RU2522866C1

RU2522866C1 - Method of production of antirabic vaccine

Info

Publication number: RU2522866C1
Application number: RU2013109993/15A
Authority: RU
Inventors: Анатолий Константинович Елисеев; Анатолий Яковлевич Самуйленко; Николай Иванович Зенов; Николай Васильевич Мельник; Сергей Николаевич Красуткин; Евгений Витальевич Маслов; Нина Михайловна Пухова; Людмила Сергеевна Хайкина; Александра Федоровна Иванова; Ирина Юрьевна Литенкова
Original assignee: Федеральное государственное унитарное предприятие "Щелковский биокомбинат"
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-07-20
Also published as: WO2014137248A1

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method of production of antirabic vaccine for animals comprises preparing of inoculum from the strain of rabies virus, infection contamination with the inoculum of the culture of the continuous cells, culturing the rabies virus, collection of virus-containing suspension with its subsequent inactivation and preparation of the target product, at that the inactivation is carried out by adding the virus-containing suspension to ethanol in the final concentration of 18-20%, exposure for 20-22 hours at a temperature of 36-37°C under constant stirring, then 4-6% aluminium hydroxide is added in a ratio to the reaction mixture of 1:(4.5-5.0).

EFFECT: simplification of the method and improvement of quality of the product by increasing the shelf life of the target product.

2 ex

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против бешенства животных.The invention relates to veterinary microbiology and biotechnology, can be used in the development of specific prophylaxis and, in particular, to obtain a vaccine against rabies in animals.

Известен способ получения антирабической вакцины для животных, включающий приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства, инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей суспензии с последующим ее инактивацией и приготовлением целевого продукта. Инактивацию вируса проводят β-пропиолактоном (Патент РФ №2287343. «Способ получения антирабической вакцины», МПК A61K 39/205, Бюл. №26, 31.05.2005).A known method of producing rabies vaccine for animals, including the preparation of seed from a strain of rabies virus, infection with seed culture of inoculated cells, cultivation of rabies virus, collecting virus-containing suspension, followed by its inactivation and preparation of the target product. Inactivation of the virus is carried out with β-propiolactone (RF Patent No. 2287343. "Method for producing rabies vaccine", IPC A61K 39/205, Bull. No. 26, 05/31/2005).

Недостатками известной вакцины являются сложность сбора вируссодержащей суспензии, недостаточный срок хранения целевого продукта.The disadvantages of the known vaccines are the difficulty of collecting virus-containing suspension, insufficient shelf life of the target product.

Задачей заявленного технического решения является упрощение способа и повышение качества продукта за счет увеличения срока хранения целевого продукта.The objective of the claimed technical solution is to simplify the method and improve the quality of the product by increasing the shelf life of the target product.

Поставленная задача решается в способе получения антирабической вакцины для животных, включающем приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства, инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей суспензии с последующей ее инактивацией и приготовлением целевого продукта тем, что инактивацию проводят добавлением к вируссодержащей суспензии этанола в конечной концентрации 18-20%, экспозицией 20-22 часа при температуре 36-37 °С при постоянном перемешивании, далее добавляют 4-6%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:(4,5-5,0).The problem is solved in a method for producing an anti-rabies vaccine for animals, including the preparation of seed from a strain of rabies virus, infection with a seed culture of transplanted cells, cultivation of rabies virus, the collection of virus-containing suspension, followed by its inactivation and preparation of the target product so that inactivation is carried out by adding to the virus-containing ethanol suspension in a final concentration of 18-20%, exposure time of 20-22 hours at a temperature of 36-37 ° C with constant stirring, d Then 4-6% aluminum hydroxide is added in the ratio to the reaction mixture 1: (4.5-5.0).

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».In the patent and scientific and technical literature, technical solutions are not known containing signs similar to those claimed, i.e. the proposal meets the criterion of "novelty."

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».The proposal is feasible in laboratory and industrial conditions, aimed at solving a real technical problem, i.e. the proposal is “industrially applicable”.

Нами впервые установлено, что инактивация вируссодержащей суспензии при определенных режимах этанолом приводит к получению целевого продукта без потери иммунологически активного материала, а это недопустимо при производстве эффективной инактивированной антирабической вакцины для животных, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - упрощение и ускорение способа, увеличение срока хранения целевого продукта без потери его качества, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».We found for the first time that inactivation of a virus-containing suspension under certain ethanol regimes results in the desired product without loss of immunologically active material, and this is unacceptable in the production of an effective inactivated rabies vaccine for animals, which makes it possible to obtain an unobvious positive effect - simplification and acceleration of the method, increase in shelf life target product without loss of quality, i.e. the proposal meets the criteria of "novelty" and "inventive step".

Способ иллюстрируется на следующих примерах.The method is illustrated in the following examples.

Пример 1. Культивирование зараженных вирусом бешенства клеток ВНК-21 проводят в суспензии в 10-литровом биореакторе при постоянном перемешивании. Через 1,2 и 3 сутки отбирают пробы для контроля инфекционной активности и отсутствия контаминации посторонней микрофлорой. По достижении титра инфекционности вируса 7,0 lg ЛД₅₀/см³ к вируссодержащей суспензии добавляют при постоянном перемешивании 96%-ный водный раствор этанола до конечной его концентрации 18%, при этом продолжается перемешивание суспензии и поддержание температуры 36 °С. Через 20 ч к вируссодержащей суспензии с инактивированным вирусом добавляют 4%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:4,5.Example 1. The cultivation of rabies virus infected BHK-21 cells is carried out in suspension in a 10-liter bioreactor with constant stirring. After 1.2 and 3 days, samples are taken to control the infectious activity and the absence of contamination by extraneous microflora. Upon reaching a virus infectivity titer of 7.0 lg LD ₅₀ / cm ^{3, a} 96% aqueous solution of ethanol is added to the virus-containing suspension with constant stirring to a final concentration of 18%, while the suspension continues to mix and maintain the temperature at 36 ° C. After 20 hours, 4% aluminum hydroxide was added to the virus-containing suspension with inactivated virus in a ratio of 1: 4.5 to the reaction mixture.

Пример 2. Культивирование инфицированных клеток проводят, как в примере 1, но к 7 л вируссодержащей суспензии добавляют 98%-ный водный раствор этанола до конечной концентрации 20%, при этом продолжаются перемешивание суспензии и поддержание температуры 37 °С. Через 22 ч к вируссодержащей суспензии с инактивированным вирусом добавляют 6%-ную гидроокись алюминия в соотношении к реакционной смеси 1:5,0.Example 2. The cultivation of infected cells is carried out as in example 1, but to 7 l of the virus-containing suspension add 98% aqueous solution of ethanol to a final concentration of 20%, while stirring the suspension and maintaining the temperature at 37 ° C. After 22 hours, 6% aluminum hydroxide was added to the virus-containing suspension with inactivated virus in a ratio of 1: 5.0 to the reaction mixture.

Контроль вакцин, полученных согласно примерам 1 и 2 (Сер-1 и Сер-2) относительно национальной референс-вакцины и прототипа на остаточную инфекционность проводили через 1,5 года хранения их путем интрацеребральной инокуляции исследуемого материала мышам массой 10-12 г. Иммуногенность исследовали методом NIH. Результаты выражали в международных единицах (ME). Антителоиндуцирующую активность определяли путем исследования сыворотки крови вакцинированных однократно в дозе 1 мл собак и кошек в реакции нейтрализации (рH). Сыворотку получали через 27 дней после иммунизации животных. рH проводили на мышах против стандартного вируса бешенства шт.CVS относительно национальной референс-сыворотки с активностью 20 МЕ/мл.The control of vaccines obtained according to examples 1 and 2 (Ser-1 and Ser-2) relative to the national reference vaccine and prototype for residual infectivity was carried out after 1.5 years of storage by intracerebral inoculation of the test material to mice weighing 10-12 g. Immunogenicity was studied NIH method. The results were expressed in international units (ME). Antibody-inducing activity was determined by examining the blood serum of those vaccinated once at a dose of 1 ml of dogs and cats in a neutralization reaction (pH). Serum was obtained 27 days after immunization of animals. pH was performed in mice against the standard PCV rabies virus relative to the national reference serum with an activity of 20 IU / ml.

Исходные серии вакцины (Сер-1 и Сер-2) не содержали в своем составе живого вируса бешенства и обладали практически одинаковой иммуногенной активностью при испытании их на мышах на уровне 2,53 МЕ/мл и 2,5 МЕ/мл соответственно. Через 18 месяцев хранения при 6-8 °С эти показатели снизились до 2,05 МЕ/мл и 2,1 МЕ/мл соответственно (на 16-19%), но продолжали отвечать международным требованиям, предъявляемым к антирабическим вакцинам, в то время как аналогичные показатели референс-вакцины и прототипа снизились на 40 и 55%, соответственно.The initial vaccine series (Ser-1 and Ser-2) did not contain live rabies virus and had almost the same immunogenic activity when tested on mice at 2.53 IU / ml and 2.5 IU / ml, respectively. After 18 months of storage at 6-8 ° C, these indicators decreased to 2.05 IU / ml and 2.1 IU / ml, respectively (16-19%), but continued to meet international requirements for rabies vaccines, at that time how similar indicators of the reference vaccine and prototype decreased by 40 and 55%, respectively.

Этанол в составе жидкой антирабической вакцины в концентрациях 18-20% полностью инактивировал инфекционность вируса и надежно защищал вакцину от случайных загрязнений посторонними агентами без потери иммунологически активного материала.Ethanol in the liquid rabies vaccine in concentrations of 18-20% completely inactivated the infectivity of the virus and reliably protected the vaccine from accidental contamination by extraneous agents without loss of immunologically active material.

Предлагаемая вакцина обладала высокой антителоиндуцирующей активностью для целевых животных. В сыворотке крови вакцинированных щенят и котят вакциной, хранившейся в течение 1,5 года в условиях бытового холодильника (6-8 °С), антитела определялись через 27 дней на уровне 3,4 МЕ/мл (щенята) и 2,2 (котята), что свидетельствует о надежной защите их от бешенства.The proposed vaccine had a high antibody-inducing activity for target animals. In the blood serum of vaccinated puppies and kittens with a vaccine stored for 1.5 years in a domestic refrigerator (6-8 ° C), antibodies were determined after 27 days at a level of 3.4 IU / ml (puppies) and 2.2 (kittens) ), which indicates their reliable protection against rabies.

Вакцина по своим качественным показателям соответствует самым строгим современным требованиям экологической и биобезопасности, она не содержит антибиотиков, ртутьсодержащих препаратов и β-пропиолактона. Сохраняет активность при длительном хранении и при широком температурном диапазоне. Пригодна для надежной защиты животных от бешенства. Вакцина является конкурентоспособной лучшим международным препаратам.The vaccine in its quality indicators meets the most stringent modern requirements of environmental and biosafety, it does not contain antibiotics, mercury-containing drugs and β-propiolactone. It remains active during long-term storage and over a wide temperature range. Suitable for reliable protection of animals from rabies. The vaccine is competitive with the best international drugs.

Claims

A method of producing an anti-rabies vaccine for animals, including preparing seed from a rabies virus strain, infecting a culture of inoculable cells with seed, culturing rabies virus, collecting the virus-containing suspension, followed by its inactivation and preparing the target product, characterized in that the inactivation is carried out by adding ethanol to the virus-containing suspension in a final concentration of 18-20%, exposure time of 20-22 hours at a temperature of 36-37 ° C with constant stirring, then add 4-6% - th aluminum hydroxide in a ratio to the reaction mixture of 1: (4.5-5.0).