RU2496783C1

RU2496783C1 - ЛЕГКО ПРОНИКАЮЩИЙ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ МЫЛКИЙ АМФИФИЛЬНЫЙ ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА γ

Info

Publication number: RU2496783C1
Application number: RU2012121477/10A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Витальевна Ямковая; Ольга Петровна Колесникова; Станислав Николаевич Загребельный; Лев Евгеньевич Панин; Виталий Иванович Ямковой
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ"
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2013-10-27

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению интерфероногенных противовирусных препаратов на основе дрожжевой РНК, и может быть использовано в медицине. В качестве индуктора IFN-γ используется легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК 80-90%, олеиновая кислота 10-20%. Изобретение позволяет эффективно индуцировать выработку интерферона γ (IFN-γ) с использованием доступных и недорогих компонентов. 2 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины и фармацевтической промышленности, в частности к интерфероногенным противовирусным препаратам на основе дрожжевой РНК.

В клинической практике для регуляции интерфероногенеза и лечения вирусных инфекций, таких как гепатит С, грипп, ВИЧ-инфекции и др., применяются препараты на основе двуспиральной РНК (дсРНК), например Ридостин [1].

Наиболее близким к предлагаемому является липосомальный индуктор интерферона, представляющий собой водно-солевой раствор дсРНК, полученной из киллерных штаммов дрожжей, одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae, фосфатидилхолина, холестерина, альфа-токоферол ацетата, сахарозы и хлорида натрия [2]. Входящие в состав данного индуктора жиры образуют комплексы с РНК, что придает последней амфифильные своства, защищает от действия нуклеаз и способствует проникновению ее в организм [3]. Как следствие, липосомальный индуктор эффективно стимулирует биосинтез эндогенного интерферона.

Однако он состоит из большого числа редких и дорогостоящих соединений и поэтому малопригоден для массового производства.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного индуктора интерферона γ (IFN-γ) с использованием доступных и недорогих компонентов.

Цель достигается тем, что в качестве индуктора IFN-γ используется легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК 80-90%, олеиновая кислота 10-20% (предполагаемое рыночное название - Виталанг-2).

Пример осуществления предлагаемого способа 1

Препарат Виталанг-1 (чистая гидрофильная высокополимерная дрожжевая РНК) с теоретической весовой экстинкцией 20,0 ОЕ₂₆₀/мг выделяли по методу [4]. Препарат хорошо растворяется в воде (30 мг препарата растворяется в 1 мл воды при комнатной температуре в течение нескольких секунд).

Препарат Виталанг-2 с весовой экстинкцией 17,8 ОЕ₂₆₀/мг выделяли по методу [5]. Препарат растворяется в воде удовлетворительно (30 мг препарата растворяется в 1 мл воды при комнатной температуре только через 30-60 мин при периодическом встряхивании), водный раствор мылкий, нерастворенные крупинки скользкие.

Пример осуществления предлагаемого способа 2

Содержание олеиновой кислоты в препарате Виталанг-2 рассчитывали по весовой экстинкции следующим образом: из теоретической весовой экстинкции вычитали весовую экстинкцию препарата Виталанг-2, полученное значение делили на теоретическую весовую экстинкцию и умножали на 100%. Результат 11,0%.

Пример осуществления предлагаемого способа 3

Содержание олеиновой кислоты в препарате Виталанг-2 определяли по обесцвечиванию бромной воды следующим образом: к 4 мл водного раствора препарата Виталанг-1 с оптической плотностью 26,6 ОЕ₂₆₀/мл и к 4 мл водного раствора препарата Виталанг-2 с оптической плотностью 28,6 ОЕ₂₆₀/мл добавляли по 100 мкл бромной воды, растворы перемешивали, переливали в 1 см прямоугольные кварцевые кюветы, закрывали их парафильмом и измеряли в течение 4 ч оптическую плотность при 445 нм первого раствора против второго. Оптическая плотность увеличивалась и через 2 ч от начала реакции достигала плато - 0,1 ОЕ₄₄₅/мл. Полученное значение делили на 145 (молярный коэффициент экстинкции бромной воды при 445 нм) и умножали на 282,18 (молекулярная масса олеиновой кислоты). Получали концентрацию олеиновой кислоты в растворе препарата Виталанг-2. Концентрацию высокополимерной РНК в этом растворе рассчитывали делением его оптической плотности при 260 нм на его весовую экстинкцию. Две концентрации суммировали, концентрацию олеиновой кислоты делили на полученную сумму и умножали на 100%. Результат 10,8%.

Пример осуществления предлагаемого способа 4

Для определения способности препаратов Виталанг-1 и Виталанг-2 проникать через биологические мембраны в 3 одинаковых стеклянных флакончика на 6 мл с завинчивающимися пробками помещали по 7 продолговатых сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus и заливали их:

1-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-1 (27,3 ОЕ₂₆₀/мл),

2-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-2 (27,1 ОЕ₂₆₀/мл),

3-й - 4,8 мл дистиллированной воды.

Через 22 ч инкубации при комнатной температуре замеряли оптическую плотность растворов в 1-м и 2-м флакончиках против 3-го. Получилось: в 1-м - 26,4 ОЕ₂₆₀/мл, во 2-м - 22,9 ОЕ₂₆₀/мл.

Т.е. клетки поглотили Виталанга-2 в 4,7 раза больше, чем Виталанга-1. Далее растворы из флакончиков сливали и промывали каждый 5-ю порциями по 5 мл дистиллированной воды. Замерив оптическую плотность 5-й порции из 1-го и 2-го флакончика против 3-го, получили:

в 1-м - 0,024 ОЕ₂₆₀/мл,

во 2-м - 0,019 ОЕ₂₆о/мл.

Сочные мешочки во всех 3-х флакончиках измельчали стеклянной палочкой, из полученных суспензий отбирали по 100 мкл раствора и, разбавив его в 50 раз дистиллированной водой, замеряли оптическую плотность растворов из 1-го и 2-го флакончика против 3-го. Получилось:

в 1-м - 0,065 ОЕ₂₆₀/мл,

во 2-м-0,318 ОЕ₂₆₀/мл.

Т.е. Виталанг-2 проникает через биологические мембраны минимум в 4, раза эффективнее Виталанга-1.

Пример осуществления предлагаемого способа 5

Для определения способности препарата Виталанг-2 индуцировать биосинтез эндогенного IFN-γ использовали мышей самцов гибридов CBF1 8-10 недельного возраста, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [6].

Концентрацию IFN-y в pg/ml в сыворотке крови мышей определяла согласно рекомендациям производителя соответствующего теста (Mouse IFN-y ELISA Set BD Biosciences).

Виталанг-2 растворяли в среде RPMI 1640, встряхивая 30 мин \ вводили мышам (n=5 в каждой группе) в различных дозах (1, 5 и 10 мг/кг однократно внутримышечно в объеме 0,1 мл. Забор крови на сыворотку производили через 3, 6, 9, 12, 24 и 48 ч. Ридостин (положительный контроль растворяли и вводили аналогично в дозе 0,07 мг/кг.

Результаты определения IFN-γ в pg/ml в сыворотке крови представлены в таблице в виде средних значений:

	Ридостин 0,07 мг/кг	Виталанг-2 1 мг/кг
3 ч	348,2	599,2
6 ч	273,2	67,4
9 ч	920	252
12 ч	618,2	592
24 ч	330,5	182,6
48 ч	773,2	1030,5

Как видно из таблицы, Виталанг-2 в дозе 1 мг/кг стимулирует большую продукцию IFN-γ по сравнению с Ридостином на сроке 3 и 48 ч после введения.

Изменение концентрации IFN-γ в pg/ml в сыворотке крови через 9

ч после введения Виталанга-2 в дозах 1,5 и 10 мг/кг представлено ниже:

Отрицательный контроль	Виталанг-21 мг/кг	Виталанг-25 мг/кг	Виталанг-210 мг/кг
71,2	252	1252	1430,2

Как видно из таблицы, Виталанг-2 на сроке 9 ч после введения классически дозозависимо стимулирует продукцию IFN-γ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).

Источники информации

1. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. - М.: Медицина, 1998. - С.147-151.

2. Патент RU 2306936 С2, 10.08.2005.

3. Патент US 6071533 А, 06.06.2000.

4. Патент RU 2392328 С2, 10.10.2009.

5. Патент RU 2403288 С1, 10.11.2010.

6. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Страсбург, 1986.

Claims

Индуктор интерферона γ на основе высокополимерной дрожжевой РНК, отличающийся тем, что в качестве действующего начала он содержит легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс одноцепочечной высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК 80-90%, олеиновая кислота 10-20%.