (Schütze et al., Mechanisms of tumor necrosis factor action. Semin Oncol. 1992; 19 (2 Suppl 4): 16-24). In this regard, it seems promising to increase the migratory and secretory activity of stromal cells of adipose tissue by pretreating (preconditioning) in the presence of TNF-alpha with their subsequent use as a material for introduction into damaged tissue.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является разработка способа повышения ангиогенной активности стромальных клеток с целью ускорения восстановления функции ишемизированной ткани в процессе клеточной терапии.The problem solved by the authors of the present invention is the development of a method for increasing the angiogenic activity of stromal cells in order to accelerate the restoration of the function of ischemic tissue during cell therapy.
Поставленная задача решается тем, что стромальные клетки жировой ткани культивируют в присутствии ФНО-альфа в количестве 5 и 100 нг/мл в течение 24 и 72 часов. Предлагаемый способ обеспечивает усиление ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани за счет повышения их миграционной, секреторной и инвазивной активности.The problem is solved in that stromal cells of adipose tissue are cultured in the presence of TNF-alpha in an amount of 5 and 100 ng / ml for 24 and 72 hours. The proposed method provides increased angiogenic activity of stromal cells of adipose tissue by increasing their migratory, secretory and invasive activity.
Также поставленная задача решается тем, что при культивировании стромальных клеток жировой ткани в присутствии ФНО-альфа используют среду, дополнительно содержащую тромбоцитарный фактор роста PDGF-BB в количестве 10 нг/мл и/или фактор стромальных клеток SDF-1 в количестве 150 нг/мл, и/или урокиназу uPA в количестве 2,5 нг/мл.The problem is also solved by the fact that when cultivating stromal cells of adipose tissue in the presence of TNF-alpha, a medium additionally containing platelet-derived growth factor PDGF-BB in an amount of 10 ng / ml and / or SDF-1 stromal cell factor in an amount of 150 ng / ml is used. , and / or urokinase uPA in an amount of 2.5 ng / ml.
Частным вариантом настоящего изобретения является способ, согласно которому в качестве среды культивирования используют среду DMEM-F12, содержащую FBS в количестве 10-15% (об.%), пенициллин в количестве 100 Ед/мл и стрептомицин в количестве 10 мкг/мл.A particular embodiment of the present invention is a method according to which DMEM-F12 medium containing FBS in an amount of 10-15% (vol.%), Penicillin in an amount of 100 U / ml and streptomycin in an amount of 10 μg / ml are used as a culture medium.
Настоящее изобретение также предоставляет способ усиления кровотока в ишемизированной области ткани организма, включающий введение эффективного количества клеток, полученных описанным выше способом, и предварительно отмытых фосфатно-солевым буфером.The present invention also provides a method for enhancing blood flow in an ischemic region of body tissue, comprising administering an effective amount of cells obtained by the method described above and previously washed with phosphate-buffered saline.
Частным вариантом настоящего изобретения является описанный выше способ, характеризующийся тем, что для введения в ишемизированную область ткани используются клетки в концентрации 100000/100 мкл, вводимые в количестве 100000-20000000.A particular embodiment of the present invention is the method described above, characterized in that for the introduction into the ischemic tissue region, cells are used in a concentration of 100000/100 μl, administered in an amount of 100000-20000000.
В связи с тем, что в настоящее время нет достаточно полных сведений о миграционной способности стромальных клеток жировой ткани на различные хемокины, их способности к секреции ангиогенных и инвазивных факторов, а также регуляции этих процессов факторами воспаления, авторами настоящего изобретения было проведено изучение этих процессов с целью выяснения характера регуляции миграции, экспрессии и секреции рецепторов факторов роста, молекул адгезии, протеолитических ферментов под действием фактора некроза опухолей-альфа.Due to the fact that currently there is not enough complete information about the migration ability of stromal adipose tissue cells to various chemokines, their ability to secrete angiogenic and invasive factors, as well as the regulation of these processes by inflammation factors, the authors of the present invention studied these processes with the purpose of clarifying the nature of the regulation of migration, expression and secretion of growth factor receptors, adhesion molecules, proteolytic enzymes under the influence of tumor necrosis factor-alpha.
Миграция стромальных клеток по градиенту концентрации хемоаттрактанта является необходимым компонентом хоуминга, обеспечивающим их доставку в пораженный участок ткани. Этот процесс обусловлен наличием на мигрирующих клетках рецепторов, избирательно взаимодействующих с цитокинами и/или хемокинами, вырабатываемыми клетками поврежденной ткани.Migration of stromal cells according to the concentration gradient of the chemoattractant is an essential component of homing, which ensures their delivery to the affected area of the tissue. This process is due to the presence of receptors on migrating cells that selectively interact with cytokines and / or chemokines produced by damaged tissue cells.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность СКЖТ к миграции в камере Бойдена существенно зависит от природы используемого хемоаттрактанта (см. Фиг.1) Наиболее сильными стимуляторами миграции клеток являются PDGF, RANTES и EGF, что свидетельствует о наличии рецепторов к этим белкам на поверхности СКЖТ. Миграция СКЖТ на SDF, HGF, uPA выражена в несколько меньшей степени, что может свидетельствовать о меньшем содержании клеточных рецепторов к этим агентам или наличии каких-либо факторов, препятствующих полному проявлению миграционного ответа.The authors of the present invention have found that the ability of MSC to migrate in the Boyden chamber substantially depends on the nature of the chemoattractant used (see Figure 1). The most potent stimulators of cell migration are PDGF, RANTES and EGF, which indicates the presence of receptors for these proteins on the surface of MSC. Migration of SKZhT on SDF, HGF, uPA is expressed to a slightly lesser extent, which may indicate a lower content of cellular receptors to these agents or the presence of any factors preventing the full manifestation of the migration response.
На основании этих данных можно выстроить вышеуказанные хемоаттрактанты в следующий ряд по степени стимуляции ими миграции СКЖТ:Based on these data, it is possible to line up the above chemoattractants in the following series in terms of their degree of stimulation of SCZH migration:
PDGF≥EGF≥RANTES>HGF≥SDF≥uPAPDGF≥EGF≥RANTES> HGF≥SDF≥uPA
Поскольку процесс миграции обусловлен специфичным взаимодействием хемоаттрактантов со своими рецепторами на клеточной поверхности, представляет интерес изучение присутствия рецепторов к факторам роста, а также молекул адгезии, являющихся ключевыми в процессе миграции. Для этого исследования авторами был выбран метод цитофлюориметрии в потоке, позволяющий количественно оценить уровень экспрессии каждого конкретного рецептора, а также выявить клеточные субпопуляции, различающиеся по уровню его экспрессии.Since the migration process is due to the specific interaction of chemoattractants with its receptors on the cell surface, it is of interest to study the presence of receptors to growth factors, as well as adhesion molecules, which are key in the migration process. For this study, the authors chose the method of flow cytofluorimetry, which allows to quantify the level of expression of each specific receptor, as well as to identify cell subpopulations that differ in its expression level.
По полученным авторами настоящего изобретения данным, представленным на Фиг.2, наиболее высокий уровень экспрессии в СКЖТ характерен для PDGFR, uPAR, гиалуронанового рецептора и ICAM-1. Рецептор фактора роста гепатоцитов (c-Met), VCAM и NCAM экспрессируются этими клетками в значительно меньшей степени.According to the data presented in FIG. 2 by the inventors of the present invention, the highest level of expression in SQL is characteristic of PDGFR, uPAR, hyaluronan receptor, and ICAM-1. Hepatocyte growth factor receptor (c-Met), VCAM, and NCAM are expressed to a much lesser extent by these cells.
Поскольку рецептор PDGF характерен для перицитов, можно полагать, что значительная часть СКЖТ представлена перицитоподобными клетками. Наличие рецептора урокиназы в составе СКЖТ свидетельствует о высокой миграционной способности этих клеток (Montuori et al., Soluble and cleaved forms of the urokinase receptor: degradation products or active molecules? Thomb. Haemost 2005; 93: 192-198), а рецептор гиалуроновой кислоты играет важную роль в процессах хоуминга, обеспечивая первичное взаимодействие клеток в кровяном русле с эндотелием.Since the PDGF receptor is characteristic of pericytes, it can be assumed that a significant part of SQT is represented by pericyte-like cells. The presence of the urokinase receptor in the composition of SCL indicates the high migration ability of these cells (Montuori et al., Soluble and cleaved forms of the urokinase receptor: degradation products or active molecules? Thomb. Haemost 2005; 93: 192-198), and the hyaluronic acid receptor plays an important role in the processes of homing, providing the primary interaction of cells in the bloodstream with endothelium.
По полученным авторами настоящего изобретения данным, представленным на Фиг.3, СКЖТ адгезируют на коллагене I типа, фибронектине, характерных для сосудистого внеклеточного матрикса, и не способны к адгезии на компоненте внеклеточного матрикса миокарда - коллагене III типа. Адгезия СКЖТ на эмбриональную сыворотку, по-видимому, обусловлена присутствием в ней витронектина.According to the data presented by the authors of the present invention, shown in FIG. 3, SCLT adhere to type I collagen, fibronectin, characteristic of the vascular extracellular matrix, and are not capable of adhesion to the component of the extracellular myocardial matrix - type III collagen. Adhesion of SSC to embryonic serum is apparently due to the presence of vitronectin in it.
Авторами настоящего изобретения был впервые осуществлен анализ влияния фактора некроза опухолей-альфа на способность стромальных клеток жировой ткани к миграции на отдельные хемокины. Наше исследование, результаты которого представлены на Фиг.4, показало, что сам по себе ФНО-альфа не является хемоаттрактантом для этих клеток. Более того, в высокой концентрации он снижает скорость миграции до уровня ниже контрольного.The authors of the present invention was the first to analyze the effect of tumor necrosis factor-alpha on the ability of stromal cells of adipose tissue to migrate to individual chemokines. Our study, the results of which are presented in Figure 4, showed that TNF-alpha alone is not a chemoattractant for these cells. Moreover, in high concentration, it reduces the rate of migration to a level below the control.
В то же время, как видно из данных, представленных на Фиг.5, преинкубация СКЖТ в присутствии ФНО-альфа усиливает миграцию на другие хемокины.At the same time, as can be seen from the data presented in FIG. 5, preincubation of SCLC in the presence of TNF-alpha enhances migration to other chemokines.
Изучение возможности образования внеклеточных протеаз стромальными клетками жировой ткани, стимулированными действием ФНО-альфа, а также его сочетанием с цитокинами: фактором стволовых клеток (SDF-1), фактором, экспрессируемым нормальными Т-клетками (RANTES), инсулиноподобным фактором роста (IGF), тромбоцитарным фактором роста (PDGF), и эпидермальным фактором роста (EGF) показало, что ФНО-альфа в процессе инкубации способен вызывать образование стромальными клетками жировой ткани матриксной металлопротеиназы-9, имеющей мол. вес 92 кДа, а также активацию матриксной металлопотеиназы-2 (72 кДа) с образованием низкомолекулярной активной формы фермента. Эти данные представлены на Фиг.6.Studying the possibility of the formation of extracellular proteases by stromal cells of adipose tissue stimulated by the action of TNF-alpha, as well as its combination with cytokines: stem cell factor (SDF-1), the factor expressed by normal T cells (RANTES), insulin-like growth factor (IGF), platelet growth factor (PDGF), and epidermal growth factor (EGF) showed that TNF-alpha during the incubation process can cause the formation of adipose tissue stromal cells matrix metalloproteinase-9, having a mol. weight 92 kDa, as well as the activation of matrix metalloproteinase-2 (72 kDa) with the formation of a low molecular weight active form of the enzyme. These data are presented in Fig.6.
Проведенная авторами настоящего изобретения оценка воздействия фактора некроза опухолей на экспрессию стромальными клетками жировой ткани молекул адгезии, а также рецепторов хемокинов и ростовых факторов выявила 2-кратное усиление экспрессии межклеточной молекулы адгезии (ICAM-1), экспрессия других факторов после предобработки клеток ФНО-альфа существенно не менялась (Данные приведены на Фиг.7).The authors of the present invention assessed the effect of tumor necrosis factor on the expression of adhesion molecules by stromal cells of adipose tissue, as well as chemokine receptors and growth factors, revealed a 2-fold increase in the expression of the intercellular adhesion molecule (ICAM-1), the expression of other factors after pretreatment of TNF-alpha cells was significantly did not change (Data is shown in Fig.7).
В дополнение к вышеописанному авторами настоящего изобретения проведена оценка влияния ФНО-альфа на образование факторов роста, результаты которой представлены на Фиг.8. СКЖТ культивировали в присутствии 5 нг/мл ФНО-альфа в течение 24 или 72 часов. Проведенный анализ показал, что в первые 24 часа инкубации в присутствии фактора некроза опухолей наблюдается усиление транскрипции ММП9, ММП2, урокиназы, VEGF, интерлейкина-4, TBS-1, PAI-1 и HGF. Это усиление было стойким и сохранялось в течение 72 час. в случае ММП9, uPA, IL-4.In addition to the above, the authors of the present invention evaluated the effect of TNF-alpha on the formation of growth factors, the results of which are presented in Fig. 8. SQLs were cultured in the presence of 5 ng / ml TNF-alpha for 24 or 72 hours. The analysis showed that in the first 24 hours of incubation in the presence of tumor necrosis factor, an increase in transcription of MMP9, MMP2, urokinase, VEGF, interleukin-4, TBS-1, PAI-1 and HGF is observed. This gain was persistent and lasted for 72 hours. in the case of MMP9, uPA, IL-4.
Авторами настоящего изобретения проведено изучение регуляции механизмов передачи клеточного сигнала, опосредующих миграцию стромальных клеток жировой ткани фактором некроза опухолей. Результаты представлены на Фиг.9. Проведенные эксперименты показали, что фактор некроза опухолей вызывает активацию р38 МАР-киназы, киназы ERK1, 2, а также ингибиторной субъединицы фактора транскрипции NFkB (IkB), обусловливая тем самым активацию самого фактора транскрипции.The authors of the present invention studied the regulation of cell signal transmission mechanisms mediating the migration of adipose stromal cells by tumor necrosis factor. The results are presented in Fig.9. The experiments showed that the tumor necrosis factor causes the activation of p38 MAP kinase, ERK1, 2 kinase, and the inhibitory subunit of the transcription factor NFkB (IkB), thereby activating the transcription factor itself.
Основываясь на данных, полученных на культурах стромальных клеток жировой ткани, авторы настоящего изобретения провели изучение влияния прекондиционирования (праймирования) клеток в присутствии ФНО-альфа на их количество, обнаруживаемое после введения экспериментальным животным. Авторы обнаружили, что культивирование СКЖТ мыши перед трансплантацией в присутствии ФНО-альфа способствует увеличению их хоуминга в ишемизированные мышцы задней конечности мыши. Эти данные представлены на Фиг.10.Based on data obtained from adipose tissue stromal cell cultures, the authors of the present invention studied the effect of preconditioning (priming) of cells in the presence of TNF-alpha on their number detected after administration to experimental animals. The authors found that culturing mouse SCL before transplantation in the presence of TNF-alpha increases their homing in ischemic muscles of the hind limb of the mouse. These data are presented in FIG. 10.
Авторами также показано, что введение мышам подкожного имплантата Матригеля, содержащего СКЖТ, предкультивированные в присутствии ФНО-альфа (+TNFα) в концентрации 5 и 100 нг/мл, усиливает васкуляризацию (прорастание сосудов). Эти данные представлены на Фиг.11.The authors also showed that the administration to mice of a subcutaneous Matrigel implant containing SCLC, precultured in the presence of TNF-alpha (+ TNFα) at a concentration of 5 and 100 ng / ml, enhances vascularization (vascular germination). These data are presented in FIG. 11.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Фиг.1.Figure 1.
Миграция СКЖТ в камере Бойдена на хемоаттрактанты SDF, HGF, PDGF, RANTES, uPA, EGF и эмбриональную телячью сыворотку (FBS). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду, не содержавшую сыворотки и хемоаттрактантов.Migration of gastrointestinal tract in the Boyden chamber to chemoattractants SDF, HGF, PDGF, RANTES, uPA, EGF and fetal calf serum (FBS). As a negative control, a culture medium containing no serum and chemoattractants was used.
Фиг.2.Figure 2.
Измерение уровня экспрессии рецепторов факторов роста (PDGF, c-Met, uPAR) и молекул адгезии (VCAM-1, ICAM-1, гиалуронановый рецептор, NCAM) методом цитофлюориметрии в потоке.Measurement of the expression level of growth factor receptors (PDGF, c-Met, uPAR) and adhesion molecules (VCAM-1, ICAM-1, hyaluronan receptor, NCAM) by flow cytometry.
Фиг.3.Figure 3.
Адгезия СКЖТ на основные белковые компоненты внеклеточного матрикса: Коллаген I и III типов, желатин и фибронектин. В качестве отрицательного контроля использовалась адгезия клеток на пластик, покрытый БСА, в качестве позитивного контроля - адгезия на поли-D-лизине.Adhesion of SCL to the main protein components of the extracellular matrix: Type I and III collagen, gelatin and fibronectin. Cell adhesion to the BSA coated plastic was used as a negative control, and poly-D-lysine adhesion was used as a positive control.
Фиг.4.Figure 4.
Зависимость скорости миграции чСКЖТ в системе Transwell от концентрации ФНО-альфа в условиях стимуляции хемотаксиса (наличие градиента концентрации цитокина) и хемокинеза (отсутствие градиента концентрации цитокина).Dependence of hSCLC migration rate in the Transwell system on TNF-alpha concentration under conditions of chemotaxis stimulation (presence of a cytokine concentration gradient) and chemokinesis (absence of a cytokine concentration gradient).
Фиг.5.Figure 5.
Влияние ФНО-альфа на хемотаксис стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) по градиенту концентраций хемоаттрактантов. Перед измерением миграции СКЖТ депривировали в течение ночи, затем преинкубировали (примировали) в течение 24 часов в присутствии 5 нг/мл ФНО-альфа. Измерение миграции проводили в системе Transwell (BD Falcon Bedford, США), представляющей собой 24-луночную плашку со вставками, оборудованными пористым полиэтилентерефталатным фильтром с диаметром пор 8 мкм. СКЖТ снимали с культуральных чашек раствором 2 мМ ЭДТА/PBS и центрифугировали при 200g 10 мин, затем ресуспендировали в среде для хемотаксиса (DMEM/0,25% BSA) в концентрации 120 тыс клеток/мл. Пористые фильтры покрывали раствором коллагена I типа 100 мкг/мл (ИМТЕК) на 37°C в течение часа, затем промывали PBS, высушивали и затем заполняли верхние камеры клеточной суспензией, после чего переносили в планшет, заполненный средой для хемотаксиса с добавлением хемоаттрактантов. Инкубацию проводили в течение 20 часов в CO2-инкубаторе при 37°C. Затем непромигрировавшие клетки счищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Diff-Quick, количество промигрировавших клеток в каждой лунке подсчитывали с помощью светового микроскопа (×400) в 6 случайно выбранных секторах. В качестве хемоаттрактантов использовали тромбоцитарный фактор роста PDGF-BB (10 нг/мл), фактор стромальных клеток SDF-1 (150 нг/мл), урокиназу uPA (2,5 нг/мл), человеческий сывороточный альбумин HSA (50 мкг/мл) и фетальную сыворотку теленка FCS (15%), вносимые в нижнюю камеру системы Transwell непосредственно перед началом измерения миграции клеток.Effect of TNF-alpha on the chemotaxis of stromal cells of adipose tissue (SCLC) according to the concentration gradient of chemoattractants. Prior to measuring migration, SSCs were deprived overnight, then incubated (primiered) for 24 hours in the presence of 5 ng / ml TNF-alpha. The migration was measured in the Transwell system (BD Falcon Bedford, USA), which is a 24-well plate with inserts equipped with a porous polyethylene terephthalate filter with a pore diameter of 8 μm. SLCT was removed from the culture dishes with a solution of 2 mM EDTA / PBS and centrifuged at 200 g for 10 min, then resuspended in chemotaxis medium (DMEM / 0.25% BSA) at a concentration of 120 thousand cells / ml. Porous filters were covered with a solution of type I
Фиг.6.6.
Образование матриксных металлопротеиназ стромальными клетками жировой ткани при стимуляции ФНО-альфа в комбинации с хемокинами, а также урокиназой и ее рекомбинантными формами. А-ФНО-альфа добавляли к клеткам в сочетании с хемокинами SDF-1, RANTES, IGF в указанных концентрациях, с последующей инкубацией культуры в CO2-инкубаторе в течение 24 час. Б-клетки инкубировали в присутствии ФНО-альфа в сочетании с PDGF-BB или EGF в тех же условиях.The formation of matrix metalloproteinases by stromal cells of adipose tissue upon stimulation of TNF-alpha in combination with chemokines, as well as urokinase and its recombinant forms. A-TNF-alpha was added to the cells in combination with chemokines SDF-1, RANTES, IGF at the indicated concentrations, followed by incubation of the culture in a CO 2 incubator for 24 hours. B cells were incubated in the presence of TNF-alpha in combination with PDGF-BB or EGF under the same conditions.
Фиг.7.7.
Влияние фактора некроза опухолей-альфа на экспрессию молекул адгезии и рецепторов хемокинов и ростовых факторов стромальными клетками жировой ткани.The effect of tumor necrosis factor-alpha on the expression of adhesion molecules and chemokine receptors and growth factors by stromal cells of adipose tissue.
Фиг.8.Fig. 8.
Влияние ФНО-альфа на продукцию факторов роста стромальными клетками жировой ткани. СКЖТ культивировали в отсутствие ФНО-альфа (-TNF-α) или в присутствии 5 нг/мл фактора (+TNF-α) в течение 24 или 72 часов. Затем клетки лизировали, выделяли РНК и оценивали образование транскриптов ММП9 (А), ММП2 (Б), урокиназы (uPA, В), урокиназного рецептора (uPAR, Г), VEGF (Д), TGF-β (Е), FGF-2 (Ж), интерлейкина-4 (IL-4, З), TBS-1 (И), PAI-1 (К), c-met (Л) и HGF (М) методом ПЦР в реальном времени, используя специфические праймеры, методом ПЦР в реальном времени (RT-PCR), как описано в тексте.Effect of TNF-alpha on the production of growth factors by stromal cells of adipose tissue. SQLs were cultured in the absence of TNF-alpha (-TNF-α) or in the presence of 5 ng / ml factor (+ TNF-α) for 24 or 72 hours. Then the cells were lysed, RNA was isolated and the formation of transcripts of MMP9 (A), MMP2 (B), urokinase (uPA, C), urokinase receptor (uPAR, G), VEGF (D), TGF-β (E), FGF-2 (G), interleukin-4 (IL-4, H), TBS-1 (I), PAI-1 (K), c-met (L) and HGF (M) by real-time PCR using specific primers, by real-time PCR (RT-PCR), as described in the text.
Фиг.9.Fig.9.
Протеинкиназные компоненты внутриклеточного сигналинга, активируемые фактором некроза опухолей и стромальных клетках жировой ткани. А-фосфорилирование р38-МАР-киназы, Б-фосфорилирование и деградация ингибирующей субъединицы фактора транскрипции NFkB (IkB), выявляемые методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфических к фосфоформам этих белков.Protein kinase components of intracellular signaling activated by tumor necrosis factor and adipose stromal cells. A-phosphorylation of p38-MAP kinase, B-phosphorylation and degradation of the inhibitory subunit of the transcription factor NFkB (IkB), detected by Western blotting using antibodies specific for the phosphoforms of these proteins.
Фиг.10.Figure 10.
Результаты подсчета количества стромальных клеток на срезах мышц экспериментальных животных. МСК ЖТ-TNF-α - клетки, предстимулированные TNF-α (5 нг/мл) в течение 24 часов 4 МСК ЖТ - клетки, культивируемые в обычной среде (достоверность различия - p<0,05).The results of counting the number of stromal cells on sections of the muscles of experimental animals. MSC VT-TNF-α - cells pre-stimulated with TNF-α (5 ng / ml) for 24
Фиг.11 Васкуляризация подкожного имплантата Матригеля у мыши, содержащего МСК ЖТ, предкультивированные в присутствии ФНО-альфа (+TNFα) в концентрации 5 и 100 нг/мл. Верхняя панель - репрезентативные фотографии сосудов на срезах подкожного имплантата Матригеля у мыши. Сосуды визуализированы окраской антителами к маркеру эндотелия мыши CD31 (красная флуоресценция). Нижняя панель - результаты подсчета плотности сосудов на срезах имплантата Матригеля. * - достоверность различия между контрольной группой (МСК) и опытными группами (MCK/TNFα) - p<0,01; # - достоверность различия между двумя опытными группами p=0,05.11 Vascularization of a subcutaneous Matrigel implant in a mouse containing VT MSC, precultured in the presence of TNF-alpha (+ TNFα) at a concentration of 5 and 100 ng / ml. Upper panel - representative photographs of blood vessels on sections of a subcutaneous Matrigel implant in a mouse. The vessels were visualized by staining with antibodies to the CD31 mouse endothelial marker (red fluorescence). The bottom panel shows the results of counting the density of blood vessels on sections of a Matrigel implant. * - significance of differences between the control group (MSC) and the experimental groups (MCK / TNFα) - p <0.01; # - significance of the difference between the two experimental groups p = 0.05.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Получение первичной культуры СКЖТ человека.Obtaining the primary culture of human gastrointestinal tract.
Для получения первичной культуры клеток СКЖТ использовали материал подкожного жира человека, полученного в результате удаления интактного жирового отложения при проведении хирургических операций. Выделение клеток из полученного в результате операции материала осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Ткань измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более нескольких кубических миллиметров) кусочков и смешивали с раствором ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (25 ед/мл Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°C в течение 45-60 мин при постоянном покачивании; по окончании инкубации к нему добавляли равный объем среды DMEM (Gibco)/10% фетальная сыворотка быка (HyClone) и центрифугировали при 200g в течение 10 мин.To obtain the primary culture of SCJT cells, human subcutaneous fat material obtained by removing intact body fat during surgical operations was used. Cells were isolated from the material obtained as a result of the operation under sterile conditions of a laminar box. The tissue was crushed with vascular scissors to a consistency of a suspension of small pieces (no larger than a few cubic millimeters) and mixed with a solution of type I collagenase enzymes (200 units / ml, Worthington Biochemical, USA) and dispase (25 units / ml Invitrogen Corporation, Germany) at a ratio tissue volume (in ml) to the volume of the enzymatic solution (in ml) 1: 2. The sample was incubated at 37 ° C for 45-60 minutes with constant swaying; at the end of the incubation, an equal volume of DMEM medium (Gibco) / 10% fetal bovine serum (HyClone) was added to it and centrifuged at 200 g for 10 min.
Белесый поверхностный слой, представленный зрелыми адипоцитами и кусочками ферментативно необработанной ткани, удаляли, а осадок, состоящий из стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ), а также остатков соединительной ткани и клеток крови суспендировали в лизирующем буфере для эритроцитов. Полученную смесь инкубировали 2-3 минуты в 37°C при перемешивании, после чего к образцу добавляли равный объем среды DMEM/10% ФСБ и фильтровали через нейлоновые мембраны (BD Falcon Cell Stainer) с размером пор 40 микрон. Для очищения популяции стромальных клеток от клеток крови и клеточного дебриса на конечном этапе суспензию центрифугировали при 200g оборотах 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде DMEM F-12 (Hyclone)/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин (GIBCO BRL). Затем высаживали клетки на чашки Петри (Corning) диаметром 100 мм и культивировали в среде DMEM-F12/10% FBS /100 Ед/мл пенициллина/10 мкг/мл стрептомицина (10 мл) в CO2-инкубаторе (5% CO2) при 37°C. На следующий день удаляли среду культивирования, проводили лизис эритроцитов, добавляя стерильную воду на 30 секунд, затем дебрис и оставшиеся неприкрепившиеся клетки отмывали фосфатно-солевым буфером. После этого к клеткам добавляли свежую среду DMEM-F12/10% FBS /100 Ед/мл пенициллина/10 мкг/мл стрептомицина. В дальнейшем смену среды проводили каждые 2-3 дня; при достижении монослоя клетки пассировали с использованием раствора Версена-трипсина (1:1). Для проведения экспериментов по изучению миграции использовали клетки не старше 2-го пассажа.The whitish surface layer, represented by mature adipocytes and pieces of enzymatically untreated tissue, was removed, and the precipitate, consisting of stromal cells of adipose tissue (SCLC), as well as residues of connective tissue and blood cells, was suspended in an erythrocyte lysis buffer. The resulting mixture was incubated for 2-3 minutes at 37 ° C with stirring, after which an equal volume of DMEM / 10% PBS was added to the sample and filtered through 40 micron pore nylon membranes (BD Falcon Cell Stainer). To purify the population of stromal cells from blood cells and cell debris at the final stage, the suspension was centrifuged at 200 g for 5 min. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in DMEM F-12 (Hyclone) / 100 U / ml penicillin / 10 μg / ml streptomycin (GIBCO BRL). Then cells were planted on Petri dishes (Corning) with a diameter of 100 mm and cultured in DMEM-F12 / 10% FBS / 100 U / ml penicillin / 10 μg / ml streptomycin (10 ml) in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) at 37 ° C. The next day, the culture medium was removed, erythrocytes were lysed, adding sterile water for 30 seconds, then debris and the remaining non-adherent cells were washed with phosphate-buffered saline. After that, fresh DMEM-F12 / 10% FBS / 100 U / ml penicillin / 10 μg / ml streptomycin was added to the cells. Subsequently, the medium was changed every 2-3 days; upon reaching the monolayer, the cells were passaged using a Versen-trypsin solution (1: 1). For experiments on the study of migration, cells no older than the 2nd passage were used.
Выделение и культивирование СКЖТ мыши.Isolation and cultivation of mouse SCLC.
Стромальные клетки жировой ткани мыши выделяли из подкожной жировой клетчатки мышей линий C57black в возрасте 8-12 недель. Выделение ткани проводилось в асептических условиях. Для выделения клеток у мыши забирали подкожное жировое отложение, располагающееся по бокам в нижней части туловища.Mouse adipose stromal cells were isolated from subcutaneous adipose tissue of C57black mice aged 8-12 weeks. Tissue isolation was performed under aseptic conditions. To isolate cells, subcutaneous fat deposition located on the sides of the lower body was taken from the mouse.
Жировую ткань помещали в одноразовую пробирку со средой DMEM (Sigma)/100 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco). В стерильных условиях культурального бокса жировую ткань фрагментировали до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергали ферментативной обработке в растворе, содержащем DMEM/100 ед/мл пеницилина о), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 25 ед/мл диспазы (Worthington Biochemical) и 200 ед/мл коллагеназы I типа (Worthington Biochemical) при 37°C в течение одного часа. По окончании инкубации образец центрифугировали в течение 10 мин при 200g и удаляли супернатант, после чего ресуспендировали в среде культивирования Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone) +10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone)/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина (Gibco) и 50% среды MyeloCult (Stemcell Technologies) и фильтровали через одноразовые нейлоновые мембраны с размером пор 40 мкм (BD Falcon) и высаживали на стерильные чашки Петри. На следующий день удаляли среду культивирования, добавляли свежую среду роста.Adipose tissue was placed in a disposable tube with DMEM (Sigma) / 100 u / ml penicillin (Gibco), 100 u / ml streptomycin (Gibco), 100 u / ml fungicone (Gibco). Under sterile conditions of the culture box, adipose tissue was fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to enzymatic treatment in a solution containing DMEM / 100 u / ml penicillin o), 100 u / ml streptomycin (Gibco), 25 u / ml dispase ( Worthington Biochemical) and 200 u / ml type I collagenase (Worthington Biochemical) at 37 ° C for one hour. At the end of the incubation, the sample was centrifuged for 10 min at 200 g and the supernatant was removed, after which it was resuspended in an Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone) + 10% Advance Stem Cell Growth Supplement (HyClone) / 100 u / ml penicillin , 100 u / ml streptomycin (Gibco) and 50% MyeloCult medium (Stemcell Technologies) and were filtered through 40 μm disposable nylon membranes (BD Falcon) and plated on sterile Petri dishes. The next day, culture medium was removed, fresh growth medium was added.
Выделенные клетки культивировали в среде роста на чашках Петри в стерильных условиях инкубатора при 37°C и при 5%-ной концентрации CO2. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки пассировали. Для этого монослой клеток обрабатывали стерильным раствором Трипсина-Версена 1:1 (ПанЭко). Суспензию открепившихся от подложки клеток рассаживали в соотношении 1:3. Для проведения экспериментов использовали клетки не старше 2-го пассажа.Isolated cells were cultured in growth medium on Petri dishes under sterile incubator conditions at 37 ° C and at 5% CO 2 concentration. Upon reaching a confluent monolayer, the cells were passaged. For this, the cell monolayer was treated with a sterile Trypsin-Versen 1: 1 solution (PanEco). A suspension of cells detached from the substrate was seated in a ratio of 1: 3. For experiments, cells no older than the 2nd passage were used.
Направленная миграция клеток в камере БойденаDirected cell migration in the Boyden chamber
Способность СКЖТ к миграции по градиенту хемоаттрактанта оценивали, используя камеру Бойдена (Neuroprobe, Cabin John, США).The ability of the gastrointestinal tract to migrate along the chemoattractant gradient was evaluated using a Boyden camera (Neuroprobe, Cabin John, USA).
Для подготовки к использованию поликарбонатный пористый фильтр с диаметром пор 12 мкм (Neuroprobe) покрывали раствором коллагена I типа 100 мкг/мл (ИМТЕК) в вакууме в течение часа. Затем фильтр сушили на воздухе 15 мин.To prepare for use, a polycarbonate porous filter with a pore diameter of 12 μm (Neuroprobe) was coated with a solution of type I
Клетки 2-го пассажа, с 70% конфлюента отмывали PBS от культуральной среды и оставляли на ночь в бессывороточной среде DMEM (Gibco). На другой день клетки снимали с культуральных чашек раствором 2 мМ ЭДТА/PBS и центрифугировали при 200g 10 мин, затем ресуспендировали в среде для хемотаксиса (DMEM/0,25% BSA) в концентрации 450 тыс клеток/мл. Этой суспензией заполняли верхние лунки камеры Бойдена (50 мкл на лунку). Предварительно в нижние лунки добавляли среду для хемотаксиса с различными хемоаттрактантами. Клеточная суспензия и раствор хемоаттрактанта в камере Бойдена разделялись покрытым коллагеном пористым фильтром. Клетки инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°C в течение 20 часов. Затем непромигрировавшие клетки счищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Diff-Quick. Далее подсчитывали количество промигрировавших клеток в каждой лунке с помощью светового микроскопа (×400) в 4 случайно выбранных секторах.
Направленная миграция клеток в системе TranswellDirectional cell migration in the Transwell system
В данном методе для изучения способности СКЖТ к миграции по градиенту хемоаттрактанта используется система вставок (BD Falcon Bedford, США), в которой верхняя камера отделена от нижней пористым полиэтилентерефталатным фильтром с диаметром пор 8 мкм. Для изучения хемотаксиса клетки СКЖТ человека предварительно депривировали в течение ночи, после чего снимали с культуральных чашек раствором 2 мМ ЭДТА/PBS и центрифугировали при 200g 10 мин, затем ресуспендировали в среде для хемотаксиса (DMEM/0,25% BSA) в концентрации 120 тыс клеток/мл. Пористые фильтры покрывали раствором коллагена I типа 100 мкг/мл (ИМТЕК) на 37°C в течение часа, затем промывали PBS, высушивали и затем заполняли верхние камеры клеточной суспензией, после чего переносили в планшет, заполненный средой для хемотаксиса с добавлением хемоаттрактантов. Инкубацию проводили в течение 20 часов в CO2-инкубаторе при 37°C. Затем непромигрировавшие клетки счищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Diff-Quick, количество промигрировавших клеток в каждой лунке подсчитывали с помощью светового микроскопа (×400) в 6 случайно выбранных секторах.In this method, an insert system (BD Falcon Bedford, USA) is used to study the ability of SCLC to migrate along the chemoattractant gradient, in which the upper chamber is separated from the lower by a porous polyethylene terephthalate filter with a pore diameter of 8 μm. To study chemotaxis, human SCL cells were pre-deprived overnight, after which they were removed from the culture plates with 2 mM EDTA / PBS and centrifuged at 200 g for 10 min, then resuspended in chemotaxis medium (DMEM / 0.25% BSA) at a concentration of 120 thousand cells / ml Porous filters were covered with a solution of type I
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток методом цитофлюориметрии в потоке.Analysis of the expression of antigens on the surface of cells by flow cytometry.
1. Метод прямого окрашивания.1. The method of direct staining.
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток проводили на СКЖТ второго или третьего пассажа. Для открепления клеток от поверхности культурального пластика их обрабатывали раствором 2 мМ ЭДТА/PBS в течение 5 мин при 37°C. Затем клеточную суспензию переносили в центрифужные пробирки, добавляли среду DMEM в соотношении 1:10 и центрифугировали при 200g 10 мин. После чего клетки ресуспендировали в 1 мл PBS и определяли их концентрацию с помощью гемоцитометрической камеры Горяева. Для оценки жизнеспособности клетки окрашивали красителем «Трипановый синий» (Диа-М), средняя жизнеспособность составляла 90-98%.Analysis of the expression of antigens on the surface of the cells was performed on SSCT second or third passage. To detach cells from the surface of the culture plastic, they were treated with a solution of 2 mM EDTA / PBS for 5 min at 37 ° C. The cell suspension was then transferred to centrifuge tubes, DMEM medium was added at a ratio of 1:10 and centrifuged at 200g for 10 minutes. After that, the cells were resuspended in 1 ml of PBS and their concentration was determined using a Goryaev hemocytometric chamber. To assess viability, cells were stained with Trypan blue dye (Dia-M); average viability was 90-98%.
Далее 100 мкл суспензии СКЖТ в концентрации 1×106 клеток/мл PBS вносили в микроцентрифужные пробирки и добавляли соответствующие флуоресцентно-меченые моноклональные антитела против человеческих антигенов в конечной концентрации 10 мкг/мл.Then, 100 μl of a suspension of SCLC in a concentration of 1 × 10 6 cells / ml PBS was added to microcentrifuge tubes and the corresponding fluorescently-labeled monoclonal antibodies against human antigens were added at a final concentration of 10 μg / ml.
Образцы инкубировали 30 мин во льду, после чего для отмывки от излишка антител добавляли 1 мл раствора PBS/1% BSA и центрифугировали 5 мин при 400 g на 4°C. Отмывку повторяли 2 раза, затем осадок клеток ресуспендировали в 100-200 мкл PBS/1% BSA и сразу же проводили измерения или фиксировали в 1% растворе формальдегида (Tousimis). Процент клеток, экспрессирующих соответствующие антигены на клеточных мембранах, оценивали на проточном флуориметре Calibur (Becton-Dickinson).Samples were incubated for 30 min in ice, after which 1 ml of PBS / 1% BSA solution was added to wash off excess antibodies and centrifuged for 5 min at 400 g at 4 ° C. Washing was repeated 2 times, then the cell pellet was resuspended in 100-200 μl of PBS / 1% BSA and measurements were taken immediately or fixed in a 1% formaldehyde solution (Tousimis). The percentage of cells expressing the corresponding antigens on cell membranes was evaluated using a Calibur flowmeter (Becton-Dickinson).
2. Метод двойного окрашивания.2. The method of double staining.
При подготовке клеток и окрашивании антителами процедуры проводятся аналогично методике прямого окрашивания, за исключением того, что в качестве первых антител используются антитела без флуоресцентной метки и вместо фиксации после отмывки от излишка первых антител проводят окраску вторыми антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой, 30 мин, в темноте, во льду. Далее отмывали излишек вторых антител, добавляя 1 мл раствора PBS/1% BSA и центрифугировали 5 мин при 400 g на 4°C. Отмывку повторяли 2 раза, затем осадок клеток ресуспендировали в 100-200 мкл PBS/1% BSA и сразу же проводили измерения или фиксировали в 1% растворе формальдегида (Tousimis). Процент клеток, экспрессирующих соответствующие антигены на клеточных мембранах, оценивали на проточном флуориметре Calibur (Becton-Dickinson, San Jose, США).When preparing cells and staining with antibodies, the procedures are similar to direct staining, except that the first antibodies are antibodies without a fluorescent label and instead of fixing after washing off the excess of the first antibodies, they are stained with second antibodies conjugated to a fluorescent label, 30 min, darkness in ice. Then, excess second antibodies were washed off by adding 1 ml of PBS / 1% BSA solution and centrifuged for 5 min at 400 g at 4 ° C. Washing was repeated 2 times, then the cell pellet was resuspended in 100-200 μl of PBS / 1% BSA and measurements were taken immediately or fixed in a 1% formaldehyde solution (Tousimis). The percentage of cells expressing the corresponding antigens on cell membranes was evaluated on a Calibur flow fluorimeter (Becton-Dickinson, San Jose, USA).
Адгезия СКЖТ на различные матриксыAdhesion of SKZhT on various matrixes
Для изучения адгезионных свойств СКЖТ 96-луночный планшет (Corning-Costar) инкубировали в течение 18 часов на +4°C с растворами матриксных белков. Далее белковые растворы аспирировали и для уменьшения неспецифического взаимодействия добавляли 1% p-p BSA, инкубировали 1 час на 37°C. Затем лунки промывали PBS 3 раза. Для приготовления клеточной суспензии монослой обрабатывали 2 мМ раствором ЭДТА, центрифугировали 200g 10 мин, затем ресуспендировали в уравновешенной в CO2 инкубаторе среде для адгезии (DMEM) в концентрации 500 тыс. клеток/мл и оставляли в CO2 инкубаторе с открытой крышкой на 10 минут. Далее в каждую лунку планшета вносили по 50 мкл PBS, а затем по 50 мкл клеточной суспензии и инкубировали 40 мин на 37°C, 5% CO2. Затем в ряде лунок клетки фиксировали, добавляя к ним 100 мкл 10% формальдегида, а остальные осторожно промывали PBS 2-3 раза, используя пипетку со срезанным наконечником. После чего клетки фиксировали 10% раствором формальдегида 30 минут, промывали 3 раза водой, высушивали и окрашивали 0,1 раствором кристаллического фиолетового (ДИА-М). Адгезионную способность определяли по интенсивности поглощения при 570 нм на планшетном спектрофотометре Multiscan Ascent (Labsystems).To study the adhesive properties of SCL, a 96-well plate (Corning-Costar) was incubated for 18 hours at + 4 ° C with matrix protein solutions. Next, protein solutions were aspirated and 1% pp BSA was added to reduce non-specific interaction, incubated for 1 hour at 37 ° C. Then the wells were washed with
Метод зимографииZymography method
Образцы кондиционированных сред клеток СКЖТ (10-20 мкл) смешивали с буфером для образцов (0,0625 М Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 0,001% бромфенола синий), не содержавшим β-меркаптоэтанол, и подвергали электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия в 7,5% полиакриламидном геле, содержащем 0,2% желатин, при 4°C и 150 В. Молекулярные массы белков определяли с помощью белковых стандартов (Bio Rad). После электрофореза гели промывали в 2,5% Тритон Х-100 в течение 1,5 ч с последующей 18 час инкубации гелей в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 0,05% Brij 35, и 10 мМ CaCl2. После инкубации гели окрашивали 0,25% кумассидом бриллиантовым синим G-250 в 40% (по объему) метаноле и 10% (по объему) уксусной кислоте с последующей отмывкой от избытка красителя смесью 40% метанола и 10% (по объему) уксусной кислоты. Протеолитическую активность оценивали путем измерения интенсивности неокрашенных полос на фоне желатина, окрашенного кумассидом.Samples of conditioned cell media of SCLC (10-20 μl) were mixed with sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.001% bromphenol blue) that did not contain β-mercaptoethanol, and subjected to electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate in a 7.5% polyacrylamide gel containing 0.2% gelatin at 4 ° C and 150 V. Molecular weights of proteins were determined using protein standards (Bio Rad). After electrophoresis, the gels were washed in 2.5% Triton X-100 for 1.5 hours followed by 18 hours of gel incubation in a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 0.05
ПЦР в реальном времениReal-time PCR
Выделение РНК из клеток проводили с помощью набора колонок и реагентов RNeasy (Qiagen) согласно рекомендации производителя.RNA isolation from cells was performed using a set of columns and RNeasy reagents (Qiagen) according to the manufacturer's recommendations.
Для анализа экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе «iCycler iQ5. Multicolor Real-time PCR detection system» («Bio-Rad», США). В качестве праймеров использовали уникальные комплементарные пары олигодезоксинуклеотидов к анализируемым генам:To analyze gene expression, real-time PCR was performed with the Sybr Green intercalating dye (Syntol, Russia) in an iCycler iQ5 thermocycler. Multicolor Real-time PCR detection system ”(Bio-Rad, USA). As primers used unique complementary pairs of oligodeoxynucleotides for the analyzed genes:
Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл, содержащей 1-5 нг кДНК, 10 пмоль каждого праймера в соответствии со стандартным протоколом фирмы «Синтол». Реакция проводилась с использованием градиента температур. Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме матрицы. После начальной стадии денатурации (95°C, 3 мин), для всех праймеров проводилось 40 последовательных циклов амплификации, включавших в себя денатурацию (95°C, 10 сек), «отжиг» (61°C, 30 сек.) и элонгацию (70°C, 30 сек).The reaction was carried out in a mixture of 25 μl containing 1-5 ng cDNA, 10 pmol of each primer in accordance with the standard protocol of Syntol. The reaction was carried out using a temperature gradient. For additional control of the purity of the reagents and work, a control reaction was carried out in which all components except the matrix were present. After the initial stage of denaturation (95 ° C, 3 min), 40 consecutive amplification cycles were carried out for all primers, including denaturation (95 ° C, 10 sec), annealing (61 ° C, 30 sec.) And elongation ( 70 ° C, 30 sec.).
Для анализа специфичности амплификации по окончании ПЦР-РВ проводили плавление продуктов с постоянным анализом флуоресценции для построения кривых плавления, а также проводили электрофорез ампликонов в 1% агарозном геле в 1х буфере трис-ацетат-ЭДТА.To analyze the specificity of amplification at the end of PCR-RV, products were melted with constant fluorescence analysis to construct melting curves, as well as amplicon electrophoresis in 1% agarose gel in 1x Tris-acetate-EDTA buffer.
Вестерн-блотWestern blot
Оценку активности МАР-киназ методом Вестерн-блоттинга проводили, стимулируя СКЖТ в присутствии ФНО-альфа (100 нг/мл).Evaluation of the activity of MAP kinases by Western blotting was carried out by stimulating SCLC in the presence of TNF-alpha (100 ng / ml).
Затем клетки снимали с подложки и лизировали в 100 мкл 2х SDS-бефера для образцов (20 мМ дитиотреитола, 6% SDS, 0,25 М трис, pH 6,8, 10% глицерина, 10 мМ NaF и бромфеноловый синий). Экстракты нагревали в кипящей водяной бане в течение 5 минут, затем обрабатывали ультразвуком с зондом 3-4 раза по 5-10 сек. Образцы разбавляли 1х SDS-буфером для образцов до нужной коцентрации, подвергали SDS-электрофорезу в полиакриамидном геле. Затем белки электрофоретически переносили на поливинилиден-дифторидную (PVDF) мембрану (Millipore, Bedford, MA). После блокирования 2% сухого молока в TBST (20 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1% твин-20) в течение 1 часа при комнатной температуре, мембрану инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами. Затем блоты промывали и инкубировали с вторичными поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 часа при комнатной температуре. Далее оценивали светимость образцов с помощью набора ECL Advance Western Blotting Kit (Amersham Biosciencesa) в соответствии с инструкцией производителя.Cells were then removed from the substrate and lysed in 100 μl of 2x SDS sample buffer (20 mM dithiothreitol, 6% SDS, 0.25 M Tris, pH 6.8, 10% glycerol, 10 mM NaF and bromphenol blue). The extracts were heated in a boiling water bath for 5 minutes, then treated with ultrasound with a probe 3-4 times for 5-10 seconds. Samples were diluted with 1x SDS sample buffer to the desired concentration, subjected to SDS-polyacryamide gel electrophoresis. Then the proteins were electrophoretically transferred onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, Bedford, MA). After blocking 2% milk powder in TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% tween-20) for 1 hour at room temperature, the membrane was incubated overnight at 4 ° C primary antibodies. Then the blots were washed and incubated with secondary polyclonal antibodies conjugated to horseradish peroxidase (HRP) for 1 hour at room temperature. The luminosity of the samples was then evaluated using the ECL Advance Western Blotting Kit (Amersham Biosciencesa) in accordance with the manufacturer's instructions.
Праймирование стромальных клеток жировой ткани мыши фактором некроза опухолейPriming of mouse adipose tissue stromal cells with tumor necrosis factor
Для праймирования клеток перед трансплантацией с помощью культивирования в присутствии ФНО-альфа использовались стромальные клетки жировой ткани 2 пассажа, достигшие 70% конфлюента. Среда культивирования Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone) +10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone)/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина (Gibco) и 50% среды MyeloCult (Stemcell Technologies) заменялась на свежую, содержащую 5 нг/мл рекомбинантного мышиного ФНО-альфа (R&D Systems) и клетки инкубировались в течение 18 часов, после чего их снимали раствором Трипсина-Версена 1:1 (ПанЭко), метили мембранным флуоресцентным красителем РКН (Sigma) по протоколу производителя и вводили мышам линии C57black.For priming cells before transplantation by culturing in the presence of TNF-alpha,
Модель односторонней ишемии задней конечности мышиModel of unilateral mouse hind limb ischemia
Для создания тяжелой острой ишемии использовали самцов мышей линии С57/В16 весом 25-30 г (8-10 недель), для которых характерно хорошее развитие коллатерального кровотока, позволяющее наличие большого количества ремоделирующихся мелких сосудов, по которым возможен приход циркулирующих клеток в зону ишемии. Животных наркотизировали внутрибрюшинным введением 2,5% раствора авертина. После этого под бинокулярным микроскопом производился разрез кожи ножницами в области проекции a. femoralis, на сосуд накладывались шелковые лигатуры нитью 6-0, затем рана ушивалась атравматической иглой с шелковой нитью 4-0.To create severe acute ischemia, male C57 / B16 mice weighing 25-30 g (8-10 weeks) were used, which are characterized by a good development of collateral blood flow, which allows the presence of a large number of remodeling small vessels, through which circulating cells can enter the ischemic zone. Animals were anesthetized by intraperitoneal administration of a 2.5% solution of avertin. After that, under a binocular microscope, a skin incision was made with scissors in the area of projection a. femoralis, silk ligatures were applied to the vessel with a 6-0 thread, then the wound was sutured with an atraumatic needle with a 4-0 silk thread.
1) Модель тяжелой ишемии1) Severe ischemia model
2) Модель умеренной ишемии2) Moderate ischemia model
3) Ишемия/реперфузия с продолжительностью ишемической фазы в 1 ч.3) Ischemia / reperfusion with a duration of ischemic phase of 1 h.
Для создания тяжелой ишемии производился продольный разрез кожи левого бедра мыши от области паховой связки до коленной области. Бедренная артерия выделялась целиком от начала (бифуркации а. Iliaca externa) до ее разделения на a. poplitae и a. saphenous и ее ветви, включая a. epigastrica inferior, а. femoralis profunda, a. circumflexa lateralis, перевязывались и отсекались. Таким образом, кровоснабжение дистальной части конечности оказывалось нарушенным на протяжении.To create severe ischemia, a longitudinal incision was made in the skin of the left thigh of the mouse from the inguinal ligament to the knee region. The femoral artery was isolated entirely from the beginning (bifurcation of A. Iliaca externa) to its division into a. poplitae and a. saphenous and its branches, including a. epigastrica inferior a. femoralis profunda, a. circumflexa lateralis, bandaged and cut off. Thus, the blood supply to the distal limb turned out to be impaired throughout.
Умеренная ишемия индуцировалась путем лигирования без иссечения а. femoralis над ее дистальной бифуркацией с сохранением n. ischiadicus и v. femoralis. В данном случае лигирование позволяло нарушить кровоснабжение нижележащих тканей с относительно сохранными крупными коллатералями, отходящими от вышележащей части a. femoralis.Moderate ischemia was induced by ligation without excision a. femoralis over its distal bifurcation with conservation of n. ischiadicus and v. femoralis. In this case, ligation allowed to disrupt the blood supply to underlying tissues with relatively intact large collaterals extending from the overlying part a. femoralis.
Модель ишемии/реперфузии состояла в следующем: a. femoralis лигировалась шелковой нитью с подложенным под нее полиэтиленовым катетером, защищающим стенку сосуда от травмы. Нарушение кровотока регистрировалось методом лазер-допплеровского сканирования. Через 60 минут лигатура снималась, кожа ушивалась, а остаточная ишемия вновь регистрировалась на лазерном допплеровском сканере.The ischemia / reperfusion model was as follows: a. femoralis was ligated with silk thread with a polyethylene catheter placed underneath to protect the vessel wall from injury. Blood flow disturbance was recorded by laser Doppler scanning. After 60 minutes, the ligature was removed, the skin was sutured, and residual ischemia was again recorded on a laser Doppler scanner.
Для оценки кровотока использовали лазер-допплеровский сканер (Laser Doppler Imaging System, Moor, Великобритания). Измерения кровотока проводили после операции и перед введением клеточной суспензии. Животное анестезировали в камере с помощью изофлюрана, после чего поддерживали глубину наркоза с помощью дыхательной маски, в которую подавалась смесь кислорода и 1-2% изофлюрана. Перед началом сканирования в течение 10-15 минут выдерживали на матрасе с температурой около 37°C. В обработку включались данные, полученные при условии, что разница в результатах двух последовательных измерений, проведенных с интервалом в 5 минуты, не превышала 10%. Для снижения возможного разброса результатов измерений при переходе от одного животного к другому, а также для исключения влияния внешних факторов (свет, глубина наркоза, температура в лаборатории и т.д.) данные обрабатывали в виде отношения кровотока в ишемизированной конечности (левая лапа) к кровотоку в интактной лапе.A laser Doppler scanner (Laser Doppler Imaging System, Moor, UK) was used to evaluate blood flow. Blood flow measurements were performed after surgery and before the introduction of the cell suspension. The animal was anesthetized in the chamber using isoflurane, and then the depth of anesthesia was maintained using a breathing mask, into which a mixture of oxygen and 1-2% isoflurane was supplied. Before starting the scan, they were kept on the mattress with a temperature of about 37 ° C for 10-15 minutes. The processing included data obtained under the condition that the difference in the results of two consecutive measurements carried out with an interval of 5 minutes did not exceed 10%. To reduce the possible dispersion of the measurement results during the transition from one animal to another, as well as to exclude the influence of external factors (light, depth of anesthesia, laboratory temperature, etc.), the data were processed as the ratio of blood flow in the ischemic limb (left paw) to blood flow in the intact paw.
Через 72 часа после операции животных наркотизировали и системно выполнялось введение 1 миллиона меченых СКЖТ, ресуспендированных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера без магния и кальция.72 hours after the operation, the animals were anesthetized and 1 million labeled SLE, resuspended in 200 μl of phosphate-saline buffer without magnesium and calcium, was systemically administered.
После введения клеток животных забивали через 15 минут, 12 часов, 1 сутки и от них забирались образцы тканей легкого, сердца, m. tibialis anterior, которые замораживались в среде Tissue tek в парах жидкого азота. Образцы хранились при температуре -70°C. С каждого замороженного фрагмента на криостате при температуре -70°C были получены серийные замороженные срезы толщиной 6 мкм с шагом 500 мкм. Стекла со срезами хранились при температуре -20°C. Для выделения РНК образцы замораживали с помощью быстрого погружения в жидкий азот. До анализа образцы ткани хранились при температуре -70°C.After the introduction of the cells, the animals were sacrificed after 15 minutes, 12 hours, 1 day, and lung tissue, heart samples were taken from them, m. tibialis anterior, which were frozen in Tissue tek medium in liquid nitrogen vapors. Samples were stored at -70 ° C. From each frozen fragment on a cryostat at a temperature of -70 ° C, serial frozen sections were obtained with a thickness of 6 μm in increments of 500 μm. Slice glasses were stored at -20 ° C. To isolate RNA, the samples were frozen by rapid immersion in liquid nitrogen. Prior to analysis, tissue samples were stored at -70 ° C.
Праймирование стромальных клеток жировой ткани мыши фактором некроза опухолей перед введением в МатригельPriming of mouse adipose tissue stromal cells with tumor necrosis factor before introduction into Matrigel
МСК ЖТ мышей C57Black культивировали в среде для недифференцированных мезенхимальных клеток (НМКЧ, Basal medium for human undifferentiated mesenchymal stem cells, HyClone, США), содержащей 10% ростовой добавки (РД, stem cell growth supplement, HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина. Перед внесением в Матригель клетки преинкубировали в течение 18 часов в свежей среде Basal medium for human undifferentiated mesenchymal stem cells, содержащей 10% ростовой добавки, в присутствии 5 или 100 нг/мл фактора некроза опухолей-альфа. Затем клетки промывали раствором Версена (0,02% раствор ЭДТА) и обрабатывая HQtase (HyClone, США), реагентом для более мягкого, чем при использовании 0,25% раствора трипсина, открепления клеток от пластика.MSCs of adipose tissue of C57Black mice were cultured in undifferentiated mesenchymal cell medium (NMCC, Basal medium for human undifferentiated mesenchymal stem cells, HyClone, USA) containing 10% growth supplement (RD, stem cell growth supplement, HyClone, USA), 100 units / ml penicillin, 100 u / ml streptomycin. Before being introduced into Matrigel, the cells were preincubated for 18 hours in fresh Basal medium for human undifferentiated mesenchymal stem cells containing 10% growth supplement in the presence of 5 or 100 ng / ml tumor necrosis factor-alpha. Then the cells were washed with Versen's solution (0.02% EDTA solution) and treated with HQtase (HyClone, USA), a reagent for softer detachment of cells from plastic than with a 0.25% trypsin solution.
Имплантация клеток в матригелеMatrigel cell implantation
Для проведения эксперимента мышам линии С57 подкожно в область паха проводили инъекцию 400 мкл Матригеля (Matrigel, BD Biosciences, США), смешанного с 200 мкл клеточной суспензии в фосфатно-солевом буфере без магния и кальция (1000000 клеток). Через 14 дней после начала эксперимента извлекали имплантанты матригелей, помещали в кюветы со средой О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония) и замораживали в жидком азоте.For the experiment, C57 mice were injected subcutaneously in the groin with 400 μl of Matrigel (Matrigel, BD Biosciences, USA) mixed with 200 μl of a cell suspension in phosphate-buffered buffer without magnesium and calcium (1,000,000 cells). 14 days after the start of the experiment, matrigel implants were removed, placed in cuvettes with O.T.T. Tissue-Tek (Sakura, Japan) and frozen in liquid nitrogen.
Подготовка тканейTissue preparation
Образцы имплантантов матригелей замораживали в жидком азоте в среде О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония). Образцы хранили при температуре -70°C. Гистологический анализ проводили на замороженных срезах толщиной 7-10 мкм. Стекла со срезами тканей фиксировали в течение 2 минут в ацетоне, охлажденном до -20°C.Matrigel implant samples were frozen in liquid nitrogen in O.S.T. Tissue-Tek (Sakura, Japan). Samples were stored at -70 ° C. Histological analysis was performed on frozen sections with a thickness of 7-10 microns. Glasses with tissue sections were fixed for 2 minutes in acetone, cooled to -20 ° C.
Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов матригелейImmunofluorescence staining of matrigel samples
Перед окрашиванием антителами срезы матригеля фиксировали раствором 4% формальдегида в течение 10 минут. Далее срезы промывали три раза буфером ФСБ. Для снижения неспецифического связывания антител срезы помещали в блокирующий раствор (2% БСА/5% кроличьей сыворотки/ФСБ) и инкубировали 30 минут. После этого срезы отмывали от избытка блокирующего раствора при помощи ФСБ и окрашивали антителами. Срезы окрашивали, используя немеченые крысиные антитела против CD31 мыши (анти-CD31, 1:100, BD Biosciences, США). Растворы антител готовили на 1% БСА/ФСБ. В качестве контрольных антител использовали аналогичное опытному (анти-CD31) разведение IgG2a,k крысы (BD Biosciences, США). После отмывки от избытка блокирующего раствора срезы на 60 минут помещали в раствор указанных антител, инкубацию проводили в темноте при комнатной температуре. После этого срезы 3 раза отмывали в ФСБ. Далее срезы на 60 минут помещали в раствор вторичных антител (кроличьи анти IgG крысы, Alexa Fluor 594, 1:2000, Invitrogen, США). Затем ядра клеток окрашивали при помощи ядерного красителя DAPI в течение 10 мин, после чего срезы промывали буфером ФСБ, заключали в среду Aqua polymount и накрывали предметными стеклами.Before staining with antibodies, sections of matrigel were fixed with a solution of 4% formaldehyde for 10 minutes. Next, the sections were washed three times with FSB buffer. To reduce nonspecific antibody binding, sections were placed in a blocking solution (2% BSA / 5% rabbit serum / FSB) and incubated for 30 minutes. After this, the sections were washed from excess blocking solution using PBS and stained with antibodies. Sections were stained using unlabeled rat antibodies against mouse CD31 (anti-CD31, 1: 100, BD Biosciences, USA). Antibody solutions were prepared in 1% BSA / FSB. As control antibodies , a rat dilution of IgG 2a, k similar to the experimental (anti-CD31) was used (BD Biosciences, USA). After washing off the excess blocking solution, the sections were placed in a solution of the indicated antibodies for 60 minutes, the incubation was carried out in the dark at room temperature. After this, the sections were washed 3 times in the FSB. Next, sections for 60 minutes were placed in a solution of secondary antibodies (rabbit anti-rat IgG, Alexa Fluor 594, 1: 2000, Invitrogen, USA). Then, the cell nuclei were stained with nuclear dye DAPI for 10 min, after which the sections were washed with FSB buffer, enclosed in Aqua polymount medium and covered with glass slides.
Микроскопические данные анализировали при помощи микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия), а последующую их обработку - в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия), MetaMorph 7.1.0.0 (Universal Imaging Corporation).Microscopic data were analyzed using an Axiovert 200M microscope (Zeiss, Germany). Images were documented using an Axiocam HRC digital video camera (Zeiss, Germany), and their subsequent processing was performed using Axiovision 3.1 programs (Zeiss, Germany), MetaMorph 7.1.0.0 (Universal Imaging Corporation).
Для каждого среза матригеля с помощью цифровой фотокамеры получали серию снимков, охватывающих более 80% поверхности среза.For each slice of matrigel using a digital camera received a series of images covering more than 80% of the surface of the slice.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011133305/10A RU2531502C2 (en) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011133305/10A RU2531502C2 (en) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011133305A RU2011133305A (en) | 2013-04-27 |
| RU2531502C2 true RU2531502C2 (en) | 2014-10-20 |
Family
ID=49151940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011133305/10A RU2531502C2 (en) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2531502C2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2162712C2 (en) * | 1994-03-18 | 2001-02-10 | Скриппс Рисерч Инститьют | Methods and composition useful for angiogenesis inhibition |
| US20050148034A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-07-07 | Hariri Robert J. | Methods for identification of modulators of angiogenesis, compounds discovered thereby, and methods of treatment using the compounds |
-
2011
- 2011-08-09 RU RU2011133305/10A patent/RU2531502C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2162712C2 (en) * | 1994-03-18 | 2001-02-10 | Скриппс Рисерч Инститьют | Methods and composition useful for angiogenesis inhibition |
| US20050148034A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-07-07 | Hariri Robert J. | Methods for identification of modulators of angiogenesis, compounds discovered thereby, and methods of treatment using the compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011133305A (en) | 2013-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Teixeira et al. | Secretome of mesenchymal progenitors from the umbilical cord acts as modulator of neural/glial proliferation and differentiation | |
| Tatebayashi et al. | Identification of multipotent stem cells in human brain tissue following stroke | |
| Wang et al. | Platelet-derived growth factor receptor beta identifies mesenchymal stem cells with enhanced engraftment to tissue injury and pro-angiogenic property | |
| AU2009314797B2 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases | |
| JP6555691B2 (en) | Activator of mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells and method for producing the same | |
| JP5597129B2 (en) | Method for isolating placenta-derived stem cells and precursor cells | |
| CN104582711B (en) | pluripotent stem cells for inducing repair and regeneration of myocardial infarction | |
| Cremonesi et al. | Fetal adnexa derived stem cells from domestic animal: progress and perspectives | |
| Ma et al. | In vitro and in vivo angiogenic capacity of BM-MSCs/HUVECs and AT-MSCs/HUVECs cocultures | |
| ES2378165T3 (en) | Use of cells from adipose tissue to induce the formation of a functional vascular network | |
| Li et al. | Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells | |
| Hao et al. | Hypoxic preconditioning enhances survival and proangiogenic capacity of human first trimester chorionic villus-derived mesenchymal stem cells for fetal tissue engineering | |
| BRPI0919020B1 (en) | USE OF ENRICHED MONOCYTIAL LINING CELLS TO TREAT ISCHEMIA AND TO TREAT ANGINA PECTORIS | |
| Moyle et al. | Three-dimensional niche stiffness synergizes with Wnt7a to modulate the extent of satellite cell symmetric self-renewal divisions | |
| JPWO2007010858A1 (en) | Pluripotent stem cells cloned from single cells derived from skeletal muscle tissue | |
| US20220031756A1 (en) | Stem Cells for Wound Healing | |
| Cheng et al. | Influence of human platelet lysate on extracellular matrix deposition and cellular characteristics in adipose-derived stem cell sheets | |
| JP2017104091A (en) | Method for producing mesenchymal cell | |
| Ying et al. | Stromal cell-derived factor-1α promotes recruitment and differentiation of nucleus pulposus-derived stem cells | |
| Huang et al. | Adult human periodontal ligament-derived stem cells delay retinal degeneration and maintain retinal function in RCS rats | |
| Ataollahi et al. | New method for the isolation of endothelial cells from large vessels | |
| RU2531502C2 (en) | Method for increasing angiogenic activity of stromal cells of fatty tissue | |
| KR102082745B1 (en) | A method for preparing a stem cell secreting anti-inflammatory substances and anti-inflammatory compositions comprising culture medium of the stem cell | |
| JP6994729B1 (en) | A therapeutic agent for osteoarthritis or ligaments or tendons, and a method for producing the same. | |
| AU2012258424B2 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases |