RU2509809C2 - Способы лечения и диагностики рака - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам прогнозирования течения рака, и может быть использовано в медицине. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком NSCLC, включает определение уровней экспрессии ChoK бета или ChoK бета и ChoK альфа в образце от указанного пациента. При этом пониженные уровни ChoK бета относительно уровней в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз. Пониженные уровни ChoK альфа и высокие уровни ChoK бета относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует хороший прогноз. Изобретение позволяет прогнозировать вероятность выживания, например выживания без рецидивов, пациента с NSCLC. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 3 пр.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к лечению рака и, в частности, лечению рака, основанного на введении активности холинкиназы-бета (здесь далее ChoKβ), а также способам разработки персонализированных методов лечения и определения реакции на агент, способный индуцировать холинкиназу-бета (здесь далее ChoKβ), с целью лечения рака, а также способам определения прогноза для пациента на основании определения уровней экспрессии ChoKβ, а также на основании определения соотношения уровней экспрессии ChoKβ и ChoKα. Наконец, изобретение относится к способам определения реакции пациента, который страдает раком, на ингибирующие ChoKα агенты на основании определения уровней экспрессии PEMT и/или ChoKβ.

Предпосылки создания изобретения

Холинкиназа (ChoK) является первым ферментом на так называемом пути Кеннеди биосинтеза фосфатидилхолина (PC), который представляет собой главный липид мембран эукариотических клеток. В частности, ChoK катализирует реакцию трансформации холина (Cho) в фосфохолин (PCho) с использованием молекулы АТФ и Mg²⁺ в качестве кофактора. Путь Кеннеди продолжается при действии фермента на PCho CDP-фосфохолинцитидилтрансферазы (CT), давая CDP-холин, и затем DAG-холинфосфотрансферазы (CPT), давая в результате PC (фиг.3). Хотя активность ChoK формирует первую стадию в синтезе PC, считается, что лимитирующей или регулирующей стадией биосинтеза PC является стадия, катализируемая посредством CT.

Аминокислотная последовательность, образующая домены холинкиназы, хорошо сохраняется во всех эукариотических организмах, например гомология между мышиными и человеческими генами составляет 85-88%. У млекопитающих семейство холинкиназы кодировано в двух разных генах: CHKA и CHKB, расположенных у людей в хромосомах 11q13.2 и 23q13.33 соответственно (Ensembl Genome Browser v48, gene view: http://www.ensembl.org/). Вследствие их высокой гомологии предполагают их появление в результате процесса дупликации генов и последующей дивергенции от общего прототипа. Экспрессия этих генов дает трансляцию трех белков доменом холин/этаноламинкиназа: ChoKα1, ChoKα2 и ChoKβ1 (обозначенных как ChoK-подобные). Альфа-изоформа имеет два варианта, генерируемые посредством альтернативного сплайсинга первичной мРНК: ChoKα1 из 457 аминокислот (ак) и ChoKα2 (439 ак), от которой она отличается только 18 ак в N-концевой области. Бета-изоформа также имеет два различных варианта с альтернативным сплайсингом, только один из которых, ChoKβ1, обладает киназной активностью. ChoKβ1 имеет 395 ак и отличается от альфа-изоформы примерно 40% своей последовательности (Aoyama at al., 2004) (фиг.4). Наконец, сдвиг рамки считывания в транскрипте ChoKβ дает появление ChoKβ2, более короткого белка (127 ак), у которого отсутствует домен холин/этаноламинкиназа и который отличается от варианта 1 по его C-концу. Неизвестно, какую роль может играть этот вариант, однако идентифицирован мышиный вариант из 164 ак с аналогичными характеристиками, обозначенный как ChoKα3.

Кроме своей роли в липидном метаболизме, имеется важный признак, который указывает, что ChoK вовлечена в канцерогенез. Первый признак того, что ChoK может играть важную роль в канцерогенезе, возникает из наблюдения, что во время трансформации клеток, опосредованной онкогеном RAS, происходит повышение PCho. Позже было продемонстрировано, что причиной повышения PCho является повышение активности ChoK (Ramirez de Molina at al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 285: 873-879), опосредованной двумя из наиболее известных эффекторов онкогена RAS, PI3K и Ral-GDS (Ramirez de Molina at al., 2002, Oncogene 21: 937-946). Описано также продуцирование PCho как существенный процесс при росте клеток, индуцированный ростом факторов в мышиных фибробластах и в различных системах человеческих клеток, в которых в результате обработки ChoK-специфическими лекарственными средствами происходит блокирование синтеза ДНК, индуцированного различными факторами, такими как EGF, PDGF или HRG.

ChoK чрезмерно экспрессируется в большом количестве клеточных линий, выделяемых из опухолей человека, а также в различных тканях опухолей молочной железы, легкого, толстой кишки, мочевого пузыря и предстательной железы человека (Nakagami at al., 1999, Jpn. J. Cancer Res 90: 419-424; Ramirez de Molina at al., 2002, Oncogene 21: 4317-4322; Ramirez de Molina at al., 2002, Biochem Biophys. Res. Commun. 296: 580-583). Такие типы опухолей представляют более 70% от общего числа случаев рака в развитых странах. Биохимические данные показывают активацию фермента в большом количестве случаев с ускорением повышения уровня ChoK при опухолевых состояниях на транскрипционном и посттрансляционном уровнях (Ramirez de Molina at al., 2002). Степень чрезмерной экспрессии или чрезмерной активности ChoK в опухолях таких типов обычно очень высока, составляя от 40 до 60% (Ramirez de Molina at al., 2004, Cancer Res 64: 6732-6739; Ramirez de Molina at al., 2002, Biochem Biophys Res Commun 296: 580-583). В случаях, которые анализировались, выделяется связь между активацией ChoKα и степенью злокачественности (Ramirez de Molina at al., 2002, Онкоген 21: 4317-4322). В заключение, недавно было проведено исследование на 167 образцах от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), которое показало, что пациенты, опухоли которых демонстрируют высокую экспрессию ChoKα, имеют значительно худший прогноз развития заболевания, что может иметь важные клинические последствия (Ramirez de Molina at al., 2007, Lancet Oncol 8: 889-897). Все эти исследования были проведены для α-изоформы.

Существенный признак демонстрирует изменение ChoK в канцерогенном процессе, указывая этот фермент в качестве мишени для разработки противоопухолевой стратегии, основанной на специфическом ингибировании его активности. Прежде всего, различные in vitro исследования в клетках, трансформированных онкогенами, демонстрируют существование высокой корреляции между ингибированием фермента и ингибированием клеточной пролиферации, при этом без летальности, связанной с приемом хемихолиния-3 (Campos at al., 2000, Bioorg Med Chem Lett 10: 767-770; Cuadrado at al., 1993, Oncogene 8: 2959-2968; HeRNAndez-Alcoceba at al., 1997, Cancer Res 59: 3112-3118; Jimenez at al., 1995, J Cell Biochem 57: 141-149). Также успешно проведены in vivo исследования ингибирования клеточного роста в ксенотрансплантатах опухолевых клеток эпидермоидной карциномы, аденокарциномы толстой кишки и аденокарциномы молочной железы человека, генерированных у безтимусных мышей (HeRNAndez-Alcoceba at al., 1999, Cancer Res 59: 3112-3118; Lacal, 2001, IDrugs 4: 419-426; Ramirez de Molina at al., 2004, Cancer Res 64: 6732-6739). В заключение, продемонстрирована in vivo специфичность MN58b относительно ChoK-мишени в ксенотрансплантатах раковых клеток молочной железы и толстой кишки посредством ЯМР, причем определено, что после противоопухолевой обработки посредством MN58b затрагиваются только уровни PCho, но не других фосфомоноэфиров (Al-Saffar at al., 2006, Cancer Res 66: 427-434).

Тем не менее, несмотря на глубокие знания механизмов действия ингибиторов ChoKα все еще неизвестно, можно ли применять ChoKβ в качестве мишени для разработки противоопухолевых лекарственных средств или можно ли применять указанный фермент в качестве биомаркера для реакции на противоопухолевые лекарственных средства или для прогнозирования в случае пациентов, страдающих раком.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающего определение уровней экспрессии ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKβ относительно уровней в эталонном образце указывают, что пациент демонстрирует плохой прогноз.

Во втором аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающего определение уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKα и высокие уровни ChoKβ относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют, что пациент демонстрирует хороший прогноз.

В третьем аспекте изобретение относится к способу определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα, включающего определение в образце от указанного пациента уровней экспрессии белка, выбранного из группы: PEMT и ChoKβ, в котором повышение уровней экспрессии PEMT или повышение уровней экспрессии ChoKβ относительно уровней в эталонном образце указывают на хорошую реакцию на ингибитор ChoKα.

В конечном аспекте изобретение относится к агенту, индуцирующему активность ChoKβ, с целью его применения при лечении рака.

Описание фигур

Фиг.1. мРНК-уровни ChoKα повышены в опухолевых линиях, тогда как для ChoKβ они неизменны или понижены. Результаты количественной PCR для ChoKα (серый) и ChoKβ (белый) в опухолевых линиях человека: A) легкого, B) мочевого пузыря и C) молочной железы. мРНК-уровни опухолевых линий сравнивают с нормальной эпителиальной линией того же происхождения способом 2^-ΔCt. Используемый для нормировки эндогенный ген представляет собой 18S.

Фиг.2. Пример экспрессии генов изоформ ChoKα и ChoKβ в образцах от пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого. Уровни экспрессии мРНК для ChoKα (A) или ChoKβ (B) в образцах опухоли легкого по сравнению с коммерческой нормальной тканью легкого, полученные с применением способа 2^-ΔCt. Результаты соответствуют Log10RQ (относительное количество) α или β изоформ относительно экспрессии эндогенного гена (18S). В каждом случае в первой колонке показана экспрессия для нормальной ткани.

Фиг.3. Индуцирование апоптоза в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW70 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 0 час, 24 час и 48 час и для контроля такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени. Клеточные экстракты этих линий разделяют посредством PAGE-SDS и переносят на нитроцеллюлозную мембрану для их иммунодетектирования антителами. Показаны примеры фотографий как результат иммунодетектирования на различных клеточных линиях: A) PARP и B) Caspase 3, деградация которых является показателем апоптоза. GAPDH используют в качестве контроля нагрузки.

Фиг.4. Повышение транскрипции ChoKβ в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW70 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 24 час и 48 час и для контроля такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени. Затем экстрагируют всю РНК из указанных клеток и проводят количественную PCR. В ответ на лекарственное средство получают повышение уровней мРНК ChoKβ во всех рассматриваемых случаях. Представлен Log10RQ, полученный методом 2^-ΔΔCt, интервал RQ_max-RQ_min соответствует ошибке.

Фиг.5. Совместная экспрессия Chokα и ChoKβ оказывает противоположные эффекты на уровни внутриклеточного этаноламина и холина. Клетки Hek293T трансфицируют векторами экспрессии ChoKα, ChoKβ, ChoKα/ChoKβ одновременно или пустым вектором pCDNA3b. Клетки метят в равновесном состоянии ¹⁴C-холином или ¹⁴C-этаноламином в течение 24 час. Экстрагируют липиды. Изображено количество внутриклеточных PEtn или PCho относительно общих липидов. Общая чрезмерная экспрессия ChoKα и ChoKβ снижает уровни PCho, достигаемые при чрезмерной экспрессии ChoKα отдельно, притом что происходит повышение внутриклеточных уровней PEtn. Результаты, которые показаны, соответствуют среднему значению±среднеквадратичное отклонение из 3 независимых экспериментов, проводимых в трех повторах. * Статистически существенные колебания (p<0,05).

Фиг.6. ChoKβ ингибирует онкогенную способность ChoKα. Клетки Hek293T трансфицируют векторами экспрессии ChoKα, ChoKβ, вместе (ChoKα/ChoKβ) или пустым вектором pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. После трансфекции инокулируют 106 клеток подкожно в спину безтимусных мышей (nu-/nu-). Обнаружено, что образование опухолей в случае ChoKα является статистически значимым (p≤0,001). Стимулирование опухолей, вызванное ChoKα, полностью аннулируется, если одновременно чрезмерно экспрессируется ChoKβ.

Фиг.7. ChoKβ ингибирует онкогенную способность ChoKα (II). Клетки ADJ из опухолей, генерированных посредством чрезмерной экспрессии ChoKα, трансфицируют векторами экспрессии ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. После трансфекции инокулируют 106 клеток подкожно в спину безтимусных мышей (nu-/nu-). A) Сравнение роста опухолей, генерированных посредством ADJ/ChoKβ и ADJ/pCDNA3b, B) фотографии ксенотрансплантатов в случае безтимусных мышей, которым сделана инъекция клеток ADJ/ChoKβ (верхнее фото) и ADJ/pCDNA3b (нижнее фото) (4,5 недели).

Фиг.8. Чрезмерная экспрессия ChoKβ в клетках ADJ, производных от Hek293T, задерживает пролиферацию клеток. Клетки ADJ, стабильные в отношении экспрессии ChoKα, трансфицируют посредством векторов экспрессии ChoKβ или пустого вектора pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. Клетки высевают на 24-луночные планшеты с плотностью 104 клеток на лунку и инкубируют в течение 16, 48 и 96 час в оптимальных условиях роста, определяют оптическую плотность после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Рост клеток, трансфицированных посредством ChoKβ, существенен через 96 час. Статистически значимым считают результат при p<0,05, отмечен звездочкой.

Фиг.9. Количественное определение экспрессии ChoKβ в образцах опухолей у пациентов с NSCLC и по сравнению с экспрессией в коммерческой нормальной ткани, используемой в качестве эталонного образца.

Фиг.10. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания, общего и без рецидивов, для пациентов с NSCLC.

Фиг.11. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания для пациентов, которые имеют стадию I NSCLC.

Фиг.12. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания для пациентов с плоскоклеточной карциномой.

Фиг.13. Диаграммы Каплана-Мейера для комбинированного эффекта экспрессии ChoKα и ChoKβ на выживание пациентов с NSCLC.

Фиг.14. Усиление транскрипции PEMT в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW780 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 24 час и 48 час и такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени в качестве контроля. Затем экстрагируют всю РНК указанных клеток и проводят количественную PCR. Изображен Log10RQ, полученный методом 2^-ΔΔCt, интервал RQ_max-RQ_min представляет ошибку. Стрелка в случае клеточных линий Hek293T и SW780 как графическое изображение величины ошибки указывает на то, что в контроле отсутствует экспрессия PEMT и что экспрессия начинается в обработанных клетках, следовательно, сравнение экстраполируют до максимального числа циклов PCR.

Фиг.15. Усиление транскрипции PEMT в ответ на чрезмерную экспрессию ChoKβ. Клетки Hek293T трансфицируют вектором экспрессии ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b в качестве контроля. Экспрессию PEMT, фермента, который не экспрессируется в этой системе в нормальных условиях, как наблюдают в случае контроля, индуцируют в качестве транскрипционного ответа на чрезмерную экспрессию ChoKβ. На фигуре показано относительное количество мРНК из PEMT в Log10RQ, полученное методом 2^-ΔΔCt. Стрелка указывает на то, что хотя экспрессионный контроль указанного гена не показан, сравнение экстраполируют до максимального числа циклов PCR.

Подробное описание изобретения

Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком, основанный на использовании уровней экспрессии ChoKβ или на соотношении уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ

Авторы настоящего изобретения установили, что уровни экспрессии ChoKβ коррелируют с выживанием пациентов, имеющих раковое заболевание. В частности, пониженные уровни ChoKβ, определяемые в образце опухоли пациента, свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз. Таким образом, возможно применение ChoKβ в качестве биомаркера с целью предсказания прогноза для субъекта, который страдает раком.

Следовательно, в одном аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком (здесь далее, первый способ прогнозирования по изобретению), включающему определение уровней экспрессии ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором уровни ChoKβ, пониженные относительно уровней в эталонном образце, свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз.

Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что комбинированное определение уровней экспрессии двух изоформ ChoK (ChoKα и ChoKβ) составляет прогностический фактор с большей прогностической вероятностью, чем определение каждого из них отдельно. В частности, авторы настоящего изобретения наблюдали, что пациенты, которые одновременно имеют высокие уровни ChoKα и пониженные уровни ChoKβ, демонстрируют худший прогноз, характеризуемый выживанием или частотой рецидивов.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком (здесь далее, второй способ прогнозирования по изобретению), включающему определение уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKα и высокие уровни ChoKβ относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует хороший прогноз.

В настоящем изобретении выражение "прогноз" понимают как ожидаемое прогрессирование заболевания, и оно касается оценки вероятности, согласно которой субъект страдает заболеванием, а также оценки его начала, состояния развития, прогрессирования или регрессии и/или прогнозирования течения заболевания в будущем. Как будет понятно специалистам в данной области, такая оценка обычно не может быть корректной для 100% субъектов, подвергаемых диагностированию, хотя преимущественно является корректной. Однако термин требует, чтобы статистически значимую часть субъектов можно было идентифицировать как страдающих заболеванием или имеющих предрасположенность к нему. Если часть является статистически значимой, специалист в данной области может легко ее определить, применяя некоторые хорошо известные способы статистической оценки, например определение доверительных интервалов, определение значений p, t-тест Стьюдента, тест Манна-Уитни и др. Подробности приведены у Dowdy и Wearden, в Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%. Значения p предпочтительно составляют 0,2, 0,1, 0,05.

Предсказание клинического итога можно выполнить, используя любой оценочный критерий, применяемый в онкологии и известный специалисту в данной области. Оценочные параметры, пригодные для описания прогрессирования заболевания, включают:

прогрессирование без заболевания, которое, как используется в настоящем изобретении, описывает долю субъектов в состоянии полного рецидива, которые не имели рецидивов заболевания в течение периода исследования;

объективная реакция, которая, как используется в настоящем изобретении, описывает долю проходящих лечение людей, у которых наблюдается полная или частичная реакция;

контроль опухоли, который, как используется в настоящем изобретении, касается доли проходящих лечение людей, у которых наблюдается полная реакция, частичная реакция, незначительная реакция или стабильное заболевание ≥6 месяцев;

выживание без прогрессирования, которое, как используется в настоящем изобретении, определяют как время от начала лечения до первого определения роста раковой опухоли;

выживание без прогрессирования в течение шести месяцев или степень "PFS6", которая, как используется в настоящем изобретении, касается процента людей, у которых отсутствует прогрессирование в течение первых шести месяцев после начала терапии;

среднее выживание, которое, как используется в настоящем изобретении, относится ко времени, за которое половина пациентов, вовлеченных в исследование, еще живы, и

время прогрессирования, как используется в настоящем изобретении, относится ко времени, после которого диагностируют заболевание (или лечат) до ухудшения заболевания.

В особом варианте осуществления изобретения определяют клинический итог как выживание субъекта или выживание без рецидивов.

Используемый в данном описании термин "субъект" относится ко всем животным, классифицируемым как млекопитающие, и включает, но не ограничивается ими, домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и людей, например людей, приматов, отличных от людей, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительным субъектом является мужчина или женщина любого возраста или расы.

Для осуществления способов прогнозирования по изобретению получают образец от субъекта, подвергаемого исследованию. Используемый в данном описании термин "образец" относится к любому образцу, который можно получить от пациента. Представленный способ можно применять к любому типу биологических образцов от пациента, такому как биопсия, ткань, клеточный образец или образец жидкости (сыворотка, слюна, сперма, мокрота, цереброспинальная жидкость (CSF), слезы, слизь, пот, молоко, экстракты головного мозга и подобное). В особом варианте осуществления указанный образец представляет собой образец ткани или часть такой ткани, предпочтительно образец опухолевой ткани или часть такой опухолевой ткани. Указанный образец можно получить обычными способами, например биопсией, применяя методы, хорошо известные специалистам в областях, относящихся к медицинским технологиям. Способы получения образца биопсии включают деление опухоли на большие куски, или микрохирургию, или другие способы отделения клеток, известные в данной области. Кроме того, опухолевые клетки можно получить посредством аспирационной цитологии с использованием тонкой иглы. Для облегчения хранения и обработки образцов их можно фиксировать в формалине и заливать парафином или сначала замораживать и затем заливать криоотверждаемой средой, например OCT соединением, посредством погружения в высококриогенную среду, которая допускает быстрое замораживание.

Как понятно специалисту в данной области, уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα можно определить, измеряя уровни мРНК, кодируемой указанными генами, или измеряя уровни белков, кодируемых указанными генами, т.е. ChoKβ или ChoKα белка.

Таким образом, в особом варианте осуществления изобретения определяют уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα, измеряя уровни экспрессии мРНК, кодируемой геном ChoKβ и/или ChoKα. Для этой цели биологический образец можно обработать до физического или механического разрушения структуры ткани или клетки с высвобождением внутриклеточных компонентов в водный или органический раствор, получая нуклеиновые кислоты для дополнительных анализов. Нуклеиновые кислоты экстрагируют из образца способами, известными специалистам в данной области и доступными коммерчески. Затем экстрагируют РНК из замороженных или свежих образцов любым из типичных для данной области знаний способов, например способом, описанным Sambrook, J. at al., 2001 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. В течение процесса экстракции предпочтительно проявляют осторожность для предупреждения деградации РНК.

В особом варианте осуществления уровень экспрессии можно определить, используя мРНК, полученную из образца ткани, фиксированного в формалине, залитого парафином. мРНК можно выделить из типового патологического образца или образца биопсии, который сначала депарафинируют. Обычный способ депарафинирования включает промывание образца в парафине органическим растворителем, таким как ксилол. Депарафинированные образцы можно регидратировать водным раствором низшего спирта. Подходящие низшие спирты включают, например, метанол, этанол, пропанолы и бутанолы. Депарафинированные образцы можно регидратировать, например, путем последовательных промываний растворами низших спиртов с понижением концентраций. Альтернативно, образец депарафинируют и регидратируют одновременно. Затем образец лизируют и экстрагируют из образца РНК.

Хотя все методики определения профиля экспрессии генов (RT-PCR, SAGE или TaqMan) пригодны для применения, если выполняются предыдущие аспекты изобретения, уровни экспрессии мРНК часто определяют посредством обратной транскрипционной-полимеразной цепной реакции (RT-PCR). В особом варианте осуществления уровни экспрессии мРНК ChoKβ и/или ChoKα определяют посредством количественной PCR, предпочтительно PCR в реальном масштабе времени. Определение можно проводить в индивидуальных образцах или в микросериях ткани.

Можно проводить сравнение представляющих интерес уровней экспрессии мРНК в образцах, подлежащих исследованию, с экспрессией контрольной РНК с целью нормировки значения экспрессии мРНК для различных образцов. Используемое в данном описании выражение "контрольная РНК" относится к РНК, уровни экспрессии которой не меняются или меняются только в ограниченной степени в опухолевых клетках относительно неканцерогенных клеток. Контрольная РНК предпочтительно представляет собой мРНК, производную генов «домашнего хозяйства», и кодирует белки, которые экспрессируются конститутивно и выполняют существенные клеточные функции. Примеры генов «домашнего хозяйства» для применения в настоящем изобретении включают β-2-микроглобулин, убиквитин, 18-S рибосомный белок, циклофилин, GAPDH и актин. В предпочтительном варианте осуществления контрольная РНК представляет собой мРНК β-актина. В одном варианте осуществления количественное определение относительной экспрессии генов рассчитывают согласно сравнительному Ct-способу, используя β-актин в качестве эндогенного контроля и коммерческие РНК-контроли в качестве калибраторов. Конечные результаты определяют по формуле 2-(ΔCt образца-ΔCt калибратора), где значения ΔCt для калибратора и образца определяют вычитанием значения CT для гена-мишени из значения для гена β-актина.

Определение уровней экспрессии ChoKβ и/или ChoKα должно коррелировать с эталонными значениями, которые соответствуют среднему значению уровней экспрессии ChoKβ и/или ChoKα, определяемых на коллекции опухолевых тканей в образцах биопсии от субъектов с раковыми заболеваниями. Когда среднее значение установлено, уровень маркера, экспрессируемого в опухолевых тканях пациентов, можно сравнивать со средним значением и, таким образом, определить как "низкий", "нормальный" или "высокий" уровень экспрессии. Коллекцию образцов, из которых определяют эталонный уровень, предпочтительно получают от субъектов, страдающих раком одного типа.

Когда среднее значение установлено, уровень маркера, экспрессируемого в опухолевых тканях пациентов, можно сравнить со средним значением и, таким образом, определить как "повышенный" или "пониженный" уровень экспрессии. Из-за вариабельности среди субъектов (например, аспектов, относящихся к возрасту, расе и др.) очень трудно (если не невозможно практически) установить абсолютные эталонные значения экспрессии ChoKβ и/или ChoKα. Таким образом, в особом варианте осуществления эталонные значения для "повышенной" или "пониженной" экспрессии ChoKβ и/или ChoKα определяют, производя расчет процентилей обычными способами, которые включают оценку групп образцов, выделенных из нормальных субъектов (т.е. людей, не имеющих раковых диагнозов), по уровням экспрессии ChoKβ и/или ChoKα. Тогда "пониженные" уровни ChoKβ можно предпочтительно установить для образцов, в которых уровни экспрессии ChoKβ равны или меньше 50-го процентиля в нормальной популяции, включая, например, уровни экспрессии, равные или меньшие 60-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 70-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 80-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 90-го процентиля в нормальной популяции и равные или меньшие 95-го процентиля в нормальной популяции. Тогда "повышенные" уровни ChoKα можно предпочтительно установить для образцов, в которых уровни экспрессии ChoKα равны или больше 50-го процентиля в нормальной популяции, включая, например, уровни экспрессии, равные или больше 60-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 70-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 80-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 90-го процентиля в нормальной популяции и равные или больше 95-го процентиля в нормальной популяции.

Альтернативно, еще в одном конкретном варианте осуществления уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα можно определить, измеряя уровни белков, кодируемых указанными генами, т.е. белка ChoKβ и/или ChoKα, и уровни их разновидностей.

Определение уровней экспрессии белков можно выполнить по иммунологическим методикам, таким как, например, ELISA, иммуноблот-анализ или иммунофлуоресценция. Иммуноблот-анализ основан на детектировании белков, предварительно разделенных посредством гель-электрофореза в условиях денатурации и иммобилизованных в мембране, обычно нитроцеллюлозной, посредством инкубации со специфическим антителом и проявляющей системой (например, хемолюминесцентной). Анализ посредством иммунофлуоресценции требует использования антитела, специфического относительно белка-мишени, для анализа экспрессии. ELISA основан на использовании антигенов или антител меченных ферментами, таким образом, что конъюгаты, образованные целевым антигеном и меченым антителом, дают в результате образование ферментативно-активных комплексов. Дано, что один из компонентов (антиген или меченое антитело) иммобилизован на подложке, комплексы антиген-антитело иммобилизованы на подложке и, таким образом, могут быть детектированы при добавлении субстрата, который преобразуется ферментом в продукт, который детектируется, например, посредством спектрофотометрии или флуориметрии.

Если применяют иммунологический способ, то для детектирования количества белков-мишеней можно использовать любое антитело или реагент, для которого известно, что он связывается с белками-мишенями с высокой аффинностью. Однако предпочтительно использование антитела, например поликлональных сывороток, супернатантов гибридом или моноклональных антител, фрагментов антител, Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂, scFv, диател, триател, тетрател и гуманизированных антител.

Кроме того, определение уровней экспрессии белка можно проводить, составляя микронабор тканей (TMA), содержащий комбинированные образцы от субъектов, и определяя уровни экспрессии белков посредством иммуногистохимических методик, хорошо известных при современном состоянии науки.

Хотя способы прогнозирования по изобретению можно обычно применять для опухоли любого типа, в предпочтительном варианте осуществления для опухолей, характеризуемых высокими уровнями экспрессии ChoKα, применяют оба способа прогнозирования по изобретению, первый и второй.

Определение высоких уровней ChoKα, путь определения уровней и эталонный образец, подходящий для определения указанных уровней, подробно объяснены в контексте терапевтического способа по изобретению.

В особом варианте осуществления способы прогнозирования по изобретению применяют к раку легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректальному раку.

Способ определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα, основанный на использовании уровней PEMT и/или ChoKβ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что существует корреляция между уровнями экспрессии PEMT и/или ChoKβ и реакцией пациента с раковым заболеванием на лечение ингибиторами ChoKα. В частности, результаты, представленные в примере 3 настоящего изобретения, показывают, что высокие уровни ChoKβ и/или PEMT коррелируют с позитивной реакцией на ингибиторы ChoKα. Эти результаты позволяют использовать ChoKβ и/или PEMT в качестве биомаркеров реакции на ингибиторы ChoKα. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα (здесь далее, способ персонализированной терапии по изобретению), включающему определение в образце от указанного пациента уровней экспрессии белка, выбранного из группы: PEMT и ChoKβ, при котором повышение уровней экспрессии PEMT или повышение уровней экспрессии ChoKβ относительно уровней в эталонном образце свидетельствуют о хорошей реакции на ингибитор ChoKα.

Выражение "определение реакции пациента" относится к оценке результатов лечения пациента, который страдает раком, в ответ на терапию, основанную на использовании ингибиторов ChoKα. Применять биомаркеры по изобретению с целью контроля эффективности лечения можно также для способов выбора и скрининга лекарственных средств с потенциальной противоопухолевой активностью. Этот способ включает a) введение субъекту (предпочтительно животному) лекарственного средства, подлежащего исследованию; b) отбор биологических образцов у животных в различных точках исследования (до, во время и/или после введения) и определение уровней маркера согласно настоящему изобретению и c) сравнение определений, проведенных на образцах, полученных на различных фазах обработки, и сравнение их с контрольными животными, например необработанными животными.

В контексте настоящего изобретения под PEMT подразумевают белок фосфатидилэтаноламинметилтрансферазу, способный катализировать превращение фосфатидилэтаноламина в фосфатидилхолин посредством двойного метилирования.

Как описано в отношении способов прогнозирования по изобретению, определение уровней PEMT и ChoKβ можно проводить путем определения соответствующих уровней полипептидов, для чего применяют стандартную методику, например, Вестерн-блоттинг или иммуноблотинг, ELISA (адсорбционный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентный EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сандвичевый метод двойных антител ELISA), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, методики, основанные на применении микронаборов белков или биочипов, включающих специфические антитела, или исследования, основанные на осаждении коллоидов, например, в формате индикаторных полосок.

Альтернативно, определение уровней PEMT и ChoKβ можно проводить путем определения соответствующих уровней мРНК, для чего можно применять стандартную методику, такую как PCR в реальном масштабе времени, SAGE, TaqMan, RT-PCR и подобные.

В случае PEMT также возможно определить уровни экспрессии путем определения активности фермента соответствующего белка, для чего применяют обычные способы, такие как способы на основе детектирования включения метильных групп, меченных фосфатидилдиметилэтаноламином, используя для этой цели [метил-3H]AdoMet в качестве донора метильных групп, как изначально описано Ridgway и Vance (Methods Enzymol. 1992, 209, 366-374), Zhu at al. (Biochem. J., 2003, 370, 987-993) и Song at al. (FASEB J., 2005, 19: 1266-1271).

В контексте настоящего изобретения выражение "ингибитор ChoKα" понимают как любое соединение, способное давать снижение активности ChoK, включая соединения, которые предотвращают экспрессию гена ChoKα, давая в результате пониженные уровни мРНК или белка ChoK, а также соединения, которые ингибируют ChoK, вызывая снижение активности фермента.

Соединения, способные предотвращать экспрессию гена ChoKα, можно идентифицировать, применяя стандартные исследования для определения уровней экспрессии мРНК, такие как RT-PCR, анализ с помощью защиты РНК, нозерн-методику, гибридизацию in situ, методику с микронаборами и подобные.

Соединения, которые дают пониженные уровни белка ChoK, можно идентифицировать, применяя стандартные исследования для определения уровней экспрессии белка, такие как иммуноблоттинг или вестерн-блоттинг, ELISA (адсорбционный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентный EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сандвичевый метод двойных антител ELISA), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, методики, основанные на применении микронаборов белков или биочипов, которые включают специфические антитела, или исследования, основанные на осаждении коллоидов в форматах индикаторных полосок.

Определение ингибирующей способности по биологической активности холинкиназы проводят, применяя стандартные исследования по измерению активности холинкиназы, например, способы, основанные на детектировании фосфорилирования холина, меченного [¹⁴C]-АТФ в присутствии очищенной рекомбинантной холинкиназы или обогащенной холинкиназой фракции с последующим детектированием фосфорилированного холина, применяя стандартные аналитические методики (например, ТСХ), как описано в EP1710236.

Конкретные ингибиторы холинкиназы I-XVIII, которые можно использовать в первой композиции по настоящему изобретению, описаны в таблице 1.

Таблица 1 Ингибиторы ChoKα

I

Соединения, описанные в патентной заявке США 20070185170, имеющие общую формулу: где Q- представляет основание, конъюгированное с фармацевтически пригодной органической или неорганической кислотой; R1 и R'1 представляют, независимо друг от друга, арильный радикал, необязательно замещенный атомом галогена, трифторметилом, гидроксилом, C1-6алкилом, амино или алкоксилом; R2 и R'2 представляют, независимо друг от друга, арильный радикал, необязательно замещенный атомом галогена, трифторметилом, гидроксилом, C1-6алкилом, амино или алкоксилом; R3 и R'3 представляют, независимо друг от друга, либо радикал, выбранный из группы, состоящей из атома H, атома галогена, трифторметила, гидроксила, амино, алкоксила и C1-6алкила, необязательно замещенного трифторметилом, гидроксилом, амино или алкоксилом, или вместе с R4 и R'4, соответственно и независимо друг от друга, радикал -CH=CH-CH=CH-, необязательно замещенный атомом галогена, трифторметилом, гидроксилом, C1-6алкилом, амино или алкоксилом; R4 и R'4 представляют, независимо друг от друга, либо радикал, выбранный из группы, состоящей из H и C1-6алкила, необязательно замещенного атомом галогена, трифторметилом, гидроксилом, амино или алкоксилом, или вместе с R3 и R'3, соответственно и независимо друг от друга, радикал -CH=CH-CH=CH-, необязательно замещенный атомом галогена, трифторметилом, гидроксилом, C1-6алкилом, амино или алкоксилом; A представляет спейсерную группу, содержащую любую двухвалентную органическую структуру, осуществляющую связь между двумя пиридиниевыми группами, присутствующими в структуре, определенной формулой I, в частности, двухвалентные молекулы, имеющие структуру,

выбранную из группы: где m, n и p равны целым числам, которые могут иметь следующие значения: m равно 0, 1; n равно 0, 1-10; p равно 0, 1; при условии, что m, n и p не равны нулю одновременно. и Предпочтительные соединения в этой группе включают соединения, в которых заместители NR1R2, R3, R4 и A являются следующими:

	Предпочтительные соединения в этой группе включают 4-(4-хлор-N-метиланилин)хинолин и 7-хлор-4-(4-хлор-N-метиламино)хинолин, имеющие структуры: и , соответственно.
II	Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 9805644, имеющие общую структурную формулу: , где n равно 1, 2 или 3, Z означает любую структурную группу, выбранную из группы: , где Y выбирают из группы: -H, -CH3, -CH2-OH, -CO-CH3, -CN, -NH2, -N(CH3)2, пирролидина, пиперидина,

пергидроазепина, -OH, -О-CO-C15H31 и др. Предпочтительные ингибиторы ChoK, имеющие определенную выше формулу, представляют собой соединения 1-6, описанные Conejo-Garcia at al. (J. Med. Chem., 2003, 46:3754-3757) и имеющие следующие структуры: где R означает H или и Соединения, которые определены приведенной выше общей формулой, выбраны из группы соединений GRQF-JCR795b, GRQF-MN94b и GRQF-MN58b, имеющих структуры:

и

III

Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 9805644, имеющие общую структурную формулу: где n равно 0, 1, 2, 3 и т.д., X означает структурный элемент, выбранный из группы A, B, C, D и E: где Y выбран из -H, -CH3, -CH2-OH, -CO-CH3, CN, -NH2, -N(CH3)2, пирролидина, пиперидина, пергидроазепина, -OH, -O-CO-C15H31, и где R1, R2 и R3 представляют собой алкильные группы, такие как -Me, -Et и подобные, хотя в некоторых случаях R2 и R3 могут быть более сложными группами, такими как -CH2-CH(OMe)2 и -CH2-CH(OEt)2. Предпочтительные соединения, имеющие приведенную выше общую структуру, представляют собой GRQF-FK3 и GRQF-FK21, имеющие следующие структуры:

IV

Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 9805644, имеющие общую структурную формулу: где X означает группу, выбранную из группы A, B, C и E: где Y представляет собой заместитель, такой как -H, -CH3, -CH2OH, -CN, -NH2, -N(CH3)2, пирролидил, пиперидинил, пергидроазепин, -OH, -О-CO-C15H31 и подобные; где Z означает алкил (-Me, -Et и др.), арильную, фенильную группу или электронодонорные группы, такие как -OMe, -NH2, -NMe2 и др. Предпочтительные соединения, имеющие приведенную выше общую структуру, представляют собой GRQF-MN98b и GRQF-MN164b, имеющие следующие структуры:

V

Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 9805644, имеющие следующую общую структурную формулу: где X означает группу, выбранную из группы A, B, C и E: где Y представляет собой заместитель, такой как -H, -CH3, -CH2OH, -CO-CH3, -CN, -NH2, -N(CH3)2, где Z означает алкильную (-Me, -Et и др.), арильную (фенильную и подобные) группу или электронодонорные группы, такие как -OMe, -NH2, -NMe2 и др. Предпочтительные соединения, имеющие приведенную выше структуру, представляют собой GRQF-FK29 и GRQF-FK33, имеющие следующие структуры:

VI

Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 2004016622, имеющие общую структурную формулу: где X означает атом кислорода или серы, Z означает простую связь, 1,2-этилиден, изопропилиден, п,п'-бифенил, п-фенил, м-фенил, 2,6-пиридилен, п,п'-оксидифенил или п,п'-гексафторизопропилидендифенил; R означает атом H, алкил, алкилдиен, алкин, арил, галоген, спирт, тиол, простой эфир, простой тиоэфир, сульфоксиды, сульфоны, замещенные или первичные амины, нитро, альдегиды, кетоны, нитрил, карбоновые кислоты, их производные и сульфаты, метансульфонат, гидрохлорид, фосфат, нитрат, ацетат, пропионат, бутират, пальмитат, оксалат, малонат, малеат, малат, фумарат, цитрат, бензоат; R' означает атом H или алкил; Y означает атом H или сульфат, метансульфонат, гидрохлорид, фосфат, нитрат, ацетат, пропионат, бутират, пальмитат, оксалат, малонат, малеат, малат, фумарат, цитрат или бензоат. В предпочтительном варианте осуществления соединения, имеющие определенную выше структуру, выбраны из группы, содержащей 2,2-бис[(5-метил-4-(4-пиридил)-2-

	оксазолил)]пропан, 2,2-бис[(5-трифторметил-4-(4-пиридил)-2-оксазолил)]пропан, 4,4'-бис[(5-трифторметил-4-(1-метил-4-пиридиний)-2-оксазолил)]бифенил, 4,4'-бис[(5-пентафторэтил-4-(1-метил-4-пиридиний)-2-оксазолил)]бифенил, 4,4'-бис[(5-трифторметил-4-(1-метил-4-пиридиний)-2-оксазолил)]гексафторизопропилидендифенил, 2,2-бис[(5-трифторметил-4-(4-пиридил)-2-тиазолил)]пропан и 4,4'-бис[(5-трифторметил-4-(1-метил-4-пиридиний)-2-тиазолил)]-1,1'-оксибисбензол.
VII	Хемихолиний-3, описанный Cuadrado at al. (Oncogene, 1993, 8: 2959-2968), Jimenez at al. (J.Cell Biochem., 57: 141-149) и HeRNAndez-Alcoceba at al. (Oncogene, 1997, 15: 2289-2301).
VIII	Соединение, описанное в международной патентной заявке WO 2007077203, имеющее общую структуру формулы: где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R11 и R12 независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(R')(R'')аминогруппу, где R' и R'' независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; группу OCOR, где R означает (CH2)2-COOH или

(CH2)2CO2CH2CH3; или каждая пара может образовывать группу (C=О) вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R9 и R10 независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; C6-C10арил; группу COR''' (где R''' означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; C1-C12алкил или N(RIV)(RV)аминогруппу, где RIV и RV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); (CH2)n-OH карбинольную группу (где n равно целому числу от 1 до 10); или вместе образуют метиленовую группу; связь ------ означает двойную связь или простую связь; и где трициклическая структура: выбрана из следующих структур: где R13, R14, R15, R16, R21, R22 и R23 независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(RVI)(RVII)аминогруппу, где RVI и RVII независимо представляют собой атом водорода или C3-C12алкильную группу; группу OCORVIII, где RVIII означает (CH2)2COOH или (CH2)2CO2CH2CH3; или каждая пара может образовывать группу (C=O) вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R17 означает атом водорода или метил; R18 и R18' независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; C1-C12алкил; C6-C10арил; CORIX (где RIX означает атом водорода; гидроксил; C1-C12алкил; N(RX)(RXI)аминогруппу, где RX и RXI независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; или C1-C12алкоксил); или трифторметил; R19, R19', R20 и R20' независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXII (где RXII означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXIII)(RXIV)аминогруппу, где RXIII и RXIV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12)алкил-]n (где n имеет значения от 1 до 3); трифторметил; или каждая пара 19-19' или 20-20' может образовывать группу C=О вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R24 и R25 независимо представляют собой атом

водорода, гидроксил или галоген. Предпочтительные соединения, которые определены приведенной выше структурой, выбраны из группы, включающей следующие соединения: 3,9-дигидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,11,12,12a,12b,13,14,14a-декагидро-6bH,9H-пицен-2,10-дион; 9-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир уксусной кислоты; 9-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир пропионовой кислоты; 9-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир додекановой кислоты; 9-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир диметилкарбаминовой кислоты; 9-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир никотиновой кислоты; 4-бром-(9-гидрокси-6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый) эфир бензойной кислоты; 14-бром-3,7,9-тригидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,11,12,12a,12b,13,14,14a-декагидро-6bH,9H-пицен-2,10-дион; 12-бром-9-гидрокси-6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый эфир диметилкарбаминовой кислоты; 4-бром-(12-бром-9-гидрокси-6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-иловый) эфир бензойной кислоты; 12-бром-3,9-дигидрокси-6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,11,12,12a,12b,13,14,14a-декагидро-6bH,9H-пицен-2,10-дион; 3,9,10-тригидрокси-6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-додекагидро-6bH-пицен-2-он; моно(10-гидрокси-2,4a,6a,9,12b,14a-гексаметил-3,11-диоксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,11,12b,13,14,14a,14b-тетрадекагидропицен-4-иловый) эфир янтарной кислоты; этиловый эфир 10-гидрокси-2,4a,6a,9,12b,14a-гексаметил-3,11-диоксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,11,12b,13,14,14a,14b-тетрадекагидропицен-4-илового эфира янтарной кислоты.

IX

Соединение, описанное в международной патентной заявке WO 2007077203, имеющее общую структуру формулы: где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19 и R20 независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(RXV)(RXVI)аминогруппу, где RXV и RXVI независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; или каждая пара может образовывать (C=О) карбоксильную группу вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R7 и R8 независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; C6-C10арил; группу CORXVII (где RXVII означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; O-C1-C12алкил; или N(RXVIII)(RXIX)аминогруппу, где RXVIII и RXIX независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); (CH2)n-OH карбинольную группу (где n равно целому числу от 1 до 10); или вместе образуют метиленовую группу, R21 и R24 независимо представляют собой замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXX (где RXX означает атом водорода; гидроксил; замещенный или

незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXXI)(RXXII)аминогруппу, где RXXI и RXXII независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил; R22 и R23 представляют собой: [1] атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXXIII (где RXXIII означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXXIV)(RXXV)аминогруппу, где RXXIV и RXXV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12 )алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил, если R24 находится в параположении относительно R20; или [2] OR22' и OR23' соответственно, где R22' и R23' независимо означают атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXXVI (где RXXVI означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXXVII)(RXVIII)аминогруппу, где RXXVII и RXVIII независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил, если R24 находится в метаположении относительно R20. Предпочтительные соединения, которые входят в приведенную выше общую структуру, выбраны из группы: [3] 14-бром-3-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8а,11,12,12а,12b,13,14,14a-декагидро-6bH,9H-пицен-2,10-диона; [4] 4,6b,8a,11,12,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-илового эфира уксусной кислоты; [5] 4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-2,10-диоксо-2,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-тетрадекагидропицен-3-илового эфира никотиновой кислоты; [6] 3,10-дигидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14,14a-додекагидро-6bH-пицен-2-она; [7] 3-гидрокси-4,6b,8a,11,12b,14a-гексаметил-7,8,8a,12a,12b,13,14,14a-октагидро-6bH,9H-пицен-2,10-диона.

X

Соединения, описанные в международной патентной заявке WO 2007077203, имеющее общую структурную формулу: где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R11 и R12 независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(R')(R'')аминогруппу, где R' и R'' независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; группу OCOR, где R означает (CH2)2-COOH или (CH2)2CO2CH2CH3; или каждая пара может образовывать группу (C=О) вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R9 и R10 независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; C6-C10арил; группу COR''' (где R''' означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; O-C1-C12алкил; или N(RIV)(RV)аминогруппу, где RIV и RV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); (CH2)n-OH карбинольную группу (где n равно целому числу от 1 до 10); или вместе образуют метиленовую группу; связь ----- означает двойную связь или одинарную связь; и где трициклическая структура: выбрана из следующих структур:

где R13, R14, R15, R16, R21, R22 и R23, независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(RVI)(RVII)аминогруппу, где RVI и RVII независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; группу OCORVIII, где RVIII представляет собой (CH2)2COOH или (CH2)2CO2CH2CH3; или каждая пара может образовывать группу (C=O) вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R17 означает атом водорода или метил; R18 и R18' независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; C1-C12алкил; C6-C10арил; CORIX (где RIX означает атом водорода; гидроксил; C1-C12алкил; N(RX)(RXI)аминогруппу, где RX и RXI независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; или C1-C12алкоксил) или трифторметил; R19, R19', R20 и R20' независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXII (где RXII означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXIII)(RXIV)аминогруппу, где RXIII и RXIV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12 )алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); трифторметил; или каждая пара 19-19' или 20-20' может образовывать группу C=O вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R24 и R25 независимо представляют собой атом водорода, гидроксил или галоген. Предпочтительные соединения, которые имеют приведенную выше структуру, выбраны из группы: [8] 7,10,11-тригидрокси-2,4a,6a,9,12b,14a-гексаметил-8-оксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,8,12b,13,14,14a,14b-тетрадекагидропицен-2-метилового эфира карбоновой кислоты; [9] 9-формил-10,11-дигидрокси-2,4a,6a,12b,14a-пентаметил-8-оксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,8,12b,13,14,14a,14b-тетрадекагидропицен-2-метилового эфира карбоновой кислоты; [10] 11-гидрокси-10-(2-метоксиэтоксиметокси)-2,4a,6a,9,12b,14a-гексаметил-8-оксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,8,12b,13,14,14a,14b-тетрадекагидропицен-2-метилового эфира карбоновой кислоты.

XI

Соединение, описанное в международной патентной заявке WO 2007077203, имеющее общую структуру формулы: где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19 и R20 независимо представляют собой атом водорода; гидроксил; атом галогена; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; N(RXV)(RXVI)аминогруппу, где RXV и RXVI независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу; или каждая пара может образовывать группу (C=О) вместе с атомом углерода, с которым они связаны; R7 и R8 независимо представляют собой атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; C6-C10арил; группу CORXVII (где RXVII означает атом водорода, гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; O-C1-C12алкил; или N(RXVIII)(RXIX)аминогруппу, где RXVIII и RXIX независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); карбинольную группу (CH2)n-OH (где n равно целому числу от 1 до 10); или вместе образуют метиленовую группу, R21 и R24 независимо представляют собой замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXX (где RXX означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или

N(RXXI)(RXXII)аминогруппу, где RXXI и RXXII независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил; R22 и R23 представляют собой: [11] атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXXIII (где RXXIII означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXXIV)(RXXV)аминогруппу, где RXXIV и RXXV независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил, если R24 находится в параположении относительно R20; или [12] OR22' и OR23', соответственно, где R22' и R23' независимо означают атом водорода; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; группу CORXXVI (где RXXVI означает атом водорода; гидроксил; замещенный или незамещенный C1-C12алкил; замещенный или незамещенный C6-C10арил; или N(RXXVII)(RXVIII)аминогруппу, где RXXVII и RXVIII независимо представляют собой атом водорода или C1-C12алкильную группу); группу [(C1-C12)алкил-O-(C1-C12a)алкил-]n (где n имеет значение от 1 до 3); или трифторметил, если R24 находится в метаположении относительно R20. Предпочтительные соединения, которые входят в приведенную выше структуру, выбраны из группы: [13] 10,11-дигидрокси-2,4a,6a,9,14a-пентаметил-1,4,4a,5,6,6a,13,14,14a,14b-декагидро-2H-пицен-3-она; [14] 10,11-дигидрокси-2,4a,6a,9,14a-пентаметил-4a,5,6,6a,13,14,14a,14b-октагидро-4H-пицен-3-она.

XII	АТФ-аналоги, включающие негидролизуемые АТФ-аналоги, такие как AMP-PCH2P, аденилилимидодифосфат (AMP-PNP), AMP-PSP и AMP, где кислород, связывающий второй и третий фосфаты АТФ-аналогов, заменен на CH2, S (например, АТФγS, АТФβ и АТФαS) и NH, соответственно, а также суицидные субстраты, такие как 5'-(п-фторсульфонилбензоил)аденозин (FSBA), N6-диэтил-бета,гамма-дибромметилен-АТФ, 2-метилтио-АТФ (APM), α,β-метилен-АТФ, β,γ-метилен-АТФ, диаденозинпентафосфат (Ap5A), 1-N6-этеноаденозинтрифосфат, аденозин-1-оксидтрифосфат, 2',3'-О-(бензоил-4-бензоил)-АТФ (B-ZАТФ), семейство АТФ-аналогов, описанное в US 2004204420, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки, 2',3'-О-(2,4,6-тринитрофенил)-АТФ (TNP-АТФ), 1-N6-(метокси)АТФ, 7-N6-(пирролидин)АТФ, 2-N6-(этокси)АТФ, 8-N6-(циклопентил)АТФ, 3-N6-(ацетил)АТФ, 9-N6-(циклопентилокси)АТФ, 4-N6-(изопропокси)АТФ, 10-N6-(пиперидин)АТФ, 5-N6-(бензил) АТФ, 11-N6-(циклогексил) АТФ и подобные.
XIII	Ингибиторы холинового транспортера, такие как аналоги N-н-алкилникотиния, HC-3 гемихолиний, декаметоний, суксаметоний, D-тубокурарин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, гексаметоний, N-алкильные аналоги (N-этилхолин, N-метилхолин), моно-, ди- и триэтилхолин, N-гидроксиэтилпирролидинийметиодид (пирролхолин) и DL-альфа-метилхолин, описанные Barker, L.A. и Mittag, T.W. (J Pharmacol Exp Ther. 1975; 192: 86-94), ион диметил-н-пентил(2-гидроксиэтил)аммония, декаметоний, гексаметоний, замещенный аналогами бис-катехола и декаметония, описанными Cai at al. (Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2007, 15: 7042-7047), имеющими структуру:
XIV	Ингибиторные антитела, способные специфически связывать и ингибировать активность холинкиназы и, в частности, моноклональные антитела, которые распознают каталитический домен или домен димеризации ChoKα и тем самым ингибируют активность ChoKα. В предпочтительном варианте осуществления ингибиторные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые определены в WO 2007138143. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления ингибиторные антитела представляют собой антитела AD3, AD8 и AD11, которые определены в WO 2007138143.
XV	Ингибиторы фолсфатидилэтаноламин N-метилтрансферазы (PEMT или EC 2.1.1.17). Обработка клеток ингибиторами ChoKα вызывает повышение экспрессии PEMT (Испанская патентная заявка P200802007, рассматриваемая совместно с настоящей). Кроме того, чрезмерная экспрессия ChoKβ в клетках также вызывает повышение экспрессии PEMT (Испанская патентная заявка P200802007, рассматриваемая совместно с настоящей), предполагая, что активация PEMT может представлять путь, используемый ChoKβ для компенсации понижения уровней фосфатидилхолина в ответ на ингибирование ChoKα. PEMT, пригодные для использования в композициях по настоящему изобретению, включают 3-деазааденозин (DZA) (Vance at al., 1986, Biochem. Biophys. Acta, 875: 501-509), 3-деазааристеромицин (Smith and Ledoux, Biochim. Biophys. Acta. 1990, 1047: 290-3), безафибрат и клофибриновую кислоту (Nishimaki-Mogami T at al., Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1304: 11-20).
XVI	Антисмысловой олигонуклеотид, специфический в отношении последовательности холинкиназы.
XVII	Фермент ДНК или рибосома, специфическая в отношении последовательности холинкиназы.
XVIII	Интерферирующая РНК, специфическая в отношении последовательности холинкиназы, например, короткая шпилечная РНК (shРНК), как определено в SEQ ID NO:3, или siРНК, определенная Glunde at al. (Cancer Res., 2005, 65: 11034-11043).

В предпочтительном варианте осуществления способ персонализированной терапии по изобретению осуществляют на пациентах с раковым заболеванием, где рак выбран из группы: рак легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректальный рак.

Способы лечения рака, основанные на стимуляции активности ChoKβ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что экспрессия ChoKβ в опухолевых клетках дает в результате снижение скорости пролиферации указанных клеток. Таким образом, в примере 1.4 настоящего изобретения показано, как в результате чрезмерной экспрессии ChoKβ и ChoKα в клетках происходит образование опухолей по сравнению со случаем, когда опухоль является результатом экспрессии ChoKα. Аналогично, наблюдали, что имплантация безтимусным мышам опухолевых клеток, чрезмерно экспрессирующих ChoKβ и ChoKα, дает опухоли, объем которых на 73% меньше, чем у опухолей, возникающих в результате имплантации клеток, экспрессирующих только ChoKα.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к агенту, индуцирующему активность ChoKβ, для его применения при лечении рака. Альтернативно, изобретение относится к применению агента, индуцирующего активность ChoKβ, для получения лекарственного средства для лечения рака. Альтернативно, изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение указанному индивидууму агента, индуцирующего активность ChoKβ.

В предпочтительном варианте осуществления агент, индуцирующий активность ChoKβ, выбран из группы:

(i) ChoKβ или функционально эквивалентного варианта ChoKβ,

(ii) полинуклеотида, кодирующего ChoKβ или ее функционально эквивалентный вариант,

(iii) вектора, включающего полинуклеотид согласно (ii),

(iv) клетки, способной секретировать ChoKβ или ее функционально эквивалентный вариант в среду.

В контексте настоящего изобретения ChoKβ понимают как белок, способный фосфорилировать холин до фосфорилхолина (PCho) и фосфорилировать этаноламин до фосфоэтаноламина (PEtn) в присутствии магния (Mg²⁺), с применением аденозин 5'-трифосфата (АТФ) в качестве донора фосфатной группы и который включает оба варианта, длинный вариант из 395 ак (ChoKβ1) и короткий вариант из 127 ак (ChoKβ2), который не имеет домена холин/этаноламинкиназа и который отличается от варианта 1 своим C-концом, являясь результатом процесса альтернативного сплайсинга.

Полипептиды ChoKβ, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают полипептиды мышиные (инвентарный номер NCBI NP_031718 по версии от 24 октября 2008), человеческие (инвентарный номер NCBI NP_005189 по версии от 28 июня 2009), крысиные (инвентарный номер NCBI NP_058873 по версии от 24 октября 2008), полосатого данио или Danio rerio (инвентарный номер NCBI NP_001093482 по версии от 22 марта 2009) или Xenopus laevis (инвентарный номер NCBI NP_001011466 по версии от 9 января 2009).

В контексте настоящего изобретения функционально эквивалентный вариант ChoKβ понимают как любую молекулу, разделяющую с ChoKβ одну или более описанных в настоящем изобретении функций, связанных с ChoKβ, in vitro и in vivo, и имеющую минимальную идентичность в аминокислотной последовательности. Таким образом, варианты ChoKβ, пригодные для применения по настоящему изобретению, образуются из предварительно определенных последовательностей посредством включения, замещения или делеции одной или более аминокислот и включают природные аллели, варианты, являющиеся результатом альтернативной обработки, и встречающиеся в природе секретированные и усеченные формы. Предпочтительно, если варианты ChoKβ демонстрируют идентичность аминокислотной последовательности с ChoKβ, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99%. Степень идентичности определяют, применяя способы, хорошо известные специалистам в данной области. Идентичность двух аминокислотных последовательностей предпочтительно определяют, применяя BLASTP алгоритм [BLASTManual, Altschul, S., at al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., at al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)], предпочтительно используя заданные параметры. Кроме того, предполагаемые варианты ChoKβ демонстрируют, по меньшей мере, некоторые функции ChoKβ, такие как, но без ограничения,:

способность ингибировать пролиферацию опухоли клеток, чрезмерно экспрессирующих ChoKα, для чего можно применять способы, описанные в примере 1.4 настоящего изобретения;

способность промотировать повышение уровней фосфоэтаноламина (PEtn), если он экспрессируется в клетке в отсутствие ChoKα, или вызывать повышение уровней PEtn, если он экспрессируется вместе с ChoKα сильнее, чем наблюдается при экспрессии только ChoKα, для чего можно применять способы, описанные в примере 1.4 настоящего изобретения.

Используемый в настоящем изобретении термин "полинуклеотид" относится к нуклеотидной полимерной форме любой длины, образованной рибонуклеотидами и/или деоксирибонуклеотидами. Термин включает как однонитевой, так и двунитевой полинуклеотид, а также модифицированные полинуклеотиды (метилированны, защищенные полинуклеотиды и подобные).

Полинуклеотиды, пригодные для применения в качестве агентов, способных индуцировать активность ChoKβ, включают, но без ограничения, полинуклеотиды, последовательности которых соответствуют мРНК ChoKβ человека (инвентарный номер NM_005198 в NCBI по версии от 28 июня 2009), мышиной мРНК ChoKβ (инвентарный номер NM_007692 в NCBI по версии от 24 октября 2008), крысиной мРНК ChoKβ (инвентарный номер NM_017177 в NCBI по версии от 24 октября 2008), мРНК ChoKβ полосатого данио (инвентарный номер NM_001100012 в NCBI по версии от 22 марта 2009).

Альтернативно, агенты, способные индуцировать активность ChoKβ, включают функционально эквивалентные варианты полинуклеотидов, предварительно определенных посредством их специфических последовательностей. В контексте настоящего изобретения под выражением "функционально эквивалентный полинуклеотид" понимают все такие полинуклеотиды, способные кодировать полипептид с активностью ChoKβ, который предварительно определен и который получен из предварительно определенных полинуклеотидов посредством включения, делеции или замещения одного или нескольких нуклеотидов относительно предварительно определенных последовательностей. Вариантные полинуклеотиды по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой полинуклеотиды, последовательность которых позволяет им гибридизироваться в весьма строгих условиях с предварительно определенными полинуклеотидами. Конкретные весьма строгие условия гибридизации включают инкубацию в 6×SSC (1×SSC: 0,15M NaCl, 0,015M цитрат натрия) и 40% формамиде при 42°C в течение 14 час с последующим одним или несколькими циклами промывания с использованием 0,5×SSC, 0,1% SDS при 60°C. Альтернативно, весьма строгие условия включают гибридизацию при температуре примерно 50-55°C в 6×SSC и конечное промывание при температуре 68°C в 1-3×SSC. Умеренно строгие условия включают гибридизацию при температуре примерно от 50°C примерно до 65°C в 0,2 или 0,3M NaCl с последующим промыванием при температуре примерно от 50°C примерно до 55°C в 0,2×SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия).

Предпочтительно, если агент, который способен индуцировать активность ChoKβ, представляет собой полинуклеотид, который оперативно связан с областью, регулирующей экспрессию. Регуляторные последовательности, пригодные для настоящего изобретения, могут представлять собой последовательности ядерных промоторов или, альтернативно, энхансерные последовательности и/или другие регуляторные последовательности, повышающие экспрессию последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты. Промотор может быть конститутивным или индуцируемым. Если желательна постоянная экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, то используют конститутивный промотор. Примеры хорошо известных конститутивных промоторов включают предранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса саркомы Рауса и подобные. Ряд других примеров конститутивных промоторов хорошо известен в данной области и может использоваться при практическом применении изобретения. Если желательна регулируемая экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, то следует использовать индуцируемый промотор. В неиндуцированном состоянии индуцируемый промотор "молчит". Выражение "молчит" означает, что в отсутствие индуктора детектируют небольшую экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты или отсутствие экспрессии; однако в присутствии индуктора происходит экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. Часто уровень экспрессии можно регулировать, варьируя концентрацию индуктора. Регулируя экспрессию, например варьируя концентрацию индуктора таким образом, чтобы сильнее или слабее стимулировать индуцируемый промотор, можно влиять на концентрацию транскрипционного продукта гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. В случае когда гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует ген, можно регулировать количество синтезируемого белка. Таким образом, можно варьировать концентрацию терапевтического продукта. Примерами хорошо известных индуцируемых промоторов являются: эстроген-промотор или андроген-промотор, металлотионеиновый промотор или промотор, который реагирует на экдизон. В данной области хорошо известен ряд других примеров, и их можно использовать в практике изобретения. Кроме конститутивных и индуцируемых промоторов (которые обычно работают в широко разнообразных типах клеток или тканей) можно использовать ткань-специфические промоторы для достижения специфической экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетках или тканях. Хорошо известные примеры ткань-специфических промоторов включают некоторые мышце-специфические промоторы, в том числе: промотор скелетного α-актина, промотор сердечного актина, промотор скелетного тропонина C, промотор сердечного/медленного сокращения тропонина C и промотор/энхансер креатинкиназы. Имеется ряд мышце-специфических промоторов, которые хорошо известны в данной области и которые можно использовать при практическом применении изобретения (обзор мышце-специфических промоторов см. Miller at al., (1993) Bioessays 15: 191-196).

В другом варианте осуществления агент, индуцирующий активность ChoKβ, является вектором, включающим полинуклеотид, который описан выше, т.е. кодирующий ChoKβ или ее функционально эквивалентный вариант. Векторы, пригодные для введения указанных полинуклеотидов, представляют собой векторы, полученные из векторов экспрессии в прокариотах, такие как pUC18, pUC19, pBluescript и их производные, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, фаги и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28, векторы экспрессии в дрожжах, такие как векторы типа 2-микронных плазмид, интегративные плазмиды, YEP векторы, центромерные плазмиды и подобные, векторы экспрессии в клетках насекомых, такие как векторы серии pAC и серии pVL, векторы экспрессии в растениях, такие как векторы серий pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE и подобные, и векторы экспрессии в высших эукариотических клетках на основе вирусных векторов (аденовирусов, вирусов, ассоциированных с аденовирусами, а также ретровирусов и, в частности, лентивирусов), а также невирусные векторы, такие как pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.l/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL и pKSV-10, pBPV-1, pML2d и pTDT1.

В другом варианте осуществления агент, индуцирующий ативность ChoKβ, представляет собой клетку, способную секретировать ChoKβ или ее функционально эквивалентный вариант в среду. Клетки, пригодные для экспрессии ChoKβ или ее функционально эквивалентного варианта, включают, но без ограничения, кардиомиоциты, адипоциты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, лимфоциты (B и T клетки), мастоциты, эозинофилы, клетки из внутренней выстилки сосудов, первичные культуры клеток, выделенных из различных органов, предпочтительно из клеток, выделенных из островков Лангерганса, гепатоциты, лейкоциты, включая моноядерные, мезенхимальные, пуповины или зрелые лейкоциты (кожи, легких, почек и печени), остеокласты, хондроциты и другие клетки соединительной ткани. Подходящими также являются принятые клеточные линии, такие как Jurkat T-клетки, NIH-3T3 клетки, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, C2C12 миобласты и клетки W138.

Специалисту в данной области будет понятно, что можно обнаружить образование микрочастиц или микрокапсул клетками, способными секретировать в среду ChoKβ или ее функционально эквивалентный вариант, так что клетки имеют более долгий срок полезного применения до использования пациентами. Материалы, пригодные для образования целевых микрочастиц по изобретению, включают любой биосовместимый полимерный материал, допускающий непрерывную секрецию терапевтических продуктов и действующий как носитель клеток. Таким образом, указанный биосовместимый полимерный материал может представлять собой, например, термопластичные полимеры или полимерные гидрогели. Термопластичные полимеры включают акриловую кислоту, акриламид, 2-аминоэтилметакрилат, поли(тетрафторэтилен-согексафторпропилен), (7-кумарокси)этиловый эфир метакриловой кислоты, N-изопропилакриламид, полиакриловую кислоту, полиакриламид, полиамидоамин, поли(амино)-п-ксилилен, поли(хлорэтилвиниловый эфир), поликапролактон, поли(капролактон-со-триметиленкарбонат), поли(карбонатмочевина)уретан, поли(карбонат)уретан, полиэтилен, акриламид и сополимеры полиэтилена, полиэтиленгликоль, полиэтиленгликольметакрилат, поли(этилентерефталат), поли(4-гидроксибутилакрилат), поли(гидроксиэтилметакрилат), поли(N-2-гидроксипропилметакрилат), поли(молочную кислоту-гликолевую кислоту), поли(L-молочную кислоту), поли(гамма-метил-L-глутамат), поли(метилметакрилат), поли(пропиленфумарат), поли(пропиленоксид), полипиррол, полистирол, поли(тетрафторэтилен), полиуретан, поливиниловый спирт, полиэтилен с ультравысокой молекулярной массой, 6-(п-винилбензамидо)гексановую кислоту и N-п-винилбензил-D-мальтонамид, и сополимеры, содержащие более одного из указанных полимеров. Полимеры типа гидрогелей включают природные материалы типа альгината, агарозы, коллагена, крахмала, гиалуроновой кислоты, бычьего сывороточного альбумина, целлюлозы и ее производных, пектина, хондроитинсульфата, фибрина и фиброина, а также синтетические гидрогели, такие как сефароза и сефадекс.

Из уровня техники в данной области известно, что некоторые приведенные выше полимеры не очень стабильны и имеют тенденцию утрачивать свойство геля, кроме того, являясь относительно пористыми, в результате чего антитела способны входить в них и повреждать клетки. По этим причинам микрочастица по изобретению необязательно может быть окружена полупроницаемой мембраной, сообщая частицам стабильность и образуя барьер, непроницаемый для антител. Полупроницаемой мембраной считают мембрану, которая позволяет проникать всем растворенным веществам, необходимым для жизнеспособности клетки, и которая позволяет выходить терапевтическим белкам, продуцируемым клетками, содержащимися внутри микрочастицы, но которая по существу непроницаема для антител, таким образом, клетки защищены от иммунной реакции, вызванной живущей в организме микрочастицей. Материалы, пригодные для образования полупроницаемой мембраны, представляют собой материалы не растворимые в биологических жидкостях, предпочтительно полиаминокислоты, такие как, например, поли-L-лизин, поли-L-орнитин, поли-L-аргинин, поли-L-аспарагин, поли-L-аспарагиновая кислота, полибензил-L-аспартат, поли-S-бензил-L-цистеин, поли-гамма-бензил-L-глутамат, поли-S-CBZ-L-цистеин, поли-ε-CBZ-D-лизин, поли-δ-CBZ-DL-орнитин, поли-O-CBZ-L-серин, поли-O-CBZ-D-тирозин, поли(γ-этил-L-глутамат), поли-D-глутаминовая кислота, полиглицин, поли-γ-N-гексил-L-глутамат, поли-L-гистидин, поли(α,β-[N-(2-гидроксиэтил)-DL-аспартамид]), поли-L-гидроксипролин, поли(α,β-[N-(3-гидроксипропил)-DL-аспартамид]), поли-L-изолейцин, поли-L-лейцин, поли-D-лизин, поли-L-фенилаланин, поли-L-пролин, поли-L-серин, поли-L-треонин, поли-DL-триптофан, поли-D-тирозин или их комбинации.

В контексте изобретения выражение "лечение рака" означает комбинированное введение композиции по изобретению для предупреждения или задержки появления симптомов, осложнений или биохимических признаков рака или опухоли для облегчения симптомов или прекращения или ингибирования их развития и прогрессирования, например появления метастазов. Обработка может быть профилактической для задержки появления заболевания или предупреждения проявления его клинических или субклинических симптомов или терапевтической обработкой для устранения или облегчения симптомов после проявления заболевания, или в связи с хирургическим вмешательством или радиотерапией.

Рак, подлежащий лечению, в контексте настоящего изобретения может быть любым типом рака или опухоли. Эти опухоли или типы рака включают, но не ограничиваются ими, гематологические типы рака (например, лейкемии или лимфомы), неврологические опухоли (например, астроцитомы или глиобластомы), меланому, рак молочной железы, рак легкого, рак головы и шеи, желудочно-кишечные опухоли (например, рак желудка, рак поджелудочной железы или колоректальный рак), рак печени (например, гепатоцеллюлярную карциному), почечно-клеточный рак, мочеполовые опухоли (например, рак яичников, вагинальный рак, цервикальный рак, рак мочевого пузыря, тестикулярный рак, рак предстательной железы), опухоли костей и опухоли сосудов. Таким образом, в особом варианте осуществления рак, который подлежит лечению или профилактике, представляет собой рак легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректальный рак.

В контексте настоящего изобретения под "раком легкого" понимают опухолевое заболевание любого типа ткани легкого, включая немелкоклеточный рак или NSCLC. В еще более конкретном варианте осуществления NSCLC выбран из плоскоклеточной карциномы легкого, крупноклеточной карциномы легкого и аденокарциномы легкого. Кроме того, настоящий способ также применим к субъекту, который страдает NSCLC на любой стадии (стадии 0, IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB или IV).

В контексте настоящего изобретения под выражением "рак молочной железы" понимают любой тип опухолевого поражения молочной железы и он включает, но без ограничения, карциному протоков in situ (DCIS), инфильтрационную или инвазивную карциному протоков, лобулярную карциному in situ (LCIS), инфильтрационную или инвазивную любулярную карциному и воспалительную карциному и опухоли на стадиях 0, I, II, IIIA, IIIB, IIIC и IV.

Выражение "рак мочевого пузыря" относится к опухоли мочевого пузыря и включает любой подтип с гистологией, которая обычно встречается при раке мочевого пузыря, такой как переходно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома, любой клинической подтип, например инвазивный рак поверхностных мышц или метастатическое заболевание и любая стадия TNM, включая опухоли T0-T4, N0-N4 и M0-M4.

Используемое в данном описании выражение "колоректальный рак" включает любой тип неоплазии толстой кишки, прямой кишки и аппендикса и относится к ранним и поздним аденомам и карциномам, а также к наследственному, семейному или споратическому раку. Наследственный CRC включает синдромы, которые включают наличие полипов, например полипозные синдромы и наиболее известный семейный аденоматозный полипоз (FAP), а также неполипозные синдромы, такие как наследственный неполипозный колоректальный рак (HNPCC) или синдром Линча 1. Также в изобретении рассматривается лечение колоректального рака на его разных стадиях, например, стадиях A, B, C1, C2 и D согласно классификации Дюкса, стадиях A, B1, B2, B3, C1, C2, C3 и D согласно классификации Астлера-Коллера, стадиях TX, TO, Tis, TI, T2, T3, NX, NO, NI, N2, MX, MO и MI согласно системе TNM, а также стадиях 0, I, II, III и IV согласно классификации AJCC (American Joint Committee on Cancer).

Продемонстрировано, что композиции по изобретению особенно эффективны при лечении опухолей, в которых существуют высокие уровни экспрессии ChoKα. Используемое в данном описании выражение "высокие уровни экспрессии ChoKα" относится к уровням ChoKα выше уровней, наблюдаемых для эталонного образца. В частности, можно считать, что образец имеет высокие уровни экспрессии ChoKα, если уровни экспрессии превышают уровни указанного эталонного образца, по меньшей мере, в 1,1 раза, 1,5 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз, 100 раз или даже более.

Указанный эталонный образец обычно получают, комбинируя равные количества образцов от популяции субъектов. Типичные эталонные образцы обычно получают от субъектов, которые клинически правильно документированы и которые не имеют заболеваний. В таких образцах можно определить нормальные (эталонные) концентрации биомаркера, например, получая среднюю концентрацию для контрольной популяции. Когда определяют эталонную концентрацию маркера, принимают во внимание несколько факторов. Такие факторы включают тип привлекаемого образца (например, ткань или CSF), возраст, массу, пол, общее физическое состояние пациента и подобное. Например, равные количества в группе, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 100 для предпочтительно более 1000 субъектов, предпочтительно классифицированных по указанным выше факторам, например, берут в качестве контрольной группы несколько возрастных категорий.

Можно проводить определение уровней экспрессии ChoKα как в образце опухоли, подлежащей лечению, так и в эталонном образце, определяя уровни мРНК кодированной ChoKα, с применением общеизвестных методик, таких как RT-PCR, анализ с помощью защиты РНК, нозерн-методика, in situ гибридизация, методика с использованием микронабора и подобные, или определяя уровни белка ChoKα с применением для этой цели общеизвестных методик типа иммуноблоттинга или вестерн-блоттинга, ELISA (адсорбционный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентного EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сандвичевый метод двойных антител ELISA), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, методики, основанные на применении биочипов или микронаборов белков, включающих специфические антитела, или исследования, основанные на осаждении коллоидов, например, в формате индикаторных полосок.

Соединения по изобретению можно вводить как в виде формы острого действия, так и формы постоянного действия. Используемое в настоящем изобретении выражение "постоянное введение" относится к способу введения, при котором соединение вводят пациенту непрерывно в течение продолжительных периодов времени для поддержания терапевтического эффекта в течение указанного периода. Форма для постоянного введения включает многократное введение доз соединения ежедневно, дважды в день, три раза в день или с меньшей частотой. Постоянное введение можно осуществлять путем нескольких внутривенных инъекций, вводимых периодически в течение дня. Альтернативно, постоянное введение включает введение в виде болюса или посредством непрерывной трансфузии, которую можно проводить ежедневно, каждые два дня, каждые 3-15 дней, каждые 10 дней или более. Обычно хроническое введение выполняют, по меньшей мере, в течение 72 час, по меньшей мере, 96 час, по меньшей мере, 120 час, по меньшей мере, 144 час, по меньшей мере, 1 недели, по меньшей мере, 2 недель, по меньшей мере, 3 недель, по меньшей мере, 4 недель, по меньшей мере, 5 недель, по меньшей мере, 6 недель, по меньшей мере, 7 недель, по меньшей мере, 8 недель, по меньшей мере, 9 недель, по меньшей мере, 10 недель, по меньшей мере, 11 недель, по меньшей мере, 12 недель, по меньшей мере, 4 месяцев, по меньшей мере, 5 месяцев, по меньшей мере, 6 месяцев, по меньшей мере, 9 месяцев, по меньшей мере, года, по меньшей мере, 2 лет или более.

Используемое в настоящем изобретении выражение "острое введение" относится к способу введения, при котором пациент подвергается воздействию разовой дозы соединения или нескольких доз, но в течение уменьшенного периода времени, например, 1, 2, 4, 6, 8, 12 или 24 час или 2, 3 или 4 дней.

Специалисту в данной области будет понятно, что терапевтически эффективное количество и/или препарат активного соединения готовят в зависимости от типа введения. Используемое в данном описании выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое позволяет полностью или частично прекратить рост опухоли.

В случае когда желательно хроническое введение соединения по изобретению, его можно вводить в виде композиции с длительным высвобождением, такой как композиции, описанные в US 5672659, US 5595760, US 5821221, US 5916883 и WO 9938536. В отличие от этого, если желательно острое введение, предпочтительным является применение формы с немедленным высвобождением. Независимо от типа введения дозируемое количество и интервал можно регулировать индивидуально, обеспечивая уровни соединений в плазме, достаточные для поддержания терапевтического эффекта. Специалист в данной области способен оптимизировать терапевтически эффективные локальные дозы без излишнего экспериментирования.

Введение соединений по изобретению требует их приготовления в виде фармацевтических композиций, которые составляют другой аспект изобретения. Фармацевтические композиции, пригодные для применения на практике способа по изобретению, содержат терапевтически эффективное количество активного агента и фармацевтически приемлемый носитель. Выражение "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим ведомством штата или федерального правительства или включенный в фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для применения на животных и, более конкретно, на людях. Термин "носитель" относится к разбавителю, соадъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят терапевтическое соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая минеральные, животные, растительные или синтетические масла, например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобные. Пригодные фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, высушенное снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и подобное. Если требуется, композиция также может содержать небольшое количество смачивающих агентов или эмульгаторов, или pH буферирующих агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с пролонгированным высвобождением и подобного. Композицию можно приготовить в виде суппозитория с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Пероральный препарат может включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсахарин, целлюлоза, карбонат магния фармацевтических типов и др. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.

В случае когда вводят нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды по изобретению, векторы или генные конструкции), в изобретении рассматриваются фармацевтические композиции, специально приготовленные для введения указанных нуклеиновых кислот. Фармацевтические композиции могут содержать указанные нуклеиновые кислоты в незащищенном виде, т.е. в отсутствие соединений, защищающих нуклеиновые кислоты от их деградации под действием нуклеаз организма, что включает преимущество устранения токсичности, связанной с реагентами, применяемыми для трансфекции. Подходящие способы введения для незащищенных соединений включают внутрисосудистый, внутриопухолевый, внутричерепной, внутрибрюшинный, внутриселезеночный, внутримышечный, субретинальный, подкожный, через слизистую оболочку, локальный и пероральный способ (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21:857-867). Альтернативно, нуклеиновые кислоты можно вводить в виде части липосом, сопряженных с холестерином или с соединениями, способными промотировать транслокацию через клеточные мембраны, например Tat пептидом, производным HIV-1 TAT белка, третьей спиралью гомеодомена белка Antennapedia D.melanogaster, белком VP22 вируса простого герпеса (herpes simplex), олигомерами аргинина и пептидами, такими как пептиды, описанные в WO07069090 (Lindgren, A. at al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21: 99-103; Schwarze, S.R. at al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21: 45-48; Lundberg, M at al., 2003, Mol. Therapy 8: 143-150 и Snyder, E.L. и Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21: 389-393). Альтернативно, полинуклеотид можно вводить в виде части плазмидного вектора или вирусного вектора, предпочтительно векторов на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов или ретровирусов, таких как вирусы на основе мышиных вирусов лейкемии (MLV) или лентивирусов (HIV, FIV, EIAV).

Композиция может быть составлена согласно рутинным методикам в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения человеку. Если необходимо, композиция также может включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для ослабления боли на месте инъекции. Если композицию вводят посредством инфильтрации, ее можно готовить и отпускать с инфильтрационной склянкой, содержащей воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композицию вводят посредством инъекции, то предоставляют ампулу воды для инъекции или стерильного физиологического раствора, таким образом, ингредиенты можно смешать непосредственно перед введением.

Количество соединения, индуцирующего активность ChoKβ, которое будет эффективным при лечении рака, можно определить по стандартным клиническим методикам на основании настоящего описания. Кроме того, в помощь определению оптимальных диапазонов доз можно необязательно применять in vitro исследования. Точная доза, используемая в препарате, также зависит от способа введения и тяжести заболевания и должна определяться согласно решению врача и в соответствии с обстоятельствами для каждого субъекта. Однако подходящие диапазоны доз для внутривенного введения обычно составляют примерно 50-5000 мкг активного соединения на кг массы тела. Подходящие диапазоны доз для внутриносового введения обычно составляют от 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Эффективную дозу можно экстраполировать из кривых доза-ответ, полученных на модельных системах in vitro исследований или исследований на животных.

Терапевтически эффективную дозу для системного введения можно первоначально определить из in vitro исследований. Например, на животных моделях можно приготовить дозу для достижения концентрации в крови в диапазоне, включающем IC₅₀, которую определяют в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения дозы, применимой для людей. Начальные дозы также можно определить из данных in vivo, например, на животных моделях, применяя методики, которые хорошо известны в данной области. Специалист в данной области может легко оптимизировать введение людям на основании данных для животных.

Другие аспекты изобретения

В дополнительных аспектах изобретение относится к:

[1] Вектору экспрессии фермента ChoKβ для применения в генно-терапевтическом способе ингибирования фермента ChoKα, предназначенном для лечения рака.

[2] Вектору экспрессии фермента ChoKβ для применения в генно-терапевтическом способе ингибирования фермента ChoKα, предназначенном для лечения рака легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректального рака.

[3] Вектору экспрессии согласно [1] или [2], отличающемуся тем, что является вирусом.

[4] Применению вектора экспрессии фермента ChoKβ в качестве агента, ингибирующего антионкогенный фермент ChoKα.

[5] Применению вектора экспрессии фермента ChoKβ при получении композиций для генной терапии, ингибирующих экспрессию фермента ChoKα, предназначенного для лечения рака.

[6] Применению согласно [5], отличающемуся тем, что рак представляет собой рак легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректальный рак.

[7] Применению согласно [4]-[6], отличающемуся тем, что вектор представляет собой вирус.

[8] Композиции для генной терапии, отличающейся тем, что содержит вектор экспрессии фермента ChoKβ, способный ингибировать фермент ChoKα.

[9] Клетке, трансфицированной вектором экспрессии фермента ChoKβ, отличающейся тем, что имеет пониженный уровень экспрессии ChoKα и/или обладает неспособностью расти или пролиферировать патологическим образом.

Изобретение проиллюстрировано ниже при помощи следующих примеров, которые следует рассматривать только как иллюстративные и ни в коем случае как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Применение Chokβ в качестве супрессора опухоли

1.1. Профиль экспрессии генов ChoKα и ChoKβ в клеточных линиях человека

С целью определения, существуют ли различия в изменении экспрессии различных изоформ ChoK при раке, в настоящем изобретении проверяют экспрессию эндогенной мРНК ChoKα и ChoKβ в наборе клеточных линий, полученных из человеческих опухолей молочной железы, мочевого пузыря, колоректальной опухоли и опухоли легкого, посредством количественной PCR. Каждый тип опухоли сравнивают по очереди с ее соответствующими нетрансформированными первичными исходными линиями в качестве контроля.

Уровни мРНК ChoKα и ChoKβ различных линий мелкоклеточных и немелкоклеточных раковых опухолей легкого человека сравнивают с первичной линией легких (BEC). Результаты, представленные на фиг.1A, показывают, что во всех опухолевых линиях существует только тип чрезмерной экспрессии ChoKα мессенджера по сравнению со стареющей первичной линией. Кроме того, в случае изоформы ChoKβ наблюдают противоположный тип, т.е. сайленсинг экспрессии этого белка в опухолевых линиях относительно первичной линии. Аналогичные результаты получены в опухолевых линиях мочевого пузыря человека по сравнению с нетрансформированной линией UROTsa (фиг.1B), в которой уровни ChoKα мессенджера чрезмерно экспрессированы в опухолевых линиях, тогда как для ChoKβ они сохраняют молчание.

Подобно описанным выше случаям в опухолевых линиях, полученных из раковой опухоли молочной железы человека, обнаружены повышенные уровни изоформы ChoKα относительно стареющей первичной эпителиальной линии (HMEC), тогда как в типе экспрессии ChoKβ не обнаружено значительного отличия (фиг.1C).

Эти результаты демонстрируют, что некоторые опухолевые линии имеют общее характеристическое повышение экспрессии гена ChoKα, тогда как ChoKβ не затрагивается, предполагая, что высокие уровни изоформы ChoKα существенны для опухолевого процесса, но это неверно для уровней ChoKβ, которые даже понижены в некоторых случаях.

1.2. Профиль экспрессии генов ChoKα и ChoKβ в образцах пациентов

Аналогичным образом, как для случая опухолевых линий человека, исследуют уровни экспрессии α и β изоформ ChoK в серии из 33 образцов пациентов с диагнозом рак легкого. С этой целью определяют уровни ChoKα и ChoKβ посредством количественной PCR, сравнивая их с коммерческой РНК нормальной ткани легкого человека в качестве эталона.

Результаты количественной PCR воспроизводят данные, предварительно полученные для клеточных линий, демонстрируя повышение более чем в два раза уровней экспрессии ChoKα в образцах опухолей относительно нормальной ткани, соответствующее 39,4% (фиг.2A). Для случая изоформы ChoKβ (фиг.2B) получают снижение уровней экспрессии опухолевых образцов более чем в два раза по сравнению с нормальной тканью, соответствующее 66,7%, аналогично результатам, обнаруженным для клеточных линий.

Полученные данные показывают, что α и β изоформы ChoK имеют противоположное поведение в условиях трансформации клеток, предполагая разные роли для двух белков в канцерогенном процессе.

1.3. Индуцирование экспрессии ChoKβ в ответ на MN58b

Кроме того, в настоящем изобретении оценивают чувствительность ChoKβ к химическому ингибитору MN58b, делая вывод, что изоформа ChoKα заметно более чувствительна к антипролиферативному эффекту MN58b, чем изоформа ChoKβ. В результате в условиях, при которых обработка этим лекарственным средством вызывает гибель клеток, затрагивается только изоформа ChoKα. С целью проверки, не происходит ли компенсационного эффекта функции ChoKα посредством ChoKβ, изучают транскрипционную реакцию ChoKβ на фармакологическое ингибирование ChoKα посредством MN58b. Для выполнения этого исследования выбирают набор человеческих опухолевых клеток различного происхождения, имеющих эффективную in vitro реакцию на антипролиферативный эффект обработки MN58b, включающий Hek293T, Jurkat, H1299 и SW780. Клетки обрабатывают 20 мкМ MN58b (концентрация, при которой ингибируется ChoKα, но ChoKβ не затрагивается в значительной степени) в течение 24 и 48 час и контролируют эффект лекарственного средства посредством иммунодетектирования протеолиза PARP или деградации каспазы 3 в качестве индикаторов гибели клеток (фиг.3). Кроме того, посредством количественной PCR определяют также уровни ChoKβ человека. Как показано на фиг.4, во всех случаях имеется повышение уровней ChoKβ в ответ на MN58b, хотя время максимального индуцирования различно для каждой клеточной линии.

Эти результаты предполагают, что затрагивается регулирование обеих изоформ ChoK, при этом ChoKβ транскрипционно индуцируется в ответ на фармакологическое ингибирование ChoKα.

1.4. Регулирующая роль ChoKβ в трансформации, опосредованной ChoKα

Чрезмерная экспрессия ChoKα, но не чрезмерная экспрессия ChoKβ, индуцирует трансформацию человеческих клеток Hek293T. Кроме того, различные клеточные линии, полученные из человеческих опухолей и образцов пациентов с раком легкого, имеют высокие уровни мРНК ChoKα и пониженные уровни мРНК ChoKβ относительно соответствующих нормальных контролей. Это предполагает различное, но связанное поведение обеих изоформ в процессе трансформации клеток.

Для изучения возможного комбинированного регулирования изоформ ChoK анализируют внутриклеточные уровни PCho и PEtn, генерируемых при чрезмерной экспрессии обеих изоформ вместе. С этой целью трансфицируют клетки Hek293T посредством пустого вектора pCDNA3b в качестве контроля и векторами экспрессии, кодирующими ChoKα, ChoKβ или обе вместе, и метят in vitro при равновесии ¹⁴C-холином или ¹⁴C-этаноламином. Результаты, показанные на фиг.5, подтверждают, что тогда как ChoKα способна промотировать высокие уровни PCho и PEtn, ChoKβ предпочтительно участвует в индуцировании уровней PEtn. В случае общей чрезмерной экспрессии обеих изоформ происходит повышение внутриклеточных уровней PEtn выше уровней, полученных с каждой из двух изоформ отдельно. Однако уровни PCho понижаются относительно уровней, полученных при чрезмерной экспрессии ChoKα, хотя еще остаются более высокими, чем контрольные. Согласно этим результатам, что касается свойств димеризации различных изоформ ChoK, образующих α/α, β/β гомодимеры или α/β гетеродимеры, ранее было продемонстрировано, что генерируются разные степени активности ChoK, причем наиболее активными димерами являются димеры, образованные α/α молекулами, и наименее активными являются β/β димеры, гетеродимеры остаются промежуточным фенотипом (Aoyama at al., 2004).

Кроме того, повышение уровней PCho играет важную роль в митогенезе, клеточной пролиферации и канцерогенезе. Следовательно, снижение внутриклеточных уровней PCho, вызванное чрезмерной экспрессией ChoKβ, может оказывать влияние на трансформацию, опосредованную ChoKα. С целью определения важности такого эффекта клетки Hek293T кратковременно трансфицируют, как описано выше, и в каждом случае проверяют один раз точную чрезмерную эктопическую экспрессию ChoK, вводят посредством инъекции 106 клеток подкожно в каждый бок безтимусных мышей nu-/nu- (n=10-12). Мышам вводят посредством инъекции клетки Hek293T, трансфицированные генерированными ChoKα опухолями при степени 25% аналогично степени, полученной ранее, принимая во внимание, что мыши с инъекцией ChoKβ не генерируют опухоли, оставаясь идентичными контрольным (фиг.6). Неожиданно, в случае клеток, совместно трансфицированных обеими изоформами, происходит общее снижение степени появления опухоли.

Кроме того, опухоли, генерированные у иммунодепрессивных мышей при чрезмерной экспрессии ChoKα в аналогичных условиях, хирургически извлекают, после чего их клетки эксплантируют, адаптируя их в культуре. Эта клеточная линия, называемая ADJ, имеет конститутивную активацию ChoKα и вызывает новообразования у иммунодепрессивных мышей, что недавно описано (Ramirez de Molina at al., 2008a). С целью подтверждения отрицательного эффекта ChoKβ на трансформационную способность ChoKα трансфицируют клетки ADJ вектором экспрессии ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b в качестве контроля, после чего их вводят посредством инъекции безтимусным мышам, как описано выше, следят за ростом опухоли в течение 6,5 недель. В случае клеток ADJ/ChoKβ генерированные опухоли имеют объем, который на 73% меньше, чем для контрольных клеток ADJ, трансфицированных пустым вектором (фиг.7).

С целью изучения эффекта ChoKβ на клетки, трансформированные посредством ChoKα в большей степени, исследовали in vitro пролиферативную способность клеток ADJ, трансфицированных ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b. Эксперимент с пролиферацией проводили во времени, окрашивая клетки кристаллическим фиолетовым. Согласно результатам, полученным in vivo на безтимусных мышах, клетки ADJ, трансфицированные ChoKβ, отражают значительное замедление пролиферации относительно контрольных клеток через 96 час поддерживания нормальных условий культивирования (фиг.8). Взятые вместе, полученные результаты предполагают, что ChoKβ играет онкосупрессорную роль в трансформации, опосредованной ChoKα.

2. Применение ChoKβ и соотношения ChoKα/ChoKβ в качестве маркера прогнозирования у пациентов с раковым заболеванием

2.1. Материалы и способы

Пациенты, включенные в исследование

Исследовали замороженные образцы раковой ткани легкого от 69 случайным образом выбранных пациентов, которые подвергались хирургической резекции NSCLC в госпитале университета La Paz в Мадриде (Испания) в период с 2001 по 2007. Из этих 69 образцов 39 представляют собой плоскоклеточные карциномы, 12 - аденокарциномы и 17 - рак другого типа. Клинические характеристики пациентов, включенных в исследование, суммированы в таблице 1.

Статистический анализ

Рассчитывают количественно экспрессию гена (AQ) методом 2^-ΔCt (Applied Biosystems) и представляют как AQ×106. Анализ экспрессии гена проводят, используя экспрессию эндогенного гена 18S для нормировки.

Получают характеристические рабочие кривые (ROC) для демонстрации соотношения между чувствительностью и ошибочно-позитивной оценкой при различных пороговых значениях экспрессии ChoKβ для выживания, специфического относительно рака легкого и выживания без рецидивов. Пороговое значение устанавливают по лучшей комбинации чувствительности и ошибочно-позитивной оценки (1-специфичности) на основании ROC-кривых.

Для определения общего выживания и выживания без рецидивов применяют способ Каплана-Мейера. В исследовании рассматривают только смерть от рецидива рака легкого. Оценивают эффект различных факторов на относящийся к опухоли рецидив и выживание посредством log-рангового теста для одномерного анализа. Для оценки эффекта экспрессии ChoKβ на выживание при поправке на потенциально мешающие факторы применяют регрессионную модель пропорциональности риска Кокса. Из модели регрессии Кокса рассчитывают коэффициенты риска (HR) и 95% доверительные интервалы (95% CI). Все сообщаемые значения p являются двусторонними. Статистическую значимость определяют как p<0,05. Статистическая анализ выполняют, применяя программное обеспечение SPSS (версия 14.0).

Таблица 1 Характеристики пациентов, включенных в исследование
	n (%)
Возраст	43-85 лет (средний 66)
Пол
Мужчины	61 (88,4%)
Женщины	8 (11,6%)
Гистология
Плоскоклеточная карцинома	39 (56,5%)
Аденокарцинома	12 (17,4%)
Другие	17 (26,1%)
Стадия
Ia	6 (8,7%)
Ib	32 (46,4%)
IIa	2 (2,9%)
IIb	11 (15,9%)
IIIa	9 (13%)
IIIb-IV	7 (10,1%)
Всего	69
Рецидив
Нет	48 (69,6%)
Есть	17 (24,6%)
Не известно	4 (5,8%)

2.2. Прогностическое значение экспрессии ChoKβ в NSCLC

Для исследования, связана ли экспрессия ChoKβ с клиническим итогом пациентов с NSCLC, анализируют экспрессию гена ChoKβ в 69 хирургических образцах NSCLC, применяя метод RT-PCR в реальном масштабе времени. Анализ экспрессии гена показывает, что экспрессия ChoKβ распределяется в опухолях дифференцированно с нормированными значениями AQ копий мРНК в диапазоне от 0,42 до 30,81 (фиг.9).

Чтобы установить, как происходит экспрессия ChoKβ в образцах опухолей по сравнению со здоровыми тканями, анализируют экспрессию ChoKβ в коммерческой РНК, полученной из ткани легкого здорового человека. Большинство опухолевых образцов демонстрируют пониженные уровни экспрессии по сравнению с уровнями для коммерческой нормальной ткани, используемой в качестве эталона (нормальная ткань имеет AQ экспрессию 13,89).

Не обнаружено соотношения экспрессии ChoKβ с доступными клинико-патологическими параметрами пациентов (стадия, гистологическая оценка, возраст или пол). Для анализа, связана ли пониженная экспрессия ChoKβ, наблюдаемая в большинстве опухолей, с клиническим итогом пациентов, устанавливают произвольную пороговую точку 4,022 AQ (70% чувствительность, 54% специфичность) согласно ROC методологии. В этих условиях 35 из 69 (51%) образцов опухолей, проанализированных на экспрессию ChoK, находятся ниже этой пороговой точки.

Пациенты с пониженной экспрессией ChoKβ демонстрируют худшее выживание при раке легкого и выживание без рецидивов, чем пациенты с более высокими концентрациями данного фермента, хотя эти различия не достигают статистической значимости (фиг.10).

Затем оценивают уровни экспрессии гена ChoKβ в образцах опухолей от пациентов с NSCLC, стадия I (фиг.11). Отмечают связь между экспрессией ChoKβ выше пороговой точки и улучшенным выживанием, специфическим относительно рака легкого (p=0,04). Пациенты с пониженной экспрессией ChoKβ имеют существенную тенденцию к повышенному риску смерти по сравнению с пациентами с более высокими концентрациями фермента (HR 0,375 [95% CI: 0,13-1,10], p=0,07). Кроме того, аналогичную тенденцию наблюдают, когда анализируют выживание без рецидивов. Пациенты с экспрессией ChoKβ ниже пороговой точки проявляют значительно повышенный риск рецидива (p=0,02), (HR 0,43 [95% CI: 0,16-1,17], p=0,1).

Аналогичные результаты получают, когда анализируют уровни экспрессии гена ChoKβ у подгруппы пациентов с плоскоклеточной карциномой. Диаграммы Каплана-Мейера демонстрируют существенную тенденцию к худшему выживанию пациентов с низкой экспрессией ChoKβ, чем пациентов с концентрациями фермента выше пороговой точки (p=0,08) (фиг.12). Кроме того, обнаружено, что пониженная экспрессия ChoKβ в опухоли этого типа в значительной степени связана с более кратким выживанием без рецидивов (p=0,03) (фиг.12).

Взятые вместе, полученные результаты предполагают, что экспрессия ChoKβ тесно связана с выживанием без рецидивов и общим выживанием среди пациентов с NSCLC. Многоэлементный регрессионный анализ Кокса предполагает, что ChoKβ может быть независимым фактором высокого риска плохого выживания для пациентов с пониженной экспрессией ChoKβ (HR 0,38 [95% CI: 0,13-1,11], p=0,07). Таким образом, ChoKβ может быть новым прогностическим фактором, который можно использовать для содействия идентификации пациентов с ранней стадией NSCLC, которые могут находиться под высоким риском рецидива, и для идентификации пациентов с благоприятным прогнозом, которые могли бы принимать менее агрессивный вариант лечения или избежать дополнительного системного лечения.

2.3. Комбинированный анализ экспрессии ChoKα и ChoKβ как мощный инструмент для прогноза NSCLC

В TCD Pharma ранее было продемонстрировано, что ChoKα играет существенную роль при раке легкого, придя к заключению, что чрезмерная экспрессия этого фермента является независимым прогнозирующим фактором выживания без рецидивов и выживания, специфического относительно рака легкого, у пациентов с ранней стадией NSCLC (Ramirez de Molina, A. at al., Lancet Oncol 8, 889-97 (2007). Здесь продемонстрировано прогнозирующее значение экспрессии ChoKβ в опухолевых образцах от пациентов с NSCLC. Такие результаты строго говорят о том, что низкая экспрессия ChoKβ связана с худшим клиническим итогом для пациентов с ранней стадией заболевания.

На базе этих первоначальных обнаружений высокую экспрессию ChoKα и низкую экспрессию ChoKβ определяют как неблагоприятные факторы, которые связаны с плохим выживанием. Действительно, обнаружено, что пациенты с низкими ChoKα и одновременно высокими ChoKβ уровнями экспрессии демонстрируют более долгое выживание, специфическое относительно рака легкого, и выживание без рецидивов, тогда как пациенты с высокими уровнями ChoKα и одновременно низкими уровнями ChoKβ демонстрируют более короткое выживание (p=0,19 для общего выживания и p=0,099 для выживания без рецидивов) (фиг.13).

Вывод из анализа Каплана-Мейера для двух других групп комбинаций: для этих двух групп наблюдали, что низкие уровни экспрессии ChoKα и одновременно высокие уровни экспрессии ChoKβ и высокие уровни экспрессии ChoKα и одновременно высокие уровни экспрессии ChoKβ демонстрируют промежуточное поведение и отсутствие различий в выживании (фиг.13).

Согласно многоэлементному регрессионному анализу Кокса пациенты с высокими уровнями ChoKα и одновременно низкими уровнями ChoKβ демонстрируют существенную тенденцию к связи со специфической смертью от рака легкого (HR 7,8 (95% CI, 0,98-67,5); p=0,06) и с рецидивом рака (HR 10,5 (95% CI, 1,22-90,0); p=0,03). Эти результаты строго показывают, что комбинированный эффект экспрессии обеих изоформ ChoK может составить лучший прогностический фактор, чем каждая в отдельности.

2.4. Выводы

Определение экспрессии гена ChoKβ может прогнозировать клинический итог у пациентов с NSCLC. Такой профиль экспрессии может быть полезен для улучшения клинического ухода за пациентами с NSCLC. Кроме того, результаты, представленные в этом сообщении, предполагают, что комбинированный эффект обеих изоформ ChoK обеспечивает мощный инструмент для идентификации пациентов с высоким риском рецидива и смерти от рака легкого для пациентов с ранней стадией NSCLC.

3. Применение PEMT и/или ChoKβ в качестве маркера реакции на лечение ингибиторами ChoKα

3.1. Фосфатидилэтаноламинметилтрансфераза (PEMT): функциональная связь между ChoKα и ChoKβ

У млекопитающих одной из точек метаболической связи между двумя ветвями пути Кеннеди для генерации PE и PC является фермент фосфатидилэтаноламинметилтрансфераза (PEMT). Этот фермент трансформирует PE в PC посредством двух последовательных метилирований (Vance & Ridgway, 1988). Описано, что этот фермент обладает существенной активностью только в клетках печени, причем его вклад составляет 30% от общего содержания PC клетки (DeLong at al., 1999; Li at al., 2005; Reo 35 at al., 2002; Sundler & Akesson, 1975). Для определения, вовлечен ли этот фермент в кросс-активность ChoKα и ChoKβ, определяют характер экспрессии гена PEMT в ответ на обработку MN58b в различных клеточных системах. С этой целью клетки Hek293T, Jurkat, H1299 и SW780 обрабатывают 20 мкМ MN58b и определяют экспрессию PEMT посредством количественной PCR. Результаты суммированы на фиг.14, где наблюдают, что во всех случаях имеется повышение уровней PEMT мРНК в ответ на специфическое ингибирование ChoKα посредством MN58b.

Кроме того, как описано выше, обработка посредством MN58b также индуцирует чрезмерную экспрессию ChoKβ на транскрипционном уровне. Для определения, связаны ли эти эффекты, анализировали уровни экспрессии PEMT посредством количественной PCR в клетках, трансфицированных вектором экспрессии ChoKβ, относительно клеток, трансфицированных пустым вектором в качестве контроля. Как можно наблюдать на фиг.16, в клетках, чрезмерно экспрессирующих ChoKβ, происходит индуцирование экспрессии PEMT, указывая, что простая чрезмерная экспрессия этой изоформы достаточна, чтобы вызвать транскрипционное индуцирование PEMT.

Claims (6)

1. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающий определение уровней экспрессии ChoKβ в образце от указанного пациента, где пониженные уровни ChoKβ относительно уровней в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз, где рак представляет собой NSCLC и где прогноз определяют посредством определения параметра, выбранного из группы, состоящей из выживания и выживания без рецидивов.

2. Способ по п.1, где рак имеет высокие уровни экспрессии ChoKα.

3. Способ по п.1 или 2, где определение уровней экспрессии ChoKβ или уровней экспрессии ChoKα выполняют путем определения уровней мРНК, кодирующей указанный белок.

4. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающий определение уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ в образце от указанного пациента, где пониженные уровни ChoKα и высокие уровни ChoKβ относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует хороший прогноз, где рак представляет собой NSCLC и где прогноз определяют посредством определения параметра, выбранного из группы, состоящей из выживания и выживания без рецидивов.

5. Способ по п.4, где рак имеет высокие уровни экспрессии ChoKα.

6. Способ по п.4, где определение уровней экспрессии ChoKβ или уровней экспрессии ChoKα выполняют путем определения уровней мРНК, кодирующей указанный белок.

Images