RU2525688C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525688C2 RU2525688C2 RU2012138835/10A RU2012138835A RU2525688C2 RU 2525688 C2 RU2525688 C2 RU 2525688C2 RU 2012138835/10 A RU2012138835/10 A RU 2012138835/10A RU 2012138835 A RU2012138835 A RU 2012138835A RU 2525688 C2 RU2525688 C2 RU 2525688C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- immitis
- supernatant
- temperature
- dirofilaria immitis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа получения очищенного антигена Dirofilaria immitis. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С. Представленное изобретение позволяет получить антиген с высокими показателями чувствительности и специфичности и может быть использовано в диагностике дирофиляриоза у людей и животных. 2 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностики дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.
Дирофиляриоз является достаточно изученной в ветеринарии проблемой. По отчетным данным ветеринарных служб субъектов юга России, дирофиляриоз занимает лидирующее место в этиологической структуре заболеваемости собак заразными болезнями и стремительно распространяется до северных границ России.
Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия прямых методов исследования. Сердечный дирофиляриоз собак диагностируют микроскопическим методом, основанным на обнаружении микрофилярий в крови. В то же время существуют скрытые формы данного гельминтоза, при котором личинок в крови обнаружить не удается, в этом случае возникает необходимость использования серологических методов исследования. Отсутствие отечественных иммунологических тестов для проведения серологических исследований делает актуальной разработку способа получения антигена Dirofilaria immitis.
Возбудителями дирофиляриоза являются как D. immitis, так и D. repens, но антиген для целей диагностики должен обладать высокой видоспецифичностью и чувствительностью в связи с разной патогенностью двух видов дирофилярий.
Известен способ получения соматического антигена D. repens (RU 2356575 C1, 27.05.2009). По данному способу для получения антигена используют неполовозрелые самки гельминта, удаленные у больных людей. Этот способ не может быть использован для получения антигена D. immitis, так как на сегодняшний день в РФ не зарегистрировано случаев обнаружения у человека гельминтов вида D. immitis. Использование неполовозрелых форм D. immitis от собак также проблемно в связи с тем, что неполовозрелые D. immitis имеют подкожную локализацию, как и половозрелые самки D. repens, а морфологическая видовая дифференциация самок Dirofilaria разных видов, удаленных из подкожных тканей собак, очень сложна.
Известен способ получения соматического антигена D. immitis, при котором гельминтов помещают в физиологический раствор в соотношении 1:10, измельчают в ступке на холоде до получения однородной массы, проводят экстрагирование белков в течение 24 часов в этом же растворе при 4°С на магнитной мешалке, по окончании экстрагирования гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин на холоде, осадок удаляют, а супернатант фракционируют гель-хроматографией на колонке 16×70 см (Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией // Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 2007. - С.8). В данном способе для получения антигена использовали половозрелых самок гельминтов D. immitis от собак. Антиген, полученный по данному способу, обладал видоспецифичностью, но при этом имел достаточно высокий процент ложноотрицательных результатов (16%).
Целью изобретения является разработка способа получения соматического очищенного антигена D. immitis с высокими показателями чувствительности и специфичности.
В предлагаемом способе отделяют и используют головной конец половозрелой самки гельминта D. immitis от собак:
- учитывая, что в нем содержатся железистые клетки пищевода - стихоциты, которые обладают высокой секретирующей активностью (Бритов В.А. Трихинеллы и их использование в медицине. - 2006. - С.56);
- исходя из того, что иммунизирующее воздействие гельминтов может осуществляться за счет секретов и экскретов, выделяемых в процессе их жизнедеятельности (Шульц Р.С., Гвоздев Е.В. Основы общей гельминтологии. Т.III, Патология и иммунология при гельминтозах. - М., 1976. - С 108).
Способ включает следующие этапы:
1. Подготовка половозрелой самки Dirofilaria immitis к гомогенизации
Самку Dirofilaria immitis, удаленную хирургическим путем из сердца и легочных артерий собак, отмывают многократно физиологическим раствором, отделяют головной конец длиной 2 см и помещают его в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.
2. Получение соматического экстракта
Проводят механическую гомогенизацию паразита 5 раз по 30 секунд с интервалом 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.
Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С.
3. Очистка экстракта в ацетоне
Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре 4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 мин при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.
К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 мин, затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.
Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.
4. Анализ диагностических свойств соматического очищенного антигена
Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 8 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.
Пример
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена D. immitis с сыворотками крови животных.
В опытах использовали сыворотки крови собак, больных сердечным дирофиляриозом (D. immitis), собак с микст инвазией D. immitis и D. repens, свободных от данной инвазии собак и сыворотки крови собак, больных токсокарозом. Кровь всех животных предварительно исследовали на наличие микрофилярий классическим способом.
Таблица 1 | ||||||||
Диагностическая эффективность ИФА с соматическим очищенным антигеном D. immitis | ||||||||
№п.п. | Группы обследованных | Кол-во обследованных | Результаты ИФА | |||||
положительный | отрицательный | Диагностическая эффективность антигена (%±m) | ||||||
абс. | %±m | абс. | %±m | |||||
1. | Собаки, больные дирофиляриозом (с микрофиляриемией): | 89 | 83 | 93,26 | 6 | 6,74 | чувствительность | 93,26 |
- D. immitis | 41 | 38 | 92,68 | 3 | 7,32 | |||
- D. repens и D. immitis | 48 | 45 | 93,75 | 3 | 6,25 | |||
2. | Собаки, свободные от микрофилярий: | 61 | 8 | 13,11 | 53 | 86,89 | специфичность | 86,89 |
- без клинических признаков дирофиляриоза | 31 | 7 | 22,58 | 24 | 77,42 | |||
- щенки в возрастедо 5 мес. | 21 | 1 | 4,76 | 20 | 95,24 | |||
- больные токсокарозом | 10 | - | 0 | 10 | 100 |
Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 93,26% и 86,89% соответственно.
В таблице 2 приведены результаты сравнительных испытаний в ИФА антигенов D. immitis, полученных по предлагаемому и приведенным выше способам.
Таблица 2 | |||
Результаты исследований диагностической эффективности в ИФА антигена D. immitis, полученного разными способами | |||
№ п.п. | Антиген D. immitis | Чувствительность | Специфичность |
1 | полученный по прототипу (Медведев А.Ю., 2007) из целой половозрелой самки D. immitis | 84,00% | 84,46% |
2 | полученный по способу, описанному в патенте (RU 23566575) из целой половозрелой самки D. immitis | 83,14% | 85,24% |
3 | полученный по предлагаемому способу из головного конца половозрелой самки D. immitis | 93,26% | 86,89% |
Из таблицы 2 (строка 2) видно, что приготовление антигена D. immitis из целой половозрелой самки (по Медведеву А.Ю., 2007) с использованием этапов по способу, описанному в предназначенном для получения антигена D. repens патенте (RU 23566575), не повышает его специфичность и чувствительность в ИФА по сравнению с антигеном, полученным по способу Медведева А.Ю.
Наиболее высокие результаты чувствительности и специфичности в ИФА получены при исследовании антигена, полученного по предлагаемому способу с использованием головного конца гельминта D. immitis.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает получение соматического очищенного антигена D. immitis с высокими показателями чувствительности и специфичности.
Claims (1)
- Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria immitis, включающий механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012138835/10A RU2525688C2 (ru) | 2012-09-10 | 2012-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012138835/10A RU2525688C2 (ru) | 2012-09-10 | 2012-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012138835A RU2012138835A (ru) | 2014-03-20 |
RU2525688C2 true RU2525688C2 (ru) | 2014-08-20 |
Family
ID=50279914
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012138835/10A RU2525688C2 (ru) | 2012-09-10 | 2012-09-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2525688C2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2703280C1 (ru) * | 2018-11-07 | 2019-10-16 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" (ФБУН "Ростов НИИ микробиологии и паразитологии") | Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper |
RU2768162C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2022-03-23 | Мария Владимировна Видманова | Способ подготовки половозрелых особей нематод для идентификации методом maldi tof масс-спектрометрии |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2356575C1 (ru) * | 2008-01-09 | 2009-05-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН "РостовНИИМП" Роспотребнадзора) | Способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria repens |
-
2012
- 2012-09-10 RU RU2012138835/10A patent/RU2525688C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2356575C1 (ru) * | 2008-01-09 | 2009-05-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН "РостовНИИМП" Роспотребнадзора) | Способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria repens |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
US, 4839275, 13.06.1989 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2703280C1 (ru) * | 2018-11-07 | 2019-10-16 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" (ФБУН "Ростов НИИ микробиологии и паразитологии") | Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper |
RU2768162C1 (ru) * | 2021-06-09 | 2022-03-23 | Мария Владимировна Видманова | Способ подготовки половозрелых особей нематод для идентификации методом maldi tof масс-спектрометрии |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012138835A (ru) | 2014-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zibaei et al. | Trend of toxocariasis in Iran: a review on human and animal dimensions | |
Svobodová et al. | The first report of authochthonous dirofilariosis in dogs in the Czech Republic | |
CN106053833A (zh) | 癌的检测方法 | |
RU2525688C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis | |
Ismail et al. | Detection and characterization of Leishmania in tissues of patients with post kala-azar dermal leishmaniasis using a specific monoclonal antibody | |
Bhandari et al. | Revisiting scrub typhus: a neglected tropical disease | |
Jayewardene et al. | The fluorescent antibody test in the serological diagnosis of the causative organisms of tropical eosinophilia and filariasis | |
NL8104979A (nl) | Werkwijze voor de bereiding van immunobiologische preparaten, toe te passen bij de diagnose , het voorkomen en/of het behandelen van candida guilliermondii infecties. | |
RU2687553C1 (ru) | Способ прижизненной дифференциальной диагностики туберкулёза и микобактериозов крупного рогатого скота | |
Saad et al. | Schistosoma mansoni and endocarditis: from egg to free DNA detection in Egyptian patients and infected BALB/c mice | |
RU2356575C1 (ru) | Способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria repens | |
de Araújo Teixeira et al. | Risk factors and detection of brucella ovis in naturally infected rams and ewes | |
Hendawy et al. | Immunological evaluation of the diagnostic values of Cephalopina titillator different larval antigens in camels from Egypt | |
RU2567845C1 (ru) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИЧИНОК T.canis МЕТОДОМ ПЕРЕВАРИВАНИЯ ПАРЕНХИМЫ ЛЕГКИХ И ПЕЧЕНИ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ | |
RU2339038C2 (ru) | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных | |
RU2799846C1 (ru) | Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae | |
Ahmed et al. | Development of Indirect ELISA for the diagnosis of bovine hypodermosis (Hypoderma lineatum) in the cattle of subtropical region of Pakistan | |
RU2702989C1 (ru) | Способ диагностики гельминтозов у человека и животных | |
RU2452501C2 (ru) | Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения, эритроцитарный диагностикум для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения и способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием указанного эритроцитарного диагностикума | |
RU2487722C2 (ru) | Способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак | |
RU2487362C1 (ru) | Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения | |
Fereig et al. | Occurrence, risk factors, and health hazards of Dictyocaulus filaria infection in goats in Qena, Egypt | |
Sherif | Schistosomal metabolic products in the diagnosis of bilharziasis | |
Abd Ali Mohammad et al. | Immunological Aspects of Patients Infested with Scabies in Thi-Qar Province, Southern Iraq | |
RU2287342C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОГО АНТИГЕНА Trichinella spiralis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150911 |