RU2525134C1 - Method of collecting selected samples of buckwheat plants - Google Patents
Method of collecting selected samples of buckwheat plants Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525134C1 RU2525134C1 RU2012153913/10A RU2012153913A RU2525134C1 RU 2525134 C1 RU2525134 C1 RU 2525134C1 RU 2012153913/10 A RU2012153913/10 A RU 2012153913/10A RU 2012153913 A RU2012153913 A RU 2012153913A RU 2525134 C1 RU2525134 C1 RU 2525134C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stress
- genes
- samples
- level
- response
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу отбора селекционных образцов растений гречихи, основанному на определении уровня экспрессии генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса.The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for selecting breeding samples of buckwheat plants, based on determining the level of expression of genes marking the level of response to the type of stress being analyzed.
Уровень техникиState of the art
Основу классической селекции составляет поиск растений, характеризующихся необходимым состоянием хозяйственно ценного признака. Целью данного поиска является обнаружение растений, сочетающих в себе наибольшее количество таких признаков и создание на их основе линий, обладающих всем комплексом необходимых состояний признаков. Затем путем нескольких последовательных скрещиваний создаются чистые линии, гомозиготные по генам, контролирующим развитие искомых признаков. За этим следует проверка полученных растений в полевых условиях. Получение сортов с заданными свойствами методами классической селекции обычно занимает более десяти лет и представляет собой дорогостоящий процесс, так как хозяйственно ценные признаки обычно контролируются большим количеством генов, а потому для нахождения растений с заданными признаками требуется мониторинг тысяч растений в популяциях после каждого скрещивания (Witcombe J.R., Virk, D.S. 2001 Number of crosses and population size for participatory and classical plant breeding. Euphytica 122, 451-462.). Одним из способов, которые существенно ускоряют ведение селекционного процесса, является использование ДНК-маркеров. ДНК-маркеры могут использоваться для определения наличия аллельных вариантов генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки (Collard ВС, Mackill DJ. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2008 Feb 12; 63(1491):557-72; патентная заявка Японии JP 011188846).The basis of classical selection is the search for plants characterized by the necessary state of an economically valuable trait. The purpose of this search is to find plants that combine the largest number of such characters and create lines based on them that have the whole complex of necessary state of characters. Then, through several successive crosses, pure lines are created that are homozygous for the genes that control the development of the desired traits. This is followed by verification of the obtained plants in the field. Obtaining varieties with desired properties by classical selection methods usually takes more than ten years and is an expensive process, since economically valuable traits are usually controlled by a large number of genes, and therefore, finding plants with given traits requires monitoring of thousands of plants in populations after each crossing (Witcombe JR , Virk, DS 2001 Number of crosses and population size for participatory and classical plant breeding. Euphytica 122, 451-462.). One of the ways that significantly speeds up the breeding process is the use of DNA markers. DNA markers can be used to determine the presence of allelic variants of genes that control economically valuable traits (Collard BC, Mackill DJ. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philos Trans R Soc Lond In Biol Sci. 2008 Feb 12; 63 (1491): 557-72; Japanese Patent Application JP 011188846).
Одними из часто используемых являются SSR-маркеры (Simple Sequence Repeats) благодаря высокой повторяемости результатов при их использовании, возможности выявления гетерозигот и относительной дешевизне. Однако зачастую эти маркеры требуют разделения продуктов амплификации в полиакриламидном геле (ПААГ), что затрудняет их использование в селекционных центрах. Другие типы маркеров основаны на известной нуклеотидной последовательности маркируемого участка ДНК: STS (sequence tagged site), SCAR или SNP (Shan, X., Blake, T. K. and Talbert, L.E. 1999 Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat. Theor. Appl. Genet. 98, 1072-1078; Sharp P. J., Johnston S., Brown G., McIntosh RA., Pallotta M., Carter M., Bariana HS., Khartkar S., Lagudah ES., Singh RP., Khairallah M., Potter R., Jones MGK. 2001 Validation of molecular markers for wheat breeding. Aust. J. Agric. Res. 52, 1357-1366; Sanchez, А.С., Brar, D. S., Huang, N., Li, Z. and Khush, G.S. 2000 Sequence tagged site marker-assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice. Crop Sci. 40, 792-797). Также широко распространены маркеры, сцепленные с локусами, кодирующими количественные признаки (QTL). На сегодняшний день определено множество ДНК-маркеров, связанных с QTL, однако данные маркеры необходимо тестировать для каждого конкретного исследования, так как множество QTL на данный момент определены неточно (Melchinger, A.E., Utz H.F., Schon C.C. 1998 Quantitative trait locus (QTL) mapping using different testers and independent population samples in maize reveals low power of QTL detection and large bias in estimates of QTL effects. Genetics 149, 383-403; заявка РСТ WO 2009029771).SSR markers (Simple Sequence Repeats) are one of the frequently used ones due to the high repeatability of the results when they are used, the possibility of detecting heterozygotes and relative cheapness. However, often these markers require the separation of amplification products in polyacrylamide gel (PAAG), which complicates their use in breeding centers. Other types of markers are based on the known nucleotide sequence of the labeled DNA site: STS (sequence tagged site), SCAR or SNP (Shan, X., Blake, TK and Talbert, LE 1999 Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat . Theor. Appl. Genet. 98, 1072-1078; Sharp PJ, Johnston S., Brown G., McIntosh RA., Pallotta M., Carter M., Bariana HS., Khartkar S., Lagudah ES., Singh RP ., Khairallah M., Potter R., Jones MGK. 2001 Validation of molecular markers for wheat breeding. Aust. J. Agric. Res. 52, 1357-1366; Sanchez, A.S., Brar, DS, Huang, N ., Li, Z. and Khush, GS 2000 Sequence tagged site marker-assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice. Crop Sci. 40, 792-797). Markers linked to quantitative trait coding loci (QTLs) are also widespread. To date, many DNA markers have been identified associated with QTL, however, these markers need to be tested for each specific study, since many QTLs are currently inaccurate (Melchinger, AE, Utz HF, Schon CC 1998 Quantitative trait locus (QTL) mapping using different testers and independent population samples in maize reveals low power of QTL detection and large bias in estimates of QTL effects. Genetics 149, 383-403; PCT application WO 2009029771).
ДНК-маркеры, связанные с исследуемым признаком, способствуют существенному ускорению селекционного процесса, так как их использование проще, чем фенотипический анализ. Селекцию с использованием ДНК-маркеров можно проводить еще на стадии проростков, что существенно экономит время и ресурсы, а также возможность отбирать отдельные растения вместо выращивания множества растений для последующего отбора потомков (Ribaut, J.-M. and Hoisington, D. 1998 Marker-assisted selection: new tools and strategies. Trends Plant Sci. 3, 236-239.; Morris, M., Dreher, K., Ribaut, J. M. and Khairallah, M. 2003 Money matters (II): costs of maize inbred line conversion schemes at CIMMYT using conventional and marker assisted selection. Mol. Breed. 11, 235-247; заявка РСТ W09841655). Помимо этого их использование позволяет определить гетерозиготные состояния необходимых генов у образцов и прогнозировать получение потомства с необходимыми свойствами.DNA markers associated with the trait under study contribute to a significant acceleration of the selection process, since their use is simpler than phenotypic analysis. Selection using DNA markers can be carried out at the seedling stage, which significantly saves time and resources, as well as the ability to select individual plants instead of growing many plants for subsequent selection of descendants (Ribaut, J.-M. and Hoisington, D. 1998 Marker- assisted selection: new tools and strategies. Trends Plant Sci. 3, 236-239 .; Morris, M., Dreher, K., Ribaut, JM and Khairallah, M. 2003 Money matters (II): costs of maize inbred line conversion schemes at CIMMYT using conventional and marker assisted selection. Mol. Breed. 11, 235-247; PCT application W09841655). In addition, their use allows one to determine the heterozygous states of the necessary genes in the samples and to predict the generation of offspring with the necessary properties.
Существует множество примеров, когда селекция с использованием ДНК-маркеров способствовала ускорению работ по выведению новых сортов и форм растений. Например, были определены SSR и STS маркеры риса, использование которых проще и дешевле стандартных тестов на чистоту популяции (Yashitola, J., Thirumurugan, Т., Sundaram, R.M., Naseerullah, M.K., Ramesha, M.S., Sarma, N.P. and Sonti, R.V. 2002 Assessment of purity of rice hybrids using microsatellite and STS markers. Crop Sci. 42, 1369-1373; патентная заявка Китая CN101436229). Еще одним примером успешного использования маркеров является определение локуса, контролирующего развитие защитных механизмов пшеницы к фузариозу (одному из основных заболеваний пшеницы, вызываемых грибом Fusarium) (Liu, S.X. and Anderson, J.A. 2003 Marker assisted evaluation of Fusarium head blight resistant wheat germplasm. Crop Sci. 43, 760-766). На данный момент существует множество определенных ДНК-маркеров, ассоциированных с хозяйственно ценными признаками. ДНК-маркеры также используются для производства гибридных культур. Их использование направлено на получение данных о локусах, которые в результате гибридизации смогут показать наилучший уровень гетерозиса (Reif, J. С., Melchinger, A.E., Xia, X.С., Warburton, M.L., Hoisington, D.A., Vasal, S.K., Beck, D., Bohn, M. and Frisch, M. 2003 Use of SSRs for establishing heterotic groups in subtropical maize. Theor. Appl. Genet. 107, 947-957.). Также ДНК-маркеры используются для определения изменения аллельных частот во время селекционного процесса (Steele, K.А., Edwards, G., Zhu, J. and Witcombe, J. R. 2004 Marker-evaluated selection in rice: shifts in allele frequency among bulks selected in contrasting agricultural environments identify genomic regions of importance to rice adaptation and breeding. Theor. Appl. Genet. 109, 1247-1260.). ДНК-маркеры также используются в «пирамидировании» - комбинировании ряда генов в одном генотипе. «Пирамидирование» заключается в последовательной гибридизации растений с целью объединения генов, однако только с помощью ДНК-маркирования возможно определить, какое количество генов уже объединено в один генотип. Одним из основных направлений «пирамидирования» является комбинирование множества генов, контролирующих развитие устойчивости к различным болезням, что делает невозможным типирование полученного растения на уровне фенотипа (Hoppers, F.J. and Pretorius, Z. A. 1997 Effects of combinations amongst genes Lrl3, Lr34 and Lr37 on components of resistance in wheat to leaf rust. Plant Pathol. 46, 737-750.; Shanti, M.L., George, M.L.C., Cruz, C.M.V., Bernardo, M.A., Nelson, R.J., Leung, H., Reddy, J.N. and Sridhar, R. 2001 Identification of resistance genes effective against rice bacterial blight pathogen in eastern India. Plant Dis. 85, 506-512; Singh, S., Sidhu, J.S., Huang, N., Vikal, Y., Li, Z., Brar, D. S., Dhaliwal, H.S. and Khush, G.S. 2001 Pyramiding three bacterial blight resistance genes (xa5, xal3 and Xa21) using marker-assisted selection into indica rice cultivar PR106. Theor. Appl. Genet. 102, 1011-1015). Так, например, удалось объединить ген, контролирующий качественную устойчивость к ржавчине у ячменя с двумя QTL, контролирующими количественное проявление данного признака (Castro, A.J. 2003 Mapping and pyramiding of qualitative and quantitative resistance to stripe rust in barley. Theor. Appl. Genet. 107, 922-930.). В теории метод пирамидирования может быть использован для объединения генов от трех и более родителей путем последовательных скрещиваний.There are many examples where selection using DNA markers has accelerated the development of new varieties and forms of plants. For example, SSR and STS rice markers were identified that are easier and cheaper to use than standard population purity tests (Yashitola, J., Thirumurugan, T., Sundaram, RM, Naseerullah, MK, Ramesha, MS, Sarma, NP and Sonti, RV 2002 Assessment of purity of rice hybrids using microsatellite and STS markers. Crop Sci. 42, 1369-1373; China Patent Application CN101436229). Another example of the successful use of markers is the determination of a locus that controls the development of wheat protective mechanisms for Fusarium (one of the main wheat diseases caused by Fusarium fungus) (Liu, SX and Anderson, JA 2003 Marker assisted evaluation of Fusarium head blight resistant wheat germplasm. Crop Sci 43, 760-766). At the moment, there are many specific DNA markers associated with economically valuable traits. DNA markers are also used for the production of hybrid cultures. Their use is aimed at obtaining data on loci that, as a result of hybridization, can show the best level of heterosis (Reif, J. C., Melchinger, AE, Xia, X. C., Warburton, ML, Hoisington, DA, Vasal, SK, Beck , D., Bohn, M. and Frisch, M. 2003 Use of SSRs for establishing heterotic groups in subtropical maize. Theor. Appl. Genet. 107, 947-957.). DNA markers are also used to determine changes in allelic frequencies during the selection process (Steele, K.A., Edwards, G., Zhu, J. and Witcombe, JR 2004 Marker-evaluated selection in rice: shifts in allele frequency among bulks selected in contrasting agricultural environments identify genomic regions of importance to rice adaptation and breeding. Theor. Appl. Genet. 109, 1247-1260.). DNA markers are also used in "pyramidation" - a combination of a number of genes in one genotype. "Pyramidization" consists in sequential hybridization of plants in order to combine genes, however, only with the help of DNA marking it is possible to determine how many genes are already combined into one genotype. One of the main directions of “pyramidization” is the combination of many genes that control the development of resistance to various diseases, which makes it impossible to type the resulting plant at the phenotype level (Hoppers, FJ and Pretorius, ZA 1997 Effects of combinations amongst genes Lrl3, Lr34 and Lr37 on components of resistance in wheat to leaf rust. Plant Pathol. 46, 737-750 .; Shanti, ML, George, MLC, Cruz, CMV, Bernardo, MA, Nelson, RJ, Leung, H., Reddy, JN and Sridhar, R. 2001 Identification of resistance genes effective against rice bacterial blight pathogen in eastern India. Plant Dis. 85, 506-512; Singh, S., Sidhu, JS, Huang, N., Vikal, Y., Li, Z., Brar, DS, Dhaliwal, HS and Khush, GS 2001 Pyramiding three bacterial blight resistance genes (xa5 , xal3 and Xa21) using marker-assisted selection into indica rice cultivar PR106. Theor. Appl. Genet. 102, 1011-1015). For example, it was possible to combine a gene that controls qualitative resistance to rust in barley with two QTLs that control the quantitative manifestation of this trait (Castro, AJ 2003 Mapping and pyramiding of qualitative and quantitative resistance to stripe rust in barley. Theor. Appl. Genet. 107 , 922-930.). In theory, the pyramidization method can be used to combine genes from three or more parents by successive crosses.
Также в отличие от классической селекции мониторинг с использованием ДНК-маркеров может быть осуществлен на любой стадии селекционного процесса. Это позволяет отбирать формы с неудачным сочетанием генов, снижая, таким образом, число растений, которые будут анализироваться в последующем поколении.Also, unlike classical selection, monitoring using DNA markers can be carried out at any stage of the selection process. This allows you to select forms with an unsuccessful combination of genes, thus reducing the number of plants that will be analyzed in the next generation.
Однако несмотря на несомненные преимущества использования ДНК-маркеров в селекционном процессе у данного метода остается множество недостатков. Во-первых, ДНК-маркер сцеплен всего с одним локусом, в результате для проверки растения на наличие искомых аллельных вариантов необходимо использование нескольких маркеров. При этом даже большое количество маркеров не может охватить все локусы, участвующие в развитии признака. Также разработка новых маркеров занимает много времени, так как необходимо, чтобы полученный ДНК-маркер соответствовал ряду необходимых признаков, например был тесно сцеплен с исследуемым локусом, что невозможно определить только на одной популяции растений. Еще одно ограничение, связанное с использованием маркеров этого типа, вызвано тем, что различные локусы, контролирующие развитие количественных признаков, могут проявлять себя по-разному в зависимости от генетического фона и могут быть неприменимы для некоторых популяций (Liao, С.Y., Wu, P., Hu, В. and Yi, K.K. 2001 Effects of genetic background and environment on QTLs and epistasis for rice (Oryza sativa L.) panicle number. Theor. Appl. Genet. 103, 104-111).However, despite the undoubted advantages of using DNA markers in the selection process, this method has many disadvantages. First, the DNA marker is linked to only one locus; as a result, several markers must be used to test the plant for the presence of the desired allelic variants. Moreover, even a large number of markers cannot cover all the loci involved in the development of the trait. Also, the development of new markers takes a lot of time, since it is necessary that the obtained DNA marker corresponds to a number of necessary characteristics, for example, is closely linked to the studied locus, which cannot be determined on only one plant population. Another limitation associated with the use of markers of this type is caused by the fact that different loci that control the development of quantitative traits can manifest themselves differently depending on the genetic background and may not be applicable for some populations (Liao, C.Y., Wu , P., Hu, B. and Yi, KK 2001 Effects of genetic background and environment on QTLs and epistasis for rice (Oryza sativa L.) panicle number. Theor. Appl. Genet. 103, 104-111).
Методом, который учитывает недостатки единичных ДНК-маркеров, стала геномная селекция (Meuwissen, Т.Н.Е., Hayes, В.J., and Goddard, М.Е. (2001). Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps. Genetics 157, 1819-1829.). Принцип геномной селекции заключается в определении маркеров количественных признаков с использованием полногеномного генотипирования. На практике маркеры для проведения геномной селекции определяются на одной популяции, а проверяются на другой. Таким образом, оцениваются все вероятные ошибки (эффекты), связанные с разработкой маркера. В итоге с использованием данного метода возможно комплексное изучение сложных признаков с более высокой точностью. Однако на данный момент стоимость эксперимента по широкомасштабному генотипированию сильно превышает стоимость одиночных ДНК-маркеров, и пока используется только для компьютерных симуляций по разработке математических алгоритмов, позволяющих повысить точность исследуемых маркеров (Lorenz AJ., Chao SM., Asoro FG., Heffner EL., Hayashi Т., Iwata Н., Smith., Sorrells ME., Jannink JL 2011. Genomic selection in plant breeding: knowledge and prospects. Advances in Agronomy 110, 77-123.). Учитывая сложность генетических сетей контролирующих формирование признаков, возможность применения этого подхода нуждается в проведении дальнейших исследований.Genome selection (Meuwissen, T.N.E., Hayes, B.J., and Goddard, M.E. (2001) became a method that takes into account the shortcomings of single DNA markers. Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps. Genetics 157, 1819-1829.). The principle of genomic selection is to identify markers of quantitative traits using genome-wide genotyping. In practice, markers for genomic selection are determined in one population and tested in another. Thus, all probable errors (effects) associated with the development of the marker are evaluated. As a result, using this method, a comprehensive study of complex features with higher accuracy is possible. However, at the moment, the cost of a large-scale genotyping experiment is much higher than the cost of single DNA markers, and so far it is used only for computer simulations to develop mathematical algorithms that can improve the accuracy of the studied markers (Lorenz AJ., Chao SM., Asoro FG., Heffner EL. Hayashi, T., Iwata, N., Smith., Sorrells ME., Jannink, JL 2011. Genomic selection in plant breeding: knowledge and prospects. Advances in Agronomy 110, 77-123.). Given the complexity of the genetic networks that control the formation of characters, the possibility of applying this approach requires further research.
Предлагаемый авторами настоящего изобретения метод основан на полногеномных исследованиях, но не геномов, а транскриптомов. Его использование позволяет проводить мониторинг функционирования генетической сети, контролирующей развитие того или иного селекционно значимого признака вне зависимости от конкретных состояний генов, что позволяет точнее охарактеризовать системы с большим числом степеней свободы, пропорциональным числу генов в сети регуляции. Помимо этого такой анализ позволяет находить узкие места в генетических сетях, в которых происходит падение сигнала, приводящего к развитию нужного состояния признака, и осуществлять направленную селекцию с отбором на функционирование данного участка генетической сети.The method proposed by the authors of the present invention is based on genome-wide studies, but not of genomes, but of transcriptomes. Its use allows monitoring the functioning of the genetic network that controls the development of one or another breeding significant trait, regardless of the specific state of the genes, which makes it possible to more accurately characterize systems with a large number of degrees of freedom proportional to the number of genes in the regulatory network. In addition, such an analysis makes it possible to find bottlenecks in genetic networks in which a signal falls, leading to the development of the desired state of the trait, and carry out directed selection with selection for the functioning of this section of the genetic network.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа отбора селекционных образцов растений гречихи, основанного на оценке состояния генетических сетей, контролирующих развитие хозяйственно-значимых признаков.The objective of the invention is to develop a method for the selection of breeding samples of buckwheat plants, based on the assessment of the state of genetic networks that control the development of economically significant traits.
Технический результат настоящего изобретения заключается в снижении сроков проведения селекции, направленной на получение новых сортов. Настоящее изобретение позволяет проводить отбор на малых выборках растений в каждом поколении сразу по нескольким десяткам признаков, что может существенно ускорить селекционный процесс.The technical result of the present invention is to reduce the timing of selection aimed at obtaining new varieties. The present invention allows selection on small samples of plants in each generation for several dozen traits at once, which can significantly accelerate the selection process.
Поставленная задача решается тем, что способ отбора селекционных образцов растений гречихи включает выращивание селектируемой и контрольной популяций при нормальных условиях с последующим помещением части образцов каждой популяции в стрессовые условия; сбор образцов ткани растений селектируемой и контрольной популяций, подвергнутых и не подвергнутых стрессовому воздействию; определение в собранных образцах уровней экспрессии предварительно выявленных генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса; сравнение уровня экспрессии генов в образцах, помещенных в стрессовые условия, и образцов выращенных при нормальных условиях; отбор тех образцов, у которых наблюдается максимальное изменение уровня экспрессии генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса, по сравнению с контрольной популяцией.The problem is solved in that the method of selection of breeding samples of buckwheat plants includes the cultivation of breeding and control populations under normal conditions, followed by placing part of the samples of each population in stressful conditions; collection of plant tissue samples from breeding and control populations subjected to and not subjected to stress; determination in the collected samples of expression levels of previously identified genes marking the level of response to the analyzed type of stress; comparing the level of gene expression in samples placed under stressful conditions and samples grown under normal conditions; selection of those samples in which there is a maximum change in the level of expression of genes marking the level of response to the analyzed type of stress, compared with the control population.
Для отбора селекционных образцов растений проводят сравнение уровней экспрессии генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса в селектрируемой и контрольной популяциях. При этом проводят отбор тех образцов из селектрируемой популяции, в которых наблюдается максимальный уровень изменения экспрессии генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса по сравнению с контрольной популяцией.To select plant breeding samples, a comparison is made of the expression levels of genes marking the level of response to the analyzed type of stress in the breeding and control populations. In this case, the selection of those samples from the breeding population in which there is a maximum level of change in the expression of genes marking the level of response to the analyzed type of stress compared with the control population is carried out.
Для этого на предварительном этапе проводят поиск генов маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса. Поиск таких генов осуществляют путем сравнения уровня экспрессии генов в растениях, подвергнутых и не подвергнутых стрессовым воздействиям, на устойчивость к которым предполагается осуществлять селекцию. Анализ может осуществляться при помощи высокопроизводительных методов Microarray (Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 1995 Oct 20; 270(5235):4б7-70.) или RNA-seq (Nagalakshmi U, Wang Z, Waern K, Shou C, Raha D, Gerstein M, Snyder M. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 2008 Jun 6; 320(5881): 1344-9. doi: 10.1126/science. 1158441. Epub 2008 May 1). В результате определяют список генов, имеющих значимое различие в уровне экспрессии у растений, подвергнутых и не подвергнутых стрессовому воздействию. На основании полученных списков выделяют гены, специфически маркирующие ответ каждый из проанализированных типов стрессам. Также выделяют стабильно экспрессирующиеся при всех видах стрессов гены, которые используют как референсные при анализе экспрессии методом полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции с детекцией результатов в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ). К выбранным генам или их части подбирают праймеры для проведения ОТ-ПЦР РВ. В процессе отбора селекционных образцов в селектируемой популяции проводят анализ уровня экспрессии генов в образцах контрольной и селектируемой популяций, как подвергнутых так и не подвергнутых стрессовым воздействиям, методом ОТ-ПЦР РВ. На основании полученных результатов проводят обор образцов, характеризующихся максимальным изменением уровня экспрессии генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса, в направлении (увеличение или уменьшение), в котором оно происходит у контрольного образца.To do this, at a preliminary stage, a search is made for genes marking the level of response to the analyzed type of stress. The search for such genes is carried out by comparing the level of gene expression in plants subjected to and not subjected to stressful impacts on which resistance is expected to be selected. The analysis can be performed using high performance Microarray methods (Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 1995
Согласно настоящему изобретению в качестве образца для эксперимента по выявлению и анализу экспрессии генов, контролирующих ответ на воздействие стрессовых условий, может быть использовано растение возраста 12-14 дней, характеризующееся развитыми семядолями. В качестве образца ткани растения могут быть использованы любые части растения, в частности семядоли или части семядолей растений. При этом для специалиста очевидно, что предпочтительно осуществлять сбор образцов ткани в одно и то же время светового цикла.According to the present invention, as a sample for an experiment to identify and analyze the expression of genes that control the response to stressful conditions, a plant of 12-14 days old characterized by developed cotyledons can be used. As a sample of plant tissue, any parts of the plant, in particular cotyledons or parts of plant cotyledons, can be used. Moreover, for the specialist it is obvious that it is preferable to collect tissue samples at the same time of the light cycle.
Согласно настоящему изобретению под термином «селектируемая популяция» подразумевается набор образцов, из которых проводится выбор растений обладающих нужным признаком.According to the present invention, the term "breeding population" means a set of samples from which a selection of plants with the desired trait is carried out.
Согласно настоящему изобретению под термином «контрольная популяция» подразумевается набор образцов, с которым проводится сравнение, представляющих районированный сорт или исходную популяцию.According to the present invention, the term "control population" means a set of samples with which a comparison is made, representing a zoned variety or the original population.
Анализ экспрессии генов представляет собой определение концентрации мРНК исследуемых генов в пробе, сравнение количества мРНК в образцах, подвергнутых воздействию стрессовых условий, с контрольными образцами. Методы проведения анализа экспрессии генов не ограничены каким-либо специальным образом. В частности, анализ экспрессии генов может осуществляться с помощью полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции с детекцией результатов в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ). Принцип метода основывается на корреляции количества ПЦР-продукта с интенсивностью флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала происходит на каждом цикле, по завершении реакции рассчитывается пороговый цикл (Ct), на котором уровень флуоресценции превышает фоновое свечение. Метод основан на том, что чем больше было исходное количество исследуемой ДНК или кДНК, тем быстрее появляется флуоресцентный сигнал и тем меньше значение Ct.Analysis of gene expression is a determination of the mRNA concentration of the studied genes in a sample, comparing the amount of mRNA in samples subjected to stressful conditions with control samples. Methods for analyzing gene expression are not limited in any special way. In particular, gene expression analysis can be carried out using the polymerase chain reaction of reverse transcription products with real-time detection of results (RT-PCR RV). The principle of the method is based on the correlation of the amount of the PCR product with the intensity of the fluorescent signal. The fluorescence signal is detected at each cycle; upon completion of the reaction, a threshold cycle (Ct) is calculated at which the fluorescence level exceeds the background glow. The method is based on the fact that the larger the initial amount of the studied DNA or cDNA, the faster the fluorescent signal appears and the lower the Ct value.
Согласно настоящему изобретению предварительно могут быть выявлены гены, маркирующие уровень ответа на анализируемый тип стресса, путем выращивания образцов сорта гречихи при нормальных условиях с последующим помещением части образцов в различные стрессовые условия; сбора образцов ткани растений, подвергнутых и не подвергнутых стрессовым воздействиям; анализа уровня экспрессии всех генов в подвергнутых и не подвергнутых стрессовому воздействия образцах; сравнения уровней экспрессии генов в образцах, подвергнутых разным типам стрессов; выявления генов, специфически изменяющих уровень экспрессии в ответ на анализируемый тип стресса.According to the present invention, genes marking the level of response to the analyzed type of stress can be previously detected by growing buckwheat cultivar samples under normal conditions, followed by placing some of the samples under various stressful conditions; collection of tissue samples of plants subjected and not subjected to stress; analysis of the level of expression of all genes in exposed and non-stressed samples; comparison of gene expression levels in samples subjected to different types of stresses; identifying genes that specifically alter the level of expression in response to the type of stress being analyzed.
Согласно настоящему изобретению термин «гены, маркирующие уровень экспрессии анализируемого стресса» (или «гены, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса») означает гены, значимо изменяющие уровень экспрессии при данном типе стресса (увеличивающие или уменьшающие) по сравнению с контрольными образцами, в то время как при остальных типах стресса уровни экспрессии данных генов остаются неизменными. Также гены, не изменяющие уровень экспрессии, в то время как при всех остальных типах стресса уровни экспрессии данных генов значимо изменяются.According to the present invention, the term "genes that mark the level of expression of the analyzed stress" (or "genes that mark the level of response to the analyzed type of stress") means genes that significantly change the expression level for this type of stress (increase or decrease) compared to control samples, in while with other types of stress, the expression levels of these genes remain unchanged. Also, genes that do not change the expression level, while for all other types of stress, the expression levels of these genes significantly change.
Согласно настоящему изобретению термин «гены, специфически изменяющие уровень экспрессии» означает гены, значимо увеличивающие или уменьшающие уровень экспрессии в ответ на определенный тип стрессового воздействия.According to the present invention, the term “genes specifically altering the level of expression" means genes that significantly increase or decrease the level of expression in response to a particular type of stress exposure.
Термин «референсные гены» означает гены, экспрессирующиеся стабильно вне зависимости от стадии развития образца или от влияния факторов внешней среды. Используются при анализе экспрессии для нивелирования погрешностей эксперимента, а также для нормирования на исходное количество материала.The term "reference genes" means genes that are stably expressed regardless of the stage of development of the sample or the influence of environmental factors. Used in the analysis of expression to level the experimental errors, as well as to normalize the initial amount of material.
Частными примерами генов, маркирующих уровень ответа на анализируемый тип стресса, являются гены, характеризующиеся нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1-32, а также гомологичные им гены, имеющие сходную нуклеотидную последовательность, имеющие общее происхождение и выполняющие сходные функции в исследуемых организмах, в частности гены, имеющие нуклеотидную последовательность на 95% гомологичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-32. Гомология между последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью утилиты BLAST.Particular examples of genes that mark the level of response to the type of stress under analysis are genes characterized by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1-32, as well as genes homologous to them, having a similar nucleotide sequence, having a common origin and performing similar functions in the studied organisms, in particular genes having a nucleotide sequence 95% homologous to the sequence shown in SEQ ID NO: 1-32. Homology between sequences can be established using well-known methods, for example, using the BLAST utility.
Согласно настоящему изобретению в качестве селектируемых образцов могут быть использованы межвидовые гибриды, представляющие собой формы, полученные в результате скрещивания растений, принадлежащих к различным видам. При этом в качестве контрольных образцов могут быть использованы дикие формы, представляющие собой растения, имеющие общее происхождение с культурными формами, однако не подвергавшиеся воздействию искусственного отбора.According to the present invention, interspecific hybrids representing the forms obtained by crossing plants of different species can be used as breeding samples. In this case, wild forms can be used as control samples, which are plants that have a common origin with cultural forms, but which were not exposed to artificial selection.
Согласно настоящему изобретению в качестве селектируемых образцов может быть использован материал, полученный при проведении мутагенеза, а в качестве контрольных образцов - растения исходной линии, не подвергавшиеся действию мутагенеза. Под термином «мутагенез» понимается неспецифическое внесение изменений в нуклеотидную последовательность посредством химических или физических воздействий на организм, частные примеры которых хорошо известны специалисту в данной области техники.According to the present invention, material obtained during mutagenesis can be used as breeding samples, and plants of the original line that were not subjected to mutagenesis can be used as control samples. The term "mutagenesis" refers to non-specific changes in the nucleotide sequence through chemical or physical effects on the body, particular examples of which are well known to the person skilled in the art.
Предлагаемый способ позволяет производить отбор растений, устойчивых к различным типам стресса (стрессовым условиям, стрессовым воздействиям). Частными примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются кратковременное воздействие высокой температурой, долговременное воздействие высокой температурой, кратковременное воздействие низкой температурой, долговременное воздействие низкой температурой, долговременное воздействие избыточным освещением, долговременное воздействие недостаточным освещением, раневое воздействие. При этом для специалиста также очевидно, что раневой стресс может служить моделью биотического стресса.The proposed method allows the selection of plants resistant to various types of stress (stressful conditions, stressful effects). Particular examples not limiting the present invention are short-term exposure to high temperature, long-term exposure to high temperature, short-term exposure to low temperature, long-term exposure to low temperature, long-term exposure to excessive lighting, long-term exposure to insufficient lighting, wound exposure. Moreover, it is also obvious to a specialist that wound stress can serve as a model of biotic stress.
Согласно настоящему изобретению растения гречихи до их помещения в стрессовые условия, а также растения, не подвергающиеся стрессовым воздействиям, выращивают при нормальных условиях, в частности растения могут быть выращены следующих параметрах: температура 22-24°С, освещенность 5000-7000 люкс, влажность 50-60%.According to the present invention, buckwheat plants are grown under normal conditions before being placed under stressful conditions, as well as plants that are not exposed to stress, in particular, plants can be grown in the following parameters: temperature 22-24 ° C, illumination 5000-7000 lux, humidity 50 -60%.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Гречиха занимает второе место по потреблению крупяных культур в России, уступая только рису, что делает ее одной из самых важных культивируемых культур в стране. На данный момент существует множество примеров успешного использования современных методов биотехнологии, в результате использования которых были выведены новые сорта растительных культур: например экспериментальная полиплоидия, химический мутагенез и т.д. В качестве примера успешной биотехнологической работы можно привести карликовые сорта злаков, которые характеризуются большей урожайностью в условиях орошения, где они имеют большее преимущество по сравнению с высокорослыми формами.Buckwheat ranks second in cereal consumption in Russia, second only to rice, making it one of the most important cultivated crops in the country. At the moment, there are many examples of the successful use of modern biotechnology methods, as a result of which new varieties of plant crops were bred: for example, experimental polyploidy, chemical mutagenesis, etc. As an example of successful biotechnological work, dwarf cereal varieties can be cited, which are characterized by higher productivity under irrigation conditions, where they have a greater advantage compared to tall forms.
Центром происхождения гречихи является Юго-Восточная Азия, характеризующаяся влажным жарким климатом, из-за чего гречиха несмотря на введение в культуру более 5 тысяч лет назад остается чувствительной к низким температурам и засухе, что существенно ограничивает ареал ее культивирования в России.The center of origin of buckwheat is Southeast Asia, characterized by a humid hot climate, which is why buckwheat, despite being introduced into the culture more than 5 thousand years ago, remains sensitive to low temperatures and drought, which significantly limits the area of its cultivation in Russia.
Для получения исходных данных для поиска генов, маркирующих ответ на стрессовые воздействия, растения на стадии семядолей подвергались воздействию ряда основных абиотических стрессов. Использовались следующие типы воздействий: высокая температура (42°С), низкая температура (4°С), избыточное освещение (40000 люкс), отсутствие освещения, ранение как имитация ответа на биотический стресс. Все стрессовые воздействия, кроме изменения уровня освещенности были сделаны кратковременными (1 час) и долговременными (24 часа). Затем был проведен сбор и анализ полученных образцов методом RNA-seq.To obtain initial data for the search for genes marking the response to stressful effects, plants at the cotyledon stage were exposed to a number of basic abiotic stresses. The following types of exposure were used: high temperature (42 ° C), low temperature (4 ° C), excessive lighting (40,000 lux), lack of lighting, injury as an imitation of the response to biotic stress. All stressful effects, except for changes in the level of illumination, were made short-term (1 hour) and long-term (24 hours). Then, the collection and analysis of the obtained samples by the RNA-seq method was carried out.
В результате были получены уровни экспрессии всех генов гречихи относительно контрольного образца и определены несколько классов генов: участвующие в неспецифическом ответе на стресс, изменяющие экспрессию только при одном типе воздействия, гены, не изменяющие экспрессию ни при одном типе воздействий (табл. 1).As a result, expression levels of all buckwheat genes with respect to the control sample were obtained and several classes of genes were determined: those participating in a nonspecific response to stress, altering expression with only one type of exposure, genes that did not change expression with any type of exposure (Table 1).
На основании полученных данных были выделены гены, специфически маркирующие каждый вид воздействия. В таблице 2 приведены последовательности генов, специфически маркирующих ответ на 8 типов стрессовых воздействий, определенных в результате анализа образцов, и праймеры для амплификации этих генов при анализе их экспрессии.Based on the data obtained, genes were specifically identified for each type of exposure. Table 2 shows the sequences of genes that specifically mark the response to 8 types of stress exposure, determined as a result of analysis of samples, and primers for amplification of these genes in the analysis of their expression.
В процессе проведения отбора селекционных образцов из растений контрольной и селектируемой популяций, подвергнутых и не подвергнутых стрессовому воздействию, проводили выделение РНК и процедуру обратной транскрипции по методу (Demidenko NV, Logacheva MD, Penin AA. Selection and validation of reference genes for quantitative real-time PCR in buckwheat (Fagopyrum esculentum) based on transcriptome sequence data. PLoS One. 2011 May 12; 6(5):el9434. doi: 10.1371/journal.pone.0019434.). Полученный образец использовали для определения уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР РВ по стандартной методике (Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr; 55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008. 112797. Epub 2009 Feb 26.). На основании полученных результатов проводили обор образцов, обладающих максимальным уровнем изменения уровня экспрессии генов, маркирующих стресс, по сравнению с контрольной популяцией.During selection of selection samples from plants of the control and breeding populations subjected to and not subjected to stress, RNA was isolated and the reverse transcription procedure was performed according to the method (Demidenko NV, Logacheva MD, Penin AA. Selection and validation of reference genes for quantitative real-time PCR in buckwheat (Fagopyrum esculentum) based on transcriptome sequence data. PLoS One. 2011 May 12; 6 (5): el9434. Doi: 10.1371 / journal.pone.0019434.). The obtained sample was used to determine gene expression levels by RT-PCR RT according to the standard method (Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr; 55 (4): 611-22. Doi: 10.1373 / clinchem.2008. 112797. Epub 2009
Основным преимуществом использования подобных маркеров является то, что их использование позволяет проводить отбор на малых выборках растений в каждом поколении сразу по нескольким десяткам признаков, что может существенно ускорить селекционный процесс. В отличие от классически используемых ДНК-маркеров отдельных локусов, отвечающих за хозяйственно важные признаки, использование экспрессионных маркеров существенно расширяет возможности селекции, так как большинство признаков контролируется несколькими десятками, а в некоторых случаях и сотнями генов. Таким образом, мониторинг данных признаков с помощью анализа экспрессии ключевых регуляторов позволяет одновременно оценивать состояние всего пути, контролирующего данный признак.The main advantage of using such markers is that their use allows several tens of traits to be selected on small samples of plants in each generation at once, which can significantly accelerate the selection process. In contrast to the classically used DNA markers of individual loci responsible for economically important characters, the use of expression markers significantly expands the possibilities of selection, since most characters are controlled by several dozens, and in some cases hundreds of genes. Thus, monitoring of these characteristics by analyzing the expression of key regulators allows us to simultaneously assess the state of the entire path that controls this characteristic.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012153913/10A RU2525134C1 (en) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | Method of collecting selected samples of buckwheat plants |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012153913/10A RU2525134C1 (en) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | Method of collecting selected samples of buckwheat plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012153913A RU2012153913A (en) | 2014-06-20 |
| RU2525134C1 true RU2525134C1 (en) | 2014-08-10 |
Family
ID=51213681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012153913/10A RU2525134C1 (en) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | Method of collecting selected samples of buckwheat plants |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525134C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049385C1 (en) * | 1991-03-29 | 1995-12-10 | Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН | Method for assessment of plant resistance to stress factors |
| WO1998041655A1 (en) * | 1997-03-20 | 1998-09-24 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A method for identifying genetic marker loci associated with trait loci |
| RU2305930C2 (en) * | 2005-08-02 | 2007-09-20 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный аграрный университет" | Method for diagnosing of adaptability potential of fruit crop sorts |
| JP2011188846A (en) * | 2010-02-17 | 2011-09-29 | Takii Shubyo Kk | Genetic polymorphism marker set, probe set, detecting kit, and variety discrimination method |
-
2012
- 2012-12-13 RU RU2012153913/10A patent/RU2525134C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049385C1 (en) * | 1991-03-29 | 1995-12-10 | Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН | Method for assessment of plant resistance to stress factors |
| WO1998041655A1 (en) * | 1997-03-20 | 1998-09-24 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A method for identifying genetic marker loci associated with trait loci |
| RU2305930C2 (en) * | 2005-08-02 | 2007-09-20 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный аграрный университет" | Method for diagnosing of adaptability potential of fruit crop sorts |
| JP2011188846A (en) * | 2010-02-17 | 2011-09-29 | Takii Shubyo Kk | Genetic polymorphism marker set, probe set, detecting kit, and variety discrimination method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MEUWISSEN T. H. E. et al., Prediction of Total Genetic Value Using Genome-Wide Dense Marker Maps, Genetics, 2001, Vol. 157, pp. 1819-1829. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012153913A (en) | 2014-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Resequencing a core collection of upland cotton identifies genomic variation and loci influencing fiber quality and yield | |
| Zhang et al. | Conditional and unconditional QTL mapping of drought-tolerance-related traits of wheat seedling using two related RIL populations | |
| US10337072B2 (en) | Copy number detection and methods | |
| BRPI0812744B1 (en) | METHODS FOR SEQUENCE-TARGETED MOLECULAR IMPROVEMENT | |
| CN110724758B (en) | Method for identifying purity of Jingnongke 728 corn hybrid based on SNP marker | |
| CN105506127A (en) | Primers and kit for detecting rice blast resistance genes Pigm and genetic typing method | |
| Li et al. | Characterization of a major quantitative trait locus on the short arm of chromosome 4B for spike number per unit area in common wheat (Triticum aestivum L.) | |
| Mirzaei | Application of molecular markers in plant sciences; An overview | |
| US20170022574A1 (en) | Molecular markers associated with haploid induction in zea mays | |
| CN104561348B (en) | The detection Oryza sativa L. height grain allelic specific PCR molecular markers of weight | |
| Liao et al. | Aus rice root architecture variation contributing to grain yield under drought suggests a key role of nodal root diameter class | |
| Iqbal et al. | Genetic factors underlying single fiber quality in A-genome donor Asian cotton (Gossypium arboreum) | |
| Budak et al. | Potential uses of molecular markers in crop improvement | |
| Hu et al. | Genome-wide association study for seedling biomass-related traits in Gossypium arboreum L. | |
| Zhang et al. | Genetic diversity and association mapping of agronomic yield traits in eighty six synthetic hexaploid wheat | |
| CN107400702A (en) | Chain molecular labeling and application with corn seed keeping quality main effect QTL qSVI-7-2 and qSVI-10 | |
| Abhijith et al. | Genome-wide association study reveals novel genomic regions governing agronomic and grain quality traits and superior allelic combinations for Basmati rice improvement | |
| RU2525134C1 (en) | Method of collecting selected samples of buckwheat plants | |
| CN109504749A (en) | The KASP detection primer of transgenic corns L239 and its filial generation homozygote and heterozygote | |
| CN112795693B (en) | Molecular marker related to chlorophyll content of corn leaf and application thereof | |
| CN113197089B (en) | Breeding method facilitating early generation selection of soft weak gluten wheat | |
| TW201606084A (en) | Method of predicting or determining plant phenotypes | |
| CN111218525B (en) | Cotton fiber quality-related GhCSSb gene SNP marker and application thereof | |
| CN107988423A (en) | The SNP marker of rice non-transgenic anti-herbicide gene OsALS and its application | |
| Behera | Integrated farming systems for prosperity of marginal farmers and sustainable agriculture: a roadmap for India |