RU2517731C2 - Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination - Google Patents
Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination Download PDFInfo
- Publication number
- RU2517731C2 RU2517731C2 RU2011127954/10A RU2011127954A RU2517731C2 RU 2517731 C2 RU2517731 C2 RU 2517731C2 RU 2011127954/10 A RU2011127954/10 A RU 2011127954/10A RU 2011127954 A RU2011127954 A RU 2011127954A RU 2517731 C2 RU2517731 C2 RU 2517731C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- transgenic
- sperm
- chickens
- protein
- gene
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Данное изобретение относится к биотехнологии. Трансгенные животные обладают многими привлекательными свойствами в качестве продуцентов фармацевтических белков как в отношении невысоких затрат по их получению, так и возможностью синтезировать сложные белки. Такие органы животных как молочная железа (3, 12), белок яйца птицы (23), семенная плазма (9), жировые железы (20), кровь и лимфа личинок насекомых (18) и другие потенциально могут быть использованы для синтеза фармацевтических белков.This invention relates to biotechnology. Transgenic animals have many attractive properties as producers of pharmaceutical proteins, both in terms of the low cost of their production, and the ability to synthesize complex proteins. Animal organs such as mammary gland (3, 12), bird egg protein (23), seminal plasma (9), fat glands (20), blood and lymph of insect larvae (18) and others can potentially be used for the synthesis of pharmaceutical proteins.
В последнее время в связи с достижениями в области молекулярной и клеточной биологии по созданию более эффективных генных векторов вирусного и невирусного происхождения, развитию технологии культивирования плюрипотентных стволовых эмбриональных клеточных линий, использованию сперматозоидов и половых органов в качестве объектов введения генов трансгенные продуценты стали рассматриваться как одни из перспективных систем синтеза фармацевтических белков.Recently, in connection with advances in molecular and cellular biology to create more efficient gene vectors of viral and non-viral origin, to develop technology for the cultivation of pluripotent stem embryonic cell lines, to use sperm and genital organs as objects for introducing genes, transgenic producers have become regarded as one of promising systems for the synthesis of pharmaceutical proteins.
Впервые интернализация экзогенной ДНК сперматозоидами млекопитающих была показана группой Брэкетта (5) в 1971 году. Однако следующие работы в этом направлении появились только и 1989 году (15) и с тех пор им уделяется пристальное внимание, так как трансгенез с использованием сперматозоидов не требует больших финансовых затрат. За последние 20 лет использование спермиев в качестве векторов для переноса генных конструкций успешно осуществлено на рыбах (14), земноводных (13), птицах (19), млекопитающих (15). Число сообщений об удачных попытках интеграции экзогенной ДНК и ее наследования в следующих поколениях трансгенных животных неуклонно растет (8, 6, 11, 10). В настоящее время изучены молекулярные механизмы двух этапов в процессе передачи трансгена с использованием спермы: 1) присоединения экзогенной ДНК к мембране сперматозоида и ее интернализация; 2) доставка указанной ДНК до ооцита в момент оплодотворения (16). Дальнейшая судьба доставленной ДНК представляется в виде двух вариантов: или она интегрируется в геном хозяина, или остается как структура вне хромосом. Оказалось, что липосомы, переносчики (моноклональные антитела (мат), DMSO и др.) (7, 21), электропорация, микроинъекция комплекса ДНК с липосомами значительно повышают эффективность хромосомного встраивания плазмид. Тогда как при инкубации экзогенной ДНК со сперматозоидом без переносчиков чаще всего встречается эписомное встраивание, и трансген не передается следующему поколению (22). Нам не встречались работы по инкубации плазмид со спермой петуха без переносчиков, собственные попытки проведения аналогичных экспериментов не привели к положительным результатам (4). Возможно, что выявленные различия в характере взаимодействий экзогенной ДНК со спермой при ее прямой инкубации и опосредованном переносе, и дальнейшие последствия этих событий регулируются разными молекулярными механизмами.For the first time, the internalization of exogenous DNA by mammalian sperm was shown by the Brackett group (5) in 1971. However, the following works in this direction appeared only in 1989 (15) and since then, close attention has been paid to them, since transgenesis using spermatozoa does not require large financial expenses. Over the past 20 years, the use of sperm as vectors for the transfer of gene constructs has been successfully carried out on fish (14), amphibians (13), birds (19), mammals (15). The number of reports of successful attempts to integrate exogenous DNA and its inheritance in the next generations of transgenic animals is steadily growing (8, 6, 11, 10). Currently, the molecular mechanisms of two stages in the process of transgene transfer using sperm have been studied: 1) attachment of exogenous DNA to the sperm membrane and its internalization; 2) delivery of the indicated DNA to the oocyte at the time of fertilization (16). The further fate of the delivered DNA is presented in the form of two options: either it integrates into the host genome, or remains as a structure outside the chromosomes. It turned out that liposomes, carriers (monoclonal antibodies (mat), DMSO, etc.) (7, 21), electroporation, microinjection of a DNA complex with liposomes significantly increase the efficiency of chromosomal insertion of plasmids. Whereas upon incubation of exogenous DNA with a non-carrier sperm, episomal insertion is most often encountered, and the transgene is not transmitted to the next generation (22). We have not seen work on incubation of plasmids with sperm of a rooster without carriers; our own attempts to conduct similar experiments did not lead to positive results (4). It is possible that the revealed differences in the nature of interactions of exogenous DNA with sperm during its direct incubation and mediated transfer, and further consequences of these events are regulated by different molecular mechanisms.
Так, К.Чанг с коллегами (7) создали специфические моноклональные антитела путем получения гибридомы после многократной иммунизации 6-недельных мышей сперматозоидами из эпидидимуса 12-недельных мышей. Эти мат связывались специфически со сперматозоидами различных видов животных и с плазмидной ДНК за счет электростатических взаимодействий. С помощью данного комплекса были получены трансгенные свиньи и мыши путем хирургического осеменения через яйцевод и оплодотворения in vitro, соответственно. При этом авторы наблюдали наследование и экспрессию чужеродного гена у потомков.So, K. Chang and colleagues (7) created specific monoclonal antibodies by obtaining hybridomas after repeated immunization of 6-week-old mice with sperm from the epididymus of 12-week-old mice. These mats bind specifically to spermatozoa of various animal species and to plasmid DNA due to electrostatic interactions. Using this complex, transgenic pigs and mice were obtained by surgical insemination through the oviduct and in vitro fertilization, respectively. Moreover, the authors observed the inheritance and expression of a foreign gene in descendants.
За последние 8 лет не появилось ни одной публикации других авторов, подтверждающих эффективность этого метода. Тогда как нами был разработан метод получения трансгенных кроликов, продуцирующих лекарственные белки в молочную железу, с использованием человеческих мат при обычном способе искусственного осеменения в отличие от хирургического осеменения или оплодотворения in vitro и (2). Авторами было проведено 10 экспериментов с ДНК (плазмидой гена человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, ч-ГКСФ). Осеменено 18 самок, из них окролились 7 (39%). У двух самок крольчата пали. Всего получено 30 живых потомков. У 13 крольчат обнаружена интеграция гена фрагмент В-казеина-hGCSF. Выход трансгенных особей от общего числа потомства составил 43%. Самки половозрелого возраста окролилась. В молоке 4-х самок был обнаружен целевой белок - ч-ГКСФ. Установлена передача гена трансгенными кроликами, полученными с использованием человеческих моноклональных антител в следующем поколении.Over the past 8 years, no publications by other authors have appeared that confirm the effectiveness of this method. Whereas we developed a method for producing transgenic rabbits producing medicinal proteins in the mammary gland using human mats in the usual method of artificial insemination, in contrast to surgical insemination or in vitro fertilization and (2). The authors conducted 10 experiments with DNA (the plasmid of the gene for human granulocyte colony stimulating factor, h-G-CSF). Inseminated 18 females, of which 7 (39%) sprang up. Two female rabbits fell. In total, 30 living descendants were obtained. In 13 rabbits, the integration of the gene fragment of B-casein-hGCSF was detected. The output of transgenic individuals from the total number of offspring was 43%. Females of mature age sprawled. The target protein, h-G-CSF, was found in the milk of 4 females. Gene transfer was established by transgenic rabbits obtained using the next generation of human monoclonal antibodies.
Последние годы наиболее пристальное внимание исследователей было направлено на разработку технологии получения рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы, которое стало возможным благодаря развитию новых методов введения чужеродных генов в половые клетки этих животных. Белок яйца содержит около 4 г белка, половина которого представлена одним белком - овальбумином. Следовательно, с помощью овальбуминового промотора можно было бы получить до грамма рекомбинантного белка с 25% чистотой в стерильном естественным образом белке яйца. В отличие от крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов было показано, что птица и человек в качестве компонентов своих гликопротеинов используют остатки сиаловой кислоты одинаковой структуры (NANA). Однако существуют значительные различия в физиологии воспроизводства кур и млекопитающих. Проблемы извлечения зиготы у птицы и ее большой размер создают трудности по инъекции чужеродных генов, в то время как сразу после снесения яйца эмбрион легкодоступен, но уже состоит из примерно 60000 клеток. Первые попытки использовать эмбриональные клетки сразу после откладки яйца, в качестве потенциальных клеток мишеней для внедрения чужеродной ДНК в половую линию птицы увенчались сначала большими надеждами, а затем долей разочарования. К успехам можно отнести разработку технологии создания половых химер кур при пересадке донорских клеток из неинкубированного яйца, затем из зародышевого серпа, крови и ранних гонад. Однако после трансфекции данных клеток не удавалось получить стабильную передачу трансгена в поколениях. Пожалуй только с использованием репликативно-дефектного ретровирусного вектора в качестве переносчика экзогенных генов были получены нескольких поколений трансгенной птицы, стабильно передающих экспрессирующий ген бактериальной β-галактозидазы в соответствии с Менделеевским распределением, но уровень экспрессии оставался низким. Человеческие моноклональные антитела (мат), полученные из яйца трансгенных кур, по своим физиологическим характеристика не уступали аналогичным, полученным с помощью таких традиционных систем, как клетки яичника хомячка (СНО) или мышиные миеломные клетки за исключением различий в профилях N-linked олигасахаридов. В отличие от трансгенных растений и млекопитающих мат, продуцируемые куриной системой, обладали повышенной ADCC, приемлемым полураспадом, несмотря на отсутствие остатка сиаловой кислоты, правильным гликозилированием, превосходным связыванием, хорошим уровнем интернализации. К тому же концентрация рекомбинантного белка также была высокой в пределах 1-3 мг на яйцо, что представлялось уже возможным использования этой технологии для коммерческого получения этого белка.In recent years, the most attention of researchers has been directed to the development of technology for the production of recombinant proteins from egg protein of a transgenic bird, which has become possible thanks to the development of new methods for introducing foreign genes into the sex cells of these animals. Egg protein contains about 4 g of protein, half of which is represented by one protein - ovalbumin. Therefore, using the ovalbumin promoter, it would be possible to obtain up to a gram of recombinant protein with 25% purity in a naturally sterile egg protein. In contrast to cattle, sheep, goats, and rabbits, it was shown that poultry and humans use sialic acid residues of the same structure (NANA) as components of their glycoproteins. However, there are significant differences in the physiology of the reproduction of chickens and mammals. The problems of zygote extraction in a bird and its large size create difficulties in the injection of foreign genes, while immediately after the laying of an egg the embryo is easily accessible, but already consists of approximately 60,000 cells. The first attempts to use embryonic cells immediately after laying the eggs as potential target cells for introducing foreign DNA into the bird's sexual line were crowned with great hopes and then some frustration. The successes include the development of the technology for creating sexual chimeras of chickens when transplanting donor cells from an unincubated egg, then from the germinal sickle, blood, and early gonads. However, after transfection of these cells, it was not possible to obtain stable transgene transmission in generations. Perhaps only using a replicatively defective retroviral vector as a carrier of exogenous genes, several generations of transgenic birds were obtained stably transmitting the bacterial β-galactosidase expression gene in accordance with the Mendeleev distribution, but the expression level remained low. Human monoclonal antibodies (mat) obtained from transgenic chicken eggs were not inferior in physiological characteristics to those obtained using traditional systems such as hamster ovary cells (CHO) or mouse myeloma cells, with the exception of differences in the profiles of N-linked oligasaccharides. In contrast to transgenic plants and mammals, the mat produced by the chicken system had an increased ADCC, acceptable half-life, despite the absence of a sialic acid residue, proper glycosylation, excellent binding, and good level of internalization. In addition, the concentration of the recombinant protein was also high in the range of 1-3 mg per egg, which was already possible to use this technology for the commercial production of this protein.
Трансгенез с использованием сперматозоидов также, как и инфекция вирусными плазмидами не требует больших финансовых затрат, однако предполагает использование невирусных конструкций генов. Действительно, использование ретро-вирусов в качестве вектора для переноса гена в организм курицы имеет целый ряд недостатков; их применение ограничивает размер гена более 8 т.н.п. сопровождается низкой экспрессией рекомбинантного белка и не лишено опасности рекомбинации ретровируса в онкогенны в организме птицы. Использование этой технологии в фармацевтической индустрии особенно привлекательно, т.к. позволяет обойти отсутствие высокой технологической квалификации и дорогостоящего оборудования, например, при получении трансгенных кур с помощью методов культивирования и трансплантации генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Поэтому разработка технологии введения чужеродного гена путем переноса со спермой открывает широкие возможности по использованию яйца кур для продукции фармацевтических белков.Sperm transgenesis as well as infection with viral plasmids does not require large financial expenditures, but involves the use of non-viral gene constructs. Indeed, the use of retro viruses as a vector for gene transfer into the chicken organism has a number of disadvantages; their use limits the size of the gene to more than 8 tp accompanied by low expression of the recombinant protein and is not without the risk of recombination of the retrovirus into oncogenes in the bird. The use of this technology in the pharmaceutical industry is particularly attractive because allows to circumvent the lack of high technological qualifications and expensive equipment, for example, when receiving transgenic chickens using methods of cultivation and transplantation of genetically modified embryonic stem cells. Therefore, the development of a technology for introducing a foreign gene by transferring with sperm opens up wide possibilities for the use of chicken eggs for the production of pharmaceutical proteins.
Нами были использованы мат человека против рецептора трансферрина для получения трансгенной птицы опосредованным переносом гена путем обычного искусственного осеменения куриц.We used a human mat against transferrin receptor to obtain a transgenic bird by mediated gene transfer by conventional artificial insemination of hens.
Во-первых, эти антитела, как было известно, связываются со сперматозоидами человека.First, these antibodies have been known to bind to human sperm.
Во-вторых, нами экспериментально показано их способность связываться с ДНК (2).Secondly, we have experimentally shown their ability to bind to DNA (2).
В-третьих, методом проточной цитометрии были выявлены человеческие моноклональные антитела (мат), специфически связывающиеся со сперматозоидами петуха. Наиболее высокий процент связывания со сперматозоидами показали мат CD71 и CD25, тогда как мат СБ95, CD38 и CD4, также специфически связывались, но лишь с небольшой популяцией сперматозоидов (табл.1).Thirdly, the method of flow cytometry revealed human monoclonal antibodies (mat) that specifically bind to rooster spermatozoa. The highest percentage of sperm binding was shown by mat CD71 and CD25, while mat SB95, CD38 and CD4 also specifically bind, but only to a small sperm population (Table 1).
В-четвертых, при инкубации этих антител с ДНК и с спермой петуха обычным методом искусственного осеменения нами достигнут высокий уровень интеграции гена, примерно одинаковый с тем который был получен Прокофьевым М.И. с соавторами (2) при использовании данных антител. Это также свидетельствует об участии человеческих моноклональных антител в создании комплекса ген-антитело-сперматозоид.Fourthly, during the incubation of these antibodies with DNA and with the sperm of a rooster by the usual method of artificial insemination, we achieved a high level of gene integration, approximately the same as that obtained by MI Prokofiev. et al. (2) using these antibodies. This also indicates the participation of human monoclonal antibodies in the creation of a gene-antibody-sperm complex.
Осеменено 12 кур трансфецированной спермой с геном человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (чГКСФ), было собрано 83 инкубационных яйца, из которых вылупились 26 цыплят, а 4 оказались «задохликами» (табл.2). Из 26-ти цыплят 9 оказались трансгенными, что составило 34,6% от общего количества проанализированных проб ДНК.Inseminated 12 chickens with transfected sperm with the gene for human granulocyte colony stimulating factor (hGCSF), 83 hatching eggs were collected, of which 26 chicks hatched, and 4 turned out to be “suffocates” (Table 2). Of the 26 chickens, 9 were transgenic, accounting for 34.6% of the total number of DNA samples analyzed.
В сыворотки крови 7-ми цыплят из 9-ти трансгенных был обнаружен целевой белок - чГКСФ (табл.3).In the blood serum of 7 chickens out of 9 transgenic, the target protein, hGKSF, was detected (Table 3).
В белке куриного яйца трансгенных кур был обнаружен белок - чГКСФ, его концентрация составила 5 нг/мл.In the protein of chicken eggs of transgenic chickens, a protein - hGCSF was detected, its concentration was 5 ng / ml.
Таким образом, отличительными особенностями изобретения являются:Thus, the distinguishing features of the invention are:
1. Выявление человеческих моноклональных антител для повышения эффективности переноса гена со сперматозоидами петуха в отличие от сперматозоидов кролика в прототипе (2).1. The identification of human monoclonal antibodies to increase the efficiency of gene transfer with rooster sperm in contrast to rabbit sperm in the prototype (2).
2. Получение трансгенной птицы с использованием человеческих антител с высоким уровнем интеграции гена сравнимой с прототипом при получении трансгенных кроликов (34.6% против 43,3% в прототипе Прокофьевым М.И. с соавторами (2)).2. Obtaining a transgenic bird using human antibodies with a high level of gene integration comparable to the prototype when receiving transgenic rabbits (34.6% versus 43.3% in the prototype by MI Prokofiev et al. (2)).
3. Разработан метод получения трансгенной птицы с использованием человеческих моноклональных антител при обычном способе искусственного осеменения в отличие от искусственного осеменения кроликов в прототипе.3. A method has been developed for producing transgenic birds using human monoclonal antibodies in the usual method of artificial insemination, in contrast to the artificial insemination of rabbits in the prototype.
4. Установлена передача гена трансгенными курицами, полученными с использованием человеческих моноклональных антител в следующем поколении.4. Transmission of the gene by transgenic hens obtained using the next generation of human monoclonal antibodies has been established.
5. Продемонстрирована экспрессия гена в сыворотку крови трансгенной птицы, полученных с использованием человеческих моноклональных антител, а также экспрессия гена в белок куриного яйца трансгенной птицы. Получение трансгенных кур иллюстрируются следующими примерами:5. Demonstrated gene expression in blood serum of transgenic birds obtained using human monoclonal antibodies, as well as gene expression in chicken egg protein of transgenic birds. Obtaining transgenic chickens are illustrated by the following examples:
Пример 1.Example 1
Подготовка спермы, трансфецированной ДНК в присутствии человеческих моноклональных антител и осеменение куриц.Preparation of sperm transfected with DNA in the presence of human monoclonal antibodies and insemination of hens.
Получение спермы от петухов осуществлялось методом Барроуса и Квина, а именно путем массажа от киля вдоль лонных костей к хвостовой части. Сперму получали в спермоприемник (маленький стаканчик с ровными краями). Разбавление спермы проводилось разбавителем, предложенным и произведенным на базе ВНИИТИП. Разбавитель представляет собой раствор, содержащий уксуснокислый натрий, глюкозу, сахарозу, бикарбонат натрия, щавелевую кислоту и дистиллированную воду. Разбавление проводили в соотношении 1:3. Готовили растворы БСА в двух концентрациях: R1 - 0,4 мг/мл и R2 - 1,5 мг/мл на основе ранее приготовленного разбавителя для спермы.Sperm was obtained from roosters by the method of Barrows and Quin, namely by massage from the keel along the pubic bones to the tail. Sperm was received in a sperm receiver (a small glass with smooth edges). Sperm dilution was carried out with a diluent, proposed and produced on the basis of VNIITIP. The diluent is a solution containing sodium acetic acid, glucose, sucrose, sodium bicarbonate, oxalic acid and distilled water. Dilution was carried out in a ratio of 1: 3. BSA solutions were prepared in two concentrations: R 1 - 0.4 mg / ml and R 2 - 1.5 mg / ml based on the previously prepared diluent for sperm.
Оценку качества спермы и подсчет количества сперматозоидов производилась под микроскопом, при этом учитывалось количества сперматозоидов, их подвижность и жизнеспособность. В опыт отбирали объем спермы содержащий 500 млн сперматозоидов.Evaluation of sperm quality and counting the number of sperm was carried out under a microscope, while taking into account the number of sperm, their motility and viability. A sperm volume containing 500 million spermatozoa was selected for the experiment.
Далее сперму центрифугировали при 220 g, 5 мин. Автоматической пипеткой удаляли супернатант, добавляли 0,5 мл раствора R1, аккуратно перемешивали и снова центрифугировали в том же режиме, таким образом, мы промывали сперму от семенной жидкости.Sperm was then centrifuged at 220 g, 5 min. The supernatant was removed with an automatic pipette, 0.5 ml of R 1 solution was added, gently mixed and centrifuged again in the same mode, so we washed the semen from the seminal fluid.
После центрифугирования супернатант также удаляли автоматической пипеткой, добавляли 0,5 мл раствора R2, перемешивали и добавляли моноклональные антитела (НПЦ «МедБиоСпектр») в количестве 150 мкг, перемешивали переворачиванием пробирки. Далее смесь спермы с антителами инкубировали 40 мин, при комнатной температуре, покачивая через каждые 5 мин.After centrifugation, the supernatant was also removed with an automatic pipette, 0.5 ml of R 2 solution was added, mixed and monoclonal antibodies (NPC MedBioSpektr) were added in an amount of 150 μg, mixed by inverting the tubes. Next, the sperm-antibody mixture was incubated for 40 minutes at room temperature, shaking every 5 minutes.
После инкубации смесь центрифугировали при 220 g, 5 мин супернатант удаляли автоматической пипеткой, добавляли 0,3 мл раствора R2, перемешивали и добавляли препараты ДНК в количестве 80γ, перемешивали переворачиванием пробирки. Далее смесь спермы с антителами и ДНК инкубировали 40 мин, при комнатной температуре, покачивая через каждые 5 мин.After incubation, the mixture was centrifuged at 220 g, for 5 min the supernatant was removed by automatic pipette, 0.3 ml of R 2 solution was added, mixed and 80 g DNA preparations were added, mixed by inverting the tubes. Next, a mixture of sperm with antibodies and DNA was incubated for 40 minutes at room temperature, shaking every 5 minutes.
По истечению 40 минут проводили контроль на подвижность сперматозоидов и при хороших показателях подвижности осуществляли искусственное осеменение куриц.After 40 minutes, sperm motility was monitored and, with good motility indices, hens were artificially inseminated.
После осеменения проводили сбор яиц в течении 7 дней, яйца закладывали на инкубацию при 37,5-38°C и относительной влажности 60%, 21 сутки до вылупле-ния цыплят.Для выделения ДНК кровь у цыплят брали из подкожно-локтевой вены. Далее проводили анализ на интеграцию ДНК с использованием ПЦР диагностики.After insemination, the eggs were collected for 7 days, the eggs were laid for incubation at 37.5-38 ° C and 60% relative humidity, 21 days before the chicks hatch. For the isolation of DNA, the blood from the chickens was taken from the sapheno-ulnar vein. Next, DNA integration analysis was performed using PCR diagnostics.
Пример №2.Example No. 2.
Получение трансгенных кур с использованием человеческих моноклональных антител.Obtaining transgenic chickens using human monoclonal antibodies.
Осеменено трансфецированными сперматозоидами 12 кур, от которых было собрано 83 инкубационных яйца, из которых вылупились 26 цыплят (31,3%). Из 26-ти цыплят 9 оказались трансгенными, что составило 34,6%.Inseminated with transfected sperm 12 chickens, from which 83 hatching eggs were collected, of which 26 chickens hatched (31.3%). Of the 26 chickens, 9 were transgenic, accounting for 34.6%.
Иммуноферментным методом было определено содержание ГКСФ человека в сыворотке крови трансгенных цыплят. Динамика экспрессии ГКСФ человека у трансгенной птицы в крови анализировалась дважды в возрасте 90 и 100 дней. При этом наблюдались изменения в динамике содержания белка ГКСФ человека в анализируемых образцах сыворотки крови. Экспрессия белка в крови полученных нами трансгенных цыплятах составила от 20 до 70 пкг/мл ГКСФ человеке, а в крови контрольных цыплят, у которых отсутствовала интеграция гена, искомый белок выявлен не был.An enzyme immunoassay was used to determine the content of human G-CSF in the blood serum of transgenic chickens. The dynamics of the expression of human G-CSF in transgenic birds in the blood was analyzed twice at the age of 90 and 100 days. At the same time, changes were observed in the dynamics of the content of human G-CSF protein in the analyzed blood serum samples. The expression of protein in the blood of the transgenic chickens we obtained ranged from 20 to 70 pg / ml of G-CSF in humans, and the desired protein was not detected in the blood of control chickens that lacked gene integration.
После достижения трансгенными половозрелости и начала яйцекладки, иммуноферментным методом было определено содержание ГКСФ человека в белке куриного яйца трансгенных куриц. Экспрессия белка ГКСФ человека в белок яйца составила 5 нг/мл, а в белке куриного яйца контрольных куриц, у которых отсутствовала интеграция гена, искомый белок выявлен не был.After transgenic maturity and the onset of oviposition began, the content of human G-CSF in the chicken egg protein of transgenic hens was determined by an enzyme immunoassay. The expression of the human G-CSF protein in egg protein was 5 ng / ml, and the desired protein was not detected in the chicken egg protein of control hens that lacked gene integration.
Также выявлено присутствие рекомбинантного зеленого флуоресцирующего белка GFP (green fluorescent protein) в белке куриного яйца от трансгенных куриц.The presence of the recombinant green fluorescent protein GFP (green fluorescent protein) in the chicken egg protein from transgenic hens was also detected.
Список литературыBibliography
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Типография ВНТИЦ, 1997. - С.14-21.1. Baryshnikov A.Yu., Tonevitsky A.G. Monoclonal antibodies in the laboratory and clinic. - M .: VNTITS Printing House, 1997. - S.14-21.
2. Прокофьев М.И. и др. Способ получения трансгенных животных, продуцирующих белки в молочную железу. Патент №2402211С2 от 27.10.2010 г.2. Prokofiev M.I. et al. A method for producing transgenic animals producing proteins in the mammary gland. Patent No. 2402211С2 dated October 27, 2010
3. Прокофьев М.И. и др. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Сельскохозяйственная биология. 2003, 6, 49-54.3. Prokofiev M.I. et al. Creation of transgenic rabbits producing human granulocyte colony stimulating factor with milk. Agricultural biology. 2003, 6, 49-54.
4. Самойлов А.В. Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур. Диссертация, Москва, 2011.4. Samoilov A.V. Development and improvement of methods for transfection of exogenous DNA into chicken embryonic cells. Thesis, Moscow, 2011.
5. Brackett B.G. et al. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc. Natl. Acad. USA. 1971, 68, 353-357.5. Brackett B.G. et al. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc. Natl. Acad. USA 1971, 68, 353-357.
6. Celebi C. et al. Transient transmission of a transgene in mouse offspring following in vivo transfection of male germ cells. Mol. Repr. Dev. 2002, 62, Ml-A%2.6. Celebi C. et al. Transient transmission of a transgene in mouse offspring following in vivo transfection of male germ cells. Mol. Repr. Dev. 2002, 62, Ml-A% 2.
7. Chang К et al. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer. BMC Biotechnol. 2002, 2, 5-10.7. Chang K et al. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer. BMC Biotechnol. 2002, 2, 5-10.
8. Chang К.T. et al. Production of transgenic rats and mice by the testis-mediated gene transfer. J. Reprod. Dev. 1999, 45, 29-36.8. Chang K.T. et al. Production of transgenic rats and mice by the testis-mediated gene transfer. J. Reprod. Dev. 1999, 45, 29-36.
9. Dyck M.K. et al. Making recombinant proteins in animals-different systems, different applications. Trends Biotechnol. 2003, 21, 394-399.9. Dyck M.K. et al. Making recombinant proteins in animals-different systems, different applications. Trends Biotechnol. 2003, 21, 394-399.
10. Harel-Markowitz E. et al. Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle-stimulating. J. Biol. Reprod. 2009, 80, 1046-1052.10. Harel-Markowitz E. et al. Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green fluorescent protein) or human follicle-stimulating. J. Biol. Reprod. 2009, 80, 1046-1052.
11. He X et al. A novel method to transfer gene in vivo system. Prog. Biochem. Biophys. 2006, 33, 685-690.11. He X et al. A novel method to transfer gene in vivo system. Prog. Biochem. Biophys. 2006, 33, 685-690.
12. Houdebine L.M. The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression // J. Biotechnol. 2002, 98, 145-160.12. Houdebine L.M. The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression // J. Biotechnol. 2002, 98, 145-160.
13. Jonak J. Sperm-mediated preparation of transgenic Xenopus laevis and transgenic DNA to the next generation. Mol. Repr. Dev. 2000, 56, 298-300.13. Jonak J. Sperm-mediated preparation of transgenic Xenopus laevis and transgenic DNA to the next generation. Mol. Repr. Dev. 2000, 56, 298-300.
14. Khoo Y.W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in Singapore // Mol. Reprod. Dev. 2000, 75, 278-280.14. Khoo Y.W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in Singapore // Mol. Reprod. Dev. 2000, 75, 278-280.
15. Lavitrano M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice. Cell. 1989, 57, 717-723.15. Lavitrano M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice. Cell. 1989, 57, 717-723.
16. Lavitrano M. et al. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation. Transplant. Proc. 1997, 29, 3508-3509.16. Lavitrano M. et al. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation. Transplant Proc. 1997, 29, 3508-3509.
17. Lavitrano M et al. The interaction of sperm cells with exogenous DNA: A role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules. Exp. Cell Res. 1997, 233, 56-62.17. Lavitrano M et al. The interaction of sperm cells with exogenous DNA: A role of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules. Exp. Cell Res. 1997, 233, 56-62.
18. Markaki M. et al. Stable expression of human Growth Hormone over 50 generation in transgenic insect larvae. Transgenic Res. 2007, 16, 99-107.18. Markaki M. et al. Stable expression of human Growth Hormone over 50 generation in transgenic insect larvae. Transgenic Res. 2007, 16, 99-107.
19. Nakanishi A. and Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods // Mol. Repr. Dev. 1993, 36, 258-261.19. Nakanishi A. and Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods // Mol. Repr. Dev. 1993, 36, 258-261.
20. Royer C. et al. Biosynthesis and cocoonexport of recombinant globular protein in transgenic silkworms. Transgenic Res. 2005, 14, 463-472.20. Royer C. et al. Biosynthesis and cocoonexport of recombinant globular protein in transgenic silkworms. Transgenic Res. 2005, 14, 463-472.
21. Wang Y.J. et al. Expression of porcine growth hormone gene in transgenic rabbits as reported by green fluorescent protein. Anim. Biotechnol. 2001, 12, 101-110.21. Wang Y.J. et al. Expression of porcine growth hormone gene in transgenic rabbits as reported by green fluorescent protein. Anim. Biotechnol. 2001, 12, 101-110.
22. Wu Z. et al. Transient transgene transmission to piglets by intrauterine insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments. Mol. Repr. Dev. 2008, 75, 26-32.22. Wu Z. et al. Transient transgene transmission to piglets by intrauterine insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments. Mol. Repr. Dev. 2008, 75, 26-32.
23. Zhu L. et al. Production of monoclonal antibody in eggs of chimeric chicken. Nat Biotechnol. 2005, 23, 1159-1169.23. Zhu L. et al. Production of monoclonal antibody in eggs of chimeric chicken. Nat Biotechnol. 2005, 23, 1159-1169.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127954/10A RU2517731C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127954/10A RU2517731C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011127954A RU2011127954A (en) | 2013-01-27 |
| RU2517731C2 true RU2517731C2 (en) | 2014-05-27 |
Family
ID=48805236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011127954/10A RU2517731C2 (en) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2517731C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2711740C2 (en) * | 2014-06-26 | 2020-01-21 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods for use thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040255345A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-12-16 | Rapp Jeffrey C. | Production of transgenic avians |
| EP1712126A1 (en) * | 2004-01-08 | 2006-10-18 | Kaneka Corporation | Transgenic bird and method of constructing the same |
| US20090133134A1 (en) * | 2000-03-28 | 2009-05-21 | Kangsheng Wang | Method and composition for genetically modifying non-human cells and animals |
| RU2402211C2 (en) * | 2007-06-29 | 2010-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биолайн Фармторг" | Method for production of transgenic rabbits producing proteins into mammary gland |
-
2011
- 2011-07-08 RU RU2011127954/10A patent/RU2517731C2/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090133134A1 (en) * | 2000-03-28 | 2009-05-21 | Kangsheng Wang | Method and composition for genetically modifying non-human cells and animals |
| US20040255345A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-12-16 | Rapp Jeffrey C. | Production of transgenic avians |
| EP1712126A1 (en) * | 2004-01-08 | 2006-10-18 | Kaneka Corporation | Transgenic bird and method of constructing the same |
| RU2402211C2 (en) * | 2007-06-29 | 2010-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биолайн Фармторг" | Method for production of transgenic rabbits producing proteins into mammary gland |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2711740C2 (en) * | 2014-06-26 | 2020-01-21 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods for use thereof |
| US10793874B2 (en) | 2014-06-26 | 2020-10-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
| RU2771532C2 (en) * | 2014-06-26 | 2022-05-05 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and their application methods |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011127954A (en) | 2013-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lillico et al. | Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs | |
| US11230697B2 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| Mozdziak et al. | Status of transgenic chicken models for developmental biology | |
| Sang | Transgenic chickens—methods and potential applications | |
| Park et al. | Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct‐specific minisynthetic promoter | |
| Bednarczyk et al. | Generation of transgenic chickens by the non-viral, cell-based method: effectiveness of some elements of this strategy | |
| US20170218336A1 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| Shakweer et al. | A review of transgenic animal techniques and their applications | |
| RU2517731C2 (en) | Method for production of transgenic chickens by mediated transgenesis through conventional artificial insemination | |
| EP1760155A2 (en) | Non-human sperm-DNA complexes for geneticallly modifying non-human animals | |
| Song et al. | Avian biotechnology: insights from germ cell-mediated transgenic systems | |
| KR101574204B1 (en) | Transgenic aves expressing codon-optimized human epidermal growth factor and method for preparing the same | |
| CA2421174A1 (en) | Cloned cells, embryos, and avians and methods, of producing them | |
| US20020162134A1 (en) | Primordial germ cell-based germ line production of birds | |
| Li et al. | Recent progress on technologies and applications of transgenic poultry | |
| CA2438612A1 (en) | Primordial germ cell-based germ line production of birds | |
| Schusser et al. | Advances in genetic engineering of the avian genome | |
| Eghbalsaied et al. | Development of a transposon-based technology for transfection of day 0 chicken embryos | |
| RU2402211C2 (en) | Method for production of transgenic rabbits producing proteins into mammary gland | |
| Etches | The hard cell (s) of avian transgenesis | |
| Singhal et al. | Transgenic animals: production and application | |
| Roychoudhury et al. | The oviduct of transgenic birds as a source of therapeutic proteins | |
| Ganguli et al. | A combinatorial approach for robust transgene delivery and targeted expression in mammary gland for generating biotherapeutics in milk, bypassing germline gene integration | |
| Samoylov et al. | Development of transgenic chicken with a gene of human granulocyte colony-stimulating factor using sperm-mediated gene transfer | |
| Volkova et al. | Effectiveness of exogenous DNA transfer to chicken embryo cells in vitro and in vivo using retroviral vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20130121 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20130513 |