RU2518227C2

RU2518227C2 - Method of assessment environmental condition of coastal ecosystems

Info

Publication number: RU2518227C2
Application number: RU2012114114/15A
Authority: RU
Inventors: Галина Анатольевна Колючкина; Анвар Джураевич Исмаилов
Original assignee: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт океанологии им. П.П. Ширшова РАН
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2014-06-10
Also published as: RU2012114114A

Abstract

FIELD: agriculture.

SUBSTANCE: invention relates to the field of ecology. The method of assessment of environmental safety of coastal marine benthic ecosystems is to study morphological and functional characteristics of the mass mussels, while as a parameter of safety the morphofunctional characteristics of Hamels are used: the ATP content in hemocytes is measured, as well as the hemocyte concentration in the hemolymph, the level of histopathology defined as the percentage of animals with histopathology, and the level of pollution is judged by the change in these parameters in comparison with the same parameters in Hamels living in optimal living environment, at that, the smaller the concentration of ATP and hemocytes and the greater the level of histopathology is, the less favourable situation is observed in the marine benthic ecosystem.

EFFECT: invention provides an extension of range of technical means for assessment of the environmental safety of coastal benthic ecosystems, using morphological and functional characteristics of Hamels.

2 dwg

Description

Настоящее предполагаемое изобретение относится к области оценки загрязненности прибрежных морских экосистем и может быть использовано при осуществлении мероприятий по предотвращению загрязнения и очистке морских акваторий.The present alleged invention relates to the field of assessing pollution of coastal marine ecosystems and can be used in the implementation of measures to prevent pollution and clean up marine areas.

Известен способ экологического мониторинга водной среды на основе регистрации положения створок раковин двустворчатых моллюсков (1). Известный способ предполагает аппаратурное решение поставленной задачи, что технологически сложно выполнимо и создает значительные погрешности контроля.A known method of environmental monitoring of the aquatic environment based on the registration of the position of the valves of shells of bivalve mollusks (1). The known method involves the hardware solution of the problem, which is technologically difficult to do and creates significant control errors.

Известны способы оценки загрязненности акваторий по энергетическому балансу клеток (2), уровню гистопатологий мидий (3) и стабильности мембран лизосом (4). Существенным недостатком этих методов является использование одного методического подхода к оценке загрязнения, поскольку ни один метод, используемый по отдельности, не позволяет получить полной информации о состоянии животного (5): в этом случае от метода зависит не только чувствительность, универсальность ответа, но и скорость задержки в проявлении реакции на загрязнение.Known methods for assessing water pollution by the energy balance of cells (2), the level of histopathology of mussels (3) and the stability of lysosome membranes (4). A significant drawback of these methods is the use of a single methodological approach to assessing pollution, since not a single method, used separately, provides complete information about the state of the animal (5): in this case, not only sensitivity, universality of the response, but also the speed depends on the method delays in the manifestation of a reaction to pollution.

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки загрязненности акваторий по набору морфофизиологических характеристик мидий (Mytilus galloprovincialis) (6). Он заключается в том, что у мидий оценивают стабильность лизосомальных мембран гемоцитов при добавлении к клеткам прижизненного красителя нейтрального красного, частоту сердечных сокращений, уровень гистопатологий и выживаемость личинок. Признаком загрязнения в данном случае оказывается комплекс показателей: снижение способности лизосомальных мембран удерживать нейтральный красный; повышение частоты сердечных сокращений; вакуолизация эпителиальных клеток пищеварительной железы, повышение содержания гранулоцитов в гонадах и соединительной ткани, дегенерация эпителия пищеварительной железы по данным гистологического исследования; а также повышение частоты деформированных Д-стадий развития личинок мидий. Такой комплексный анализ позволяет не только выявлять разовые загрязнения, но и предсказать последствия загрязнения среды обитания родительских особей на дальнейшую динамику популяции. Однако существенным минусом этого способа является невозможность консервации материала, на каком либо этапе выполнения работ, а также трудоемкость исследований, связанных с анализом личиночных стадий. Другим существенным недостатком этого способа является невозможность использования методики оценки стабильности лизосомальных мембран с нейтральным красным для моллюсков, использующих в качестве переносчика кислорода гемоглобин в эритроцитах, поскольку краситель полностью маскируется гемоглобином. Именно такие моллюски вида Anadara cf. inaequivalvis (далее, анадары) в настоящее время широко встречаются в прибрежной зоне южных морей Евразии (7) и чрезвычайно удобны для исследования загрязнений, поскольку обитают, в том числе и в эстуарных зонах рек на рыхлых грунтах, где наиболее вероятно возникновение загрязнений. На песчаных грунтах массовым видом является Chamelea gallina (7). Для исследования скальных и искусственных твердых грунтов удобно использование двустворчатых моллюсков вида Mytilus galloprovincialis (7).Closest to the proposed one is a method for assessing water pollution by a set of morphophysiological characteristics of mussels (Mytilus galloprovincialis) (6). It consists in the fact that the stability of the lysosomal hemocyte membranes when adding neutral red dye to the cells, the heart rate, the level of histopathology, and the survival of the larvae are assessed in mussels. A sign of contamination in this case is a set of indicators: reduced ability of lysosomal membranes to retain neutral red; increased heart rate; vacuolization of epithelial cells of the digestive gland, an increase in the content of granulocytes in the gonads and connective tissue, degeneration of the epithelium of the digestive gland according to histological examination; as well as an increase in the frequency of deformed D-stages of development of mussel larvae. Such a comprehensive analysis allows not only to identify single pollution, but also to predict the consequences of pollution of the environment of the parental individuals on the further dynamics of the population. However, a significant disadvantage of this method is the impossibility of preserving the material at any stage of the work, as well as the complexity of studies associated with the analysis of larval stages. Another significant drawback of this method is the inability to use the methodology for assessing the stability of neutral red lysosomal membranes for mollusks using hemoglobin in red blood cells as an oxygen carrier, since the dye is completely masked by hemoglobin. It is these mollusks of the species Anadara cf. inaequivalvis (hereinafter, anadaras) are currently widely found in the coastal zone of the southern seas of Eurasia (7) and are extremely convenient for the study of pollution, because they live, including in estuarine zones of rivers on loose soils, where pollution is most likely to occur. A mass species on sandy soils is Chamelea gallina (7). For the study of rocky and artificial hard soils, it is convenient to use bivalve mollusks of the species Mytilus galloprovincialis (7).

Целью настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для оценки экологического благополучия прибрежных донных экосистем с использованием морфофункциональных характеристик хамелей, анадар и мидий.The aim of the present invention is to expand the arsenal of technical tools for assessing the environmental well-being of coastal bottom ecosystems using the morphological and functional characteristics of chameles, anadar and mussels.

Поставленная цель достигается тем, что, в известном способе оценки экологического благополучия прибрежных донных экосистем, включающего изучение морфофункциональных характеристик хамелей, мидий и анадар (далее, двустворчатых моллюсков), в качестве показателя благополучия используют содержание АТФ в гемоцитах, концентрацию гемоцитов в гемолимфе, уровень гистопатологий (присутствие/отсутствие), и об уровне загрязнения судят по отклонению этих показателей от аналогичных показателей у двустворчатых моллюсков, обитающих в оптимальных условиях. При этом, чем меньше концентрация АТФ и гемоцитов и больше уровень гистопатологий, тем менее благополучная ситуация наблюдается в донной экосистеме. Известно, что в норме в незагрязненных акваториях (с не превышающими ПДК значениями концентраций тяжелых металлов и нефтяных углеводородов) концентрация АТФ в гемоцитах анадар в среднем составляет 0,4±0,3 моль/10¹⁶кл. (8), у мидий 6,2±6/1 моль/10¹⁶кл., у хамелей 2,4±2,0 моль/10¹⁶кл. (10); содержание гемоцитов в гемолимфе анадар составляет 25000±10000 кл./мкл, мидий 2500±1500 кл./мкл, 1400±790 кл./мкл; а гистопатологические изменения отсутствуют (8; 9). Изменения вышеуказанных параметров, происходящие вследствие обычных сезонных колебаний абиотических параметров (изменения температуры, например) укладываются в вышеуказанные диапазоны (9). А в загрязненных акваториях концентрация АТФ на порядок меньше нормы, содержание гемоцитов в гемолимфе меньше нормальных на 50%, чем в норме, а также у 80-100% моллюсков отмечаются гистопатологии (основные гистопатологии - вакуолизация эпителиальных клеток пищеварительной железы, коричневые клетки в пищеварительной железе и желтый пигмент в эпителиальных клетках пищеварительной железы) (8; 9).This goal is achieved by the fact that, in the known method of assessing the ecological well-being of coastal benthic ecosystems, including the study of the morphological and functional characteristics of chameles, mussels and anadars (hereinafter, bivalves), the ATP content in hemocytes, the concentration of hemocytes in hemolymph, and the level of histopathology are used as an indicator of well-being (presence / absence), and the level of contamination is judged by the deviation of these indicators from similar indicators in bivalves that live in optimal conditions fishing. Moreover, the lower the concentration of ATP and hemocytes and the higher the level of histopathologies, the less favorable the situation is in the bottom ecosystem. It is known that normally in uncontaminated water areas (with concentrations of heavy metals and petroleum hydrocarbons not exceeding the MPC), the ATP concentration in anadar hemocytes averages 0.4 ± 0.3 mol / 10 ¹⁶ cells. (8), for mussels 6.2 ± 6/1 mol / 10 ¹⁶ cells., For chameles 2.4 ± 2.0 mol / 10 ¹⁶ cells. (10); the hemocyte content in anadar hemolymph is 25,000 ± 10,000 cells / μl, mussel 2500 ± 1,500 cells / μl, 1,400 ± 790 cells / μl; and histopathological changes are absent (8; 9). Changes to the above parameters that occur as a result of the usual seasonal fluctuations of the abiotic parameters (temperature changes, for example) fall within the above ranges (9). And in contaminated waters, the ATP concentration is an order of magnitude lower than normal, the hemocyte content in hemolymph is less than normal by 50% than normal, and 80-100% of mollusks have histopathologies (the main histopathologies are vacuolization of the epithelial cells of the digestive gland, brown cells in the digestive gland and yellow pigment in the epithelial cells of the digestive gland) (8; 9).

Возможность практической реализацииPossibility of practical implementation

Для осуществления изобретения необходимо произвести отбор двустворчатых моллюсков: вручную с использованием легководолазного снаряжения или с использованием драг, черпаков и прочего оборудования. Для анализа концентрации гемоцитов в гемолимфе и АТФ в гемоцитах необходимо отбирать по 10 моллюсков со станции, для гистологического анализа - по 30 моллюсков, для анализа на содержание ТМ - по 3-10 моллюсков. Хранить моллюсков следует при температуре соответствующей температуре отбора не более 2-х часов после момента сбора.To implement the invention, it is necessary to select bivalve mollusks: manually using diving equipment or using dredges, scoops and other equipment. To analyze the concentration of hemocytes in hemolymph and ATP in hemocytes, it is necessary to select 10 mollusks from the station, for histological analysis - 30 mollusks, for analysis for the content of HM - 3-10 mollusks. Keep the mollusks at a temperature corresponding to the selection temperature of not more than 2 hours after the time of collection.

Исследование клеточного состава гемолимфы и концентрации в ней гемоцитов. Гемолимфу необходимо отобрать при помощи стерильных шприцов из синуса мускула-замыкателя, осторожно приоткрыв створки раковины. Подсчет концентрации гемоцитов производится при помощи микроскопа с увеличением 400х в камере Горяева.The study of the cellular composition of hemolymph and the concentration of hemocytes in it. Hemolymph must be removed using sterile syringes from the sinus of the muscle-closure, carefully opening the flaps of the shell. Hemocyte concentration is calculated using a microscope with a magnification of 400x in the Goryaev’s chamber.

Для анализа содержания АТФ в гемоцитах необходимо отобрать по 50 мкл гемолимфы у каждого моллюска и смешать каждую пробу с диметилсульфоксидом в соотношении 1:1. Если дальнейший анализ невозможно произвести непосредственно после отбора гемолимфы, образцы следует хранить при температуре -18°C не более месяца. Биолюминесцентный анализ концентрации АТФ с использованием светлячковой люциферазы следует проводить на люминометре (например, RFT20046 (Германия)) с пороговой чувствительностью не менее 10^-9 моль АТФ/л.To analyze the ATP content in hemocytes, it is necessary to take 50 μl of hemolymph from each mollusk and mix each sample with dimethyl sulfoxide in a 1: 1 ratio. If further analysis cannot be carried out immediately after hemolymph selection, the samples should be stored at -18 ° C for no more than a month. A bioluminescent analysis of ATP concentration using firefly luciferase should be carried out on a luminometer (for example, RFT20046 (Germany)) with a threshold sensitivity of at least 10 ^-9 mol ATP / L.

Для гистологического исследования отделенные от раковины мягкие ткани моллюсков следует фиксировать 4% формальдегидом или фиксатором Дэвидсона (глицерин дистиллированный : 40% формальдегид : спирт 96° : морская вода в соотношении 1:2:3:3). В дальнейшем образцы следует обезвоживать по стандартной гистологической методике и заливать в среду Гитомикс. Срезы (5-7 мкм толщиной) следует окрасить гематоксилином Караччи и эозином и изучать под световым микроскопом при увеличении 400х-900х. При анализе препаратов необходимо выявлять присутствие или отсутствие патологии у каждого моллюска (в частности, вакуолизации эпителиальных клеток пищеварительной железы, присутствия коричневых клеток в пищеварительной железе и желтого пигмента в эпителиальных клетках пищеварительной железы), и в результате, определить процентное содержание особей на данной станции с такой патологией.For histological examination, the soft tissues of mollusks separated from the shell should be fixed with 4% formaldehyde or Davidson's fixative (distilled glycerin: 40% formaldehyde: alcohol 96 °: sea water in a ratio of 1: 2: 3: 3). Subsequently, the samples should be dehydrated according to the standard histological procedure and poured into the Gitomix medium. Sections (5-7 microns thick) should be stained with Karacci hematoxylin and eosin and examined under a light microscope at 400x-900x magnification. When analyzing drugs, it is necessary to identify the presence or absence of pathology in each mollusk (in particular, vacuolization of the epithelial cells of the digestive gland, the presence of brown cells in the digestive gland and yellow pigment in the epithelial cells of the digestive gland), and as a result, determine the percentage of individuals at this station with such a pathology.

На микрофотографиях показаны гистологические препараты моллюсков, содержащихся в оптимальных условиях обитания, - Фиг.1 и моллюсков, собранных в загрязненном районе, - Фиг.2. Преимущества предложенного способа оценки уровня загрязнения акватории состоят в том, что он чрезвычайно прост в методическом исполнении, не трудоемок, не требует высокой квалификации работников, определяющих уровень загрязнения акватории. При простоте выполнения исследований он дает репрезентативные результаты и весьма эффективен для получения оценки комплексного загрязнения акватории.The microphotographs show the histological preparations of mollusks contained in optimal living conditions, - Fig.1 and mollusks collected in the contaminated area, - Fig.2. The advantages of the proposed method for assessing the level of pollution of the water area are that it is extremely simple in methodological design, not laborious, does not require highly qualified workers who determine the level of pollution of the water area. Given the simplicity of research, it gives representative results and is very effective in obtaining an assessment of complex pollution of the water area.

Источники информацииInformation sources

1. Патент России №2361207.1. Patent of Russia No. 2361207.

2. Thebault, M.T., Rafflin, J.P., Picado, A.M. et al. 2000. Coordinated changes of adenylate energy charge and ATP/ADP: use in ecotoxicology studies. Ecotoxicol. Environ. Saf. 46, 23-28.2. Thebault, M.T., Rafflin, J.P., Picado, A.M. et al. 2000. Coordinated changes of adenylate energy charge and ATP / ADP: use in ecotoxicology studies. Ecotoxicol. Environ. Saf. 46, 23-28.

3. Sunila I. Histopathologycal effects of environmental pollutants on the common mussel, Mytilus edulis L. (Baltic Sea), and their application in marine monitoring. Helsinki, 1987. Thesis of PhD.3. Sunila I. Histopathologycal effects of environmental pollutants on the common mussel, Mytilus edulis L. (Baltic Sea), and their application in marine monitoring. Helsinki, 1987. Thesis of PhD.

4. Lowe D. Lisosomal membrane impairment in blood cells of Perna viridis: An invitro marker of contaminant induced damage. // Res. Bull. Phuket Mar. Biol. Cent. 1995. V.60. P.79-82.4. Lowe D. Lisosomal membrane impairment in blood cells of Perna viridis: An invitro marker of contaminant induced damage. // Res. Bull. Phuket Mar. Biol. Cent. 1995. V.60. P.79-82.

5. Phelps D.K., Katz C.H., Scott B.J., Reynolds B.H. Coastal monitoring: evaluation of monitoring methods in Narragansett Bay, Long Islang Sound, and New York Bight, and a general monitoring strategy // New Approaches to Monitoring Aquatic Ecosystems. ASTM 940. Boyle, T.P. (ed.). American Society for testing and Materials. Philadelphia. 1986.5. Phelps D.K., Katz C.H., Scott B.J., Reynolds B.H. Coastal monitoring: evaluation of monitoring methods in Narragansett Bay, Long Islang Sound, and New York Bight, and a general monitoring strategy // New Approaches to Monitoring Aquatic Ecosystems. ASTM 940. Boyle, T.P. (ed.). American Society for testing and Materials. Philadelphia 1986.

6. Wedderburn J., McFadzen I., Sanger R.C. et al. The field application of cellular and physiological biomarkers, in the mussel Mytilus edulis, in conjunction with early life stage bioassays and adult histopathology // Mar. Pol. Bull. 2000. V.40. №.3. P.257-267.6. Wedderburn J., McFadzen I., Sanger R.C. et al. The field application of cellular and physiological biomarkers, in the mussel Mytilus edulis, in conjunction with early life stage bioassays and adult histopathology // Mar. Pol. Bull. 2000. V.40. Number 3. P.257-267.

7. Zaitsev, Yu. P., Ozturk B. (Eds.) Exotic species in the Aegean, Marmara, Black, Azov and Caspian seas. No. 8. Turkish Marine Research Foundation, 2001. 267 pp.7. Zaitsev, Yu. P., Ozturk B. (Eds.) Exotic species in the Aegean, Marmara, Black, Azov and Caspian seas. No. 8. Turkish Marine Research Foundation, 2001. 267 pp.

8. Колючкина Г.А., Исмаилов А.Д. Морфофункциональные особенности двустворчатых моллюсков при экспериментальном загрязнении среды тяжелыми металлами // Океанология. 2011. Т.51. №5. С.857-866.8. Kolyuchkina G.A., Ismailov A.D. Morphofunctional features of bivalve mollusks during experimental pollution of the environment with heavy metals // Oceanology. 2011.V.51. No. 5. S.857-866.

9. Колючкина Г.А., Милютин Д.М. Использование морфофункционального анализа Anadara sp. cf. Anadara inaequivalvis (Bivalvia) в экологическом мониторинге // Океанология. Т.53. №2, Март-Апрель 2013, С.192-199.9. Kolyuchkina G.A., Milyutin D.M. Using morphofunctional analysis Anadara sp. cf. Anadara inaequivalvis (Bivalvia) in environmental monitoring // Oceanology. T.53. No. 2, March-April 2013, S.192-199.

10. Колючкина Г.А. Биомаркеры воздействия загрязнений на двустворчатых моллюсков северо-кавказского побережья Черного моря Дисс. канд. биол. наук. 03.00.18. Москва. 2009.10. Kolyuchkina G.A. Biomarkers of the effects of pollution on bivalves of the North Caucasian Black Sea coast Diss. Cand. biol. sciences. 03/00/18. Moscow. 2009.

Claims

A method for assessing the ecological well-being of coastal marine bottom ecosystems, which consists in studying the morphofunctional characteristics of mass bivalve mollusks, characterized in that the morphofunctional characteristics of chameles are used as an indicator of well-being: they measure the ATP content in hemocytes, the concentration of hemocytes in hemolymph, the level of histopathology, defined as the percentage of individuals with histopathology, and the level of contamination is judged by the change in these indicators in comparison with similar indicators of chameles living in optimal living conditions, while the lower the concentration of ATP and hemocytes and the higher the level of histopathology, the less favorable the situation is observed in the marine bottom ecosystem.