RU2515915C1 - Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses - Google Patents
Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2515915C1 RU2515915C1 RU2012141950/10A RU2012141950A RU2515915C1 RU 2515915 C1 RU2515915 C1 RU 2515915C1 RU 2012141950/10 A RU2012141950/10 A RU 2012141950/10A RU 2012141950 A RU2012141950 A RU 2012141950A RU 2515915 C1 RU2515915 C1 RU 2515915C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- cattle
- cells
- viruses
- virus
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии, в частности получению нового штамма клеток из легкого плода крупного рогатого скота «ЛПК», отвечающего требованиям биобезопасности и чувствительного к широкому спектру вирусов.The present invention relates to the field of veterinary biotechnology and virology, in particular the production of a new strain of cells from the lung fetus of cattle "LPK" that meets the requirements of biosafety and is sensitive to a wide range of viruses.
В клетках животного происхождения в процессе длительного культивирования происходят кариологические, культурально-морфологические изменения, которые могут приводить к изменению чувствительности их к вирусам. При этом возможна их контаминация латентными вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами, что создает угрозу для биобезопасности в производстве биопрепаратов, а также непредсказуемым результатам при проведении вирусологических исследований. В связи с этим получение новых клеточных штаммов, свободных от контаминантов и чувствительных к возбудителям вирусных болезней, является актуальным.In cells of animal origin during prolonged cultivation, karyological, cultural-morphological changes occur that can lead to a change in their sensitivity to viruses. Moreover, their contamination with latent viruses, mycoplasmas, and other microorganisms is possible, which poses a threat to biosafety in the production of biological products, as well as unpredictable results in virological studies. In this regard, obtaining new cell strains that are free of contaminants and sensitive to pathogens of viral diseases is relevant.
Известен штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1, чувствительный к вирусам гриппа А, аденовирусам человека и крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Штамм представлен клетками эпителиоподобного типа, поддерживается на среде Игла MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота (1).A known strain of heteroploid cells of Taurus-1 calf kidney is sensitive to influenza A viruses, human and cattle adenoviruses, and cattle infectious rhinotracheitis. The strain is represented by cells of the epithelial-like type; it is maintained on MEM Eagle medium with 10% cattle serum (1).
Известен также штамм культивируемых клеток легких плода коровы для культивирования вирусов (ЛЭК). Монослой формируется клетками эпителиоподобного типа в течение 3-4 сут. на среде Игла MEM с 10% сыворотки. Культура клеток ЛЭК обеспечивает репродукцию вирусов ИРТ, ПГ-3, PC крупного рогатого скота. Инфекционный титр этих возбудителей достигает на этой культуре 105-106ТЦД50/мл.Also known is a strain of cultured lung cells of a fetal cow for the cultivation of viruses (LEK). A monolayer is formed by epithelial-like cells within 3-4 days. on medium MEM Needle with 10% serum. The cell culture LEC provides the reproduction of viruses IRT, PG-3, PC cattle. The infectious titer of these pathogens reaches 10 5 -10 6 TCD 50 / ml on this culture.
В процессе длительного культивирования штамм ЛЭК контаминировался вирусом ВД-БС и M.arginini (2). Прототип.During prolonged cultivation, the LEC strain was contaminated with the VD-BS virus and M.arginini virus (2). Prototype.
В задачу наших исследований входило получение нового, свободного от контаминации, чувствительного к вирусам крупного рогатого скота штамма клеток легкого плода коровы, применяемого для диагностики вирусных инфекций и накопления вирусного материала.The objective of our research was to obtain a new, free of contamination, virus-sensitive cattle lung cell strain of a cow used for the diagnosis of viral infections and the accumulation of viral material.
Предложенный штамм обладает следующими свойствами.The proposed strain has the following properties.
Морфологические признаки. Клеточный пласт ЛПК на 3-4 сут. культивирования состоит из тесно прилегающих друг к другу полигональных клеток с четко выраженными границами. В популяции преобладают клетки фибробластоподобного типа. Ядра клеток крупные, овальной или округлой формы с одним или двумя ядрышками. Большинство ядер содержат мелкосетчатый хроматин. Цитоплазма гомогенная, в отдельных клетках встречаются вакуоли, расположенные, в основном, возле ядра. Некоторые клетки (1%) содержат по два ядра.Morphological signs. Cellular layer of LPC for 3-4 days. cultivation consists of closely adjacent polygonal cells with clearly defined boundaries. Fibroblast-like cells predominate in the population. The nuclei of the cells are large, oval or round with one or two nucleoli. Most nuclei contain fine chain chromatin. The cytoplasm is homogeneous, in individual cells vacuoles are found, located mainly near the nucleus. Some cells (1%) contain two nuclei.
Кариологические признаки. Штамм ЛПК является диплоидным. Модальное число хромосом 58-60 (85%), интервал изменчивости 56-62.Karyological signs. Strain LPK is diploid. The modal number of chromosomes is 58-60 (85%), the range of variation is 56-62.
Молекулярно-генетические признаки. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами, комплементарными к участку генома, кодирующего субъединицу b цитохром оксидазы, подтверждено происхождение штамма от крупного рогатого скота. Штамм свободен от вирусов диареи - болезни слизистых оболочек, лейкоза крупного рогатого скота, микоплазм, что подтверждено методом ПЦР.Molecular genetic traits. In the polymerase chain reaction (PCR) with species-specific primers complementary to the site of the genome encoding the cytochrome oxidase subunit b, the origin of the strain from cattle is confirmed. The strain is free from diarrhea viruses - diseases of the mucous membranes, leukemia of cattle, mycoplasmas, which is confirmed by PCR.
В цитологических препаратах и при бактериологическом исследовании не выявлено контаминации бактериями, грибами, простейшими.In cytological preparations and bacteriological examination, no contamination by bacteria, fungi, and protozoa was revealed.
Культуральные свойства. Штамм ЛПК поддерживают на среде, состоящей из ГЛА и Игла MEM 1: 1 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Культуру клеток выращивают при температуре 36,5-37°C. Кратность рассева 1: 2 - 1: 3. Срок формирования монослоя 3-4 сут.Cultural properties. The LPC strain is maintained on a medium consisting of GLA and a 1: 1 MEM Needle with 10% fetal cattle serum. The cell culture is grown at a temperature of 36.5-37 ° C. Multiplicity of sieving 1: 2 - 1: 3. The term for the formation of a monolayer is 3-4 days.
Получение штамма. Предложенный штамм ЛПК получали следующим образом. Легкое плода коровы подвергали дезагрегации с использованием 0,125%-ного раствора трипсина в нескольких циклах. Диспергированные клетки объединяли, центрифугировали при 1000 об/мин, определяли жизнеспособность, ресуспендировали в ростовой среде (ГЛА в смеси с Игла MEM и 10% сыворотки плодов коров) и засевали в культуральные флаконы. На 5-е сутки после образования монослоя проводили субкультивирование с кратностью рассева 1:2-1:3. Последующие пассажи проводили через 3-4 суток на среде того же состава. Отделение клеток от стекла осуществляли смесью версена с трипсином в соотношении 9:1. Клетки криоконсервировали с использованием 10% ДМСО, 40% фетальной сыворотки и 50% питательной среды. Концентрация клеток составляла 3-4 млн клеток в 1 мл. Жизнеспособность после восстановления - 85-90%.Getting strain. The proposed LPC strain was prepared as follows. The lungs of a cow fetus were disaggregated using a 0.125% trypsin solution in several cycles. Dispersed cells were combined, centrifuged at 1000 rpm, viability was determined, resuspended in growth medium (GLA mixed with Needle MEM and 10% serum of cow fruit) and inoculated into culture bottles. On the 5th day after the formation of the monolayer, subculturing was carried out with a sieving ratio of 1: 2-1: 3. Subsequent passages were performed after 3-4 days on an environment of the same composition. The separation of cells from glass was carried out with a mixture of versene with trypsin in a ratio of 9: 1. Cells were cryopreserved using 10% DMSO, 40% fetal serum, and 50% culture medium. The cell concentration was 3-4 million cells in 1 ml. Viability after recovery is 85-90%.
Пример 1. Культивирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ)Example 1. The cultivation of the virus of infectious rhinotracheitis in cattle (RTI)
В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ИРТ в количестве 0,01-1 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем инокулум удаляли, а в культуру вносили поддерживающую среду, состоящую из ГЛА и Игла MEM 1:1. Инфицированную культуру инкубируют при температуре 37°C в течение 1-3 сут, ежедневно оценивая изменения в монослое. ЦПД проявлялось через 18-30 часов. Полное разрушение монослоя наблюдали через 30-72 часа в зависимости от заражающей дозы и штамма вируса. Уровень накопления вируса определяли по его инфекционному титру в стандартной культуре клеток почки теленка ПТ и параллельно в культуре клеток ЛПК. Максимальный титр вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ЛПК, составлял 106-106,75ТЦД50/мл. Культура клеток ЛПК проявляла чувствительность ко всем испытанным штаммам вируса (ТК-А(ВИЭВ)В2, ТНЛ, К-40).An IRT virus in the amount of 0.01-1 TCD50 / ml was introduced into the culture of LPC cells with the formed monolayer. Virus adsorption was carried out for 1 hour at a temperature of 37 ° C. Then the inoculum was removed, and a support medium consisting of GLA and MEM Needle 1: 1 was introduced into the culture. The infected culture is incubated at 37 ° C for 1-3 days, daily assessing changes in the monolayer. CPD manifested itself after 18-30 hours. Complete destruction of the monolayer was observed after 30-72 hours depending on the infecting dose and strain of the virus. The level of virus accumulation was determined by its infectious titer in a standard culture of PT calf kidney cells and, in parallel, in the LPC cell culture. The maximum titer of the IRT virus reproduced in the LPC cell culture was 10 6 -10 6.75 TCD 50 / ml. The LPC cell culture was sensitive to all tested virus strains (TK-A (VIEV) B 2 , TNL, K-40).
Уровень репродукции вируса свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК.The level of reproduction of the virus testified to a high sensitivity of the cell culture of the LPC.
Пример 2. Культивирование штамма ПТК 45/86 вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота (ПГ-3)Example 2. The cultivation of the strain PTC 45/86 virus parainfluenza-3 cattle (PG-3)
В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ПГ-3 в количестве 0,1-1 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - формирование симпластов, удлинение клеток, образование пустот - наблюдали через 48 часов, максимальное ЦПД - через 72 часа после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений - 106-107 ТЦД50/мл по ЦПД или 106,3-107,5 по гемадсорбции эритроцитов морской свинки.PG-3 virus in the amount of 0.1-1 TCD 50 / ml was introduced into the culture of LPC cells with the formed monolayer. Virus adsorption was carried out for 1 hour. The inoculum was removed, a support medium was introduced into the infected culture and cultured at 37 ° C for 3-5 days. The first signs of CPD — the formation of symplasts, cell elongation, and the formation of voids — were observed after 48 hours, and the maximum CPD was observed 72 hours after infection. The infectious titer of the virus reached its maximum values - 10 6 -10 7 TCD 50 / ml according to the CPD or 10 6.3 -10 7.5 according to the hemadsorption of guinea pig erythrocytes.
Уровень репродукции вируса ПГ-3 свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК к этому возбудителю.The level of reproduction of the PG-3 virus testified to a high sensitivity of the LPC cell culture to this pathogen.
Пример 3. Культивирование вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС)Example 3. The cultivation of the diarrhea virus - diseases of the mucous membranes of cattle (VD-BS)
В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ВД-БС (штаммы ВК-1B 1 №28 и Орегон) в количестве 0,1-0,5 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - образование отдельных участков округлых пикнотических клеток - наблюдали через 48 часов после заражения. Выраженное ЦПД (большинство клеток монослоя представлено мелкими пикнотическими клетками, которые быстро отслаивались от стекла) регистрировали через 72-96 часов после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений -105,5-106,0ТЦД50/мл.VD-BS virus (VK-1B 1 strain No. 28 and Oregon strains) was introduced into the culture of LPC cells with a formed monolayer in an amount of 0.1-0.5 TCD 50 / ml. Virus adsorption was carried out for 1 hour. The inoculum was removed, a support medium was introduced into the infected culture and cultured at 37 ° C for 3-5 days. The first signs of CPD — the formation of separate sections of rounded pycnotic cells — were observed 48 hours after infection. Pronounced CPD (most monolayer cells are represented by small pycnotic cells that quickly peeled off the glass) were recorded 72-96 hours after infection. The infectious titer of the virus reached a maximum value of -10 5.5 -10 6.0 TCD 50 / ml.
Пример 4. Определение титра антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови крупного рогатого скота в реакции нейтрализацииExample 4. Determination of the titer of antibodies to the RTI virus in the serum of cattle in the neutralization reaction
Уровень антител против вируса ИРТ в положительной и отрицательной сыворотке определяли в реакции нейтрализации. Для этого делали двукратные серийные разведения сыворотки, в которые добавляли по 100 ТЦД50/мл вируса. Суспезию клеток ЛПК с концентрацией 150-200 тыс. клеток/мл с 10% фетальной сыворотки разливали в лунки культуральных планшетов, содержавших смесь разведений сыворотки и 100 ТЦД50/лунку вируса. Учет реакции проводили через 48 часов культивирования в СО2 инкубаторе при температуре 37°C. Титр антител составлял 1:32 для положительной и 0 для отрицательной сыворотки, что соответствовало титру антител, выявляемому в других культурах клеток.The level of antibodies against the RTI virus in positive and negative serum was determined in the neutralization reaction. For this, two serial dilutions of serum were made, to which 100 TCD 50 / ml of the virus was added. A suspension of LPC cells with a concentration of 150-200 thousand cells / ml from 10% fetal serum was poured into the wells of culture plates containing a mixture of dilutions of serum and 100 TCD 50 / well of the virus. The reaction was taken into account after 48 hours of cultivation in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C. The antibody titer was 1:32 for positive and 0 for negative serum, which corresponded to the titer of antibodies detected in other cell cultures.
Культура клеток ЛПК, как видно из примера, пригодна для определения титра антител в реакции нейтрализации.The cell culture of LPC, as can be seen from the example, is suitable for determining the titer of antibodies in the neutralization reaction.
Пример 5. Выделение вируса ИРТ из назальных мазков больного крупного рогатого скотаExample 5. Isolation of the RTI virus from nasal smears of a sick cattle
В пробирки со сформированным монослоем клеток ЛПК (а также MDBK - контроль) вносили назальную слизь, разведенную культуральной средой Игла MEM 1:10. После адсорбции в течение 1 часа клетки трижды промывали и инкубировали со средой без сыворотки при температуре 37°C в течение 5 суток. ЦПД, характерное для вируса ИРТ, проявлялось уже в первом пассаже, в то время как в процессе трех слепых пассажей в культуре клеток MDBK присутствия вируса не выявили.Nasal mucus diluted in culture medium Needle MEM 1:10 was added to the tubes with the formed monolayer of LPC cells (as well as the MDBK control). After adsorption for 1 hour, the cells were washed three times and incubated with serum-free medium at 37 ° C for 5 days. The CPI characteristic of the IRT virus was already evident in the first passage, while the presence of the virus was not detected during the three blind passages in the MDBK cell culture.
Культура ЛПК является пригодной для вирусовыделения.Culture of LPC is suitable for virus isolation.
Как видно из приведенных примеров, штамм является новым, свободным от контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов животных. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов, обеспечивающий высокий уровень их репродукции. Культура клеток штамма ЛПК пригодна для диагностики вирусных инфекций, в частности выделения вирусов из патологического материала и индикации противовирусных антител в реакции нейтрализации.As can be seen from the above examples, the strain is new, free from contamination by viruses, mycoplasmas, bacteria, fungi, cells of other animal species. It is a biosafe substrate for the cultivation of viruses, providing a high level of their reproduction. The cell culture of the LPC strain is suitable for the diagnosis of viral infections, in particular the isolation of viruses from pathological material and the indication of antiviral antibodies in the neutralization reaction.
Штамм апробирован с положительным результатом в отделах клеточной биотехнологии и вирусологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии в 2011-2012 гг.The strain was tested with a positive result in the departments of cell biotechnology and virology GNU VIEV Russian Agricultural Academy in 2011-2012.
Штамм хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) под №83.The strain is stored in a specialized collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals RKKK (P) (CJS RAAS) under No. 83.
Предложенный штамм клеток легкого плода коровы найдет применение в научно-исследовательских учреждениях, диагностических лабораториях, биологической промышленности.The proposed strain of lung fetal cells of a cow will find application in research institutions, diagnostic laboratories, and the biological industry.
Просим предложенный штамм, согласно документации, назвать «ЛПК».We ask the proposed strain, according to the documentation, to name "LPK".
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ №1347448, Кл. C12N 5/06, 27.09.1985 г.1. RF patent No. 1347448, Cl. C12N 5/06, 09/27/1985
2. А.С. СССР №1306121, Кл. C12N 5/06, 22.12.1986 г.2. A.S. USSR No. 1306121, Cl. C12N 5/06, 12/22/1986
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012141950/10A RU2515915C1 (en) | 2012-10-02 | 2012-10-02 | Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012141950/10A RU2515915C1 (en) | 2012-10-02 | 2012-10-02 | Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012141950A RU2012141950A (en) | 2014-04-10 |
| RU2515915C1 true RU2515915C1 (en) | 2014-05-20 |
Family
ID=50435833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012141950/10A RU2515915C1 (en) | 2012-10-02 | 2012-10-02 | Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2515915C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU1347448C (en) * | 1985-09-27 | 1995-04-10 | Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН | Strain taurus-1 of heteroploid cells of calf kidney used for virus cultivation |
| US20030161817A1 (en) * | 2001-03-28 | 2003-08-28 | Young Henry E. | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof |
-
2012
- 2012-10-02 RU RU2012141950/10A patent/RU2515915C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU1347448C (en) * | 1985-09-27 | 1995-04-10 | Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН | Strain taurus-1 of heteroploid cells of calf kidney used for virus cultivation |
| US20030161817A1 (en) * | 2001-03-28 | 2003-08-28 | Young Henry E. | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012141950A (en) | 2014-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kosoy et al. | Bartonella melophagi in blood of domestic sheep (Ovis aries) and sheep keds (Melophagus ovinus) from the southwestern US: cultures, genetic characterization, and ecological connections | |
| Mori et al. | Critical aspects for detection of Coxiella burnetii | |
| CN101665781B (en) | High-titer Porcine circovirus 2-type cultured cell, preparation method and use thereof | |
| CN104812893B (en) | The production method of the parvovirus of high infection titer | |
| WO2022110962A1 (en) | Neutralizing antibody against severe acute respiratory syndrome type ii coronavirus (sars-cov-2) | |
| TW201404884A (en) | Primer set, method and kit for detecting pathogen in animals or plants | |
| Carli et al. | Real-time polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma gallisepticum in chicken trachea | |
| Swaminathan et al. | Establishment of caudal fin cell lines from tropical ornamental fishes Puntius fasciatus and Pristolepis fasciata endemic to the Western Ghats of India | |
| Khan et al. | The generation of regulatory B cells by helminth parasites | |
| CN107312849B (en) | CPA detection method for detecting mycoplasma bovis, kit and application thereof | |
| Oğuzoğlu et al. | A sheeppox virus outbreak in Central Turkey in 2003: isolation and identification of capripoxvirus ovis | |
| Ayelet et al. | Outbreak investigation and molecular characterization of African horse sickness virus circulating in selected areas of Ethiopia | |
| RU2515915C1 (en) | Strain of diploid cells of fetal lung of cattle for reproduction of viruses | |
| CN102108414A (en) | Real-time fluorescence transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) detection method and kit for pike fry rhabdovirus (PFRV) | |
| Kalinin et al. | Study of cell culture strains sensitivity to sacbrood virus | |
| CN115466711A (en) | Method for obtaining virus-free cell line and virus-free cell line obtained by method | |
| RU2560569C2 (en) | Alekseevskiy strain of swinepox virus for virological, molecular-genetic, monitoring studies, production of vaccines and diagnostic preparations | |
| RU2348689C1 (en) | Constant sso-2 cell line of parenchymic organ pool of siberian sturgeon acipenser baeri | |
| RU2616287C1 (en) | Agent for producing preparations for diagnostics of typhus caused by rickettsia raoultii with genotype dns28 | |
| CN113234676A (en) | Method for promoting duck T cell proliferation and application thereof | |
| RU2354691C1 (en) | Strain of rickettsiaceae "candidatus rickettsia tarasevichiae''-candidate to new species used for rickettsiaceae identification and obtaining diagnostic preparations | |
| Chambers et al. | Equine influenza culture methods | |
| Al-Mubarak et al. | Molecular and serological identification of newcastle disease virus propagated in embryonated chicken eggs | |
| RU2201959C2 (en) | Strain of piglet kidney transplantable cell sus scrofa pk-15/b5 used for virology investigation | |
| RU2704449C2 (en) | AGENT FOR PREPARING PREPARATIONS FOR DIAGNOSING RICKETTSIOSIS CAUSED BY RICKETTSIA RAOULTII GENOTYPE DnS14 |