RU2514019C2 - Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers - Google Patents
Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers Download PDFInfo
- Publication number
- RU2514019C2 RU2514019C2 RU2012123342/15A RU2012123342A RU2514019C2 RU 2514019 C2 RU2514019 C2 RU 2514019C2 RU 2012123342/15 A RU2012123342/15 A RU 2012123342/15A RU 2012123342 A RU2012123342 A RU 2012123342A RU 2514019 C2 RU2514019 C2 RU 2514019C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- cells
- target cells
- patients
- cytotoxic activity
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммунологии, и касается способа оценки цитотоксической активности (ЦА) лимфоцитов натуральных киллеров, (НК)-лимфоцитов, в периферической крови больных и здоровых, основанного на подсчете числа недеградированных клеток-мишеней К-562 после их контакта с НК-лимфоцитами на автоматическом счетчике и анализаторе клеток. Изобретение может быть использовано в медицинской иммунодиагностике при комплексном обследовании больных с целью выявления у них изменений цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров; его применение также возможно в лечебной практике с целью коррекции выявленных изменений этого звена иммунитета у больных с психопатологической симптоматикой и при различных соматических заболеваниях, в первую очередь злокачественных новообразованиях и заболеваниях инфекционной природы.The invention relates to medicine, in particular to clinical immunology, and relates to a method for assessing the cytotoxic activity (CA) of natural killer lymphocytes, (NK) lymphocytes in the peripheral blood of patients and healthy, based on counting the number of undegraded target cells K-562 after their contact with NK lymphocytes on an automatic counter and cell analyzer. The invention can be used in medical immunodiagnostics with a comprehensive examination of patients in order to detect changes in the cytotoxic activity of natural killer lymphocytes in them; its use is also possible in medical practice in order to correct the revealed changes in this immunity in patients with psychopathological symptoms and various somatic diseases, primarily malignant neoplasms and diseases of an infectious nature.
Известен колориметрический способ оценки ЦА НК-лимфоцитов в периферической крови, основанный на окрашивании мертвых клеток-мишеней трипановым синим или аламаром синим в результате повышения проницаемости их мембраны после контакта в цитотоксическом тесте с НК-лимфоцитами (Анфалова Т.В., Казанский Д.Б., Хромых Л.М. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003; (9):3 56-360). Этот способ является неточным, так как при подсчете окрашенных клеток могут учитываться вместе с клетками-мишенями и погибшие клетки крови.A known colorimetric method for evaluating the CA of NK lymphocytes in peripheral blood is based on staining dead target cells with trypan blue or alamar blue as a result of increasing the membrane permeability after contact with NK lymphocytes in a cytotoxic test (Anfalova T.V., Kazan DB ., Khromykh L.M. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2003; (9): 3 56-360). This method is inaccurate, since when counting stained cells, dead blood cells can be taken into account together with target cells.
Известен также радиоактивный способ оценки, который основан на измерении количества радиоактивной Н-РНК в клетках-мишенях, оставшихся недеградированными после контакта в цитотоксическом тесте с НК-лимфоцитами. В качестве клеток-мишеней, адаптированных к НК, используют клетки миелолейкоза человека линии К-562, которые перед постановкой цитотоксического теста обрабатывают 3H-уридином (Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и др. Иммунология. 1981; 3: 88-90, прототип). Сущность этого способа заключается в том, что при постановке цитотоксического теста к мононуклеарным клеткам, выделенным из периферический крови больных и здоровых и состоящим из моноцитов и пула лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, добавляют клетки-мишени К-562, которые предварительно метят в течение часа радиоактивной меткой по 3Н-уридиному и еще в течение часа трижды отмывают от невключившейся радиоактивной метки большими объемами среды 199. После инкубации в течение 16-18 часов взвесь клеток осаждают с помощью вакуумного насоса и харвестера, предназначенного для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах, на специальные стекловолокнистые фильтры. Фильтры высушивают в течение 6-18 часов, затем переносят во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и оставляют еще на 6-18 часов для выхода β-частиц в жидкость. После этого подсчитывают уровень радиоактивности проб на β-счетчике.A radioactive evaluation method is also known, which is based on measuring the amount of radioactive N-RNA in target cells that remained undegraded after contact with NK lymphocytes in a cytotoxic test. As target cells adapted to NK, human K-562 line myeloid leukemia cells are used, which are treated with 3 H-uridine before setting up a cytotoxic test (Rykova M.P., Spirande I.V., Zedgenidze M.S. et al. Immunology. 1981; 3: 88-90, prototype). The essence of this method is that when setting up a cytotoxic test, mononuclear cells isolated from the peripheral blood of patients and healthy and consisting of monocytes and a pool of lymphocytes, 10-15% of which are NK lymphocytes, add target cells K-562, which are preliminarily labeled for 3 hours with a 3 H-uridine radioactive label and washed with large volumes of medium 199 from the unincorporated radioactive tag for three hours more. After incubation for 16-18 hours, the cell suspension is sedimented using vacuum a pump and a harvester designed to collect cells by filtration on filters, on special fiberglass filters. The filters are dried for 6-18 hours, then transferred to bottles with scintillation liquid and left for another 6-18 hours for the release of β-particles into the liquid. After that, the level of radioactivity of the samples on the β-counter is counted.
Недостатком этого способа является длительность и сложность его проведения, а также опасность для здоровья исполнителя. А именно, оценка ЦА НК является многоэтапной, занимает по продолжительности 2-3 дня и требует применения большого количества дорогостоящих приборов и специфических материалов, таких как харвестр, вакуумный насос, β-счетчик, сцинтилляционные флаконы, стекловолокнистые фильтры, а также связана с использованием вредных для организма веществ, таких как сцинтилляционная жидкость и радиоактивная метка, для работы с которыми необходимо использование вытяжного шкафа. Кроме того, для работы с радиоактивностью необходимо разрешение санэпидстанции на оборудование специального радиоактивного блока, состоящего из отдельного помещения с вытяжным шкафом, холодильником и сейфом для хранения радиоизотопов.The disadvantage of this method is the duration and complexity of its implementation, as well as the danger to the health of the performer. Namely, the assessment of CA NA is multi-stage, takes 2-3 days and requires the use of a large number of expensive instruments and specific materials, such as a harvester, vacuum pump, β-counter, scintillation bottles, fiberglass filters, and also involves the use of harmful for the body of substances such as scintillation fluid and a radioactive label, to work with which it is necessary to use a fume hood. In addition, to work with radioactivity, it is necessary to authorize the sanitary and epidemiological station to equip a special radioactive unit, which consists of a separate room with a fume hood, a refrigerator and a safe for storing radioisotopes.
Целью изобретения является упрощение способа оценки ЦА НК-лимфоцитов, а именно, уменьшение времени оценки, его стоимости и трудоемкости, а также возможность сделать его безопасным для исследователя, так как в этом случае исключается применение сцинтилляционной жидкости и радиоактивных компонентов. Отсутствие радиоактивной метки исключает также необходимость получения разрешения санэпидстанции для работы с радиоактивными веществами.The aim of the invention is to simplify the method for evaluating the CA of NK lymphocytes, namely, to reduce the evaluation time, its cost and complexity, as well as the ability to make it safe for the researcher, since in this case the use of scintillation fluid and radioactive components is excluded. The absence of a radioactive label also eliminates the need to obtain permission from a sanitary and epidemiological station to work with radioactive substances.
Это достигается тем, что, во-первых, в отличие от известного способа в предлагаемом способе в цитотоксическом тесте к мононуклеарным клеткам добавляют клетки-мишени К-562, не обработанные 3H-уридином и РНКазой. Во-вторых, для оценки ЦА НК-лимфоцитов используется вместо нескольких приборов только один прибор - автоматический счетчик и анализатор клеток, настроенный на выявление клеток, диаметр которых находится в диапазоне от 15 до 40 мкм. Это соответствует диаметру клеток-мишеней К-562, который превышает диаметр самых крупных клеток крови - моноцитов, диаметр которых не достигает 15 мкм. С помощью этого прибора оценивают уровень ЦА НК-лимфоцитов по числу клеток-мишеней К-562, недеградированных после контакта с НК-лимфоцитами. В-третьих, этап оценки цитотоксической активности НК занимает всего 10-15 минут вместо 2-3 дней при оценке известным способом. В-четвертых, предлагаемый способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов полностью исключает применение опасной для здоровья исследователя радиоактивной метки, в связи с чем исчезает необходимость оборудования специального радиоактивного блока.This is achieved by the fact that, firstly, in contrast to the known method, in the proposed method, in the cytotoxic test, K-562 target cells not treated with 3 H-uridine and RNase are added to the mononuclear cells. Secondly, to assess the CA of NK lymphocytes, only one device is used instead of several devices - an automatic counter and a cell analyzer, configured to detect cells whose diameter is in the range from 15 to 40 microns. This corresponds to the diameter of the target cells K-562, which exceeds the diameter of the largest blood cells - monocytes, whose diameter does not reach 15 microns. Using this device, the level of CA of NK lymphocytes is estimated by the number of K-562 target cells that are not degraded after contact with NK lymphocytes. Thirdly, the stage of assessing the cytotoxic activity of NK takes only 10-15 minutes instead of 2-3 days when evaluated in a known manner. Fourth, the proposed method for assessing the cytotoxic activity of NK lymphocytes completely eliminates the use of a radioactive label that is hazardous to the health of the researcher, and therefore the need for special radioactive unit equipment disappears.
Способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов по прототипу заключается в следующем.A method of evaluating the cytotoxic activity of NK lymphocytes according to the prototype is as follows.
1) Для постановки цитотоксического теста в качестве клеток-мишеней для НК лимфоцитов используют клетки миелолейкоза человека линии К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН), поддерживаемые ин витро в среде RPMI-1640 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН), с добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы Hyclone, USA) и 10% глютамина.1) For the production of a cytotoxic test, target cells for NK lymphocytes are human myeloid leukemia cells of the K-562 line (DI Ivanovsky Institute of Virology, RAMS), supported in vitro in RPMI-1640 medium (FSUE PIPVE named M .P. Chumakova RAMS), with the addition of 10% fetal serum (Defined Fetal Bovine Serum company Hyclone, USA) and 10% glutamine.
2) Перед постановкой цитотоксического теста 3 мл взвеси клеток-мишеней К-562 в концентрации 1-4×106 в 1 мл среды 199 помещают в центрифужную пробирку, добавляют 0,3 мл рабочего раствора 3Н-уридина (3 мкКи/мл, удельная радиоактивность 24 Ки/мМ, Институт молекулярной генетики РАН). Клетки помещают в термостат при 37°С на один час. По истечении этого времени клетки трижды отмывают от не включившейся в них радиоактивной метки большими объемами среды 199 с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4°С в течение 10 мин; затем разводят до концентрации 105/мл. По времени эта процедура занимает еще один час.2) Before staging a cytotoxic test, 3 ml of suspension of K-562 target cells at a concentration of 1-4 × 10 6 in 1 ml of medium 199 are placed in a centrifuge tube, 0.3 ml of working solution of 3 N-uridine (3 μCi / ml, specific radioactivity 24 Ci / mM, Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences). Cells are placed in a thermostat at 37 ° C for one hour. After this time, the cells are washed three times from the radioactive label not included in them with large volumes of 199 medium by centrifugation at 1100-1200 rpm and 4 ° C for 10 min; then diluted to a concentration of 10 5 / ml. In time, this procedure takes another hour.
3) Для деградации не включившегося в клетки-мишени К-562 3H-уридина к ним добавляют панкреатическую рибонуклеазу А (РНКазу, РЕАХИМ НПО «Биолар), которая разрезает 3'-конец неспаренных цитидиловых и уридиловых нуклеотидов, катализируя их деградацию^3) For the degradation of K-562 3 H-uridine that was not included in the target cells, pancreatic ribonuclease A (RNase, REAHIM NPO Biolar) is added to them, which cuts the 3'-end of unpaired cytidyl and uridyl nucleotides, catalyzing their degradation ^
4) Мононуклеарные клетки, в состав которых входят моноциты и общий пул лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, выделяют из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с уд. пл. 1,077, разводят их средой 199 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН) до концентрации 4×106/мл.4) Mononuclear cells, which include monocytes and a common pool of lymphocytes, 10-15% of which are NK lymphocytes, are isolated from the peripheral blood of patients in a density gradient of ficoll-verographin with beats. pl. 1,077, dilute them with medium 199 (FSUE PIPVE named after MP Chumakov RAMS) to a concentration of 4 × 10 6 / ml.
5) Постановку цитотоксического теста осуществляют в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах, у которых объем лунки составляет 0,25 мл (завод «Медполимер», Санкт-Петербург); в лунки с опытными пробами вносят 0,05 мл среды 199, 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина, затем добавляют в соотношении 20:1 0,05 мл взвеси мононуклеарных клеток и 0,1 мл обработанных 3H-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562. В лунки с контрольными пробами вместо мононуклеарных клеток добавляют 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставят в 2-х или 3-х параллелях.5) The staging of the cytotoxic test is carried out in special 96-well round-bottom polystyrene plates, in which the volume of the hole is 0.25 ml (Medpolimer plant, St. Petersburg); 0.05 ml of medium 199, 0.05 ml of complete medium 199 enriched with 10% fetal calf serum and 10% glutamine solution are added to wells with experimental samples, then 0.05 ml of mononuclear cell suspension and 0 are added in a 20: 1 ratio. 1 ml treated with 3 H-uridine and RNase target cells K-562. Instead of mononuclear cells, 0.05 ml of 199 medium is added to the wells with control samples. Each experimental and control sample is placed in 2 or 3 parallels.
6) Планшеты инкубируют в термостате в течение 16-18 часов при температуре 37°С и 5% СО2.6) The plates are incubated in a thermostat for 16-18 hours at a temperature of 37 ° C and 5% CO 2 .
7) После инкубации клетки переносят с помощью многоканального харвестера, прибора, предназначенного для сбора клеток методом фильтрации на фильтрах (Combi cell Harvester Skatron, England), и вакуумного насоса (фирма Millipore) из планшетов на специальные стекловолокнистые фильтры (Skatron, Filter Mat for 12 well Cell Harvesters, England) и отмывают натрий-фосфатным буфером от невключившейся метки.7) After incubation, the cells are transferred using a multichannel harvester, a device designed to collect cells by filtering on filters (Combi cell Harvester Skatron, England), and a vacuum pump (Millipore) from the plates onto special fiberglass filters (Skatron, Filter Mat for 12 well Cell Harvesters, England) and washed with sodium phosphate buffer from the unincorporated label.
8) Фильтры высушивают на воздухе в течение 6-18 часов, после чего помещают в сцинтилляционные флаконы (Beckman, USA). В вытяжном шкафу с помощью диспенсера (Brinkmann, Germany) наливают в каждый флакон по 3 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 (Институт монокристалл, Украина) и оставляют еще на 6-18 часов для выхода β-частиц в сцинтилляционную жидкость.8) The filters are dried in air for 6-18 hours, after which they are placed in scintillation vials (Beckman, USA). In a fume hood, using a dispenser (Brinkmann, Germany), 3 ml of ZhS-8 scintillation liquid (Monocrystal Institute, Ukraine) is poured into each vial and left for another 6-18 hours for β-particles to enter the scintillation liquid.
9) После этого сцинтилляционные флаконы помещают в жидкостной сцинтилляционный счетчик β-частиц (MicroBeta trilux, PerkinElmer Inc.) и подсчитывают число радиоактивных импульсов в каждом флаконе.9) After that, the scintillation vials are placed in a liquid β-particle scintillation counter (MicroBeta trilux, PerkinElmer Inc.) and the number of radioactive pulses in each vial is counted.
10) В формулу для расчета цитотоксической активности НК-лимфоцитов вносят значения радиоактивности, полученные во флаконах с опытными и контрольными образцами, и выражают результат в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в %, который рассчитывают по формуле:10) In the formula for calculating the cytotoxic activity of NK lymphocytes, the radioactivity values obtained in bottles with experimental and control samples are added, and the result is expressed as a cytotoxicity index (IC) in%, which is calculated by the formula:
Предлагаемый способ. Оценку цитотоксической активности НК-лимфоцитов на автоматическом счетчике и анализаторе клеток с помощью подсчета числа недеградированных после контакта с НК клеток-мишеней К-562, осуществляли следующим образом.The proposed method. Evaluation of the cytotoxic activity of NK lymphocytes on an automatic cell counter and analyzer by counting the number of K-562 target cells not degraded after contact with NK was carried out as follows.
1) Для постановки цитотоксического теста в качестве клеток-мишеней для НК-лимфоцитов использовали клетки миелолейкоза человека линии К-562 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН), поддерживаемые ин витро на среде RPMI-1640 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН), с добавлением 10% фетальной сыворотки (Defined Fetal Bovine Serum фирмы Hyclone, USA) и 10% глютамина.1) For the production of a cytotoxic test, target cells for NK lymphocytes were human myeloid leukemia cells of the K-562 line (DI Ivanovsky Institute of Virology, RAMS) supported in vitro on RPMI-1640 medium (FSUE PIPVE named after MP Chumakova RAMS), with the addition of 10% fetal serum (Defined Fetal Bovine Serum company Hyclone, USA) and 10% glutamine.
2) Клетки-мишени перед постановкой цитотоксического теста не метили Н-уридином, вследствие чего исчезала необходимость обработки их РНКазой; отмывали один раз большим количеством среды 199 (ФГУП «ПИПВЭ имени М.П. Чумакова РАМН) с помощью центрифугирования при 1100-1200 об/мин и 4°С в течение 10 мин и разводили до концентрации 1х10 /мл средой 199.2) The target cells were not labeled with N-uridine before staging the cytotoxic test, and as a result, the need to treat them with RNase disappeared; washed once with a large amount of medium 199 (FSUE PIPVE named after MP Chumakov RAMS) by centrifugation at 1100-1200 rpm and 4 ° C for 10 min and diluted to a concentration of 1x10 / ml with medium 199.
3) Мононуклеарные клетки, в состав которых входили моноциты и общий пул лимфоцитов, 10-15% от которого составляют НК-лимфоциты, выделяли из периферической крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с уд. пл. 1,077, разводили средой 199 до концентрации 4×106/мл.3) Mononuclear cells, which included monocytes and a common pool of lymphocytes, 10-15% of which are NK lymphocytes, were isolated from the peripheral blood of patients in a density gradient of ficoll-verographin with beats. pl. 1,077, was diluted with medium 199 to a concentration of 4 × 10 6 / ml.
4) Постановку цитотоксического теста осуществляли в специальных 96-луночных круглодонных полистироловых планшетах с объемом лунки 0,25 мл (завод «Медполимер», Санкт-Петербург). В лунки с опытными пробами к 0,05 мл среды 199 добавляли 0,05 мл полной среды 199, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 10% раствором глютамина; затем в соотношении 20:1 добавляли 0,05 мл взвеси мононуклеарных клеток и 0,1 мл не обработанных 3H-уридином и РНКазой клеток-мишеней К-562. В лунки с контрольными пробами вместо мононуклеарных клеток добавляли 0,05 мл среды 199. Каждую опытную и контрольную пробы ставили в 2-х или 3-х параллелях.4) The cytotoxic test was carried out in special 96-well round-bottom polystyrene plates with a volume of 0.25 ml (Medpolimer plant, St. Petersburg). 0.05 ml of complete medium 199 enriched with 10% fetal calf serum and 10% glutamine solution was added to the wells with experimental samples to 0.05 ml of medium 199; then, 0.05 ml of a suspension of mononuclear cells and 0.1 ml of untreated 3 H-uridine and RNase K-562 target cells were added in a 20: 1 ratio. Instead of mononuclear cells, 0.05 ml of 199 medium was added to the wells with control samples. Each experimental and control sample was placed in 2 or 3 parallels.
5) Планшеты инкубировали в термостате в течение 16-18 часов при температуре 37°С и 5% СО2.5) The plates were incubated in a thermostat for 16-18 hours at a temperature of 37 ° C and 5% CO 2 .
6) После инкубации содержимое лунок двух или трех параллелей каждой пробы с помощью автоматической пипетки переносили из планшета для культивирования в пластиковые пробирки типа "Ependorf" и тщательно перемешивали.6) After incubation, the contents of the wells of two or three parallels of each sample were transferred using an automatic pipette from the culture plate into Ependorf plastic tubes and mixed thoroughly.
7) Из каждой пробирки отбирали 100 мкл клеточной взвеси и разводили в 10 мл жидкости для разведения проб в специальных акуветах объемом 20 мл (акуветы и жидкость для разведения проб поставляются с прибором).7) 100 μl of cell suspension was taken from each tube and diluted in 10 ml of sample dilution liquid in special 20 ml aquuets (aquuets and sample dilution liquid are supplied with the device).
8) Акуветы помещали в автоматический счетчик и анализатор клеток (Beckman Coulter, USA), с помощью которого подсчитывали число недеградированных после контакта с НК-лимфоцитами клеток-мишеней К-562.8) Akuvet was placed in an automatic cell counter and analyzer (Beckman Coulter, USA), with the help of which the number of K-562 target cells not degraded after contact with NK lymphocytes was counted.
9) При анализе подсчитанных клеток учитывали только те клетки, диаметр которых находился в диапазоне от 15 до 40 мкм. Так как диаметр самых крупных мононуклеарных клеток крови, а именно моноцитов, не более 15 мкм, а диаметр клеток-мишеней К-562 более 15 мкм, то клетки, подсчитанные на приборе в диапазоне от 15 до 40 мкм, относили именно к клеткам К-562.9) When analyzing the counted cells, only those cells whose diameter was in the range from 15 to 40 μm were taken into account. Since the diameter of the largest mononuclear blood cells, namely monocytes, is not more than 15 μm, and the diameter of the K-562 target cells is more than 15 μm, the cells counted on the device in the range from 15 to 40 μm were assigned specifically to K- cells 562.
10) В формулу для расчета ЦА НК вносили значения, полученные на приборе, то есть, число клеток-мишеней в пробах с опытными и контрольными образцами, и выражали результат также в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в %, который рассчитывали по формуле:10) The values obtained on the instrument, that is, the number of target cells in the samples with experimental and control samples, were entered into the formula for calculating the CA of NK, and the result was also expressed as the cytotoxicity index (IC) in%, which was calculated by the formula:
Процедура оценки ЦА НК на приборе является менее трудоемкой, экономичной и безопасной для здоровья исследователя, так как занимает по продолжительности 10-15 минут, не требует применения большого количества приборов, радиоактивных веществ и сцинтилляционной жидкости, как в прототипе.The procedure for assessing CA NA on the device is less time-consuming, economical and safe for the health of the researcher, since it takes 10-15 minutes, does not require the use of a large number of devices, radioactive substances and scintillation fluid, as in the prototype.
Субъекты и параметры исследований.Subjects and research parameters.
У 16 больных шизофренией с первым приступом эндогенного психоза в возрасте от 18 до 25 лет (средний возраст - 20,8±0,4) проводили сравнительный анализ двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов: по измерению уровня 3H-уридина в клетках-мишенях К-562, то есть по прототипу, и по числу клеток-мишеней К-562, как в предлагаемом способе. Всех больных обследовали один раз до назначения им психотропной терапии. Исследования проводили на мононуклеарных клетках, выделенных из периферической венозной крови больных в градиенте плотности фиколл-верографина с плотностью 1,077 и состоящих из моноцитов и пула лимфоцитов, 10-15% от которых составляют НК-лимфоциты.In 16 patients with schizophrenia with the first attack of endogenous psychosis aged 18 to 25 years (average age - 20.8 ± 0.4), a comparative analysis of two methods for assessing the cytotoxic activity of NK lymphocytes was carried out: by measuring the level of 3 H-uridine in the cells targets K-562, that is, the prototype, and the number of target cells K-562, as in the proposed method. All patients were examined once before prescribing psychotropic therapy. Studies were performed on mononuclear cells isolated from peripheral venous blood of patients in a density gradient of ficoll-verographin with a density of 1.077 and consisting of monocytes and a pool of lymphocytes, 10-15% of which are NK lymphocytes.
Поскольку оба способа оценки ЦА НК-лимфоцитов связаны с клетками-мишенями К-562, оставшимися недеградированными в результате цитолитического действия на них НК-лимфоцитов, целью исследования было продемонстрировать, что результаты, полученные с помощью предлагаемого способа, аналогичны результатам, полученным с помощью известного способа. Для подтверждения идентичности полученных результатов цитотоксический тест при обоих способах оценки ЦА НК-лимфоцитов ставили в разных вариантах: в культуре клеток в общей группе больных и в подгруппах больных с низким и высоким уровнем активности НК; в культуре клеток без моноцитов, которые удаляли с помощью адгезии в пластиковых чашках в течение одного часа при 37°С и 5% СО2; в культуре клеток с добавлением серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М.Since both methods for assessing the CA of NK lymphocytes are associated with K-562 target cells remaining undegraded as a result of the cytolytic effect of NK lymphocytes on them, the aim of the study was to demonstrate that the results obtained using the proposed method are similar to those obtained using the known way. To confirm the identity of the results obtained, the cytotoxic test with both methods for assessing the CA of NK lymphocytes was set in different ways: in cell culture in the general group of patients and in subgroups of patients with low and high levels of NK activity; in cell culture without monocytes, which were removed by adhesion in plastic cups for one hour at 37 ° C and 5% CO 2 ; in cell culture with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 and 10 -7 M.
Статистические вычисленияStatistical Computing
Все статистические исследования проводили, используя StatSoft (USA), версию 6. При сравнении различных групп использовали критерий U Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Spearman Rank R.All statistical studies were performed using StatSoft (USA), version 6. When comparing different groups, the U Mann-Whitney test was used. Correlation analysis was performed using Spearman Rank R.
Примеры.Examples.
Пример 1 (по прототипу).Example 1 (prototype).
Пример 2 (предлагаемый способ).Example 2 (the proposed method).
Пример 3.Example 3
Аналогично примерам 1 и 2, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток больных в общей группе.Similarly to examples 1 and 2, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 M before suspension of the cytotoxic test to suspension of target cells K-562 and mononuclear cells of patients in the general group.
Пример 4Example 4
Аналогично примерам 1 и 2, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток больных в общей группе.Similarly to examples 1 and 2, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -7 M before suspension of the cytotoxic test to suspension of target cells K-562 and mononuclear cells of patients in the general group.
Пример 5Example 5
Аналогично примерам 1 и 2, но с удалением моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток больных в общей группе перед постановкой цитотоксического теста.Similarly to examples 1 and 2, but with the removal of monocytes from the suspension of mononuclear cells of patients in the general group before staging a cytotoxic test.
Пример 6Example 6
Аналогично примерам 1 и 2, но с оценкой ЦА НК в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.Similarly to examples 1 and 2, but with an assessment of CA NK in a subgroup of patients with a high level of CA NK.
Пример 7Example 7
Аналогично примеру 6, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.Analogously to example 6, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 M before suspension of the cytotoxic test to suspend K-562 target cells and mononuclear cells in a subgroup of patients with high levels of CA NK.
Пример 8Example 8
Аналогично примеру 6, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с высоким уровнем ЦА НК.Analogously to example 6, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -7 M before suspension of the cytotoxic test, to suspend K-562 target cells and mononuclear cells in a subgroup of patients with high levels of CA NK.
Пример 9Example 9
Аналогично примерам 1 и 2, но с оценкой ЦА НК в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.Similarly to examples 1 and 2, but with an assessment of CA NK in a subgroup of patients with a low level of CA NK.
Пример 10Example 10
Аналогично примеру 9, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.Analogously to example 9, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 M before suspension of the cytotoxic test, to suspend K-562 target cells and mononuclear cells in a subgroup of patients with low CA NK.
Пример 11Example 11
Аналогично примеру 9, но с добавлением перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-7 М к взвеси клеток-мишеней К-562 и мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.Analogously to example 9, but with the addition of serotonin at a concentration of 10 -7 M before suspension of the cytotoxic test, to suspend K-562 target cells and mononuclear cells in a subgroup of patients with low CA CA.
Пример 12Example 12
Аналогично примеру 9, но с удалением перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток в подгруппе больных с низким уровнем ЦА НК.Analogously to example 9, but with the removal of monocytes from a suspension of mononuclear cells in a subgroup of patients with a low level of CA NK before staging a cytotoxic test.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
В таблице 1 представлены данные сравнительного анализа двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов в общей группе больных. Можно видеть, что значения уровня цитотоксической активности НК, определяемого радиоактивным способом, как в примере 1, и подсчетом числа клеток-мишеней К-562 на анализаторе, как в примере 2, представляют собой практически одинаковые величины. При статистической обработке результатов эти данные были полностью подтверждены, то есть значимые различия между средними значениями определяемых показателей обнаружены не были (p>0,05). Подтверждением правильности полученных результатов служило выявление статистически значимых позитивных корреляций между уровнем цитотоксической активности НК-лимфоцитов, определяемым в недеградированных мишенях К-562 радиоактивным способом, с одной стороны, и их числом (Spearman r=0,6; p<0,05), с другой стороны.Table 1 presents the data of a comparative analysis of two methods for assessing the cytotoxic activity of NK lymphocytes in the general group of patients. You can see that the values of the level of cytotoxic activity of NK, determined by the radioactive method, as in example 1, and counting the number of target cells K-562 on the analyzer, as in example 2, are almost the same values. During statistical processing of the results, these data were fully confirmed, that is, significant differences between the average values of the determined indicators were not found (p> 0.05). Confirmation of the correctness of the results was the identification of statistically significant positive correlations between the level of cytotoxic activity of NK lymphocytes, determined in non-degraded K-562 targets by the radioactive method, on the one hand, and their number (Spearman r = 0.6; p <0.05), on the other hand.
В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа двух способов оценки цитотоксической активности НК в общей группе больных с добавлением в культуры клеток перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М и удалением перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток. Из таблицы видно, что значения ЦА НК-лимфоцитов, определяемой по уровню радиоактивности в недеградированных клетках-мишенях К-562 на β-счетчике и подсчетом их числа на анализаторе, практически одинаковы во всех вариантах постановки цитотоксического теста. Статистическая обработка результатов полностью подтвердила эти данные, то есть значимые различия между средними значениями определяемых показателей выявлены не были (p>0,05). Корреляционный анализ также подтвердил схожесть результатов, полученных с помощью оценки ЦА НК радиоактивным способом и на анализаторе в разных вариантах постановки цитотоксического теста. А именно, был выявлен высокий уровень позитивной корреляционной связи между результатами, полученными двумя способами в культурах клеток с добавлением серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М (Spearman r=0,81; p<0,001) и с удалением из взвеси мононуклеарных клеток моноцитов (r=0,95; p<0,001).Table 2 presents the data of a comparative analysis of two methods for assessing the cytotoxic activity of NK in the general group of patients with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 and 10 -7 M before removal of monocytes from the suspension of mononuclear cells before staging the cytotoxic test. The table shows that the values of CA of NK lymphocytes, determined by the level of radioactivity in non-degraded target cells K-562 on the β-counter and counting their number on the analyzer, are almost identical in all variants of the cytotoxic test. Statistical processing of the results fully confirmed these data, that is, significant differences between the average values of the determined indicators were not revealed (p> 0.05). Correlation analysis also confirmed the similarity of the results obtained by assessing the CA of the NK by the radioactive method and on the analyzer in different versions of the cytotoxic test. Namely, a high level of positive correlation was found between the results obtained by the two methods in cell cultures with the addition of serotonin at a concentration of 10 -6 and 10 -7 M (Spearman r = 0.81; p <0.001) and with the removal of mononuclear from the suspension monocyte cells (r = 0.95; p <0.001).
В Таблице 3 представлены результаты сравнительного анализа двух способов оценки ЦА НК-лимфоцитов в подгруппах больных с высоким и низким уровнем этой активности, а также при добавлении перед постановкой цитотоксического теста серотонина в концентрации 10-6 и 10-7 М в культуры клеток больных в каждой подгруппе и удалении перед постановкой цитотоксического теста моноцитов из взвеси мононуклеарных клеток больных с низким уровнем ЦА НК. Из таблицы видно, что значения уровня ЦА НК-лимфоцитов, определяемого радиоактивным способом на β-счетчике и подсчетом их числа на анализаторе, практически одинаковы во всех вариантах постановки цитотоксического теста. Статистическая обработка результатов также подтвердила эти данные, то есть значимые различия между средними значениями показателей, определяемых радиоактивным способом и на анализаторе, в разных вариантах постановки цитотоксического теста выявлены не были (p>0,05). При этом выявлялся высокий уровень позитивных корреляционных связей между значениями цитотоксической активности НК, полученными с помощью оценки по уровню 3H-уридина в недеградированных мишенях и на анализаторе по числу оставшихся мишеней (Spearman r=0,81; p<0,001).Table 3 presents the results of a comparative analysis of two methods for assessing the CA of NK lymphocytes in subgroups of patients with high and low levels of this activity, as well as when serotonin at a concentration of 10 -6 and 10 -7 M is added to the cell cultures of patients in each a subgroup and removal of monocytes from a suspension of mononuclear cells of patients with a low level of CA NK before staging a cytotoxic test of monocytes. The table shows that the values of the level of CA of NK lymphocytes, determined by the radioactive method on the β-counter and counting their number on the analyzer, are almost the same in all versions of the cytotoxic test. Statistical processing of the results also confirmed these data, that is, significant differences between the average values of the indicators determined by the radioactive method and on the analyzer were not detected in different versions of the cytotoxic test (p> 0.05). At the same time, a high level of positive correlation was found between the values of the cytotoxic activity of NK obtained by assessing the level of 3 H-uridine in undegraded targets and on the analyzer by the number of remaining targets (Spearman r = 0.81; p <0.001).
Таким образом, предложен новый безопасный и экономичный по времени и по затратам способ оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов. Сравнительный анализ двух способов оценки цитотоксической активности НК-лимфоцитов в общей группе больных с помощью подсчета уровня радиоактивности в недеградированных клетках-мишенях К-562 и подсчета их числа на автоматическом счетчике и анализаторе клеток выявил полную идентичность полученных результатов, которая подтверждалась во всех вариантах постановки цитотоксического теста. При этом предлагаемый способ является более простым и коротким в исполнении, так как требует использования всего одного прибора вместо нескольких и занимает по времени 10-15 минут против 2-х-3-х дней, необходимых для оценки цитотоксической активности НК радиоактивным способом. Важным преимуществом предлагаемого способа оценки является также безопасность для здоровья исследователя, так как ее проведение не требует использования радиоактивной метки и сцинтилляционной жидкости. Известно, что НК-лимфоциты являются первой линией защиты организма человека и животных от разного рода чужеродных воздействий, к которым относятся инфекционные агенты и собственные трансформированные клетки. Основываясь на этом, можно предположить, что использование простого и безопасного способа оценки ЦА НК-лимфоцитов найдет широкое применение в качестве тест-системы для выявления снижения активности этого важного звена естественного иммунитета у больных с психопатологической симптоматикой и различными соматическими заболеваниями, в первую очередь злокачественными новообразованиями и заболеваниями инфекционной природы, а также при проведении скрининговых обследований с целью выявления среди населения групп людей с риском развития этих заболеваний.Thus, a new safe and economical time and cost method for assessing the cytotoxic activity of NK lymphocytes has been proposed. A comparative analysis of two methods for assessing the cytotoxic activity of NK lymphocytes in the general group of patients by counting the level of radioactivity in non-degraded K-562 target cells and counting their numbers on an automatic counter and cell analyzer revealed the complete identity of the results, which was confirmed in all variants of cytotoxic test. Moreover, the proposed method is simpler and shorter in execution, since it requires the use of only one device instead of several and takes 10-15 minutes against the 2-3 days required to evaluate the cytotoxic activity of NK in a radioactive manner. An important advantage of the proposed evaluation method is also the health safety of the researcher, since its implementation does not require the use of a radioactive label and scintillation fluid. It is known that NK lymphocytes are the first line of defense of the human body and animals from all sorts of foreign influences, which include infectious agents and their own transformed cells. Based on this, it can be assumed that the use of a simple and safe method for assessing the CA of NK lymphocytes will be widely used as a test system to detect a decrease in the activity of this important link of natural immunity in patients with psychopathological symptoms and various somatic diseases, primarily malignant neoplasms and diseases of an infectious nature, as well as when conducting screening tests to identify groups of people at risk of development among the population silent disease.
10-6 МWith the addition of serotonin in concentration
10 -6 M
10-7 МWith the addition of serotonin in concentration
10 -7 M
10-6 МWith the addition of serotonin in concentration
10 -6 M
10-7 МWith the addition of serotonin in concentration
10 -7 M
Claims (1)
A method for assessing the cytotoxic activity of natural killer lymphocytes is carried out on K-562 target cells that remain undegraded after contact with NK lymphocytes, including the isolation of NK lymphocytes in mononuclear cells from the peripheral blood of patients, staging a cytotoxic test based on incubation of NK lymphocytes and K-562 target cells, characterized in that K-562 target cells are used that do not label 3 with H-uridine, and the cytotoxic activity of NK lymphocytes is evaluated by counting the number of remaining undegraded target cells on an automatic cell counter and analyzer configured to detect cells with a diameter of 15 to 40 μm, after which the cytotoxicity index (IC) is calculated, in%, according to the formula:
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012123342/15A RU2514019C2 (en) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012123342/15A RU2514019C2 (en) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012123342A RU2012123342A (en) | 2013-12-20 |
RU2514019C2 true RU2514019C2 (en) | 2014-04-27 |
Family
ID=49784360
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012123342/15A RU2514019C2 (en) | 2012-06-06 | 2012-06-06 | Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2514019C2 (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2632109C1 (en) * | 2016-07-11 | 2017-10-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" | Method for nk-cells cytotoxic activity determination |
RU2753693C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-08-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук | Method for identifying increased cell-mediated cytotoxicity of lymphocytes in people in arctic conditions |
RU2811001C1 (en) * | 2023-06-23 | 2024-01-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН | Method of predicting effector failure of cytotoxic cells by increasing concentrations of scd54, scd56, scd71 molecules in the blood |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1455317A1 (en) * | 1986-06-11 | 1989-01-30 | 2-й Московский государственный медицинский институт им.Н.И.Пирогова | Method of differential diagnosis of truncal and hemispheric ischemic insult in cerebral blood circulation disorders |
SU1727078A1 (en) * | 1990-05-15 | 1992-04-15 | Институт иммунологии | Method of killer activity determination |
RU2109288C1 (en) * | 1994-09-13 | 1998-04-20 | Войсковая часть 20914 | Method to determine natural killer activity of human lymphocytes under hyperbaric conditions |
RU2208786C1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия | Method determining spontaneous cell cytotoxicity |
JP4712289B2 (en) * | 2003-08-26 | 2011-06-29 | 株式会社エイ・エル・エイ | Immune promoting composition |
-
2012
- 2012-06-06 RU RU2012123342/15A patent/RU2514019C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1455317A1 (en) * | 1986-06-11 | 1989-01-30 | 2-й Московский государственный медицинский институт им.Н.И.Пирогова | Method of differential diagnosis of truncal and hemispheric ischemic insult in cerebral blood circulation disorders |
SU1727078A1 (en) * | 1990-05-15 | 1992-04-15 | Институт иммунологии | Method of killer activity determination |
RU2109288C1 (en) * | 1994-09-13 | 1998-04-20 | Войсковая часть 20914 | Method to determine natural killer activity of human lymphocytes under hyperbaric conditions |
RU2208786C1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия | Method determining spontaneous cell cytotoxicity |
JP4712289B2 (en) * | 2003-08-26 | 2011-06-29 | 株式会社エイ・エル・エイ | Immune promoting composition |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DITTAMI GM, et al Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter // J Vis Exp. 2012 Jun 21;(64). Abstract, Найдено из Интернета 21.03.2013 на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22760092 * |
РЫКОВА М.П. и др. Иммунология, 1981; 3: 88-90. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2632109C1 (en) * | 2016-07-11 | 2017-10-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" | Method for nk-cells cytotoxic activity determination |
RU2753693C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-08-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук | Method for identifying increased cell-mediated cytotoxicity of lymphocytes in people in arctic conditions |
RU2811001C1 (en) * | 2023-06-23 | 2024-01-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН | Method of predicting effector failure of cytotoxic cells by increasing concentrations of scd54, scd56, scd71 molecules in the blood |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012123342A (en) | 2013-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Evans | Cytological methods for detecting chemical mutagens | |
Koryakina et al. | Cryopreservation of human monocytes for pharmacopeial monocyte activation test | |
Funk et al. | Transfusion-transmitted bacterial infections–haemovigilance data of German blood establishments (1997–2010) | |
Cringoli et al. | Ancylostoma caninum: calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs | |
CN108845129B (en) | Application of biomarker of active tuberculosis diseases | |
RU2514019C2 (en) | Method of evaluating cytotoxic activity of lymphocytes of natural killers | |
Guo et al. | Inflammasome assays in vitro and in mouse models | |
JP6822769B2 (en) | Regularly arranged spheroids of the same size and their use | |
RU2289816C1 (en) | Method for determination of functional activity of phagocytes (faf) | |
Abreu Sousa et al. | Haematological and biochemical parameters of wild capuchin monkeys in Brasília, Federal District—Brazil | |
und akutem renalen Nierenversagen | Equine piroplasmosis–a case of severe Babesia caballi infection associated with acute renal failure | |
Ehimiyein et al. | Efficacy of a direct rapid immunohistochemical test (DRIT) for rabies detection in Nigeria | |
RU2360969C1 (en) | Method of erythrocyte analysis for bacteria fixing activity | |
RU2362997C2 (en) | Way of revealing disturbance of function of phagocytes at development of relapsing infectious processes | |
Yusuf et al. | Assessment of DNA damage in medical radiation workers using the alkaline comet assay and the chromosome aberration | |
Wardhana et al. | Correlation between hemolysis index and storage period to potassium levels of Packed Red Cell in Sanglah General Hospital, Bali, Indonesia | |
Petzoldt et al. | A rapid quantitative method based on motility of bull sperm cells for in vitro toxicity testing of biomaterials | |
Knudsen | Risk assessment for biological agents in the laboratory | |
Marini et al. | Oral CBD treatment is associated to an anti-inflammatory gene expression signature in myeloid cells of people living with HIV | |
Wee et al. | Diminished mixed lymphocyte response in ankylosing spondylitis | |
Rodríguez et al. | Human Polymorphonuclear Neutrophil Phenotypes Generated in vitro | |
RU2415423C2 (en) | Method for determining neutrophil capacity by nitroblue tetrazolium reduction reaction | |
Hans | Immune cell profiling in COVID-19 recovered patients using mass cytometry | |
Ali | Normal reference values of some hematological parameters among adult sudanese people in elmatama locality | |
GACHIE | HAEMATOLOGICAL REFERENCE INTERVALS FOR ADOLESCENTS AND ADULTS IN NAKURU COUNTY, KENYA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170607 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200114 |