RU2495048C1 - Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease - Google Patents

Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease Download PDF

Info

Publication number
RU2495048C1
RU2495048C1 RU2012115397/04A RU2012115397A RU2495048C1 RU 2495048 C1 RU2495048 C1 RU 2495048C1 RU 2012115397/04 A RU2012115397/04 A RU 2012115397/04A RU 2012115397 A RU2012115397 A RU 2012115397A RU 2495048 C1 RU2495048 C1 RU 2495048C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
pam
peptides
css
kkk
Prior art date
Application number
RU2012115397/04A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Андрей Валентинович Исаев
Сергей Александрович Кетлинский
Андрей Семенович Симбирцев
Александр Владимирович Петров
Александр Александрович Колобов
Алексей Николаевич Прусаков
Светлана Адамовна Синева
Елена Анатольевна Варюшина
Георгий Вячеславович Александров
Original Assignee
Андрей Валентинович Исаев
Сергей Александрович Кетлинский
Андрей Семенович Симбирцев
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Андрей Валентинович Исаев, Сергей Александрович Кетлинский, Андрей Семенович Симбирцев filed Critical Андрей Валентинович Исаев
Priority to RU2012115397/04A priority Critical patent/RU2495048C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2495048C1 publication Critical patent/RU2495048C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.
SUBSTANCE: invention refers to immunology and medicine, namely to new peptides of general formula: X-CC-C(Y)-CC-Z, wherein X is a B-cell epitope of apolipoprotein B100 protein; C is an amino acid residue specified in K or R; Y is an immunoadjuvant specified in a group of Pam1CSS-; Pam2CSS-, Pam3CSS-; Z - T-helper epitope specified in AKFVAAWTLKAAA, KLIPNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE.
EFFECT: peptide preparations possess higher antisclerotic activity as compared to their analogues, and the compositions thereof are of practical interest as a vaccine for preventing and treating atherosclerotic vascular disease.
9 cl, 1 dwg, 6 tbl, 7 ex

Description

Изобретение относится к области иммунологии и медицины, а именно к новым пептидам общей формулы: Х-ЦЦ-Ц(У)-ЦЦ-Z,The invention relates to the field of immunology and medicine, namely to new peptides of the general formula: X-CZ-C (U) -TsZ-Z,

где Х - В-клеточный эпитоп белка аполипопротеина В 100;where X is the B-cell epitope of the apolipoprotein B 100 protein;

Ц - аминокислотный остаток, выбранный из К или R;C is an amino acid residue selected from K or R;

Y - иммуноадъювант, выбранный из группы Pam1CSS-; Pam2CSS-, Pam3CSS-.Y - immunoadjuvant selected from the group Pam 1 CSS-; Pam 2 CSS, Pam 3 CSS.

Z - Т-хелперный эпитоп, выбранный из AKFVAAWTLTCAAA, KLI-PNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;Z - T-helper epitope selected from AKFVAAWTLTCAAA, KLI-PNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;

и препаратам на основе указанных пептидов для профилактики и лечения атеросклероза.and preparations based on these peptides for the prevention and treatment of atherosclerosis.

Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, в результате которого происходит вариабельная комбинация изменений внутренней оболочки (интимы) артерий, которое вызывает утолщение внутренних слоев (внутренней оболочки) больших и средних артерий, а также накопление липидов, сложных углеводов, фиброзной ткани, компонентов крови, кальцификацию. Атеросклероз снижает кровоток и может вызвать ишемию и некроз тканей в органах, снабжаемых сосудами, которые подверглись заболеванию. Атеросклероз является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, инсульт и болезни периферических артерий. Он является основной причиной смертности в западном мире и, как предсказывают, в течение двух десятилетий станет ведущей причиной смертности во всем мире (RU 2322260, 2006).Atherosclerosis is a chronic disease that results in a variable combination of changes in the inner lining (intima) of the arteries, which causes a thickening of the inner layers (inner lining) of the large and medium arteries, as well as the accumulation of lipids, complex carbohydrates, fibrous tissue, blood components, calcification. Atherosclerosis reduces blood flow and can cause ischemia and tissue necrosis in organs supplied with vessels that have been affected. Atherosclerosis is a major cause of cardiovascular disease, including myocardial infarction, stroke, and peripheral artery disease. It is the leading cause of death in the Western world and is predicted to become the leading cause of death worldwide in two decades (RU 2322260, 2006).

Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), во внеклеточном матриксе сосуда. Частицы ЛПНП подвергаются модификации в результате окисления. Продукты, вырабатываемые при окислении ЛПНП, являются токсичными для клеток сосудов, вызывают воспаление и инициируют образование бляшек. Во многих отношениях атеросклероз представляет собой ответ на повреждение, включающий воспаление и фиброз. Эпитопы в окисленных ЛПНП узнаются иммунной системой и вызывают стимуляцию образования антител, которые обычно направлены против структур на основе тех или иных пептидов, в частности, против айолипопротеина В (ApoB) и его фрагментов (RU 2322260, 2006).The disease begins with the accumulation of lipoproteins, primarily low-density lipoproteins (LDL), in the extracellular matrix of the vessel. LDL particles undergo modification as a result of oxidation. Products produced by the oxidation of LDL are toxic to vascular cells, cause inflammation and initiate plaque formation. In many ways, atherosclerosis is a response to damage, including inflammation and fibrosis. Epitopes in oxidized LDL are recognized by the immune system and cause stimulation of the formation of antibodies, which are usually directed against structures based on certain peptides, in particular, against Aiolipoprotein B (ApoB) and its fragments (RU 2322260, 2006).

ApoB является белком, постоянно ассоциирующимся с ЛПНП. ApoB содержит 4563 аминокислоты. Окисленные ЛПНП приводят к деградации ApoB на фрагменты, аполипопротеин В фрагментируется и альдегидные аддукты соединяются с положительно заряженными аминокислотами, в частности с лизином. При этом пептидные последовательности, которые обычно не экспонирующиеся из-за трехмерной структуры аполипопротеина В (иммунные реакции почти исключительно направлены против пептидных последовательностей длиной в 5-6 аминокислот), становятся доступными для иммунных клеток и становятся иммуногенными из-за гаптенилирования с альдегидами. Исходя из этого, можно предположить, что естественные и искусственно синтезированные пептиды на основе ApoB могут быть использованы для создания вакцин против атеросклероза.ApoB is a protein that is constantly associated with LDL. ApoB contains 4563 amino acids. Oxidized LDL leads to degradation of ApoB into fragments, apolipoprotein B is fragmented, and aldehyde adducts combine with positively charged amino acids, in particular lysine. In this case, peptide sequences that are usually not exposed due to the three-dimensional structure of apolipoprotein B (immune reactions are almost exclusively directed against peptide sequences 5-6 amino acids in length) become accessible to immune cells and become immunogenic due to haptenylation with aldehydes. Based on this, it can be assumed that natural and artificially synthesized peptides based on ApoB can be used to create vaccines against atherosclerosis.

В настоящее время показано (George et al. Atherosclerosis, Volume 138, 1998: "Hyperimmunization of apo-E-deficient mice with homologous malondialdehyde low-density lipoprotein suppresses early atherogenesis", p.147-152), что введение некоторых подобных пептидов против окисленных ЛПНП снижает развитие атеросклероза. Вместе с тем проведенные исследования показали, что это происходит далеко не всегда. В частности, при исследовании влияния пептидов, входящих в ApoB (RU 2296582, 2007), на развитие атеросклероза выяснилось, что иммунизация с применением смеси пептидов #10, 45, 154, 199 и 240 дает толчок к усилению развития атеросклероза. Иммунизация с применением других пептидных последовательностей, например, пептидных последовательностей #1 и с 30 по 34, в целом не влияет на развитие атеросклероза. Т.е. иммунные реакции против окисленных ЛПНП могут защищать против развития, вносить вклад в развитие атеросклероза и совсем не оказывать какого-либо эффекта в зависимости от того, на какие структуры окисленных ЛПНП они направлены.It has now been shown (George et al. Atherosclerosis, Volume 138, 1998: "Hyperimmunization of apo-E-deficient mice with homologous malondialdehyde low density lipoprotein suppresses early atherogenesis", p.147-152) that the introduction of some of these peptides against oxidized LDL reduces the development of atherosclerosis. However, studies have shown that this does not always happen. In particular, when studying the effect of peptides included in ApoB (RU 2296582, 2007) on the development of atherosclerosis, it was found that immunization using a mixture of peptides # 10, 45, 154, 199, and 240 gives impetus to increased development of atherosclerosis. Immunization using other peptide sequences, for example, peptide sequences # 1 and from 30 to 34, generally does not affect the development of atherosclerosis. Those. immune responses against oxidized LDL can protect against development, contribute to the development of atherosclerosis and have no effect at all, depending on which structures of oxidized LDL they are directed to.

В этой связи поиск пептидных структур ApoB, способных предотвращать развитие атеросклероза и служить основой для создания вакцин против атеросклероза является достаточно актуальной и практически важной задачей.In this regard, the search for peptide structures of ApoB that can prevent the development of atherosclerosis and serve as the basis for the creation of vaccines against atherosclerosis is quite relevant and practically important.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому решению к заявляемой группе изобретений являются фрагменты ApoB, а также фармацевтические композиции и вакцины на их основе, предлагаемые для профилактики и терапии атеросклероза (RU 2296582, 2007). В рамках изобретения были получены 38 пептидных последовательностей, перспективных для диагностики и лечения атеросклероза. Наиболее перспективными для лечения атеросклероза, по мнению, авторов являются пептиды p1-EEEMLENVSLVCPKDATRFK, p2-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS, p74-VISIPRLQAEARSEILAHWS и p301-HTFLIYITELLKKLQSTTVM. Как показали исследования, проведенные авторами настоящего изобретения, среди других пептидов перспективными являются предлагаемые в ближайшем аналоге пептиды р45-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK и р210-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH.The closest in technical essence and the achieved solution to the claimed group of inventions are fragments of ApoB, as well as pharmaceutical compositions and vaccines based on them, proposed for the prevention and treatment of atherosclerosis (RU 2296582, 2007). In the framework of the invention, 38 peptide sequences were obtained that are promising for the diagnosis and treatment of atherosclerosis. The most promising for the treatment of atherosclerosis, according to the authors, are the peptides p1-EEEMLENVSLVCPKDATRFK, p2-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS, p74-VISIPRLQAEARSEILAHWS and p301-HTFLIYITELLKKLQSTTVM. As shown by studies conducted by the authors of the present invention, among other peptides, the peptides p45-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK and p210-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH proposed in the closest analogue are promising.

Наряду с возможностью использования индивидуальных пептидов отмечалась возможность применения в качестве вакцинных препаратов против атеросклероза смесей пептидов с канонизированным бычьим сывороточным альбумином и гидратом окиси алюминия.Along with the possibility of using individual peptides, the possibility of using mixtures of peptides with canonized bovine serum albumin and alumina hydrate as vaccines against atherosclerosis was noted.

Недостатком вышеуказанных пептидов и вакцинных препаратов является их недостаточная эффективность при атеросклерозе.The disadvantage of the above peptides and vaccines is their lack of effectiveness in atherosclerosis.

Задачей, решаемой авторами, являлось получения более эффективных препаратов для профилактики и лечения атеросклероза сосудов на основе пептидов, а также расширение круга возможных пептидных препаратов на основе фрагментов ApoB.The problem solved by the authors was to obtain more effective drugs for the prevention and treatment of vascular atherosclerosis based on peptides, as well as expanding the range of possible peptide drugs based on ApoB fragments.

Применение фрагмента иммуноадъюванта в структуре должно былоThe use of a fragment of an immunoadjuvant in the structure was to

обеспечить более простую доставку вакцинной конструкции к иммуноком-петентным клеткам.to provide easier delivery of the vaccine construct to immunocompetent cells.

Использование фрагмента T-хелперного эпитопа в заявляемом комплексе представлялось целесообразным в связи с возможностью в его присутствии снижения или исключения генетически обусловленных вариаций в иммунном ответе на B-эпитоп, исходя из того, что пептиды, которые кодируют T-клеточную детерминанту, стимулирующую Th-клетки млекопитающих, связываются с продуктами главного комплекса гистосовместимости второго типа большинства гаплотипов и вызывают сильный CD4+Th ответ у большинства членов аутбредной популяции. Это, в частности, наблюдалось в случае использования фрагмента QYIKANSKFIGITE столбнячного токсина, пептида KLIPNASLIENCTKAEL из белка вируса чумы собак, пептида GALNNRFQIKGVELKS из легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа, или пептид AKFVAAWTLKAAA, получивший название PADRE (Panina-Bordignon P. et.al. Eur.J.Immunol. (1989) 19, 2237-2242).The use of a fragment of the T-helper epitope in the claimed complex seemed appropriate due to the possibility in its presence of reducing or eliminating genetically determined variations in the immune response to the B-epitope, based on the fact that peptides that encode a T-cell determinant that stimulates Th cells mammals, bind to the products of the main histocompatibility complex of the second type of most haplotypes and cause a strong CD4 + Th response in most members of the outbred population. This, in particular, was observed with the use of the QYIKANSKFIGITE fragment of tetanus toxin, the KLIPNASLIENCTKAEL peptide from the dog plague virus protein, the GALNNRFQIKGVELKS peptide from the influenza hemagglutinin light chain peptide, or the AKFVAAWTLKAAA peptide, which was named P. Pordigne et al. Pordign.aldon.ald.onordon.ald.onordon.ald. J. Immmunol. (1989) 19, 2237-2242).

Поставленная задача была решена путем использования для данных целей комплексных препаратов, имеющих в своей структуре как фрагменты ApoB-100, так дополнительно фрагменты иммуноадъюванта и T-хелперного эпитопа.The problem was solved by using complex preparations for these purposes, having in their structure both fragments of ApoB-100 and additionally fragments of the immunoadjuvant and T-helper epitope.

Технический результат достигался созданием пептида общей формулы:The technical result was achieved by creating a peptide of the General formula:

X-ЦЦ-Ц(Y)-ЦЦ-Z,X-CC-C (Y) -CC-Z,

где X - B-клеточный эпитоп белка аполипопротеина B 100;where X is the B-cell epitope of the apolipoprotein B 100 protein;

Ц - аминокислотный остаток, выбранный из K или R;C is an amino acid residue selected from K or R;

Y - иммуноадъювант, выбранный из группы Pam1CSS-; Pam2CSS-, Pam3CSS-.Y - immunoadjuvant selected from the group Pam 1 CSS-; Pam 2 CSS, Pam 3 CSS.

Z - T-хелперный эпитоп, выбранный из AKFVAAWTLKAAA, KLI-PNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;Z is a T-helper epitope selected from AKFVAAWTLKAAA, KLI-PNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;

и композиций на их основе.and compositions based on them.

В качестве B-клеточных эпитопов белка Apo-B 100 он содержит пептидные фрагменты Apo B 100, в частности, описанные в работе (RU 2296582, 2007). Лучшие результаты были получены при использовании для данных целей следующих пептидов: пептид, идентичный последовательности 43-62 аполипопротеина В 100 человека (p2); пептид, идентичный последовательности 661-680 аполипопротеина B 100 человека (p45); пептид, идентичный последовательности 3136-3155 аполипопротеина В 100 человека (p210).As B-cell epitopes of Apo-B 100 protein, it contains peptide fragments of Apo B 100, in particular, described in (RU 2296582, 2007). The best results were obtained using the following peptides for these purposes: a peptide identical to the sequence of 43-62 apolipoprotein B 100 person (p2); a peptide identical to the sequence 661-680 of human apolipoprotein B 100 (p45); a peptide identical to the sequence of 3136-3155 apolipoprotein B 100 person (p210).

В качестве иммуноадъюванта используются, как правило, известные соединения, способные обеспечивать активацию адаптивного иммунного ответа с образованием антигенспецифических в отношении определенного патогена клонов T- и B-лимфоцитов, а также Т-клеток памяти.As an immunoadjuvant, as a rule, known compounds are used that are capable of activating an adaptive immune response with the formation of antigen-specific clones of T and B lymphocytes, as well as memory T cells, with respect to a particular pathogen.

К их числу относятся, в частности, пептиды, из группы Pam1CSS-; Pam2CSS-, Pam3CSS-.These include, in particular, peptides from the group Pam 1 CSS-; Pam 2 CSS, Pam 3 CSS.

Лучшие результаты при применении пептидов достигались при использовании в качестве иммуноадъюванта соединения (Pam2Cys), имеющего структурную формулуThe best results with the use of peptides were achieved using the compound (Pam 2 Cys) having the structural formula as an immunoadjuvant

Figure 00000001
Figure 00000001

Между B-эпитопом и иммуноадъювантом расположена последовательность из двух остатков положительно заряженных аминокислот (например, лизина или аргинина). Аналогичная последовательность находится между иммуноадъювантом и Т-эпитопом. Эти последовательности служат сайтами, по которым проходит внутриклеточный процессинг вакцинной конструкции до свободных детерминант.Between the B-epitope and the immunoadjuvant is a sequence of two residues of positively charged amino acids (for example, lysine or arginine). A similar sequence is found between the immunoadjuvant and the T-epitope. These sequences serve as sites through which intracellular processing of the vaccine construct passes to free determinants.

В качестве T-хелперного эпитопа были использованы пептидыPeptides used as T-helper epitope

AKFVAAWTLKAAA,AKFVAAWTLKAAA,

KLIPNASLIENCTKAEL, иKLIPNASLIENCTKAEL, and

QYIKANSKFIGITE.QYIKANSKFIGITE.

Пептиды получают по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе, в растворе или используя методы ковергентного синтеза (например, описанной J.M. Steward and J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969). При твердофазном синтезе первая аминокислота присоединяется к нерастворимому полимеру, наращивание полипептидной цепи производится последовательно или на стадии конденсации используются защищенные фрагменты, удаление избытков реагентов осуществляется фильтрованием с последующей промывкой Синтез может быть проведен с использованием Boc/Bzl или Fmoc/tBu технологии, или любой другой системы ортогональных защитных групп.По завершении сборки целевой последовательности проводят отщепление пептида от полимера, сопровождающееся, как правило, удалением постоянных защитных групп. Очистку конечного продукта проводят, как правило, хроматографическими методами, например, с помощью обращенно-фазовой или ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии.The peptides are prepared using standard solid phase peptide synthesis technology, in solution, or using coherent synthesis methods (e.g., as described by J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969). In solid-phase synthesis, the first amino acid is attached to an insoluble polymer, the polypeptide chain is built up sequentially or protected fragments are used at the condensation stage, excess reagents are removed by filtration, followed by washing. Synthesis can be carried out using Boc / Bzl or Fmoc / tBu technology, or any other system orthogonal protective groups. Upon completion of the assembly of the target sequence, the peptide is cleaved from the polymer, usually accompanied by removal of permanent protecting groups. Purification of the final product is carried out, as a rule, by chromatographic methods, for example, using reversed-phase or ion-exchange high-performance liquid chromatography.

Проведенные испытания показали, что наряду с индивидуальными комплексными пептидами для предотвращения развития атеросклероза могут использоваться и их смеси. В частности, лучшие результаты были получены при использовании в качестве вакцины против атеросклероза препарата, содержащего смесь пептидов:Tests have shown that, along with individual complex peptides, mixtures of them can be used to prevent the development of atherosclerosis. In particular, the best results were obtained when using a drug containing a mixture of peptides as a vaccine against atherosclerosis:

- Р2-ИРП2-ТЭ1:- P2-IRP2-TE1:

Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam2CSS)KK-AKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam 2 CSS) KK-AKFVAAWTLKAAA

- Р45-ИРП2-ТЭ1:- R45-IRP2-TE1:

Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam2CSS)KK-AKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam 2 CSS) KK-AKFVAAWTLKAAA

- Р210-ИРП2-ТЭ1:- P210-IRP2-TE1:

Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam2CSS)KK-AKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam 2 CSS) KK-AKFVAAWTLKAAA

в соотношении 0,25-0,5:0,25-0,5:0,25-0,5. Наибольшая эффективность достигалась при соотношении пептидов 1:1:1. Уменьшение доли одного из пептидов в смеси менее чем до 0,25 приводило к существенному падению антиате-росклеротической активности.in the ratio of 0.25-0.5: 0.25-0.5: 0.25-0.5. The greatest efficiency was achieved with a peptide ratio of 1: 1: 1. A decrease in the proportion of one of the peptides in the mixture to less than 0.25 led to a significant decrease in antiatherosclerotic activity.

На фиг.1 приведены приведены микрофотографии препаратов нисходящей аорты en face у мышей Apo E (-/-)после окрашивания масляным красным О Оригинальное увеличение в 40 раз.Figure 1 shows micrographs of preparations of the descending aorta en face in Apo E (- / -) mice after staining with oil red O Original increase of 40 times.

А) группа мышей №4 (иммунизация смесью пептидов), Б) группа мышей №1 (контроль, введение PBS), В) группа мышей №2 (контроль, введение AK-FVAAWTLKAAA-ТЭ 1). В приложении 1 приведены формулы основных используемых соединений.A) group of mice No. 4 (immunization with a mixture of peptides), B) group of mice No. 1 (control, PBS administration), C) group of mice No. 2 (control, administration of AK-FVAAWTLKAAA-TE 1). Appendix 1 provides the formulas of the main compounds used.

Сущность и преимущества заявляемого изобретения иллюстрируются следующими примерамиThe essence and advantages of the claimed invention are illustrated by the following examples.

Пример 1. Синтез исходных пептидов.Example 1. Synthesis of starting peptides.

Синтез пептидов проводился твердофазным способом на синтезаторе Applied Biosystems 430A по методу in situ с использованием noc-boc-защищенных производных аминокислот (Schnolzer M. et. al. Int. J. Pept. Prot. Res. - 1992. - v.40. - N2 - р.180-193). В работе были использованы следующие производные трифункциональных аминокислот Boc-(Mts)-Arg-OH, Boc-(Bzl)-Ser-OH, Boc-(Bzl)-Thr-OH, Boc-(Dnp)-His-OH, Boc-(OBzl)-Glu-OH, Boc-(OBzl)-Asp, Boc-(ClZ)-Lys, Boc-(Cl2Bzl)-Tyr-OH. Для синтеза пептидов использован 0,1 мМ Вос-(Bzl)-Ser-РАМ-полимера, Boc-(Dnp)-His-PAM-полимера, Boc-(ClZ)-Lys-PAM-полимера и Boc-βAla-PAM-полимера. В качестве нерастворимой матрицы использован 1% сополимер стирола и дивинилбензола.The peptides were synthesized by the solid state method on an Applied Biosystems 430A synthesizer according to the in situ method using noc-boc protected amino acid derivatives (Schnolzer M. et. Al. Int. J. Pept. Prot. Res. - 1992. - v.40. - N2 - p. 180-193). The following derivatives of trifunctional amino acids Boc- (Mts) -Arg-OH, Boc- (Bzl) -Ser-OH, Boc- (Bzl) -Thr-OH, Boc- (Dnp) -His-OH, Boc- were used in the work (OBzl) -Glu-OH, Boc- (OBzl) -Asp, Boc- (ClZ) -Lys, Boc- (Cl2Bzl) -Tyr-OH. The peptides were synthesized using 0.1 mM Boc- (Bzl) -Ser-PAM-polymer, Boc- (Dnp) -His-PAM-polymer, Boc- (ClZ) -Lys-PAM-polymer and Boc-βAla-PAM- polymer. As an insoluble matrix used 1% copolymer of styrene and divinylbenzene.

Деблокирование проводили неразбавленной трифторуксусной кислотой (TFA) два раза по 1 минуте. Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления 3х-кратного избытка диизопропилэтиламина непосредственно в реакционную смесь, на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором диизопропилэтила-мина (DIPEA) в диметилформамиде (DMF). Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 2-5-кратные избытки реагентов. Смесь производных аминокислот готовили непосредственно перед внесением в реакционный сосуд.The release was carried out with undiluted trifluoroacetic acid (TFA) twice in 1 minute. The neutralization during the first condensation was carried out by adding a 3 x excess of diisopropylethylamine directly to the reaction mixture, at the stage of addition of the amino acid residue; re-condensation was carried out after additional washing of the peptidyl polymer with 10% solution of diisopropylethylamine (DIPEA) in dimethylformamide (DMF). The addition of amino acid residues was carried out by the method of 1-hydroxybenzotriazole esters using 2-5-fold excess of reagents. A mixture of amino acid derivatives was prepared immediately before being added to the reaction vessel.

Контроль за полнотой реакции конденсации проводили с помощью нингидринового и бромфенолового тестов.The completeness of the condensation reaction was monitored using ninhydrin and bromophenol tests.

После завершения наращивания пептидной цепи пептидил-полимеры, содержащие гистидин, обрабатывали смесью DMF: этандитиол (EDT):DIPEA=7:2:1 в течение 30 минут и промывали DMF и хлористым метиленом (DCM). Все пептидил-полимеры обрабатывали TFA два раза по 1 минуте, промывали DCM и диэтиловым эфиром, извлекали из реактора и высушивали.After completion of the peptide chain extension, the peptidyl polymers containing histidine were treated with a mixture of DMF: ethanedithiol (EDT): DIPEA = 7: 2: 1 for 30 minutes and washed with DMF and methylene chloride (DCM). All peptidyl polymers were treated with TFA twice in 1 minute, washed with DCM and diethyl ether, removed from the reactor and dried.

Отщепление пептидов от полимера и удаление боковых защитных группировок проводили с помощью жидкого фтористого водорода по Sn1/Sn2 механизмам в присутствии скавенджеров. Для этого 1 г пептидил-полимера помещали в реактор для работы с фтористым водородом (HF), добавляли 0.8 мл м-крезола, 0.2 мл EDT, 6.5 мл диметилсульфида (DMS) и 2.5 мл HF, и перемешивали 2 часа при 0°C. Затем упаривали DMS и HF и в реактор перегоняли 10 мл HF и смесь перемешивают при 0°C 1 час. После упаривания HF остаток переносили с помощью эфира на фильтр, промывали ацетонитрилом и эфиром. Продукт выделяли смыванием TFA в 200 мл эфира.The peptides were cleaved from the polymer and the side protective groups were removed using liquid hydrogen fluoride via Sn1 / Sn2 mechanisms in the presence of scavengers. For this, 1 g of the peptidyl polymer was placed in a hydrogen fluoride (HF) reactor, 0.8 ml of m-cresol, 0.2 ml of EDT, 6.5 ml of dimethyl sulfide (DMS) and 2.5 ml of HF were added, and stirred for 2 hours at 0 ° C. Then, DMS and HF were evaporated, and 10 ml of HF was distilled into the reactor, and the mixture was stirred at 0 ° C for 1 hour. After evaporation of HF, the residue was transferred with ether to a filter, washed with acetonitrile and ether. The product was isolated by washing off TFA in 200 ml of ether.

Выделенные грубые продукты, подвергались очистке методом полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR C-18, 6µ, 60Å, 19×300 mm в градиенте ацетонитрила 5-75% за 30 минут.Детекция при 220 нм. Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали аминокислотному, масс-спектральному и ВЭЖХ анализам:The isolated coarse products were purified by semi-preparative reverse-phase HPLC on a Waters Prep Nova-Pak HR C-18, 6µ, 60Å, 19 × 300 mm column in an acetonitrile gradient of 5-75% in 30 minutes. Detection at 220 nm. The fraction corresponding to the peak of the main product, after freeze drying, was subjected to amino acid, mass spectral and HPLC analyzes:

- условия ВЭЖХ анализа: аналитический хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak C-18, 5µm, 100А°, 3,6×150 mm; градиент (10-50)% ацетонитрила в 0,1% TFA за 20 минут;- HPLC conditions: Gilson analytical chromatograph, France, DeltaPak C-18 column, 5µm, 100A °, 3.6 × 150 mm; gradient (10-50)% acetonitrile in 0.1% TFA in 20 minutes;

- условия аминослотного анализа: аминокислотный анализатор LKB Alpha Plus 4151, Швеция; гидролиз:- Amino-slot analysis conditions: LKB Alpha Plus 4151 amino acid analyzer, Sweden; hydrolysis:

- 4М метансульфокислота, содержащая 0.2% триптамина, 110°C, 22 часа;- 4M methanesulfonic acid containing 0.2% tryptamine, 110 ° C, 22 hours;

- 12N соляная кислота, пропионовая кислота (1:1), 110°C, 22 часа.- 12N hydrochloric acid, propionic acid (1: 1), 110 ° C, 22 hours.

- условия масс-спектрального анализа: массспектрометр Voyager-DE Bio-Spectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США. Все синтезированные пептиды имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствующие теоретическим значениям. Чистота соединений по данным аналитической ОФ-ВЭЖХ составляла не менее 95%.- conditions for mass spectral analysis: Voyager-DE Bio-Spectrometry Workstation mass spectrometer, Per Sepetive Biosystems, USA. All synthesized peptides had the amino acid composition and molecular weight corresponding to theoretical values. The purity of the compounds according to analytical RP-HPLC was at least 95%.

В результате применения данной методологии были получены пептиды, аналогичные полученным в наиболее близком аналоге, а именно p2-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS; p45-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK и p210-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH, которые затем были подвергнуты дальнейшей модификации с получением пептидовAs a result of applying this methodology, peptides similar to those obtained in the closest analogue were obtained, namely p2-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS; p45-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK and p210-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH, which were then further modified to produce peptides

p2MAP-(ATRFKHLRKYTYNYEAESSS)4K2KβA;p2MAP- (ATRFKHLRKYTYNYEAESSS) 4 K 2 KβA;

p45MAP-(IEIGLEGKGFEPTLEALFGK)4K2KβA иp45MAP- (IEIGLEGKGFEPTLEALFGK) 4 K 2 KβA and

p210MAP-(KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH)4K2KβAp210MAP- (KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH) 4 K 2 KβA

Пример 2. Получение целевых (комплексных) пептидовExample 2. Obtaining target (complex) peptides

Синтез пептидов проводился твердофазным методом с использованием Boc/Bzl стратегии в ручном режиме /J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969/. Для временной защиты α-аминофункции использовали трет-бутилоксикарбонильную группу. Для блокирования боковых радикалов аргинина, лизина и гистидина использовали мезитиленсульфонильную, 2-хлорбензилоксикарбонильную и динитрофенильную группировки, соответственно. Серии, треонин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты в полипептидную цепь вводили в виде соответствующих бензиловых эфиров, а триптофан в виде формильного производного по индольному кольцу. Боковая цепь остатка лизина, к которому впоследствии через спейсер был присоединен дипальмитоилоксипролилцистеин, была блокирована флюо-ренилметилоксикарбонильной группой.The peptides were synthesized by the solid phase method using the Boc / Bzl strategy in manual mode /J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969 /. For temporary protection of the α-amino function, a tert-butyloxycarbonyl group was used. To block the side radicals of arginine, lysine and histidine, mesitylenesulfonyl, 2-chlorobenzyloxycarbonyl and dinitrophenyl groups were used, respectively. The series, threonine, aspartic and glutamic acids were introduced into the polypeptide chain as the corresponding benzyl esters, and tryptophan as a formyl derivative along the indole ring. The side chain of the lysine residue, to which dipalmitoyloxyprolylcysteine was subsequently attached via a spacer, was blocked by the fluorenylmethyloxycarbonyl group.

В качестве нерастворимой матрицы были использованы соответствующие PAM-полимеры с начальной емкостью ~1 мМол/г.В качестве полимера использован 1% сополимер стирола и дивинилбензола. Наращивание полипептидной цепи вели методом in situ. Деблокирование проводили неразбавленной TFA два раза по 1 минуте.The corresponding PAM polymers with an initial capacity of ~ 1 mMol / g were used as an insoluble matrix. A 1% copolymer of styrene and divinylbenzene was used as the polymer. The extension of the polypeptide chain was carried out by in situ method. The release was carried out undiluted TFA twice in 1 minute.

Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления 3-кратного избытка DIPEA непосредственно в реакционную смесь на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в DMF. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 3 кратные избытки реагентов. После присоединения аминокислотных остатков, соответствующих последовательности синтезируемых пептидов, проводили ацетилирование N-концевой аминогруппы, используя 40 эквивалентов уксусного ангидрида в DMF. Формильные группировки с остатков триптофана и динитрофенильная защита гистидина удалялись обработкой 20% раствором пиперидина в DMF в течение 30 минут.The neutralization during the first condensation was carried out by adding a 3-fold excess of DIPEA directly to the reaction mixture at the stage of addition of the amino acid residue; re-condensation was carried out after additional washing of the peptidyl polymer with a 10% solution of DIPEA in DMF. The addition of amino acid residues was carried out by the method of 1-hydroxybenzotriazole esters using 3-fold excess of reagents. After the addition of amino acid residues corresponding to the sequence of synthesized peptides, the N-terminal amino group was acetylated using 40 equivalents of acetic anhydride in DMF. Formyl groups from tryptophan residues and histidine dinitrophenyl protection were removed by treatment with 20% piperidine in DMF for 30 minutes.

Флюоренилметилоксикарбонильную группу с боковой цепи остатка лизина в положении 23 удаляли обработкой пептидил-полимера 50% раствором пиперидина в DMF. Серин (вводили в виде соответствующего бензилового эфира, а цистеин - как Fmoc(Trt)Cys-OH. После удаления тритила с сульфгидрильной группы цистеина присоединяли остаток 1-бром-2,3-гидрокси пропана, который потом ацилировали 1-гидроксибензотриазольным производным пальмитиновой кислоты в хлористом метилене. Fmoc группировку с альфа аминогруппы цистеина удаляли либо после введения остатков пальмитиновой кислоты (при получении диацильных производных), либо до их введения (при получении триа-цильных производных).The fluorenylmethyloxycarbonyl group from the side chain of the lysine residue at position 23 was removed by treating the peptidyl polymer with a 50% solution of piperidine in DMF. Serine (introduced as the corresponding benzyl ester, and cysteine as Fmoc (Trt) Cys-OH. After removal of trityl from the sulfhydryl cysteine group, the residue of 1-bromo-2,3-hydroxy propane was added, which was then acylated with a 1-hydroxybenzotriazole derivative of palmitic acid in methylene chloride. Fmoc grouping with the alpha amino group of cysteine was removed either after the introduction of palmitic acid residues (upon receipt of diacyl derivatives), or before their introduction (upon preparation of triacyl derivatives).

Удаление постоянных защитных групп и отщепление пептидов от нерастворимой матрицы проводили безводным жидким фтористым водородом в присутствии скавенджеров. В сосуд с пептидил-полимером переносили 9.5 мл фтористого водорода и 0.3 мл м- крезола и 0.2 мл этандитиола и перемешивании на магнитной мешалке при 0°C в течение 1 часа. Затем фтористый водород упаривали, и пептид высаживали эфиром из трифторуксусной кислоты.Permanent protecting groups were removed and peptides were cleaved from the insoluble matrix by anhydrous liquid hydrogen fluoride in the presence of scavengers. 9.5 ml of hydrogen fluoride and 0.3 ml of m-cresol and 0.2 ml of ethanedithiol were transferred into a vessel with a peptidyl polymer under stirring on a magnetic stirrer at 0 ° C for 1 hour. Then, hydrogen fluoride was evaporated, and the peptide was precipitated with ether from trifluoroacetic acid.

Выделенные продукты подвергались очистке методом полупрепаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6µ, 60Å, 19×300 mm в градиенте ацетонитрила 5-75% за 30 минут.Детекция при 220 нм. Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали окислению. Полученные целевые соединения были охарактеризованы данными масс-спектрометрии, аминокислотного и ВЭЖХ анализов.The isolated products were purified by semi-preparative reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) on a Waters Prep Nova-Pak HR C-18, 6µ, 60Å, 19 × 300 mm column in an acetonitrile gradient of 5-75% in 30 minutes. Detection at 220 nm . The fraction corresponding to the peak of the main product, after freeze drying, was subjected to oxidation. The obtained target compounds were characterized by mass spectrometry, amino acid and HPLC analyzes.

Условия ВЭЖХ анализа: аналитический хроматограф Gilson, Франция, колонка DeltaPak С-18, 5µm, 100A°, 3,6×150 mm; градиент (15-65)% ацетонитрила в 0,1% TFA за 25 минут;Conditions for HPLC analysis: Gilson analytical chromatograph, France, DeltaPak C-18 column, 5µm, 100A °, 3.6 × 150 mm; gradient (15-65)% acetonitrile in 0.1% TFA in 25 minutes;

Условия аминослотного анализа: аминокислотный анализатор LKB Alpha Plus 4151, Швеция; гидролиз последовательным введением:Amino -lot analysis conditions: LKB Alpha Plus 4151 amino acid analyzer, Sweden; hydrolysis by sequential administration:

- 4M метансульфокислоты, содержащей 0.2% триптамина, при 110°C, в течение 22 часов;- 4M methanesulfonic acid containing 0.2% tryptamine, at 110 ° C, for 22 hours;

- смесью 12N соляной и пропионовой кислот в соотношении 1:1, при 110°C, в течение 22 часов.- a mixture of 12N hydrochloric and propionic acids in a ratio of 1: 1, at 110 ° C, for 22 hours.

Условия масс-спектрального анализа: масс-спектрометр Voyager-DE Bio-Spectrometry Workstation, Per Sepetive Biosystems, США.Mass spectral analysis conditions: Voyager-DE Bio-Spectrometry Workstation mass spectrometer, Per Sepetive Biosystems, USA.

Все синтезированные пептиды имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствующие теоретическим значениям. Чистота соединений по данным аналитической ОФ-ВЭЖХ составляла не менее 90%. Структуры полученных пептидов, молекулярные веса и времена выхода в условиях аналитической ОФ ВЭЖХ приведены в таблице 1.All synthesized peptides had the amino acid composition and molecular weight corresponding to theoretical values. The purity of the compounds according to analytical RP-HPLC was at least 90%. The structures of the obtained peptides, molecular weights, and exit times under the conditions of analytical RP HPLC are shown in Table 1.

ТаблицаTable Характеристики полученных пептидовCharacteristics of the resulting peptides ШифрCipher Структура пептидаPeptide structure Молекулярный весMolecular weight Время выхода, мин.Exit time, min Теор.Theor Эксп.Exp. ИРП2 ТЭ1IRP2 TE1 Ac-KKK(SCPam2)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KKK (SCPam 2 ) KKAKFVAAWTLKAAA 2858,742858.74 2859,482859.48 7,757.75 Р2-ИРП1-ТЭ1P2-IRP1-TE1 Ас-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(SSCPam1)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (SSCPam 1 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5050.025050.02 5050.945050.94 10.5610.56 р45-ИРП1-ТЭ1r45-IRP1-TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(SSCPam1)KKAKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (SSCPam 1 ) KKAKFVAAWTLKAAA 4750.824750.82 4752.074752.07 9.729.72 р210-ИРП1-ТЭ1r210-IRP1-TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(SSCPam1)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (SSCPam 1 ) KKAKFVAAWTLKAAA 4982.084982.08 4983.154983.15 9.659.65 р2-ИРП2-ТЭ1P2-IRP2-TE1 Ac-ATRFKFILRKYTYNYEAESSS-KKK(SSCPam2)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKFILRKYTYNYEAESSS-KKK (SSCPam 2 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5292,435292,43 5292,405,292.40 16.8916.89 р45-ИРП2-ТЭ1r45-IRP2-TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(SSCPam2)KKAKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (SSCPam 2 ) KKAKFVAAWTLKAAA 4989,234989,23 4991,074991.07 14.1212/14 р210-ИРП2-ТЭ1r210-IRP2-TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(SSCPam2)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (SSCPam 2 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5220,495220,49 5221,295221.29 11.2811.28 р2-ИРП3-ТЭ1P2-IRP3-TE1 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(SSCPam3)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (SSCPam 3 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5530.845530.84 5532.125532.12 23.1823.18 р45-ИРП3-PADREp45-IRP3-PADRE Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(SSCPam3)KKAKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (SSCPam 3 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5227.645227.64 5527.985527.98 20.5420.54 р210-ИРП3-ТЭ1r210-IRP3-TE1 Ас-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(SSCPam3)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (SSCPam 3 ) KKAKFVAAWTLKAAA 5458.905458.90 5460.265460.26 17.8617.86 ИРП2-ТЭ2IRP2-TE2 Ac-KKK(SSCPam2)KKKLIP-NASLIENCTKAELAc-KKK (SSCPam 2 ) KKKLIP-NASLIENCTKAEL 3368.313368.31 3369.783369.78 6.786.78 р2-ИРП2-ТЭ2P2-IRP2-TE2 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(SSCPam2)KKKLIP-NASLIENCTKAELAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (SSCPam 2 ) KKKLIP-NASLIENCTKAEL 5802.005802.00 5802.615802.61 15.1315.13 р45-ИРП2-ТЭ2r45-IRP2-TE2 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(SSCPam2)KKKLIP-NASLIENCTKAELAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (SSCPam2) KKKLIP-NASLIENCTKAEL 5499.815499.81 5502.225502.22 13.3613.36 р210-ИРП2-ТЭ2P210-IRP2-TE2 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(SSCPam2)KKKLIP-NASLIENCTKAELAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (SSCPam 2 ) KKKLIP-NASLIENCTKAEL 5730.065730.06 5731.365731.36 11.9711.97 ИРП2*-ТЭ3IRP2 * -TE3 Ac-RRK(SSCPam2)RRQYI-KANSKFIGITEAc-RRK (SSCPam 2 ) RRQYI-KANSKFIGITE 3235.033235.03 3235.883235.88 7.207.20 р2-ИРП2*-ТЭ3P2-IRP2 * -TE3 Ac-TRFKHLRKYTYNYEAESSS-RRK(SSCPam2)RRQYIKANSKFIGITEAc-TRFKHLRKYTYNYEAESSS-RRK (SSCPam 2 ) RRQYIKANSKFIGITE 5668.725668.72 5668.705668.70 14.2814.28 р45-ИРП2-ТЭ3r45-IRP2-TE3 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-RRK(SSCPam2)RRQYIKANSKFIGITEAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-RRK (SSCPam 2 ) RRQYIKANSKFIGITE 5365.525365.52 5365.675365.67 12.2612.26 р210-ИРП2*-ТЭ3P210-IRP2 * -TE3 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-RRK(SSCPam2)RRQYIKANSKFIGITEAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-RRK (SSCPam 2 ) RRQYIKANSKFIGITE 5596.785596.78 5597.855597.85 10.8410.84

В таблице использованы следующие обозначения:The following notation is used in the table:

ТЭ1 - универсальный T-клеточный эпитоп последовательности AK-FVAAWTLKAAA (PADRE); ТЭ2 - универсальный T-клеточный эпитоп последовательности KLIPNASLIENCTKAEL из слитого белка вируса чумы собак; ТЭ3-универсалъный T-клеточный эпитоп последовательности QYIKANSKFIGITE из столбнячного токсина;TE1 is a universal T-cell epitope of the sequence AK-FVAAWTLKAAA (PADRE); TE2 is the universal T-cell epitope of the KLIPNASLIENCTKAEL sequence from the fusion protein of the dog plague virus; TE3-universal T-cell epitope of the QYIKANSKFIGITE sequence from tetanus toxin;

ИРП(1-3) - иммунорегуляторные пептиды последовательности PamnCysSerSer-, отличающиеся количеством остатков пальмитиновой кислоты, где n=1-3, фланкированные остатками лизина; ИРП2*- - иммунорегуляторный пептид последовательности Pam2CysSerSer-, фланкированный остатками аргинина;IRP (1-3) - immunoregulatory peptides of the sequence Pam n CysSerSer-, characterized by the number of palmitic acid residues, where n = 1-3, flanked by lysine residues; IRP2 * - - immunoregulatory peptide of the sequence Pam 2 CysSerSer-, flanked by arginine residues;

Ac - ацетил, остаток уксусной кислоты; K - остаток лизина; I - остаток изолейцина; Е - остаток глутаминовой кислоты; D - остаток аспарагиновой кислоты; C - остаток цистеина; T - остаток треонина; Q - остаток глютамина; S - остаток серина; V - остаток валина; Y - остаток тирозина; P - остаток пролина; R - остаток аргинина; L - остаток лейцина; F - остаток фенилаланина; W - остаток трип-тофана; A - остаток аланина; G - остаток глицина; N - остаток аспарагина: H - остаток гистидина.Ac is acetyl, the residue is acetic acid; K is the lysine residue; I - isoleucine residue; E is the remainder of glutamic acid; D is the remainder of aspartic acid; C is the cysteine residue; T is the threonine residue; Q is the glutamine residue; S is the residue of serine; V is the remainder of valine; Y is the tyrosine residue; P is the remainder of proline; R is the remainder of arginine; L is the leucine residue; F is the residue of phenylalanine; W is the remainder of tryptophan; A is the residue of alanine; G is the residue of glycine; N - asparagine residue: H - histidine residue.

Пример 4. Оценка влияния иммунизации пептидами на атеросклеротические бляшки аорты у мышейExample 4. Evaluation of the effect of immunization with peptides on atherosclerotic aortic plaques in mice

Получение препаратов аорты и окрашивание бляшек выполняли по методике (Branen L. et. al. // The histichemical Journal, 2001, v.33, p.227-229). Аорту, дугу аорты и прилегающую к ней треть сердца выделяли после осторожной перфузии фосфатно-солевым буфером и затем 4% забуференным раствором пара-формальдегида. Жир с препарата как можно тщательнее удаляли. Затем аорту разрезали вдоль, раскрывали и помещали на предварительно покрытое овальбумином новое стекло, высушивали на воздухе 30 минут и фиксировали в течение суток в формалине. Раствор овальбумина для покрытия стекол приготавливали путем разведения 1:20 маточного раствора 15% куриного яичного альбумина фильтрованного, 50% глицерина и 0,2% азида натрия. Окрашивание бляшек проводили с использованием раствора красителя жирового красного О в метаноле и заключали под покровное стекло.Obtaining aortic preparations and staining of plaques was performed according to the method (Branen L. et. Al. // The histichemical Journal, 2001, v.33, p.227-229). The aorta, the aortic arch, and the adjacent third of the heart were isolated after careful perfusion with phosphate-buffered saline and then with a 4% buffered solution of para-formaldehyde. Fat from the preparation was carefully removed. Then the aorta was cut lengthwise, opened and placed on a new glass previously coated with ovalbumin, dried in air for 30 minutes and fixed for one day in formalin. A solution of ovalbumin for coating the glasses was prepared by diluting 1:20 a stock solution of 15% filtered chicken egg albumin, 50% glycerol and 0.2% sodium azide. Plaque staining was performed using a solution of the dye of fatty red O in methanol and enclosed under a coverslip.

Измерения площадей бляшек проводили с помощью компьютеризированной гистоморфометрии. Препараты фотографировали с использованием системы визуализации, включавшей световой микроскоп DMLB и цифровой камеры DC 300 (Leica, Германия). Делали снимки каждого поля зрения при увеличении в 40 раз, при этом с каждого препарата для получения целой аорты делали около 20 снимков, затем соединяли для получения фотографии целой аорты с помощью программы Canon Fotostish на компьютере. Для морфометрических исследований фотографии калибровали, измеряли с использованием программы Image J. Каждую аорту просматривали под микроскопом на увеличении в 160-320 раз, при наличии сомнений уточняли границы бляшек на большем увеличении. Бляшки обводили каждую в отдельности. Затем с помощью программы Image J измеряли: количество бляшек, расположенных в местах отхождения сосудов, 2) количество бляшек аорты, не связанных с сосудами и 3) площадь каждой бляшки в микрометрах.Plaque areas were measured using computerized histomorphometry. The preparations were photographed using an imaging system including a DMLB light microscope and a DC 300 digital camera (Leica, Germany). Pictures of each field of view were taken at a magnification of 40 times, while about 20 pictures were taken from each preparation to obtain an entire aorta, then they were combined to obtain a photograph of the whole aorta using the Canon Fotostish program on a computer. For morphometric studies, the photographs were calibrated, measured using the Image J. program. Each aorta was examined under a microscope at a magnification of 160-320 times; if in doubt, the borders of the plaques were enlarged at a higher magnification. Plaques encircled each individually. Then, using the Image J program, we measured: the number of plaques located at the sites of vascular discharge, 2) the number of aortic plaques not connected with the vessels, and 3) the area of each plaque in micrometers.

Получение препаратов и окрашивание срезов проводили, как было описано в статье (Fredrikson G.N. et al. Ingibition of atherosclerosis in ApoE-Null mict by immunization with Apo-100 peptide secuences // Atherosclerosis, Thrombosisand Molecular Biology, 2003, v.23, p.879-884). Участок дуги аорты и прилегающую к ней треть сердца заключали в ОСТ (Япония) и замораживали в жидком азоте. Изготавливали серийные криостатные срезы толщиной 10 мкм. Срезы начинали собирать, когда на препаратах появлялись створки клапана аорты. Срезы в порядке получения раскладывали на предметные стекла. Приготавливали по три-четыре стекла из одного образца. Для визуализации бляшек срезы окрашивали раствором красителя жирового красного О в изопропаноле, докрашивали гематоксилином Карацци и заключали под покровное стекло. С использованием системы визуализации получали микрофотографии срезов. Бляшки обводили каждую в отдельности. Затем с помощью программы Image J измеряли площадь каждой бляшки в микрометрах, а также измеряли площадь просвета аорты. Площадь бляшек учитывали на срезах, на которых четко визуализировались три клапана. Таким образом, оценивали в большинстве случаев по три среза от животного. На препаратах с использованием программы Image J измеряли площади бляшек и выражали их в виде процента от площади просвета аорты. Для оценки содержания коллагена срезы окрашивали по методу Ван-Гизона. Содержание коллагена в процентах оценивали с помощью компьютеризированной гистоморфометрии.Preparation and staining of sections was performed as described in the article (Fredrikson GN et al. Ingibition of atherosclerosis in ApoE-Null mict by immunization with Apo-100 peptide secuences // Atherosclerosis, Thrombosisand Molecular Biology, 2003, v. 23, p. 879-884). A section of the aortic arch and the adjacent third of the heart were enclosed in OCT (Japan) and frozen in liquid nitrogen. Serial cryostatic sections were prepared with a thickness of 10 μm. Sections began to be collected when aortic valve cusps appeared on the preparations. Slices in the order they were laid out on glass slides. Three to four glasses were prepared from one sample. To visualize plaques, sections were stained with a solution of the dye of fatty red O in isopropanol, stained with Carazzi hematoxylin and placed under a coverslip. Using a visualization system, micrographs of sections were obtained. Plaques encircled each individually. Then, using the Image J program, the area of each plaque was measured in micrometers, and the aortic lumen area was also measured. The area of plaques was taken into account on sections on which three valves were clearly visualized. Thus, in most cases, three sections from the animal were evaluated. On preparations using the Image J program, plaque areas were measured and expressed as a percentage of the aortic lumen area. Sections were stained using the Van Gieson method to evaluate collagen content. The percentage of collagen was evaluated using computerized histomorphometry.

При статистической обработке данных различия между группами считали достоверными при p<0,05.In the statistical processing of data, differences between groups were considered significant at p <0.05.

Исследования проводились в отношении 20 групп мышей по 12 штук в каждой группе:Studies were conducted on 20 groups of mice, 12 pieces in each group:

Группа 1 - контрольная (PBS) Группы 2-19 - получали пептиды, полученные по примеру 2 в дозе 50 мг.Group 1 - control (PBS) Groups 2-19 - received the peptides obtained in example 2 at a dose of 50 mg.

Препарат вводился в три этапа: в возрасте мышей 7-8 недель, в возрасте 9-10 недель и в возрасте 11-12 недель внутрибрюшинно. В течение 10-11 недели мыши находились на высокохолестериновом питании (Western diet). На 24-25 неделе их забивали и проводили исследования аорты.The drug was administered in three stages: at the age of mice 7-8 weeks, at the age of 9-10 weeks and at the age of 11-12 weeks intraperitoneally. For 10-11 weeks, the mice were fed a high cholesterol diet (Western diet). At 24-25 weeks they were killed and aortic examinations were performed.

Полученные результаты приведены в таблице 2. Полученные данные свидетельствуют, что лучшие результаты получены при использовании пептида Р210-ИРП2-ТЭ1.The results obtained are shown in table 2. The data obtained indicate that the best results were obtained using the peptide P210-IRP 2 -TE1.

Для подтверждения эффективности пептида по сравнению с входящими в него фрагментами было проведено сопоставление антисклеротической активности пептида Р210-ИРП2-ТЭ1 по сравнению с пептидом Р210 и смесью пептидов Р210 и ИРП2-ТЭ1. Полученные результаты (таблица 3) показали, что полученный пептид обладает повышенной эффективностью по сравнению со своими аналогами.To confirm the effectiveness of the peptide in comparison with its constituent fragments, the antisclerotic activity of the peptide Р210-ИРП 2 -ТЭ1 was compared with the peptide Р210 and a mixture of peptides Р210 and ИРП 2 -ТЭ1. The results obtained (table 3) showed that the obtained peptide has increased efficiency compared to its counterparts.

Пример 4. Получение композиции для профилактики и лечения атеросклероза сосудов на основе смеси пептидов. По 10 мг пептидов Р2-ИРП2-ТЭ1, Р45-ИРП2-ТЭ1 и Р210-ИРП2-ТЭ1 растворяли в 10 мл 0,02M натрий фосфатного буфера, рН7,4. Полученный раствор разливали по ампулам по 1 мл, замораживали и лиофилизировали. Используя разное весовое соотношение пептидов при приготовлении раствора для высушивания, получали смесь (смесь 1) с соотношением компонентов 1:1:1.Example 4. Obtaining a composition for the prevention and treatment of atherosclerosis of blood vessels based on a mixture of peptides. 10 mg peptides Р2-ИРП 2 -ТЭ1, Р45-ИРП 2 -ТЭ1 and Р210-ИРП 2 -ТЭ1 were dissolved in 10 ml of 0.02M sodium phosphate buffer, pH 7.4. The resulting solution was poured into 1 ml ampoules, frozen and lyophilized. Using a different weight ratio of peptides in the preparation of the solution for drying, a mixture was obtained (mixture 1) with a ratio of components 1: 1: 1.

Пример 5. В условиях примера 4 получали смеси, содержащие пептиды Р2-ИРП2-ТЭ 1, Р45-ИРП2-ТЭ1 и Р210-ИРП2-ТЭ1 в соотношении компонентовExample 5. In the conditions of example 4, mixtures were obtained containing peptides P2-IRP 2- TE1, P45-IRP 2- TE1 and P210-IRP 2- TE1 in a ratio of components

Смесь 2 - 0,25:0,5:0,25:Mixture 2 - 0.25: 0.5: 0.25:

Смесь 3 - 0,5:0,25-0,25;Mixture 3 - 0.5: 0.25-0.25;

Смесь 4 - 0,25:0,25:0,5.Mixture 4 - 0.25: 0.25: 0.5.

Пример 6. В условиях примера 3 было произведено изучение препаратов, полученных по примерам 4 и 5. Полученные результаты приведены в таблицах 4 и 5.Example 6. In the conditions of example 3 was a study of the preparations obtained in examples 4 and 5. The results are shown in tables 4 and 5.

Как следует из представленных данных, количество и площадь «бляшек сосудов» в группе 4, иммунизированной смесью пептидов, были статистически достоверно более низкими по сравнению с контрольной группой 2, которым вводили Р210+ИРП2-ТЭ1. Различия между группой 4 и группами 1 -3 были статистически достоверными.As follows from the data presented, the number and area of “vascular plaques” in group 4 immunized with a mixture of peptides were statistically significantly lower compared to control group 2, which was administered P210 + RPI 2- TE1. The differences between group 4 and groups 1-3 were statistically significant.

На рисунке 1 приведены микрофотографии препаратов нисходящей аорты en face у мышей Apo Е (-/-)после окрашивания масляным красным О Оригинальное увеличение в 40 раз. А) группа мышей №4 (иммунизация смесью пептидов), Б) группа мышей №1 (контроль, введение PBS), В) группа мышей №2 (контроль, введение ТЭ1). На микрофотографиях препаратов видно, что под микроскопом атеросклеротические бляшки четко визуализировались в виде темно-красных объектов на внутренней по поверхности аорты. Бляшки характеризовались расположением в просветах сосудов, отходящих от аорты («бляшки сосудов»). Некоторые бляшки оказывались не связанными расположением с сосудами («бляшки стенки аорты»). Наблюдается более низкое количество бляшек (красное окрашивание) в группе 4 (Рис.1А) по сравнению с контрольными группами 1 и 2 (Рис.1Б и В, соответственно).Figure 1 shows micrographs of en face descending aorta preparations in Apo E (- / -) mice after staining with oil red O Original magnification of 40 times. A) a group of mice No. 4 (immunization with a mixture of peptides), B) a group of mice No. 1 (control, administration of PBS), C) a group of mice No. 2 (control, introduction of TE1). Micrographs of the preparations show that under the microscope, atherosclerotic plaques were clearly visualized as dark red objects on the inner surface of the aorta. Plaques were characterized by the location in the lumens of blood vessels extending from the aorta ("vascular plaques"). Some plaques turned out to be unconnected by arrangement with vessels (“plaques of the aortic wall”). There is a lower number of plaques (red staining) in group 4 (Fig. 1A) compared with control groups 1 and 2 (Fig. 1B and C, respectively).

Пример 7. Исследование содержания коллагена в бляшках синуса аортыExample 7. The study of collagen content in plaques of the aortic sinus

Дополнительно к измерению площадей бляшек синуса аорты проверяли, насколько иммунизация смесью пептидов будет влиять на фенотип бляшек, а именно - на количество коллагена. От количества коллагена зависит прочность самой бляшки, а это, в свою очередь, влияет на вероятность ее разрыва. Разрушение бляшки, особенно в аорте, является опасным осложнением атеросклероза у человека.In addition to measuring the area of aortic sinus plaques, it was checked how much immunization with a mixture of peptides will affect the phenotype of plaques, namely, the amount of collagen. The strength of the plaque itself depends on the amount of collagen, and this, in turn, affects the likelihood of its rupture. Plaque destruction, especially in the aorta, is a dangerous complication of atherosclerosis in humans.

Мышам вводили пептид Р210 (группа 1), Р210+ИРП2-ТЭ1 (группа 2), Р210-ИРП2-ТЭ1 (группа 3) и смесь пептидов №1, Как показали результаты исследований (таблица 6), иммунизация в группах 2-4 приводила к выраженному увеличению среднего относительного количества коллагена в бляшке. Процент коллагена в бляшках в среднем увеличивался в 1,9 (2 группа); в 1,63 (3 группа) и в 1,82 (4 группа) раза по сравнению с 1 группой.The mice were injected with peptide P210 (group 1), P210 + IRP 2- TE1 (group 2), P210-IRP 2- TE1 (group 3) and a mixture of peptides No. 1, As shown by the results of studies (table 6), immunization in groups 2- 4 led to a pronounced increase in the average relative amount of collagen in the plaque. The percentage of collagen in plaques increased on average 1.9 (group 2); 1.63 (group 3) and 1.82 (group 4) times compared with group 1.

Различия между группами 1 и 2, 1 и 3 достоверны. В четвертой группе мы наблюдали выраженную тенденцию к увеличению количества коллагена в бляшках, отсутствие статистической достоверности можно объяснить тем, что в данной группе было меньшее количество животных.The differences between groups 1 and 2, 1 and 3 are significant. In the fourth group, we observed a pronounced tendency to increase the amount of collagen in the plaques; the lack of statistical reliability can be explained by the fact that in this group there were fewer animals.

Таблица 6.Table 6. Относительное содержание коллагена в бляшках синуса аорты у ApoE (-/-) мышей (%)Relative collagen content in aortic sinus plaques in ApoE (- / -) mice (%) ПоказательIndicator ГруппаGroup 1one 22 33 4four СреднееAverage 1212 22,822.8 19,619.6 21,821.8 Ст.откл.St. off 1,171.17 3,13,1 2,72.7 9,79.7 Кол-во мышейNumber of mice 1010 1010 11eleven 55 Т-тестT test 1 и 21 and 2 1 и 31 and 3 1 и 41 and 4 РR 0,008290.00829 0,019990.01999 0,103150.10315

Анализ полученных результатов показал, что заявляемые пептиды обладают более высокой антисклеротической активностью по сравнению с аналогами, а композиции на их основе представляют практический интерес в качестве вакцины для профилактики и лечения атеросклероза сосудов.Analysis of the results showed that the claimed peptides have a higher antisclerotic activity compared to analogues, and compositions based on them are of practical interest as a vaccine for the prevention and treatment of vascular atherosclerosis.

Приложение 1Annex 1 СТРУКТУРЫ ОСНОВНЫХ ПЕПТИДОВSTRUCTURES OF BASIC PEPTIDES 1. (Pam2CysSerSer-):1. (Pam 2 CysSerSer-):

Figure 00000002
Figure 00000002
2. ТЭ1:2. TE1: AKFVAAWTLKAAAAKFVAAWTLKAAA 3. Р2-ИРП2-ТЭ1:3. P2-IRP2-TE1: Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam2CSS)KX-AKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam2CSS) KX-AKFVAAWTLKAAA 4. Р45-ИРП2-ТЭ14. R45-IRP2-TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam2CSS)KK-AKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam2CSS) KK-AKFVAAWTLKAAA 5. Р210-ИРП2-ТЭ15. P210-IRP2-TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam2CSS)KK-AKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam2CSS) KK-AKFVAAWTLKAAA

Таблица 2table 2 Влияние природы пептида на тяжесть атеросклеротических поражений нисходящей аорты у ApoE-/- мышейThe effect of the nature of the peptide on the severity of atherosclerotic lesions of the descending aorta in ApoE - / - mice ШифрCipher Структура пептидаPeptide structure ПоказательIndicator Количество бляшек сосудов, штThe number of plaque vessels, pcs Площадь бляшек сосудов, мкм2 The area of plaque vessels, μm 2 Общее количество бляшек, штThe total number of plaques, pcs PBSPbs КонтрольThe control 11,1±2,411.1 ± 2.4 2155±4082155 ± 408 14,0±2,514.0 ± 2.5 ИРП2ТЭ1IRP2TE1 Ac-KKK(SSCPam2)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KKK (SSCPam 2 ) KKAKFVAAWTLKAAA 9,8±1,39.8 ± 1.3 1950±4001950 ± 400 12,8±3012.8 ± 30 Р2-ИРП1-ТЭ1P2-IRP1-TE1 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam1CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam 1 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,41±1,89.41 ± 1.8 1950±3551950 ± 355 12,9±3,712.9 ± 3.7 Р45-ИРП1-ТЭ1R45-IRP1-TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam1CSS)KK AKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam 1 CSS) KK AKFVAAWTLKAAA 9,9±1,759.9 ± 1.75 1900±3101900 ± 310 12,2±3,112.2 ± 3.1 Р210-ИРП2-ТЭ1P210-IRP 2 -TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam1CSS)KK AKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam 1 CSS) KK AKFVAAWTLKAAA 9,95±1,69.95 ± 1.6 1910±3051910 ± 305 12,1±3,512.1 ± 3.5 Р2-ИРП2-ТЭ1P2-IRP 2 -TE1 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam2CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam 2 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,87±1,89.87 ± 1.8 1890±2991890 ± 299 12,05±3,412.05 ± 3.4 Р45-ИРП2-ТЭ1R45-IRP 2 -TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam2CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam 2 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,5±1,59.5 ± 1.5 1800±3101800 ± 310 11,8±3,111.8 ± 3.1 Р210-ИРП2-ТЭ1P210-IRP 2 -TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam2CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam 2 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,2±1,59.2 ± 1.5 1650±3541650 ± 354 11,2±3,211.2 ± 3.2 Р2-ИРП3-ТЭ1P2-IRP 3 -TE1 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam3CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam 3 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,4±1,89.4 ± 1.8 1700±3301700 ± 330 11,8±3,111.8 ± 3.1 Р45-ИРП3-ТЭ1R45-IRP 3 -TE1 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam3CSS)KK AKFVAAWTLKAAAAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam 3 CSS) KK AKFVAAWTLKAAA 9,56±1,559.56 ± 1.55 1780±3151780 ± 315 12,0±3,512.0 ± 3.5 Р210-ИРП3-ТЭ1P210-IRP3-TE1 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam3CSS)KKAKFVAAWTLKAAAAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam 3 CSS) KKAKFVAAWTLKAAA 9,6±1,79.6 ± 1.7 1870±3301870 ± 330 12,05±3,1512.05 ± 3.15 ИРП2-ТЭ2IRP2-TE2 Ac-KKK(Pam2CSS)KKKLIPNASLIENCTKAELAc-KKK (Pam 2 CSS) KKKLIPNASLIENCTKAEL 9,44±1,549.44 ± 1.54 1850±3101850 ± 310 12,5±3,112.5 ± 3.1 Р2-ИРП2-ТЭ2P2-IRP2-TE2 Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(Pam2CSS)KKKLIPNASLIENCTKAELAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (Pam 2 CSS) KKKLIPNASLIENCTKAEL 9,6±1,39.6 ± 1.3 1810±3061810 ± 306 12,8±3,012.8 ± 3.0 Р45-ИРП2-ТЭ2R45-IRP2-TE2 Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(Pam2CSS)KKKLIPNASLIENCTKAELAc-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (Pam 2 CSS) KKKLIPNASLIENCTKAEL 9,5±1,89.5 ± 1.8 1870±3401870 ± 340 12,9±3,512.9 ± 3.5 Р210-ИРП2-ТЭ2P210-IRP2-TE2 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(Pam2CSS)KKKLIPNASLIENCTKAELAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (Pam 2 CSS) KKKLIPNASLIENCTKAEL 9,9±1,49.9 ± 1.4 1855±2991855 ± 299 13,2±2,913.2 ± 2.9 ИРП2*-ТЭ3IRP2 * -TE3 Ac-RRK(Pam2CSS)RRQYIKANSKFIGITEAc-RRK (Pam 2 CSS) RRQYIKANSKFIGITE 9,7±1,9.7 ± 1, 1880±2901880 ± 290 13,0±3,513.0 ± 3.5 Р2-ИРП2*-P2-IRP2 * - Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-RRK(Pam2CSS)RRAc-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-RRK (Pam 2 CSS) RR 9,9±1,89.9 ± 1.8 1830±3001830 ± 300 13,5±3,313.5 ± 3.3 р45-ИРП2-ТЭ3r45-IRP2-TE3 Ac-IEIGLEGKGFEPTEEAEFGK-RRK(SSCPam2)RRQYIKANSKFIGITEAc-IEIGLEGKGFEPTEEAEFGK-RRK (SSCPam2) RRQYIKANSKFIGITE 9,86±1,79.86 ± 1.7 1850±3301850 ± 330 13,8±3,413.8 ± 3.4 р210-ИРП2*-ТЭ3P210-IRP2 * -TE3 Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-RRK(SSCPam2)RRQYIKANSKFIGITEAc-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-RRK (SSCPam 2 ) RRQYIKANSKFIGITE 10,2±1,610.2 ± 1.6 1900±3501900 ± 350 14,2±3,614.2 ± 3.6 В таблице использованы следующие обозначения:The following notation is used in the table: ТЭ1 - универсальный T-клеточный эпитоп последовательности AKFVAAWTLKAAA (PADRE);TE1 - universal T-cell epitope of the sequence AKFVAAWTLKAAA (PADRE); ТЭ2 - универсальный T-клеточный эпитоп последовательности KLIPNASLIENCTKAEL из слитого белка вируса чумы собак;TE2 is the universal T-cell epitope of the KLIPNASLIENCTKAEL sequence from the fusion protein of the dog plague virus; ТЭ3- универсальный T-клеточный эпитоп последовательности QYIKANSKFIGITE из столбнячного токсина; ИРП(1-3) - иммунорегуляторные пептиды последовательности PamnCysSerSer-, отличающиеся количеством остатков пальмитиновой кислоты, где n=1-3, фланкированные остатками лизина;TE3 is the universal T-cell epitope of the QYIKANSKFIGITE sequence from tetanus toxin; IRP (1-3) - immunoregulatory peptides of the sequence Pam n CysSerSer-, characterized by the number of palmitic acid residues, where n = 1-3, flanked by lysine residues; ИРП2* - иммунорегуляторный пептид последовательности Pam2CysSerSer-, фланкированный остатками аргинина;IRP2 * - immunoregulatory peptide of the sequence Pam 2 CysSerSer- flanked by arginine residues; Ac - ацетил, остаток уксусной кислоты; K - остаток лизина; I - остаток изолейцина; Е - остаток глутаминовой кислоты; D - остаток аспарагиновой кислоты; С - остаток цистеина; Т - остаток треонина; Q- остаток глютамина;Ac is acetyl, the residue is acetic acid; K is the lysine residue; I - isoleucine residue; E is the remainder of glutamic acid; D is the remainder of aspartic acid; C is the cysteine residue; T is the remainder of threonine; Q is a glutamine residue; S - остаток серина; V - остаток валина; Y - остаток тирозина; P - остаток пролина; R - остаток аргинина; L - остаток лейцина; F - остаток феншаланина; W - остаток триптофана; А - остаток аланина; G - остаток глицина; N -остаток аспарагина; Н - остаток гистидина.S is the residue of serine; V is the remainder of valine; Y is the tyrosine residue; P is the remainder of proline; R is the remainder of arginine; L is the leucine residue; F is the remainder of fenshalanin; W is the tryptophan residue; A is the residue of alanine; G is the residue of glycine; N is the remainder of asparagine; H is the histidine residue.

Таблица 3Table 3 Влияние профилактической иммунизации на тяжесть атеросклеротических поражений нисходящей аорты у ApoE-/-мышей.The effect of prophylactic immunization on the severity of atherosclerotic lesions of the descending aorta in ApoE - / - mice. ПоказательIndicator Ед. изм.Units rev. ГруппаGroup 1one 22 33 4four P210P210 Р210+ИРП2-ТЭ1P210 + IRP2-TE1 Р210-ИРП2-ТЭ1P210-IRP2-TE1 W-ИРП2-ТЭ1W-IRP2-TE1 Количество бляшек сосудовThe number of plaque vessels шт.PC. 11,1±2,411.1 ± 2.4 9,9±2,49.9 ± 2.4 9,0±2,59.0 ± 2.5 9,2±1,59.2 ± 1.5 Площадь бляшек сосудовArea of vascular plaques Мкм2 Μm 2 2155±4082155 ± 408 2159±4562159 ± 456 1738±6421738 ± 642 1650±3541650 ± 354 Общее количество бляшекTotal plaque count шт.PC. 14,0±2,514.0 ± 2.5 12,6±3,012.6 ± 3.0 12,4±4,412.4 ± 4.4 11,2±3,211.2 ± 3.2

Таблица 4Table 4 Влияние состава препарата на тяжесть атеросклеротических поражений нисходящей аорты у АроЕ-/- мышей.The effect of the composition of the drug on the severity of atherosclerotic lesions of the descending aorta in AroE - / - mice. ПоказательIndicator Ед. изм.Units rev. ГруппаGroup Р45-ИРП2-ТЭ1R45-IRP2-TE1 Р2-ИРП2-ТЭ1P2-IRP2-TE1 Р210-ИРП2-ТЭ1P210-IRP2-TE1 Р2-Р2-ИРП2-ТЭ1 Р45-ИРП2-ТЭ1 Р210-ИРП2-ТЭ1Р2-Р2-ИРП2-ТЭ1 Р45-ИРП2-ТЭ1 Р210-ИРП2-ТЭ1 Количество бляшек сосудовThe number of plaque vessels шт.PC. 8,1±2,38.1 ± 2.3 9,7±2,69.7 ± 2.6 9,0±2,59.0 ± 2.5 6,2±1,3 рм=0,055 р24=0,00256.2 ± 1.3 p m = 0.055 p 24 = 0.0025 Площадь бляшек сосудовArea of vascular plaques Мкм2 Μm 2 1494±4831494 ± 483 2120±4862120 ± 486 1738±642 Р2-3=0,1161738 ± 642 P2-3 = 0.116 1190±336 р2·4=0,00()91190 ± 336 p 2 · 4 = 0.00 () 9 Общее количество бляшекTotal plaque count шт.PC. 10,0±2,610.0 ± 2.6 12,1±3,112.1 ± 3.1 12,4±4,412.4 ± 4.4 7,2±2,6 рм=0,081 р24=0,0097.2 ± 2.6 p m = 0.081 p 24 = 0.009

Таблица 5Table 5 Влияние соотношения ингредиентов препарата Р2, Р2-ИРП2-ТЭ1, Р45- ИРП2-ТЭ1, Р210-ИРП2-ТЭ1 на тяжесть атеросклеротических поражений нисходящей аорты у АроЕ-/- мышей.The effect of the ratio of the ingredients of the drug P2, P2-IRP 2- TE1, P45-IRP 2- TE1, P210-IRP 2- TE1 on the severity of atherosclerotic lesions of the descending aorta in ApoE - / - mice. Показатель Indicator Ед. изм.Units rev. СмесьMixture смесьmixture 1one 22 33 4four Соотношение ингредиентовRatio of ingredients 0,33:0,33:0,330.33: 0.33: 0.33 0,25:0,5:0,250.25: 0.5: 0.25 0,5:0,25:0,25;0.5: 0.25: 0.25; 0,25:0,25:0,50.25: 0.25: 0.5 Количество бляшек сосудовThe number of plaque vessels шт.PC. 6,2±1,3 рм=0,0556.2 ± 1.3 p m = 0.055 7,6±1,17.6 ± 1.1 8,0±1,28.0 ± 1.2 7,4±1,17.4 ± 1.1 Площадь бляшек сосудовArea of vascular plaques Мкм2 Μm 2 1190±336 р2·4=0,0091190 ± 336 p 2 · 4 = 0.009 1470±3521470 ± 352 1510±3151510 ± 315 1333±1761333 ± 176 Общее количество бляшекTotal plaque count шт.PC. 7,2±2,6 рм=0,0817.2 ± 2.6 p m = 0.081 8,4±2,18.4 ± 2.1 7,0±2,47.0 ± 2.4 8,8±2,28.8 ± 2.2

Claims (9)

1. Пептид общей формулы:
X-ЦЦ-Ц(Y)-ЦЦ-Z,
где Х - B-клеточный эпитоп белка аполипопротеина В 100;
Ц - аминокислотный остаток, выбранный из K или R;
Y - иммуноадъювант, выбранный из группы Pam1CSS-; Pam2CSS-, Pam3CSS-;
Z - T-хелперный эпитоп, выбранный из AKFVAAWTLKAAA, KLIPNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;
для профилактики и лечения атеросклероза сосудов, обладающий антисклеротическим действием.
1. The peptide of the General formula:
X-CC-C (Y) -CC-Z,
where X is the B-cell epitope of the apolipoprotein B 100 protein;
C is an amino acid residue selected from K or R;
Y - immunoadjuvant selected from the group Pam 1 CSS-; Pam 2 CSS; Pam 3 CSS;
Z is a T-helper epitope selected from AKFVAAWTLKAAA, KLIPNASLIENCTKAEL, QYIKANSKFIGITE;
for the prevention and treatment of vascular atherosclerosis, which has an antisclerotic effect.
2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что в качестве B-клеточного эпитопа белка аполипопротеина В 100 он содержит пептид p2 аполипопротеина В 100.2. The peptide according to claim 1, characterized in that as the B-cell epitope of the protein Apolipoprotein B 100 it contains the peptide p2 of Apolipoprotein B 100. 3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что в качестве В-клеточного эпитопа белка аполипопротеина В 100 он содержит пептид p45 аполипопротеина В 100.3. The peptide according to claim 1, characterized in that as a b-cell epitope of the protein apolipoprotein B 100 it contains the peptide p45 of apolipoprotein B 100. 4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что в качестве В-клеточного эпитопа белка аполипопротеина В 100 он содержит пептид p210 аполипопротеина В 100.4. The peptide according to claim 1, characterized in that as a B-cell epitope of the protein Apolipoprotein B 100 it contains the peptide p210 Apolipoprotein B 100. 5. Пептид по п.1 p2-ИРП1-PADRE, имеющий общую формулу Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK(SSCPam1)KK-AKFVAAWTLKAAA.5. The peptide according to claim 1 p2-IRP1-PADRE having the general formula Ac-ATRFKHLRKYTYNYEAESSS-KKK (SSCPam 1 ) KK-AKFVAAWTLKAAA. 6. Пептид по п.1 p45-ИРП1-PADRE, имеющий общую формулу Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK(SSCPam1)KK-AKFVAAWTLKAAA.6. The peptide according to claim 1 p45-IRP1-PADRE having the general formula Ac-IEIGLEGKGFEPTLEALFGK-KKK (SSCPam 1 ) KK-AKFVAAWTLKAAA. 7. Пептид по п.1 p210-ИРП1-PADRE, имеющий общую формулу Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK(SSCPam1)KK-AKFVAAWTLKAAA.7. The peptide according to claim 1 p210-IRP1-PADRE having the general formula Ac-KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH-KKK (SSCPam 1 ) KK-AKFVAAWTLKAAA. 8. Композиция для профилактики и лечения атеросклероза сосудов на основе B-клеточного эпитопа белка аполипопротеина В 100, содержащий смесь пептидов по пп.5, 6 и 7 в соотношении 0,25-0,5:0,25-0,5:0,25-0,5.8. Composition for the prevention and treatment of vascular atherosclerosis based on the B-cell epitope of apolipoprotein B 100 protein containing a mixture of peptides according to claims 5, 6 and 7 in the ratio of 0.25-0.5: 0.25-0.5: 0 , 25-0.5. 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что соотношение пептидов по пп.5, 6 и 7 составляет 1:1:1. 9. The composition according to claim 8, characterized in that the ratio of peptides according to claims 5, 6 and 7 is 1: 1: 1.
RU2012115397/04A 2012-04-18 2012-04-18 Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease RU2495048C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012115397/04A RU2495048C1 (en) 2012-04-18 2012-04-18 Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012115397/04A RU2495048C1 (en) 2012-04-18 2012-04-18 Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2495048C1 true RU2495048C1 (en) 2013-10-10

Family

ID=49302940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012115397/04A RU2495048C1 (en) 2012-04-18 2012-04-18 Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2495048C1 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
RU2296582C2 (en) * 2001-04-05 2007-04-10 Форскарпатент И Сюд Peptide fragments, pharmaceutical compositions and vaccines based on the same, and uses thereof in prophylaxis and therapy of arteriosclerosis
EA012984B1 (en) * 2003-12-17 2010-02-26 Вайет Immunogenic peptide carrier conjugates and method of producing same
WO2011025978A2 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Stuart Bunting Methods of treatment using anti-oxidized ldl antibodies

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
RU2296582C2 (en) * 2001-04-05 2007-04-10 Форскарпатент И Сюд Peptide fragments, pharmaceutical compositions and vaccines based on the same, and uses thereof in prophylaxis and therapy of arteriosclerosis
EA012984B1 (en) * 2003-12-17 2010-02-26 Вайет Immunogenic peptide carrier conjugates and method of producing same
WO2011025978A2 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Stuart Bunting Methods of treatment using anti-oxidized ldl antibodies

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5238920A (en) Pulmonary surfactant protein fragments
DK2479275T3 (en) HLA-A * 1101-restricted WT1 peptide or pharmaceutical composition comprising this
EP0275748B1 (en) Peptide derivatives and their therapeutical use
TWI228128B (en) Tumor antigenic peptides derived from cyclophilin B
CN105899224B (en) Composition for treating and preventing benign prostatic hyperplasia
JPH09501159A (en) Synthetic multiple tandem repeat mucins and mucin-like peptides, and uses thereof
CN108025052B (en) Anti-malarial compositions and methods
JP6357470B2 (en) Improved CD31 peptide
CN105121463B (en) Peptides
FR2717081A1 (en) Retropeptides, antibodies against them, and their uses for vaccination and in vitro diagnosis.
RU2495048C1 (en) Peptide possessing antiatherosclerotic action and composition for preventing and treating atherosclerotic vascular disease
IT9019914A1 (en) IMMUNOGENIC COMPOUNDS, THE PROCEDURE FOR THEIR SYNTHESIS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF ANIMALARY VACCINES
JPH10212300A (en) Peptide vaccine
EP2922563A1 (en) Cd44v6-derived peptides for treating metastasizing cancers
WO2017054831A1 (en) Use of human derived immunosuppressive proteins and peptides as medicaments
FR2830940A1 (en) Process for selecting ligands for human leukocyte antigen DP4, useful as immunomodulators for treating e.g. tumors, based on inhibition of binding
ITMI20071119A1 (en) NEW SYNTHETIC LIGANDS FOR IMMUNOGLOBULINES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THAT INCLUDE THEM
US7223835B2 (en) VEGF peptides and their use for inhibiting angiogenesis
AU2002210713A1 (en) VEGF peptides and their use for inhibiting angiogenesis
JPH10506877A (en) T cell epitope of ryegrass pollen allergen
JP3734855B2 (en) Peptides and their uses
WO2006035815A1 (en) Method of producing partial peptide of enolase protein from plasmodium falciparum
JP3716298B2 (en) Novel antihypertensive peptide
JP4171794B2 (en) Peptides and their uses
WO2006114799A1 (en) Synthetic peptides for the diagnosis and therapy of berillium granulomatous disease

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160419