JP2017104091A - Method for producing mesenchymal cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は体細胞を材料として間葉系幹細胞をはじめとする間葉系の細胞を製造する方法に関する。本発明はまた、前記方法により得られる間葉系細胞、当該細胞を有効成分として含有する再生医療用の組成物に関する。 The present invention relates to a method for producing mesenchymal cells such as mesenchymal stem cells using somatic cells as a material. The present invention also relates to a mesenchymal cell obtained by the above method and a composition for regenerative medicine containing the cell as an active ingredient.
近年の細胞関連研究の発展、とくに多能性細胞に関する多くの研究成果は、個体への移植に利用可能な品質、量の治療用細胞の入手に道を開いた。すでにいくつかの疾患についてはその治療に有効な形質を有する細胞を患者に移植する試みが開始されている。 Recent developments in cell-related research, especially many pluripotent cells, have paved the way for the availability of therapeutic cells in quality and quantity that can be used for transplantation into individuals. Already, an attempt has been made to transplant a cell having a trait effective for treating some diseases into a patient.
間葉系の細胞は筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪、結合組織等、生体の種々の器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は骨髄、脂肪組織、血液、胎盤、臍帯、等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属する細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞はそれらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療への取り組みも始められている。 Mesenchymal cells form various organs of the living body such as muscle, bone, cartilage, bone marrow, fat, connective tissue and the like, and are promising as materials for regenerative medicine. Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated cells present in tissues such as bone marrow, adipose tissue, blood, placenta, and umbilical cord. Since it has the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system, mesenchymal stem cells are attracting attention as a starting material for producing those cells. In addition, efforts have been started for regenerative medicine in which mesenchymal stem cells themselves are used to reconstruct bone, cartilage, myocardium, and the like.
再生医療では、治療用細胞を入手、作製する手段は課題とされている。非自己ドナー由来の細胞、胚性幹細胞から分化させた細胞は拒絶反応のおそれがあるため、自己の細胞より多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を作製し、これを所望の細胞に分化させたものが治療用細胞として期待されている。また、他家移植を安全に実施するために、種々のＨＬＡ型の細胞からｉＰＳ細胞のストックを作製し、保存しておく試みも開始されている。これらの方法では、ｉＰＳ細胞の作製（リプログラミング）、所望の細胞への分化、の双方のステップで高い転換効率を得ることが必要である。 In regenerative medicine, a means for obtaining and producing therapeutic cells is an issue. Since cells derived from non-self donor cells or cells differentiated from embryonic stem cells may be rejected, pluripotent stem cells (for example, iPS cells) were prepared from the own cells and differentiated into desired cells. Things are expected as therapeutic cells. In addition, attempts have been made to prepare and store iPS cell stocks from various HLA-type cells in order to safely carry out allogeneic transplantation. In these methods, it is necessary to obtain high conversion efficiency in both steps of iPS cell generation (reprogramming) and differentiation into a desired cell.
一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されており、例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することで神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。このような、遺伝子導入を行わずに体細胞から所望の細胞への転換を行う方法は、治療用細胞を取得する手段としてより有効な選択肢である可能性がある。 On the other hand, a method for directly converting somatic cells such as fibroblasts into other cells has also been reported. For example, it is known that neuronal cells can be obtained by culturing fibroblasts with a chemical (non-native). Patent Document 1). Such a method of converting from a somatic cell to a desired cell without performing gene transfer may be a more effective option as a means for obtaining a therapeutic cell.
本発明の目的は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から短期間に直接かつ効率よく間葉系幹細胞ならびに種々の間葉系細胞を誘導する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for inducing mesenchymal stem cells and various mesenchymal cells directly and efficiently from somatic cells in a short time without artificially introducing genes.
本発明者らは、治療その他の用途に使用できる間葉系幹細胞を得る方法について鋭意研究を重ねた結果、体細胞を培養する際に種々の細胞内シグナルを制御することにより、高効率で間葉系幹細胞を誘導できることを見出した。さらに、同様の手法によって体細胞から各種の間葉系細胞を直接誘導できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of earnest research on methods for obtaining mesenchymal stem cells that can be used for treatment and other uses, the present inventors have achieved high efficiency by controlling various intracellular signals when culturing somatic cells. It was found that leaf stem cells can be induced. Furthermore, the inventors have found that various mesenchymal cells can be directly induced from somatic cells by the same technique, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、
［１］ 間葉系細胞を製造する方法であって、体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養する工程を包含する方法、
［２］ Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下に体細胞を培養する工程を包含する［１］の方法、
［３］ Ｓｍａｄシグナルがトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤又は骨形成タンパク質シグナル阻害剤により阻害される［２］の方法、
［４］ ｐ５３シグナルがｐ５３阻害剤により阻害される［２］または［３］の方法、
［５］ グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルがグリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤により阻害される［２］〜［４］のいずれかの方法、
［６］ 細胞内ｃＡＭＰ濃度がアデニル酸サイクラーゼ活性化剤により増加される［２］〜［５］のいずれかの方法、
［７］ トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で体細胞の培養が実施される［２］の方法、
［８］ トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有する培地中で、２日間以上体細胞の培養が実施される［７］の方法、
［９］ 体細胞が分化した細胞である［１］〜［８］のいずれかの方法、
［１０］ 体細胞が線維芽細胞である［９］の方法、
［１１］ 体細胞がヒト細胞である［１］〜［１０］のいずれかの方法、
［１２］ 間葉系細胞が、間葉系幹細胞である［１］〜［１１］のいずれかの方法、
［１３］ 間葉系幹細胞を分化させる工程をさらに包含する［１２］の方法、
［１４］ 間葉系幹細胞を分化させる工程が、間葉系幹細胞を脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞及び心筋細胞からなる群より選択される細胞に分化させる工程である［１３］の方法、
［１５］ 脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞及び心筋細胞からなる群より選択される間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質を含有する培地が使用される［１４］の方法、
［１６］ 間葉系幹細胞を分化させる工程が、体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養する工程の次に行われるか、または体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養する工程と同時に行われる、［１３］〜［１５］のいずれかの方法、
［１７］ 培地が、間葉系幹細胞から他の間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質をさらに含有することを特徴とする［７］または［８］の方法、
［１８］ ［１］〜［１７］いずれかの方法で得られる間葉系細胞、
［１９］ ［１８］の間葉系細胞を有効成分として含有する医薬用の組成物、および
［２０］ 間葉系細胞を有効成分として含有する医薬用の組成物の製造方法であって、体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養して間葉系細胞を得る工程を包含する方法
に関する。
That is, the present invention
[1] A method for producing a mesenchymal cell, the method comprising culturing somatic cells under conditions capable of controlling intracellular signals,
[2] The method according to [1], comprising a step of culturing somatic cells under the condition of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration,
[3] The method of [2], wherein the Smad signal is inhibited by a transforming growth factor-β signal inhibitor or a bone morphogenetic protein signal inhibitor,
[4] The method of [2] or [3], wherein the p53 signal is inhibited by a p53 inhibitor,
[5] The method according to any one of [2] to [4], wherein the glycogen synthase kinase 3β signal is inhibited by a glycogen synthase kinase 3β signal inhibitor,
[6] The method according to any one of [2] to [5], wherein the intracellular cAMP concentration is increased by an adenylate cyclase activator.
[7] Transforming growth factor-β signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, glycogen synthase kinase 3β signal inhibitor and adenylate cyclase activator The method of [2],
[8] Transform growth factor-β signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, glycogen synthase kinase 3β signal inhibitor and adenylate cyclase activator for 2 days or longer The method according to [7], wherein the cells are cultured.
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the somatic cell is a differentiated cell,
[10] The method according to [9], wherein the somatic cell is a fibroblast.
[11] The method according to any one of [1] to [10], wherein the somatic cell is a human cell.
[12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the mesenchymal cells are mesenchymal stem cells.
[13] The method according to [12], further comprising the step of differentiating mesenchymal stem cells.
[14] The method according to [13], wherein the step of differentiating the mesenchymal stem cell is a step of differentiating the mesenchymal stem cell into a cell selected from the group consisting of an adipocyte, an osteoblast, a chondrocyte, and a cardiomyocyte.
[15] The method according to [14], wherein a medium containing a substance effective for inducing differentiation into mesenchymal cells selected from the group consisting of fat cells, osteoblasts, chondrocytes and cardiomyocytes is used.
[16] The step of differentiating the mesenchymal stem cell is performed after the step of culturing the somatic cell under a condition capable of controlling the intracellular signal, or the condition capable of controlling the intracellular signal. The method according to any one of [13] to [15], which is performed simultaneously with the step of culturing below,
[17] The method according to [7] or [8], wherein the medium further contains a substance effective for inducing differentiation from mesenchymal stem cells to other mesenchymal cells.
[18] Mesenchymal cells obtained by any of the methods [1] to [17]
[19] [18] A method for producing a medicinal composition containing mesenchymal cells as an active ingredient, and [20] a method for producing a medicinal composition containing mesenchymal cells as an active ingredient, The present invention relates to a method comprising a step of culturing cells under conditions capable of controlling intracellular signals to obtain mesenchymal cells.
本発明の方法によれば、入手の容易な体細胞を材料として、高い効率で、かつ短期間で間葉系幹細胞をはじめとする間葉系細胞を直接誘導できる。また、細胞への外来遺伝子の挿入のリスクもなく、より安全性の高い間葉系細胞の取得が可能となる。 According to the method of the present invention, mesenchymal cells such as mesenchymal stem cells can be directly induced with high efficiency and in a short period of time using readily available somatic cells as a material. In addition, it is possible to obtain a safer mesenchymal cell without the risk of inserting a foreign gene into the cell.
本発明において、間葉系細胞には、間葉系幹細胞をはじめとする未分化な間葉系細胞、ならびに分化型の間葉系細胞、すなわち、間葉系に属するすべての細胞が包含される。 In the present invention, the mesenchymal cells include undifferentiated mesenchymal cells including mesenchymal stem cells and differentiated mesenchymal cells, that is, all cells belonging to the mesenchymal system. .
（１）本発明の間葉系幹細胞の製造方法
本発明は、細胞内のシグナルを制御しうる条件下に体細胞を培養する工程を包含する、間葉系幹細胞の製造方法に関する。細胞内のシグナルには、例えば、Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナル、細胞内ｃＡＭＰを介するシグナル等がある。細胞内シグナルの制御としては、例えば、Ｓｍａｄシグナルの阻害、ｐ５３シグナルの阻害、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害、細胞内ｃＡＭＰ濃度の増加等が挙げられる。細胞内のシグナルを制御しうる条件とは、細胞内シグナルの制御を達成できるいずれの条件であってもよく、例えば、公知の化学的手段または物理的手段を利用することができる。さらに、本発明は、Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下に体細胞を培養する工程を包含する、間葉系幹細胞の製造方法に関する。
(1) Method for Producing Mesenchymal Stem Cells of the Present Invention The present invention relates to a method for producing mesenchymal stem cells, comprising a step of culturing somatic cells under conditions that allow control of intracellular signals. Examples of intracellular signals include Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal, and signal via intracellular cAMP. Examples of the control of intracellular signals include inhibition of Smad signal, inhibition of p53 signal, inhibition of glycogen synthase kinase 3β signal, increase of intracellular cAMP concentration, and the like. Conditions under which intracellular signals can be controlled may be any conditions that can achieve control of intracellular signals. For example, known chemical means or physical means can be used. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a mesenchymal stem cell, comprising a step of culturing somatic cells under the condition of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration. About.
生物の細胞は体細胞と生殖細胞に大きく二分される。本発明の間葉系幹細胞の製造方法には、その出発材料として任意の体細胞が使用できる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、株化された細胞のいずれでもよい。間葉系細胞または間葉系幹細胞の分化系列に属さない体細胞も本発明に使用することができる。本発明には分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞、最終分化への途上にある体細胞、初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明に使用できる体細胞としては、特に本発明を限定するものではないが、任意の体細胞、例えば造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞が挙げられる。またこれら細胞の前駆細胞、癌細胞、にも本発明の方法を適用できる。 Living cells are largely divided into somatic cells and germ cells. Arbitrary somatic cells can be used as the starting material for the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention. The somatic cell is not particularly limited, and may be either a primary cell collected from a living body or a cell line established. Somatic cells that do not belong to the differentiation lineage of mesenchymal cells or mesenchymal stem cells can also be used in the present invention. In the present invention, somatic cells in various stages of differentiation, for example, somatic cells that have undergone terminal differentiation, somatic cells that are on the way to final differentiation, and somatic cells that have been initialized and have acquired pluripotency can be used. The somatic cells that can be used in the present invention are not particularly limited, but any somatic cells such as hematopoietic cells (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow cells, etc.), organ-derived Cells (hepatocytes, spleen cells, pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc.), muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibroblasts, nerve cells, Examples include osteoblasts, chondrocytes, endothelial cells, stromal cells, and adipocytes. The method of the present invention can also be applied to precursor cells of these cells and cancer cells.
上記の体細胞の供給源としては、ヒトもしくは非ヒト動物が例示されるがこれらに限定されるものではない。ヒトへの投与を目的として本発明の方法により間葉系幹細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞が材料とされる。レシピエント自身より採取された体細胞を間葉系幹細胞の誘導に供してもよい。 Examples of the somatic cell source include, but are not limited to, human or non-human animals. When producing mesenchymal stem cells by the method of the present invention for the purpose of administration to humans, preferably, somatic cells collected from a donor whose histocompatibility antigen type matches or similar to that of the recipient are used as the material. Somatic cells collected from the recipient themselves may be used for the induction of mesenchymal stem cells.
Ｓｍａｄは、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）−βスーパーファミリーの細胞内シグナル伝達を担っている一群の分子である。ＴＧＦ−βスーバーファミリーには、ＴＧＦ−βの他、アクチビン、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）などが含まれる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインが結合したレセプターによりリン酸化を受けると、Ｓｍａｄは核内に移行して転写活性化因子として機能する。Ｓｍａｄにより伝達されるシグナルは細胞の増殖、分化、アポトーシスの制御に関わっている。 Smads are a group of molecules responsible for intracellular signaling in the transforming growth factor (TGF) -β superfamily. The TGF-β super family includes activin, bone morphogenetic protein (BMP) and the like in addition to TGF-β. When subjected to phosphorylation by a receptor to which a cytokine of the TGF-β superfamily is bound, Smad moves into the nucleus and functions as a transcriptional activator. Signals transmitted by Smad are involved in the control of cell proliferation, differentiation and apoptosis.
本発明の方法における「Ｓｍａｄシグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、Ｓｍａｄシグナルを阻害することができる公知の手段を利用することができる。本発明にはＳｍａｄに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば抗Ｓｍａｄ抗体やその他の薬剤）や、Ｓｍａｄ自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、Ｓｍａｄが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＳｍａｄシグナルを阻害することができる。すなわち、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン及び／又はそのレセプターの機能を阻害することにより、本発明を実施することができる。当該方法には、抗サイトカイン抗体、抗サイトカインレセプター抗体（アンタゴニスト抗体）、サイトカインレセプター阻害剤等が使用できる。本発明では、特に本発明を限定するものではないが、阻害剤として作用する物質、例えばＴＧＦ−βシグナル阻害剤及び／又はＢＭＰシグナル阻害剤でＴＧＦ−β及び／又はＢＭＰが関わるシグナル伝達を阻害することにより、Ｓｍａｄシグナルを阻害することが好適である。 There is no particular limitation on the means for achieving the culture conditions “inhibition of Smad signal” in the method of the present invention, and a known means capable of inhibiting Smad signal can be used. In the present invention, a substance that acts directly on Smad and inhibits its function (for example, an anti-Smad antibody or other drug), a drug that suppresses the production of Smad itself, or the like can be used. In addition, the Smad signal can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving Smad upstream. That is, the present invention can be carried out by inhibiting the functions of the TGF-β superfamily cytokine and / or its receptor. In this method, an anti-cytokine antibody, an anti-cytokine receptor antibody (antagonist antibody), a cytokine receptor inhibitor and the like can be used. In the present invention, although the present invention is not particularly limited, a substance acting as an inhibitor, such as a TGF-β signal inhibitor and / or a BMP signal inhibitor, inhibits signal transduction involving TGF-β and / or BMP. By doing so, it is preferable to inhibit the Smad signal.
本発明に使用できるＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ Ｎｏ． ３０１８３６−４１−９）、ＲｅｐＳｏｘ［Ｅ−６１６４５２］（ＣＡＳ Ｎｏ． ４４６８５９−３３−２）、Ａ−８３−０１（ＣＡＳ Ｎｏ． ９０９９１０−４３−６）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ Ｎｏ． ３９６１２９−５３−６）、ＳＤ２０８（ＣＡＳ Ｎｏ． ６２７５３６−０９−８）が例示される。また、本発明に使用できるＢＭＰシグナル阻害剤としては、ＬＤＮ−１９３１８９（ＣＡＳ Ｎｏ． １０６２３６８−２４−４）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ Ｎｏ． ８６６４０５−６４−３）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ：Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， Ｖｏｌ． １５， ｐ６０７７−８４）が例示される。間葉系幹細胞の誘導に有効なＴＧＦ−βシグナル阻害剤、ＢＭＰシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ＳＢ−４３１５４２は０．２μＭ〜２０μＭ、ＬＤＮ−１９３１８９は０．１μＭ〜１０μＭの範囲で、それぞれ本発明の方法に使用することができる。 Examples of TGF-β signal inhibitors that can be used in the present invention include SB431542 (CAS No. 301836-41-9), RepSox [E-61652] (CAS No. 446859-33-2), A-83-01 (CAS). No. 909910-43-6), LY364947 (CAS No. 396129-53-6), SD208 (CAS No. 627536-09-8). Moreover, as a BMP signal inhibitor which can be used for this invention, LDN-193189 (CAS No. 1062368-24-4), Dorsomorphin (CAS No. 866405-64-3), Noggin (Noggin: J Neuroscience, 1995, Vol. 15, p6077-84). What is necessary is just to determine suitably the density | concentration of the TGF- (beta) signal inhibitor and BMP signal inhibitor effective in the induction | guidance | derivation of a mesenchymal stem cell. Although the present invention is not particularly limited, for example, SB-431542 can be used in the method of the present invention in the range of 0.2 μM to 20 μM, and LDN-193189 can be used in the range of 0.1 μM to 10 μM.
ｐ５３タンパク質は、がん抑制遺伝子として知られているｐ５３遺伝子の産物であり、細胞周期調節やアポトーシス制御に関わっている。その機能はＤＮＡとの特異的結合並びに遺伝子発現制御を通じて発揮されている。 The p53 protein is a product of the p53 gene known as a tumor suppressor gene, and is involved in cell cycle regulation and apoptosis control. Its function is exhibited through specific binding with DNA and gene expression control.
本発明における「ｐ５３シグナルの阻害下」の培養条件を達成するための手段には特に限定はなく、ｐ５３シグナルを阻害することができる公知の手段を利用すればよい。ｐ５３タンパク質の活性は細胞やＤＮＡのダメージの影響を受けることが知られており、適切な物理的、化学的処理を細胞に施すことでｐ５３シグナルを阻害することができる。前記の物理的処理としては振動、可視光もしくは放射線の照射、温度刺激等が挙げられる。また、抗ｐ５３タンパク質抗体や公知のｐ５３シグナル阻害剤も本発明に好適である。本発明に使用できるｐ５３阻害剤としては、ピフィスリン（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α（ＣＡＳ Ｎｏ． ６３２０８−８２−２）、ピフィスリン−β（ＣＡＳ Ｎｏ． ５１１２９６−８８−１）、ピフィスリン−μ（ＣＡＳ Ｎｏ． ６４９８４−３１−２）、ＮＳＣ６６８１１（ＣＡＳ Ｎｏ． ６９６４−６２−１）、Ｎｕｔｌｉｎ−３（ＣＡＳ Ｎｏ． ５４８４７２−６８−０）が例示される。間葉系幹細胞の誘導に有効なｐ５３阻害剤の濃度は適宜決定すればよい。特に本発明を限定するものではないが、例えば、ピフィスリンは０．５μＭ〜５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。 The means for achieving the culture conditions “inhibition of p53 signal” in the present invention is not particularly limited, and a known means capable of inhibiting p53 signal may be used. The activity of p53 protein is known to be affected by cell and DNA damage, and p53 signal can be inhibited by applying appropriate physical and chemical treatment to the cell. Examples of the physical treatment include vibration, irradiation with visible light or radiation, temperature stimulation, and the like. Anti-p53 protein antibodies and known p53 signal inhibitors are also suitable for the present invention. Examples of p53 inhibitors that can be used in the present invention include pifthrin-α (CAS No. 63208-82-2), pifthrin-β (CAS No. 51112296-88-1), pifthrin-μ (CAS No. 64984). -31-2), NSC66811 (CAS No. 6964-62-1), Nutlin-3 (CAS No. 548472-68-0). What is necessary is just to determine suitably the density | concentration of the p53 inhibitor effective in the induction | guidance | derivation of a mesenchymal stem cell. Although not specifically limiting the present invention, for example, pifisulin can be used in the method of the present invention in the range of 0.5 μM to 50 μM.
グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）３βは、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして見いだされた。ＧＳＫ３βは種々のタンパク質をリン酸化する活性を有しており、グリコーゲン代謝のみならず、細胞分裂、細胞増殖他の生理現象にも関わっている。 Glycogen synthase kinase (GSK) 3β has been found as a protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. GSK3β has an activity to phosphorylate various proteins and is involved not only in glycogen metabolism but also in other physiological phenomena such as cell division and cell proliferation.
本発明の方法における「ＧＳＫ３βシグナルの阻害下」の培養条件には特に限定はなく、ＧＳＫ３βの活性を阻害する物質、例えば抗ＧＳＫ３β抗体やＧＳＫ３β阻害剤のようなＧＳＫ３βシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＧＳＫ３βは自身の特定の部位がリン酸化されると活性を失うことから、当該リン酸化を促進する手段もＧＳＫ３βシグナルの阻害に利用することができる。本発明に使用できるＧＳＫ３βシグナル阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ Ｎｏ． ２５２９１７−０６−９）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ；ＣＡＳ Ｎｏ． ６６７４６３−６２−９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ Ｎｏ． １４２２７３−２０−９）、Ａ１０７０７２２（ＣＡＳ Ｎｏ． １３８４４２４−８０−９）が例示される。本発明の方法に有効なＧＳＫ３βシグナル阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１は０．１μＭ〜１０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。 There are no particular limitations on the culture conditions of “under inhibition of GSK3β signal” in the method of the present invention, and it is possible to use a substance that inhibits the activity of GSK3β, for example, GSK3β signal inhibition means such as anti-GSK3β antibody or GSK3β inhibitor it can. In addition, since GSK3β loses its activity when its specific site is phosphorylated, means for promoting the phosphorylation can also be used for inhibition of GSK3β signal. Examples of GSK3β signal inhibitors that can be used in the present invention include CHIR99021 (CAS No. 252917-06-9), BIO ((2′Z, 3′E) -6-Bromoindrubin-3′-oxime; CAS No. 667463- 62-9), Kenpaulone (CAS No. 142273-20-9), A1070722 (CAS No. 1384424-80-9). The concentration of the GSK3β signal inhibitor effective for the method of the present invention may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, CHIR99021 can be used in the method of the present invention in the range of 0.1 μM to 10 μM.
環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸サイクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。 Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a substance involved in various intracellular signal transduction as a second messenger. cAMP is produced in cells by adenosine triphosphate (ATP) being cyclized by adenylate cyclase.
本発明の方法における「細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下」の培養条件には特に限定はない。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸サイクラーゼに直接作用して活性化できる物質、アデニル酸サイクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つ、ｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ｃＡＭＰ）も本発明に使用できる。本発明に使用できるアデニル酸サイクラーゼ活性化剤としては、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ． ６６５７５−２９−９）やフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２−３４８２４３）が例示される。本発明の方法に有効なアデニル酸サイクラーゼ活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、フォルスコリンは０．５μＭ〜５０μＭの範囲で本発明の方法に使用することができる。 There are no particular limitations on the culture conditions of “conditions for increasing intracellular cAMP concentration” in the method of the present invention. In addition to substances that can be activated by directly acting on adenylate cyclase, an enzyme involved in cAMP production, substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, an enzyme that degrades cAMP, etc. It can be used as a means of increasing cAMP concentration. Dibutyryl cAMP (dibutylyl cAMP), which is a structural analog of cAMP having the same action as cAMP in cells, can also be used in the present invention. Examples of the adenylate cyclase activator that can be used in the present invention include forskolin (CAS No. 66575-29-9) and forskolin derivatives (for example, JP-A-2002-348243). The concentration of the adenylate cyclase activator effective for the method of the present invention may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, forskolin is used in the method of the present invention in the range of 0.5 μM to 50 μM. it can.
本発明による間葉系幹細胞の製造では、Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下で体細胞の培養が実施される。本発明の好適な態様では、Ｓｍａｄシグナルを阻害する手段としてのトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤及び骨形成タンパク質シグナル阻害剤に加えて、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤並びにアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有させた培地中で体細胞を培養することにより、体細胞から一段階の培養で、直接間葉系幹細胞を得ることができる。前記の阻害剤及び活性化剤（以下、有効成分と記載する場合がある）は、間葉系幹細胞の誘導に有効な濃度で培地に添加される。間葉系幹細胞の誘導に有効な濃度は、適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μＭ〜５０μＭ程度である。 In the production of mesenchymal stem cells according to the present invention, somatic cells are cultured under the conditions of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration. In a preferred embodiment of the present invention, in addition to transforming growth factor-β signal inhibitor and bone morphogenetic protein signal inhibitor as means for inhibiting Smad signal, p53 inhibitor, GSK3β signal inhibitor and adenylate cyclase activation By culturing somatic cells in a medium containing an agent, mesenchymal stem cells can be obtained directly from the somatic cells in a single stage. The inhibitor and activator (hereinafter sometimes referred to as an active ingredient) are added to the medium at a concentration effective for inducing mesenchymal stem cells. The concentration effective for the induction of mesenchymal stem cells may be determined as appropriate and is not particularly limited, but is, for example, about 0.1 μM to 50 μM.
本発明の間葉系幹細胞の製造方法の好適な態様では、体細胞を培養する工程においてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない。核初期化因子によるリプログラミングを促進すると言われるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を使用しない本発明の方法では、意図しない分化を起こしかねない全能性の細胞が誘導されるリスクはより低いと言える。 In a preferred embodiment of the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention, a histone deacetylase inhibitor is not used in the step of culturing somatic cells. In the method of the present invention that does not use a histone deacetylase inhibitor that is said to promote reprogramming by nuclear reprogramming factors, it can be said that the risk of inducing totipotent cells that may cause unintended differentiation is lower.
本発明における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、前記の各種シグナルに対する阻害手段等を発揮させて実施すればよい。培地は公知の培地や市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２やこれらを改変した培地に適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。 The culture of somatic cells in the present invention may be performed by selecting a medium, temperature, and other conditions according to the type of somatic cells to be used, and exhibiting the means for inhibiting the various signals described above. The medium can be selected from a known medium or a commercially available medium. For example, it can be used by adding appropriate components (serum, protein, amino acids, sugars, fatty acids, antibiotics, etc.) to common media such as MEM, DMEM, DMEM / F12 and modified media. .
培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件が例示される。培養中は適切な間隔で有効成分を含有する培地の交換を実施することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明の方法を実施する場合、前記の有効成分を含有する培地での培養開始から２日後には間葉系幹細胞のマーカーを発現する細胞が出現する。通常、有効成分を含有する培地中で２日から３０日、好ましくは３日から２０日培養することで、間葉系幹細胞を得ることができる。使用する体細胞として培養の容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を間葉系幹細胞に転換することも可能である。したがってスケールアップした間葉系幹細胞製造も容易である。 As culture conditions, general cell culture conditions may be selected. The conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified. During culture, it is preferable to replace the medium containing the active ingredient at appropriate intervals. When the method of the present invention is carried out using fibroblasts as a material, cells expressing a mesenchymal stem cell marker appear 2 days after the start of culture in a medium containing the active ingredient. Usually, mesenchymal stem cells can be obtained by culturing in a medium containing an active ingredient for 2 to 30 days, preferably 3 to 20 days. It is possible to convert somatic cells whose number of cells has been increased in advance into mesenchymal stem cells by selecting somatic cells that can be easily cultured. Therefore, it is easy to produce scaled-up mesenchymal stem cells.
前記の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた間葉系幹細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を実施することが好ましい。 For the culture, cell culture equipment (containers) such as plates, dishes, cell culture flasks, cell culture bags and the like can be used. As the cell culture bag, a gas permeable bag is suitable. When a large amount of cells are required, a large culture tank may be used. The culture can be performed in either an open system or a closed system, but when the obtained mesenchymal stem cells are to be administered to humans, it is preferable to perform the culture in a closed system.
本発明の間葉系幹細胞の製造方法により、間葉系幹細胞を含有する細胞集団が得られる。この細胞集団をそのままいろいろな目的に使用することが可能であるが、適切な手段により間葉系幹細胞を分離もしくは富化してもよい。例えば、間葉系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを認識する抗体を使用して間葉系幹細胞を高含有する細胞集団や純化された間葉系幹細胞を得ることができる。抗体を使用した細胞の分離方法としては、例えば抗体を固定化したカラムやセルソーターを利用することができる。 By the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention, a cell population containing mesenchymal stem cells can be obtained. Although this cell population can be used as it is for various purposes, mesenchymal stem cells may be isolated or enriched by an appropriate means. For example, a cell population containing a high amount of mesenchymal stem cells or a purified mesenchymal stem cell can be obtained using an antibody that recognizes a cell surface marker characteristic of mesenchymal stem cells. As a method for separating cells using an antibody, for example, a column or cell sorter on which an antibody is immobilized can be used.
（２）本発明の間葉系細胞の製造方法
本発明により、前記の方法で間葉系幹細胞を製造する工程を包含する、各種細胞の製造方法も提供される。本発明により得られた間葉系幹細胞を適切な物質を含有する培地中で培養することにより、間葉系幹細胞から分化して生じることが知られている各種の細胞、すなわち間葉系に属する細胞を得ることができる。
(2) Method for Producing Mesenchymal Cells of the Present Invention The present invention also provides a method for producing various cells including the step of producing mesenchymal stem cells by the above method. By culturing the mesenchymal stem cells obtained by the present invention in a medium containing an appropriate substance, the cells belong to various cells known to be differentiated from mesenchymal stem cells, that is, mesenchymal systems. Cells can be obtained.
本発明の方法で得られる、間葉系に属する細胞にも特に限定はなく、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）等が例示される。間葉系に属する種々の間葉系細胞について、間葉系幹細胞から分化誘導する方法が知られている。例えば、脂肪細胞についてはデキサメサゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ロシグリタゾン、グルココルチコイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤等が、骨細胞についてはデキサメサゾン、アスコルビン酸又はアスコルビン酸−２−リン酸、β−グリセロリン酸等が、骨芽細胞についてはデキサメサゾン、ハイドロコルチゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸等が、軟骨細胞についてはインスリン、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸、ハイドロコルチゾン、ＴＧＦ−β、デキサメタゾン等が、心筋細胞については５−アザシチジン、ＴＧＦ−β、アンジオテンシンＩＩ、ＢＭＰ−２、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等が、それぞれの細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。間葉系幹細胞にこれらの物質を接触させることにより、所望の細胞を得ることができる。「間葉系細胞への分化に有効な物質」としては、例えば「分化誘導剤」として市販されているものを使用することもできる。さらに、心筋細胞への分化誘導には、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル阻害剤も使用できる。 The cells belonging to the mesenchymal system obtained by the method of the present invention are not particularly limited, and are adipocytes (brown adipocytes, white adipocytes), chondrocytes, bone cells, osteoblasts, muscle cells (skeletal muscle cells, Smooth muscle cells, cardiomyocytes) and the like. Various mesenchymal cells belonging to the mesenchymal system are known to induce differentiation from mesenchymal stem cells. For example, dexamethasone, insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine, rosiglitazone, glucocorticoid, phosphodiesterase inhibitor and the like are used for adipocytes, and dexamethasone, ascorbic acid or ascorbic acid-2-phosphate, β- Glycerophosphate, etc., dexamethasone, hydrocortisone, ascorbic acid, β-glycerophosphate etc. for osteoblasts, insulin, ascorbic acid, ascorbic acid-2-phosphate, hydrocortisone, TGF-β, dexamethasone for chondrocytes As for cardiomyocytes, 5-azacytidine, TGF-β, angiotensin II, BMP-2, dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like are known as effective substances for inducing differentiation into respective cells. Desired cells can be obtained by contacting these substances with mesenchymal stem cells. As the “substance effective for differentiation into mesenchymal cells”, for example, those commercially available as “differentiation inducers” can also be used. Furthermore, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal inhibitor can also be used to induce differentiation into cardiomyocytes.
本発明の一つの態様は、本発明の間葉系幹細胞の製造方法において実施される、体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養する工程と、間葉系幹細胞を分化させる工程とが同時に行われる方法である。例えば、体細胞を細胞内のシグナルを制御しうる条件下に培養する工程を、前記の、各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質を共存させて実施する方法である。例えば、Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下で体細胞を培養する際に、培地中に各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質を含有せしめることにより、体細胞からの間葉系細胞の直接誘導を達成することができる。本発明は特定の原理に基づくものに限定されないが、培養の初期に生成した間葉系幹細胞が、共存する「分化の誘導に有効な物質」の作用に基づいて分化を方向づけられることから、１種類の培地で体細胞を培養することにより、１段階で所望の間葉系細胞を得ることができる。 One embodiment of the present invention includes a step of culturing somatic cells under conditions capable of controlling intracellular signals and a step of differentiating mesenchymal stem cells, which are performed in the method for producing mesenchymal stem cells of the present invention. Are performed simultaneously. For example, the step of culturing somatic cells under conditions capable of controlling intracellular signals is carried out in the presence of the aforementioned substances effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells. For example, when somatic cells are cultured under the condition of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration, induction of differentiation into various mesenchymal cells in the medium Incorporation of an effective substance in can directly achieve the induction of mesenchymal cells from somatic cells. Although the present invention is not limited to those based on a specific principle, since mesenchymal stem cells generated in the early stage of culture can be differentiated based on the action of a coexisting “substance effective for inducing differentiation”, 1 By culturing somatic cells in various media, desired mesenchymal cells can be obtained in one step.
また、本発明の間葉系細胞の製造方法は、間葉系幹細胞を各種の間葉系細胞に分化させるために使用される既知の培地に、Ｓｍａｄシグナル阻害剤（例えば、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤及び骨形成タンパク質シグナル阻害剤）、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤並びにアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有させた培地中で、体細胞を培養することにより実施することもできる。本発明のこのような態様には、市販の間葉系幹細胞分化用の培地（例えばＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ等）を使用することができる。 In addition, the method for producing mesenchymal cells of the present invention comprises adding a Smad signal inhibitor (for example, transforming growth factor-) to a known medium used for differentiating mesenchymal stem cells into various mesenchymal cells. β signal inhibitor and bone morphogenetic protein signal inhibitor), p53 inhibitor, GSK3β signal inhibitor and adenylate cyclase activator can also be carried out by culturing somatic cells. In such an embodiment of the present invention, commercially available media for differentiation of mesenchymal stem cells (for example, Mesenchymal Stem Cell Differential Medium, Prosthetic Stem Cell Differentiation Medium of Promocell, etc.) can be used.
培養条件としては、前記した間葉系幹細胞の製造のための体細胞の培養と同様に、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件が例示される。培養中は適切な間隔で培地の交換を実施することが好ましい。通常、有効成分および各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質を含有する培地中で７日から４０日程度、例えば７日から３０日程度培養することで、分化した間葉系細胞を得ることができる。使用する体細胞として培養の容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を間葉系細胞に転換することも可能である。したがってスケールアップした各種間葉系細胞の製造も容易である。 As the culture conditions, general cell culture conditions may be selected as in the case of somatic cell culture for the production of mesenchymal stem cells. The conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified. During culture, it is preferable to change the medium at an appropriate interval. Usually, mesenchymal cells differentiated by culturing for about 7 to 40 days, for example, about 7 to 30 days in a medium containing an active ingredient and a substance effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells. Can be obtained. It is possible to convert somatic cells whose number of cells has been increased in advance into mesenchymal cells by selecting somatic cells that can be easily cultured. Therefore, it is easy to produce various scaled-up mesenchymal cells.
本発明の別の態様は、本発明の間葉系幹細胞の製造方法によって間葉系幹細胞を製造し、次いで該間葉系幹細胞を分化させる工程に付すことを特徴とする、間葉系細胞の製造方法である。間葉系幹細胞を分化させる工程は、間葉系幹細胞を各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質と接触させることにより実施することができる。この工程は、例えば、間葉系幹細胞が生成した後の培養物に前記物質を添加して行ってもよく、間葉系幹細胞を前記物質を含有する別の培地中で培養することによって行ってもよい。培地中の各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質の濃度は、使用する物質の種類等によって、当業者により適宜決定することができる。 Another aspect of the present invention is a method for producing a mesenchymal stem cell, comprising the step of producing a mesenchymal stem cell by the method for producing a mesenchymal stem cell of the present invention and then subjecting the mesenchymal stem cell to differentiation. It is a manufacturing method. The step of differentiating mesenchymal stem cells can be carried out by contacting the mesenchymal stem cells with a substance effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells. This step may be performed, for example, by adding the substance to the culture after the mesenchymal stem cells are generated, or by culturing the mesenchymal stem cells in another medium containing the substance. Also good. The concentration of a substance effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells in the medium can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the type of substance used.
培養条件としては、前記した間葉系幹細胞の製造のための体細胞の培養と同様に、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件が例示される。培養中は適切な間隔で培地の交換を実施することが好ましい。通常、有効成分を含有する培地中で体細胞を２日から３日程度培養することで間葉系幹細胞が出現し、次いで、各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質を培養物に添加するか、または前記物質を含有する培地に交換して培養を続け、体細胞の培養開始から７日から４０日程度、例えば７日から３０日程度で、分化した間葉系細胞を得ることができる。使用する体細胞として培養の容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を間葉系細胞に転換することも可能である。したがってスケールアップした各種間葉系細胞の製造も容易である。 As the culture conditions, general cell culture conditions may be selected as in the case of somatic cell culture for the production of mesenchymal stem cells. The conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified. During culture, it is preferable to change the medium at an appropriate interval. Usually, mesenchymal stem cells appear by culturing somatic cells for about 2 to 3 days in a medium containing active ingredients, and then a substance effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells is cultured. Or is replaced with a medium containing the substance, and the culture is continued to obtain differentiated mesenchymal cells in about 7 to 40 days, for example, about 7 to 30 days from the start of somatic cell culture. be able to. It is possible to convert somatic cells whose number of cells has been increased in advance into mesenchymal cells by selecting somatic cells that can be easily cultured. Therefore, it is easy to produce various scaled-up mesenchymal cells.
前記した、間葉系細胞の製造に係る２つの態様は、ともに間葉系幹細胞の誘導に使用可能な体細胞を材料として実施することができる。また、「Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下」も、間葉系幹細胞を誘導する場合と同様にして準備することができる。 Both of the above-described two aspects relating to the production of mesenchymal cells can be carried out using somatic cells that can be used to induce mesenchymal stem cells as materials. Further, “under the condition of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration” can be prepared in the same manner as in the case of inducing mesenchymal stem cells.
例えば、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有させた培地に、さらにデキサメサゾン、インスリン及び３−イソブチル−１−メチルキサンチンを添加して体細胞を培養した場合、培養開始より３日程度で脂肪細胞様の形態の細胞が出現する。７日後には細胞内に脂肪が蓄積されていることを確認することが可能である。特に本発明を限定するものではないが、例えば、デキサメサゾンは０．１μＭ〜１０μＭの範囲で、インスリンは０．０５μＭ〜２０μＭの範囲で、３−イソブチル−１−メチルキサンチンは０．０５μＭ〜１０μＭの範囲で、それぞれ使用される。 For example, in a medium containing transforming growth factor-β signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, GSK3β signal inhibitor and adenylate cyclase activator, dexamethasone, insulin and 3-isobutyl- When somatic cells are cultured with 1-methylxanthine added, cells in an adipocyte-like form appear in about 3 days from the start of the culture. After 7 days, it is possible to confirm that fat is accumulated in the cells. Although not particularly limited to the present invention, for example, dexamethasone is in the range of 0.1 μM to 10 μM, insulin is in the range of 0.05 μM to 20 μM, and 3-isobutyl-1-methylxanthine is in the range of 0.05 μM to 10 μM. Used in each range.
本発明における心筋細胞誘導方法の一態様として、Ｓｍａｄシグナル、ｐ５３シグナル、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３βシグナルの阻害下、かつ細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる条件下で、さらに分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナルを阻害しながら体細胞を培養する工程を包含する方法が挙げられる。当該方法では、所望によりヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を阻害しながら培養してもよい。これらの条件で８〜２０日間体細胞を培養することにより、自律的に拍動する心筋細胞が出現する。前記のＭＡＰＫシグナル阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ Ｎｏ． ３９１２１０−１０−９）、ＰＤ１８４３５２（ＣＡＳ Ｎｏ． ２１２６３１−７９−３）、ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ Ｎｏ． １６７８６９−２１−８）、ＰＤ３３４５８１（ＣＡＳ Ｎｏ． ５４８７５６−６８−９）が例示されるが、これらに限定されるものではない。ＨＤＡＣ阻害剤としては、（１）脂肪酸類、例えば酪酸、β−ヒドロキシ酪酸、バルプロ酸、これらの塩やエステルなど、（２）ヒドロキサム酸類、例えばトリコスタチンＡ、オキサムフラチン、スベロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ）など、（３）環状ペプチド、例えばトラポキシン（ｔｒａｐｏｘｉｎ）、アピシヂン（ａｐｉｃｉｄｉｎ）、ＦＫ２２８など、（４）ベンズアミドなど、が使用できる。前記の阻害剤の、心筋細胞の誘導に有効な濃度は適宜決定すればよく、特に限定はない。例えば、ＰＤ０３２５９０１がＭＡＰＫ阻害剤として使用される場合には０．１μＭ〜１０μＭの範囲で使用される。また、バルプロ酸がＨＤＡＣ阻害剤として使用される場合には０．０１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で使用される。 In one embodiment of the method for inducing cardiomyocytes in the present invention, mitogen-activated protein kinase (MAPK) is further added under the condition of inhibiting Smad signal, p53 signal, glycogen synthase kinase 3β signal and increasing intracellular cAMP concentration. And a method comprising culturing somatic cells while inhibiting signals. In this method, the culture may be performed while inhibiting histone deacetylase (HDAC) as desired. By culturing somatic cells for 8-20 days under these conditions, autonomously beating cardiomyocytes appear. Examples of the MAPK signal inhibitor include PD0325901 (CAS No. 391210-10-9), PD184352 (CAS No. 212631-79-3), PD98059 (CAS No. 167869-21-8), PD334581 (CAS No. 548756-68-9) is exemplified, but not limited thereto. Examples of HDAC inhibitors include (1) fatty acids such as butyric acid, β-hydroxybutyric acid, valproic acid, salts and esters thereof, and (2) hydroxamic acids such as trichostatin A, oxamflatin, and suberoylanilide. (3) Cyclic peptides such as trapoxin, apicidin, FK228, and (4) benzamide can be used. The effective concentration of the inhibitor for cardiomyocyte induction may be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, when PD0325901 is used as a MAPK inhibitor, it is used in the range of 0.1 μM to 10 μM. Moreover, when valproic acid is used as an HDAC inhibitor, it is used in the range of 0.01 mM to 1 mM.
前記の、本発明により得られた間葉系幹細胞を分化させて得られた間葉系細胞、ならびに本発明の方法により体細胞から直接誘導された間葉系細胞も、適切な手段によって混在する他の細胞と分離することができる。分離手段としては、所望の間葉系細胞に特異的な細胞表面マーカーを認識する抗体の使用が例示される。 The mesenchymal cells obtained by differentiating the mesenchymal stem cells obtained by the present invention and the mesenchymal cells directly derived from somatic cells by the method of the present invention are also mixed by appropriate means. Can be separated from other cells. Examples of the separation means include use of an antibody that recognizes a cell surface marker specific to a desired mesenchymal cell.
（３）本発明の方法により得られる間葉系幹細胞
上記の、本発明の間葉系幹細胞の製造方法により、間葉系幹細胞を含有する細胞集団を得ることができる。
(3) Mesenchymal stem cells obtained by the method of the present invention By the above-described method for producing mesenchymal stem cells of the present invention, a cell population containing mesenchymal stem cells can be obtained.
本発明による間葉系幹細胞の誘導は、例えば間葉系幹細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を指標に間葉系幹細胞を検出して確認することもできる。間葉系幹細胞に特徴的な分子としては、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１６６等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、間葉系幹細胞には発現していないネガティブマーカーとしてＣＤ１９、ＣＤ４５等が知られており、間葉系幹細胞であることの確認に利用することができる。前記の分子の検出には免疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、各分子のｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。間葉系幹細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた間葉系幹細胞を単離、精製するうえでも有用である。 The induction of mesenchymal stem cells according to the present invention can also be confirmed by detecting mesenchymal stem cells using, for example, molecules characteristic of mesenchymal stem cells, such as enzymes, receptors, low molecular compounds, and the like as indicators. Examples of molecules characteristic of mesenchymal stem cells include, but are not limited to, CD105, CD73, CD166, and the like. Moreover, CD19, CD45, etc. are known as negative markers that are not expressed in mesenchymal stem cells, and can be used to confirm that they are mesenchymal stem cells. Although an immunological method (detection by an antibody) can be used for the detection of the molecule, the detection may be performed by quantifying the amount of mRNA of each molecule. Antibodies that recognize molecules characteristic of mesenchymal stem cells are also useful for isolating and purifying mesenchymal stem cells obtained by the present invention.
本発明の方法により得られる間葉系幹細胞ならびに当該細胞を含有する組成物は、骨疾患、軟骨疾患、心疾患、脊髄損傷、移植片対宿主病等の疾患の治療に有用である。また、外科治療後の組織修復に使用することもできる。本発明により得られた間葉系幹細胞を使用して、種々の疾患の治療のための医薬用組成物を製造することができる。 The mesenchymal stem cell obtained by the method of the present invention and the composition containing the cell are useful for the treatment of diseases such as bone disease, cartilage disease, heart disease, spinal cord injury, and graft-versus-host disease. It can also be used for tissue repair after surgical treatment. The mesenchymal stem cells obtained by the present invention can be used to produce pharmaceutical compositions for the treatment of various diseases.
本発明の間葉系幹細胞を医薬用の組成物とする場合には、常法により、当該細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。 When the mesenchymal stem cell of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it is a preparation in a form suitable for administration to an individual by mixing the cell with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method. And it is sufficient. As the carrier, for example, saline for injection, distilled water for injection made isotonic by adding glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) can be mentioned. Furthermore, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), storage You may mix | blend an agent, antioxidant, etc.
本発明で得られる間葉系幹細胞は、研究、例えば間葉系幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの間葉系幹細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。 The mesenchymal stem cells obtained in the present invention can also be used for research, for example, research on differentiation of mesenchymal stem cells, drug screening for various diseases, evaluation of efficacy and safety of drug candidate compounds, and the like. According to the present invention, since many mesenchymal stem cells can be obtained by one operation, it is possible to obtain reproducible research results without being affected by cell lot differences as in the past. It becomes possible.
（４）本発明の方法により得られる間葉系細胞
また、本発明により得られた間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、ならびに本発明の方法により体細胞から直接誘導される間葉系細胞も、上記のとおり医薬用の組成物とすることができる。この場合も、目的や投与の方法に応じて適切な組成、形態が選択される。さらにこれらの細胞を、そのそれぞれに作用する医薬候補化合物のスクリーニングや化合物の安全性評価に使用することもできる。
(4) Mesenchymal cells obtained by the method of the present invention In addition, mesenchymal cells differentiated from the mesenchymal stem cells obtained by the present invention, and mesenchymal cells directly induced from somatic cells by the method of the present invention Cells can also be made into pharmaceutical compositions as described above. Also in this case, an appropriate composition and form are selected according to the purpose and administration method. Furthermore, these cells can also be used for screening drug candidate compounds acting on each of them and for evaluating the safety of the compounds.
本発明の間葉系幹細胞から分化した間葉系細胞、本発明の方法により体細胞から直接誘導された間葉系細胞としては、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）が例示されるが、これらに限定されるものではない。前記細胞はたとえばその特徴的な性質や特異的なマーカーを利用して検出、確認、分離を行うことができる。 Examples of mesenchymal cells differentiated from mesenchymal stem cells of the present invention and mesenchymal cells directly derived from somatic cells by the method of the present invention include adipocytes (brown adipocytes, white adipocytes), chondrocytes, bones Examples include, but are not limited to, cells, osteoblasts, and myocytes (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes). The cells can be detected, confirmed and separated using, for example, their characteristic properties and specific markers.
脂肪細胞は細胞内に脂肪を蓄積する。したがって、オイルレッドＯを用いた細胞内脂肪の染色によって脂肪細胞を検出することができる。白色脂肪細胞に特異的な分子として、リポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、アディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）等が、また褐色脂肪細胞に特異的な分子としてＵＣＰ１、ＥＬＯＶＬ３、ＰＧＣ１Ａ等が、それぞれ知られている。前記分子の発現を免疫学的に検出すること、前記分子をコードするｍＲＮＡの転写を検出することにより、白色脂肪細胞及び褐色脂肪細胞を検出することができる。 Adipocytes accumulate fat in the cells. Therefore, fat cells can be detected by staining intracellular fat using Oil Red O. As molecules specific to white adipocytes, lipoprotein lipase (LPL), hormone sensitive lipase (HSL), adiponectin (ADIPOQ) and the like, and as molecules specific to brown adipocytes, UCP1, ELOVL3, PGC1A and the like, respectively. Are known. White adipocytes and brown adipocytes can be detected by immunologically detecting the expression of the molecule and detecting transcription of mRNA encoding the molecule.
軟骨細胞はデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸のような酸性ムコ多糖を含んでいることから、酸性ムコ多糖の染色に使用されるアルシアンブルーで染色することにより、軟骨細胞を検出することができる。軟骨細胞で高発現しているＩＩ型コラーゲンも軟骨細胞の確認に有用な分子である。 Since chondrocytes contain acidic mucopolysaccharides such as dermatan sulfate and chondroitin sulfate, chondrocytes can be detected by staining with Alcian Blue used for staining acidic mucopolysaccharides. Type II collagen highly expressed in chondrocytes is also a useful molecule for confirmation of chondrocytes.
骨芽細胞のマーカーとしては骨型アルカリホスファターゼが知られており、これを指標として骨芽細胞を検出することができる。骨芽細胞は細胞外にカルシウムを沈着させる性質を持つので、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色やアリザリンレッド染色により細胞外のカルシウムを染色することによって骨芽細胞を検出することもできる。 Bone-type alkaline phosphatase is known as an osteoblast marker, and osteoblasts can be detected using this as an index. Since osteoblasts have the property of depositing calcium outside the cells, osteoblasts can also be detected by staining extracellular calcium with von Kossa staining or alizarin red staining.
心筋細胞は自律的に拍動するという他の細胞にはない特徴を有しており、顕微鏡下での観察により他の細胞と区別することができる。また、心筋細胞の特異的マーカーとしては心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＴ）、αミオシン重鎖、αアクチニン等が知られており、これら分子の発現を指標に心筋細胞の誘導を確認することができる。 Cardiomyocytes have a characteristic that other cells do not pulsate autonomously, and can be distinguished from other cells by observation under a microscope. Further, cardiac troponin C (cTnT), α myosin heavy chain, α actinin and the like are known as specific markers for cardiomyocytes, and the induction of cardiomyocytes can be confirmed using the expression of these molecules as an index.
これらの間葉系細胞は、生体において数の減少もしくは機能の低下があった細胞を補充・補完する再生医療に有用である。また、これらの細胞を単独で、あるいは他の細胞や基材（生体高分子等）と組み合わせて形成させた組織を治療に使用することもできる。たとえば、褐色脂肪細胞の生体への移植や投与は生体の代謝改善、肥満防止等への効果が期待されている。さらに、これらの間葉系細胞は、医薬候補化合物のスクリーニングや化合物の安全性評価に使用することもできる。 These mesenchymal cells are useful for regenerative medicine that supplements / complements cells that have decreased in number or function in the living body. In addition, a tissue formed by using these cells alone or in combination with other cells or a substrate (such as a biopolymer) can also be used for treatment. For example, transplantation and administration of brown adipocytes into a living body are expected to have effects on improving the metabolism of the living body and preventing obesity. Furthermore, these mesenchymal cells can also be used for screening drug candidate compounds and for evaluating the safety of the compounds.
軟骨細胞について、外傷や老化に伴う関節損傷の治療や関節疾患の治療、症状軽減の目的で患者への投与が試みられている。また、軟骨細胞を細胞外マトリックス成分のような足場物質と組み合わせて組織化し、患部に移植する方法も開発されている。 Chondrocytes have been tried to be administered to patients for the purpose of treating joint damage associated with trauma and aging, treating joint diseases, and reducing symptoms. In addition, a method of organizing chondrocytes in combination with a scaffold substance such as an extracellular matrix component and transplanting it to an affected area has been developed.
心不全、心筋梗塞等の心疾患の治療手段として、心筋細胞の製造法、その移植方法の開発が行われている。たとえば、心筋細胞と内皮細胞等を積層化して形成させた心筋シートは、優れた治療効果と生着性を示すことから。重度の心不全の治療への利用が期待されている。また、心筋細胞は医薬品候補のような化合物の心毒性を評価するための重要なツールである。 As a means for treating heart diseases such as heart failure and myocardial infarction, methods for producing cardiomyocytes and transplantation methods have been developed. For example, a myocardial sheet formed by laminating myocardial cells and endothelial cells and the like shows excellent therapeutic effects and engraftment. It is expected to be used for the treatment of severe heart failure. Cardiomyocytes are also an important tool for evaluating the cardiotoxicity of compounds such as drug candidates.
本発明の方法により得られた種々の間葉系細胞は、前記の間葉系幹細胞と同様に、医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすることができる。さらに各細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。 Various mesenchymal cells obtained by the method of the present invention are prepared in a form suitable for administration to an individual, for example, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier in the same manner as the mesenchymal stem cells. It can be. Furthermore, it can also be set as the composition combined with the other cell and component effective in function display and engraftment improvement of each cell.
（５）本発明の間葉系細胞製造用の培地
本発明は、体細胞を材料として間葉系細胞を製造するために有用な培地を提供する。
(5) Medium for producing mesenchymal cells of the present invention The present invention provides a medium useful for producing mesenchymal cells using somatic cells as a material.
体細胞からの間葉系幹細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して作製された基礎培地に、有効成分としてトランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤を含有させた培地が例示される。前記の有効成分は間葉系幹細胞の誘導に有効な濃度で含有されていればよく、当該濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は公知の培地や市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な細胞培養用の培地であるＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２やこれらを改変した培地を本発明の培地に使用することができる。さらに、前記の有効成分の作用を妨げない範囲で、公知の培地成分、たとえば血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を含有させてもよい。 As a medium used for the production of mesenchymal stem cells from somatic cells, a basal medium prepared by mixing components necessary for cell culture, transforming growth factor-β signal inhibitor, bone as an active ingredient Examples thereof include a medium containing a forming protein signal inhibitor, a p53 inhibitor, a GSK3β signal inhibitor, and an adenylate cyclase activator. The active ingredient may be contained at a concentration effective for the induction of mesenchymal stem cells, and the concentration can be appropriately determined by those skilled in the art. The basal medium can be selected from a known medium or a commercially available medium. For example, MEM, DMEM, DMEM / F12, which are general cell culture media, and media obtained by modifying them can be used as the media of the present invention. Further, in the range that does not interfere with the action of the active ingredient, known medium components such as serum, protein (albumin, transferrin, growth factor, etc.), amino acids, saccharides, vitamins, fatty acids, antibiotics, etc. Also good.
体細胞から各種の間葉系細胞を製造するために使用される培地は、間葉系幹細胞の製造に使用される培地の成分に加えて、間葉系幹細胞から所望の間葉系細胞への分化を誘導するのに適した成分、例えば前記の「各種間葉系細胞への分化の誘導に有効な物質」をさらに含有していればよい。前記の間葉系幹細胞製造用の培地に脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、あるいは筋細胞への分化の誘導に有効な物質を添加した培地は、体細胞からそれぞれの分化細胞を誘導するのに有用である。本発明を特に限定するものではないが、例えば体細胞から褐色脂肪細胞を製造するための培地としては、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤に加え、インスリン、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有させた培地が例示される。また、体細胞から心筋細胞を製造するための培地としては、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル阻害剤、骨形成タンパク質シグナル阻害剤、ｐ５３阻害剤、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤及びアデニル酸サイクラーゼ活性化剤に加え、ＭＡＰＫシグナル阻害剤を含有させた培地が例示される。心筋細胞誘導用の培地は、さらにＨＤＡＣ阻害剤を含有していてもよい。 The medium used for producing various mesenchymal cells from somatic cells is not only the components of the medium used for producing mesenchymal stem cells, but also from mesenchymal stem cells to the desired mesenchymal cells. It only has to contain a component suitable for inducing differentiation, for example, the above-mentioned “substance effective for inducing differentiation into various mesenchymal cells”. A medium in which a substance effective for inducing differentiation into adipocytes, bone cells, osteoblasts, chondrocytes, or muscle cells is added to the medium for producing mesenchymal stem cells described above. Useful for guiding. Although the present invention is not particularly limited, for example, a medium for producing brown adipocytes from somatic cells includes transforming growth factor-β signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, GSK3β signal. Examples thereof include a medium containing insulin, dexamethasone, and 3-isobutyl-1-methylxanthine in addition to the inhibitor and the adenylate cyclase activator. The medium for producing cardiomyocytes from somatic cells includes transforming growth factor-β signal inhibitor, bone morphogenetic protein signal inhibitor, p53 inhibitor, GSK3β signal inhibitor and adenylate cyclase activator. Examples thereof include a medium containing a MAPK signal inhibitor. The medium for inducing cardiomyocytes may further contain an HDAC inhibitor.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to the range of an Example.
実施例１ ヒト線維芽細胞からの間葉系幹細胞の誘導
１） ヒト線維芽細胞
材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。２２才、３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
Example 1 Induction of Mesenchymal Stem Cells from Human Fibroblasts 1) Human Fibroblasts Human fibroblasts used as materials were purchased from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. It is a fibroblast derived from human skin of 22 and 38 years old.
２） ヒト線維芽細胞からの間葉系幹細胞直接誘導
ヒト線維芽細胞を、それぞれ３５ｍｍ ディッシュに８×１０４個ずつ撒き、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地（和光純薬社製）で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で２日間インキュベートした。
2) Direct induction of mesenchymal stem cells from human fibroblasts Human fibroblasts were seeded 8 × 10 4 in a 35 mm dish, respectively, and DMEM high supplemented with 10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin Incubation was performed for 2 days in a glucose medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
Ｓｍａｄシグナルを阻害する２つの化合物、即ちＢＭＰシグナル阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（和光純薬社製：終濃度１μＭ）とＴＧＦ−βシグナル阻害剤であるＳＢ−４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社製：終濃度２μＭ）、ＧＳＫ３βシグナル阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）、ｐ５３シグナルの阻害剤であるピフィスリン−α（和光純薬社製：終濃度５μＭ）並びにｃＡＭＰの生産促進剤であるフォルスコリン（和光純薬社製：終濃度７．５μＭ）を含む間葉系幹細胞増殖培地（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ：ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を調製した。前記の、２日間培養したヒト線維芽細胞のディッシュの培地をこの間葉系幹細胞増殖培地に置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で３日毎に培地交換し培養を継続した。 Two compounds that inhibit Smad signal, namely, LDN-193189 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 1 μM) which is a BMP signal inhibitor and SB-431542 (manufactured by Tocris: final concentration 2 μM) which is a TGF-β signal inhibitor. ), CHIR99021 which is a GSK3β signal inhibitor (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 1 μM), pifthrin-α which is an inhibitor of p53 signal (Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 5 μM), and cAMP production promoter. A mesenchymal stem cell growth medium (manufactured by PromoCell) containing forskolin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 7.5 μM) was prepared. The medium of the human fibroblast dish cultured for 2 days was replaced with the mesenchymal stem cell growth medium, and the medium was changed every 3 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 to continue the culture.
３） 間葉系幹細胞の評価
間葉系幹細胞増殖培地での培養物を２％ ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ＣＤ１０５抗体（ａｂｃａｍ社製：ａｂ１１４１４）を使用した。この結果、間葉系幹細胞増殖培地での培養開始から２日後にＣＤ１０５陽性の細胞の出現が確認された。間葉系幹細胞増殖培地での培養開始から３日後の３８才ヒト由来の線維芽細胞の培養物を染色し、微分干渉顕微鏡で観察した結果を図１に示す。扁平な広い細胞質を持つ細胞が出現しており、それらに間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１０５が発現していることが示された。
さらに、間葉系幹細胞増殖培地での培養開始から８、９日後の細胞について同様に免疫染色を行った。図２、３に８日後、９日後の２２才ヒト由来の線維芽細胞の培養物の写真をそれぞれ示す。図２、３に示されるとおり、６０％以上の細胞がＣＤ１０５陽性細胞であった。
3) Evaluation of mesenchymal stem cells A culture in a mesenchymal stem cell growth medium was fixed with 2% PFA (paraformaldehyde) and then immunostained. Anti-CD105 antibody (Abcam: ab11414) was used for staining. As a result, the appearance of CD105 positive cells was confirmed 2 days after the start of the culture in the mesenchymal stem cell growth medium. FIG. 1 shows the result of staining a culture of fibroblasts derived from a 38-year-old human 3 days after the start of culturing in a mesenchymal stem cell growth medium and observing with a differential interference microscope. Cells with flat and broad cytoplasm appeared, and it was shown that CD105, a marker of mesenchymal stem cells, was expressed in them.
Furthermore, immunostaining was similarly performed on cells 8 and 9 days after the start of culture in a mesenchymal stem cell growth medium. 2 and 3 show photographs of cultures of fibroblasts derived from a 22-year-old human after 8 days and 9 days, respectively. As shown in FIGS. 2 and 3, more than 60% of the cells were CD105 positive cells.
実施例２ 褐色脂肪細胞の誘導１
１） ヒト線維芽細胞より得た間葉系幹細胞からの褐色脂肪細胞の誘導
実施例１と同様に、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養したヒト線維芽細胞を用意した。
Example 2 Induction of brown adipocytes 1
1) Induction of brown adipocytes from mesenchymal stem cells obtained from human fibroblasts In the same manner as in Example 1, human fibroblasts cultured in DMEM high glucose medium were prepared.
前記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を実施例１記載の間葉系幹細胞増殖培地と置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で３日間培養した。その後、インスリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、デキサメタゾン（終濃度２．５μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（終濃度０．５ｍＭ）、ロシグリタゾン（終濃度１μＭ）、ＳＢ−４３１５４２（終濃度２μＭ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μＭ）、ピフィスリン−α（終濃度５μＭ）及びフォルスコリン（終濃度７．５μＭ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ， Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地への培地交換を行いながら３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養を継続した。 The dish medium of human fibroblasts was replaced with the mesenchymal stem cell growth medium described in Example 1, and cultured for 3 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . Thereafter, insulin (final concentration 10 μg / mL), dexamethasone (final concentration 2.5 μM), 3-isobutyl-1-methylxanthine (final concentration 0.5 mM), rosiglitazone (final concentration 1 μM), SB-431542 (final concentration) 2 L), LDN-193189 (final concentration 1 μM), pifthrin-α (final concentration 5 μM) and forskolin (final concentration 7.5 μM) D-MEM (High Glucose) with L-Glutamine, Phenol Red, Sodium Pyruvate ( The medium was changed to Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Thereafter, the culture was continued under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 while changing the medium to the medium having the same composition every 3 days.
２） 褐色脂肪細胞の評価
間葉系幹細胞増殖培地での培養開始から７日後に２％ ＰＦＡで細胞を固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ＵＣＰ１抗体（ａｂｃａｍ社製のａｂ１０９８３；４００倍希釈で使用）を使用した。７０％以上の細胞がＵＣＰ１陽性であった。さらに、褐色脂肪細胞特異的マーカーとして知られるＵｃｐ１、Ｃｋｍｔ１、Ｆａｂｐ４遺伝子が発現していることを確認した。この結果、培養開始から７日後には褐色脂肪細胞が出現していることが示された。
2) Evaluation of brown adipocytes Cells were fixed with 2% PFA 7 days after the start of culture in a mesenchymal stem cell growth medium, and then immunostained. Anti-UCP1 antibody (ab10983 manufactured by abcam; used at 400-fold dilution) was used for staining. More than 70% of the cells were UCP1 positive. Furthermore, it was confirmed that Ucp1, Ckmt1, and Fabp4 genes known as brown adipocyte-specific markers were expressed. As a result, it was shown that brown adipocytes appeared 7 days after the start of culture.
また、以下の操作で細胞のオイルレッドＯ染色を実施した。ディッシュから培地を除去して細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで細胞を２０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．３％のオイルレッドＯ イソプロパノール溶液と蒸留水を６：４で混合して調製したオイルレッド染色液をディッシュに加え、室温で１５分放置した。その後、染色液をディッシュから除き、さらに細胞を６０％ イソプロパノール及び蒸留水で順次洗浄した後に細胞の染色状態を観察した。この結果、内部に脂肪が蓄積されている細胞の存在が明らかとなった。
培養開始から３５日後には、７０％以上の細胞がオイルレッドＯ陽性であった。
In addition, oil red O staining of the cells was performed by the following operation. The medium was removed from the dish and the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), then the cells were fixed with 20% neutral buffered formalin solution. The fixed cells were washed with PBS, and then an oil red staining solution prepared by mixing 6: 4 of a 0.3% oil red O isopropanol solution and distilled water was added to the dish and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the staining solution was removed from the dish, and the cells were washed successively with 60% isopropanol and distilled water, and the stained state of the cells was observed. As a result, the existence of cells in which fat was accumulated became clear.
After 35 days from the start of the culture, 70% or more of the cells were oil red O positive.
実施例３ 褐色脂肪細胞の誘導２
１） ヒト線維芽細胞からの褐色脂肪細胞の誘導
実施例１と同様に、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養したヒト線維芽細胞を用意した。
Example 3 Induction of brown adipocytes 2
1) Induction of brown adipocytes from human fibroblasts In the same manner as in Example 1, human fibroblasts cultured in DMEM high glucose medium were prepared.
ＳＢ−４３１５４２（終濃度２μＭ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μＭ）、ピフィスリン−α（終濃度５μＭ）、フォルスコリン（終濃度７．５μＭ）、インスリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ：約１．７μＭ）、デキサメタゾン（終濃度２．５μＭ）並びに３−イソブチル−１−メチルキサンチン（終濃度０．５ｍＭ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ， Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬社製）を調製し、褐色脂肪細胞誘導培地とした。前記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を褐色脂肪細胞誘導培地に置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で３日毎に培地交換し培養を継続した。 SB-431542 (final concentration 2 μM), LDN-193189 (final concentration 1 μM), CHIR99021 (final concentration 1 μM), pifthrin-α (final concentration 5 μM), forskolin (final concentration 7.5 μM), insulin (final concentration 10 μg / mL: about 1.7 μM), dexamethasone (final concentration 2.5 μM) and 3-isobutyl-1-methylxanthine (final concentration 0.5 mM) D-MEM (High Glucose) with L-Glutamine, Phenol Red, Sodium Pyruvate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared and used as a brown adipocyte induction medium. The medium of the human fibroblast dish was replaced with a brown adipocyte induction medium, and the medium was changed every 3 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture was continued.
２） 褐色脂肪細胞の評価
実施例２−１）の培養物の培養開始から４日後に脂肪細胞様の細胞が出現した。培養開始７日後に細胞を２％ ＰＦＡで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗ＵＣＰ１抗体（ａｂｃａｍ社製のａｂ１０９８３；４００倍希釈で使用）を使用した。また、実施例２同様にオイルレッド染色を実施して脂肪が蓄積された細胞の存在を確認した。さらに、Ｕｃｐ１、Ｃｋｍｔ１、Ｆａｂｐ４の各遺伝子が発現していることを確認した。この結果、褐色脂肪細胞誘導培地での培養開始から７日後には褐色脂肪細胞が誘導されていることが示された。
さらに、培養開始から３５日後には７０％以上の細胞がＵＣＰ１陽性であった。
2) Evaluation of brown adipocytes Adipocyte-like cells appeared 4 days after the start of culture of the culture of Example 2-1). Seven days after the start of culture, the cells were fixed with 2% PFA, and then immunostained. Anti-UCP1 antibody (ab10983 manufactured by abcam; used at 400-fold dilution) was used for staining. Further, oil red staining was performed in the same manner as in Example 2 to confirm the presence of cells in which fat was accumulated. Furthermore, it was confirmed that each gene of Ucp1, Ckmt1, and Fabp4 was expressed. As a result, it was shown that brown adipocytes were induced 7 days after the start of the culture in the brown adipocyte induction medium.
Furthermore, after 35 days from the start of culture, 70% or more of the cells were UCP1 positive.
実施例４ 心筋細胞の誘導
１） ヒト線維芽細胞からの心筋細胞の誘導
実施例１と同様に、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養したヒト線維芽細胞（３８才のヒト皮膚由来）を用意した。
Example 4 Induction of cardiomyocytes 1) Induction of cardiomyocytes from human fibroblasts In the same manner as in Example 1, human fibroblasts (38-year-old human skin-derived) cultured in DMEM high glucose medium were prepared.
１０％ ウシ胎児血清、１％ Ｎ−２サプリメント、２％ Ｂ−２７サプリメント、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ，ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）に、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤であるＲｅｐＳｏｘ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製：終濃度５μＭ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μＭ）、ピフィスリン−α（終濃度５μＭ）、フォルスコリン（終濃度７．５μＭ）、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（和光純薬社製：終濃度１μＭ）ならびにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるバルプロ酸（和光純薬社製：終濃度０．１ｍＭ）を調整し、心筋細胞誘導培地とした。前記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を心筋細胞誘導培地に置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で４日毎に培地交換し培養を継続した。 10% fetal bovine serum, 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, 1 × MEM non-essential amino acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 50 μg / mL ascorbic acid, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin D-MEM, high glucose, pyruvate (ThermoFisher) containing TGF-β signal inhibitor RepSox (BioVision: final concentration 5 μM), LDN-193189 (final concentration 1 μM), CHIR99021 (final concentration 1 μM) ), Pifthrin-α (final concentration 5 μM), forskolin (final concentration 7.5 μM), PD0325901 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 1 μM), a mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal inhibitor, Valproic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: final concentration 0.1 mM), an inhibitor of stone deacetylase (HDAC), was prepared to obtain a cardiomyocyte induction medium. The medium of the human fibroblast dish was replaced with a cardiomyocyte induction medium, and the medium was changed every 4 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and the culture was continued.
２） 心筋細胞の評価
心筋細胞誘導培地での培養開始から８日後以降の顕微鏡下での観察により、収縮あるいは拍動する単体の細胞や小さな細胞塊が認められた。培養開始から１４日以降には、収縮あるいは拍動する心筋細胞様細胞の大きな細胞塊が多数見られるようになった。１８日後に細胞の自律的拍動が認められた。さらに、これらの心筋細胞様の細胞はαアクチニン、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＴ）陽性であることが免疫的方法により確認された。培養開始から２１日後には２５％以上の細胞がｃＴｎＴ陽性であった（ａｂｃａｍ社製の抗ｃＴｎＴ抗体 ａｂ１０２１４を２００倍希釈で使用）。このことから、前記の培地を使用して体細胞から直接心筋細胞を誘導できることが示された。さらに、心筋細胞誘導培地としてバルプロ酸を含有しないもの（他の成分は変更なし）を使用した場合も、効率の低下はあるものの、心筋細胞を誘導することができた。
2) Evaluation of cardiomyocytes By observation under a microscope after 8 days from the start of culture in the cardiomyocyte induction medium, single cells or small cell masses that contract or beat were observed. After 14 days from the start of culture, many large cell clusters of contracting or beating cardiomyocyte-like cells came to be seen. After 18 days, autonomous pulsation of the cells was observed. Furthermore, it was confirmed by immunological methods that these cardiomyocyte-like cells were positive for α-actinin and cardiac troponin C (cTnT). More than 25% of the cells were positive for cTnT 21 days after the start of the culture (the anti-cTnT antibody ab10214 manufactured by abcam was used at a 200-fold dilution). This indicates that cardiomyocytes can be induced directly from somatic cells using the medium described above. Furthermore, when a cardiomyocyte induction medium containing no valproic acid (the other components were not changed) was used, cardiomyocytes could be induced, although the efficiency was reduced.
実施例５ 骨芽細胞の誘導
１） ヒト線維芽細胞からの骨芽細胞の誘導
実施例１と同様に、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養したヒト線維芽細胞（３８才のヒト皮膚由来）を準備した。
Example 5 Induction of osteoblasts 1) Induction of osteoblasts from human fibroblasts In the same manner as in Example 1, human fibroblasts (derived from 38-year-old human skin) cultured in DMEM high glucose medium were prepared. .
ＳＢ−４３１５４２（終濃度２μＭ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μＭ）、ピフィスリン−α（終濃度５μＭ）並びにフォルスコリン（終濃度７．５μＭ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ， Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（和光純薬社製）に、さらに市販の骨芽細胞分化誘導剤（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ；タカラバイオ社製）を添加して骨芽細胞誘導培地を作製した。前記の分化誘導剤は、添付された説明書の指示に従って培地に添加した（培地１００ｍＬあたりにアスコルビン酸を１ｍＬ、ハイドロコルチゾンを２００μＬ、β−グリセロリン酸を２ｍＬ、それぞれ添加した）。 D-MEM (High) containing SB-431542 (final concentration 2 μM), LDN-193189 (final concentration 1 μM), CHIR99021 (final concentration 1 μM), pifthrin-α (final concentration 5 μM) and forskolin (final concentration 7.5 μM) Glucose) With L-Glutamine, Phenol Red, Sodium Pyruvate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a commercially available osteoblast differentiation inducer (Osteoblast-Inducer Reagent; manufactured by Takara Bio Inc.) is added to the osteoblast-inducing medium. Was made. The differentiation inducer was added to the medium according to the instructions in the attached instructions (1 mL of ascorbic acid, 200 μL of hydrocortisone, and 2 mL of β-glycerophosphate were added per 100 mL of the medium).
前記のヒト線維芽細胞の培養容器中の培地を骨芽細胞誘導培地で置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養した。対照として、骨芽細胞誘導培地からＳＢ−４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α、フォルスコリンを除いた培地でのヒト線維芽細胞の培養も実施した。培養中、培地は３日毎に交換した。 The medium in the culture vessel for human fibroblasts was replaced with an osteoblast-inducing medium, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . As a control, human fibroblasts were also cultured in a medium in which SB-431542, LDN-193189, CHIR99021, pifthrin-α, and forskolin were removed from the osteoblast induction medium. During the culture, the medium was changed every 3 days.
２） 骨芽細胞の評価
骨芽細胞誘導培地での培養開始から１７日後に培養物をｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色に供した。染色後の培養物中に、周辺にカルシウムが沈着した骨芽細胞が確認された（図４Ａ）。全細胞に占める骨芽細胞の割合は６０％以上であった。一方、対照の培養物中にはｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色陽性の細胞は検出されなかった（図４Ｂ）。このことから、前記の骨芽細胞誘導培地を使用することにより、一段階の培養で線維芽細胞から骨芽細胞を製造できることが明らかとなった。
2) Evaluation of osteoblasts The culture was subjected to von Kossa staining 17 days after the start of culture in the osteoblast induction medium. Osteoblasts with calcium deposited in the periphery were confirmed in the culture after staining (FIG. 4A). The proportion of osteoblasts in all cells was 60% or more. On the other hand, von Kossa staining positive cells were not detected in the control culture (FIG. 4B). From this, it became clear that osteoblasts can be produced from fibroblasts in one stage of culture by using the above-mentioned osteoblast induction medium.
実施例６ 軟骨細胞の誘導
１） ヒト線維芽細胞からの軟骨細胞の誘導
実施例１と同様に、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養したヒト線維芽細胞（３８才のヒト皮膚由来）を準備した。
Example 6 Induction of chondrocytes 1) Induction of chondrocytes from human fibroblasts In the same manner as in Example 1, human fibroblasts (derived from 38-year-old human skin) cultured in DMEM high glucose medium were prepared.
ＳＢ−４３１５４２（終濃度２μＭ）、ＬＤＮ−１９３１８９（終濃度１μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（終濃度１μＭ）、ピフィスリン−α（終濃度５μＭ）、フォルスコリン（終濃度７．５μＭ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社製；終濃度１％）、アスコルビン酸−２−リン酸（終濃度５０μｇ／ｍＬ）、デキサメタゾン（終濃度１００ｎＭ）、ＴＧＦ−β３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製：終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ−プロリン（終濃度４０μｇ／ｍＬ）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ社製；終濃度１×）を含むＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ， Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を調製し、軟骨細胞誘導培地とした。 SB-431542 (final concentration 2 μM), LDN-193189 (final concentration 1 μM), CHIR99021 (final concentration 1 μM), pifthrin-α (final concentration 5 μM), forskolin (final concentration 7.5 μM), Insulin-Transferrin-Selenium ( Gibco; final concentration 1%), ascorbic acid-2-phosphate (final concentration 50 μg / mL), dexamethasone (final concentration 100 nM), TGF-β3 (manufactured by PeproTech: final concentration 10 ng / mL), L-proline (Final concentration 40 μg / mL), DMEM, High Glucose, Pyruvate (ThermoFisher Scientific, Inc.) containing Antibiotic-Antilytic (Gibco; final concentration 1 ×) was prepared as a chondrocyte induction medium. .
前記のヒト線維芽細胞の培養容器中の培地を軟骨細胞誘導培地に置換し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養した。対照として、軟骨細胞誘導培地からＳＢ−４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、ＣＨＩＲ９９０２１、ピフィスリン−α、フォルスコリンを除いた培地でのヒト線維芽細胞の培養も実施した。培養中、培地は３日毎に交換した。 The medium in the culture vessel for human fibroblasts was replaced with a chondrocyte induction medium and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . As a control, human fibroblasts were also cultured in a medium in which SB-431542, LDN-193189, CHIR99021, pifthrin-α and forskolin were removed from the chondrocyte induction medium. During the culture, the medium was changed every 3 days.
２） 軟骨細胞の評価
培養開始から１９日後に培養物をアルシアンブルー染色に供した。軟骨細胞誘導培地での培養物中にはアルシアンブルーで染色される、ムコ多糖を生成している軟骨細胞が６０％以上存在することが確認された（図５Ａ）。一方、対照の培養物中にはアルシアンブルー染色陽性の細胞は検出されなかった（図５Ｂ）。以上の結果より、本発明の方法によって線維芽細胞から一段階の培養で軟骨細胞を製造できることが明らかとなった。
2) Evaluation of chondrocytes After 19 days from the start of the culture, the culture was subjected to Alcian blue staining. It was confirmed that 60% or more of chondrocytes producing mucopolysaccharide stained with alcian blue were present in the culture in the chondrocyte induction medium (FIG. 5A). On the other hand, cells positive for Alcian blue staining were not detected in the control culture (FIG. 5B). From the above results, it was clarified that chondrocytes can be produced from fibroblasts by one-step culture by the method of the present invention.
本発明の方法は、簡便であり、かつスケールアップも容易であることから、安定した間葉系幹細胞、ならびに間葉系の種々の細胞の供給を可能とする。本発明の方法により得られる間葉系細胞は各種の研究、医療の分野において有用である。 Since the method of the present invention is simple and easy to scale up, stable mesenchymal stem cells and various mesenchymal cells can be supplied. The mesenchymal cells obtained by the method of the present invention are useful in various research and medical fields.
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