RU2493248C1 - Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода - Google Patents
Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода Download PDFInfo
- Publication number
- RU2493248C1 RU2493248C1 RU2012106867/10A RU2012106867A RU2493248C1 RU 2493248 C1 RU2493248 C1 RU 2493248C1 RU 2012106867/10 A RU2012106867/10 A RU 2012106867/10A RU 2012106867 A RU2012106867 A RU 2012106867A RU 2493248 C1 RU2493248 C1 RU 2493248C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- concentration
- exposure
- yeast
- saccharomyces cerevisiae
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности. Способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода включает выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, инкубацию с защитным агентом, воздействие пероксидом водорода с последующим определением числа выживших клеток. В качестве защитного агента используют соевые ингибиторы протеаз в концентрации 0,1-2,0 г/л. Время инкубации с защитным агентом составляет 5-6 ч, концентрация перекиси водорода - 700-750 мМ. Изобретение обеспечивает высокую степень защиты дрожжевых клеток при отсутствии угнетающего действия. Доля выживших дрожжевых клеток при осуществлении способа увеличивается по сравнению с контролем в 1,2-5,4 раза. 7 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке способов защиты клеток дрожжей от окислительного стресса в результате воздействия пероксида водорода, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.
Известен способ защиты клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса с помощью трегалозы, маннитола и галактозы. Способ включает добавление одного из углеводов в концентрации 500 мМ в среду культивирования, инкубирование дрожжей в течение 1 ч, воздействие смесью перекиси водорода в концентрации 2 мМ и треххлористого железа в концентрации 1 мМ в течение 1 ч с последующим определением числа выживших клеток [Benaroudj N., Do Нее Lee, Goldberg A.L. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. // The Journal Of Biological Chemistry. 2001, vol. 276, No. 26, pp.24261-24267]. При использовании данного способа защиты дрожжей достигается 20-кратное увеличение доли выживших клеток по сравнению с контролем (культурой без добавления углевода). Недостатком данного способа является использование в качестве тест-культуры мутантного в отношении синтеза трегалозы штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вследствие чего данный способ не отражает защитного действия углеводов на не мутированные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от стрессорных воздействий различной природы (действие окислителей, γ-радиации, фотоокисление) с использованием в качестве защитных агентов алкилоксибензолов [Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующее действие микробных АОБ различной структуры на стрессовый ответ дрожжей. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, №5, с.571-575]. Способ включает выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, добавление алкилоксибензолов в концентрации от 0,13 до 1,9 г/л, инкубирование культуры с алкилоксибензолами в течение 2 ч, воздействие различными стрессорными агентами с последующим определением числа выживших клеток. В условиях окислительного стресса (H2O2, 100 мМ, 30 мин) показано, что С7-АОБ в концентрациях 0,25-0,64 г/л повышает устойчивость клеток дрожжей к перекиси водорода в 2-5 раз. В следующей серии экспериментов стресс индуцировали γ-облучением дозой 50 крад: при концентрациях алкилоксибензола 1,40-1,65 г/л число жизнеспособных клеток увеличивалось в 1,2-1,3 раза (по сравнению с контролем без внесения алкилоксибензола).
Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, главным из которых является относительно низкая степень защиты дрожжевых клеток (увеличение выживаемости в 1,2-1,3 раза) при воздействии на культуру облучением, а также то, что при использовании более высоких, по сравнению с оптимальными, концентраций алкилоксибензола (более 0,65 г/л) защитное действие пропадает и даже может проявляться угнетающее действие на рост дрожжей. Кроме того, в прототипе используется относительно низкая концентрация перекиси водорода (100 мМ) и не описан защитный эффект алкилоксибензолов при более высоких концентрациях стрессорного агента, хотя в условиях процессов использования и культивирования дрожжевых штаммов могут иметь место более высокие концентрации пероксида водорода и более жесткие воздействия стрессоров.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от факторов окислительного стресса на примере перекиси водорода и жесткого ультрафиолетового облучения, позволяющего достигнуть высокой степени защиты дрожжевых клеток при отсутствии угнетающего действия на дрожжевые клетки.
Поставленная задача решается тем, что предлагается способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от стрессорных агентов, включающий выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, инкубацию с защитным агентом в течение 5-6 часов, воздействие различными стрессорными агентами (на примере перекиси водорода и жесткого ультрафиолетового облучения) с последующим определением числа выживших клеток, причем в качестве защитных агентов используют соевые ингибиторы протеаз в концентрации от 0,1 до 2,0 г/л.
В отличие от прототипа, в данном способе используется значительно более высокая концентрация пероксида водорода (700-750 мМ, что в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом), но достигаемый защитный эффект при этом находится на том же уровне. При использовании в качестве стрессорного агента жесткого ультрафиолетового излучения эффект от внесения ингибиторов протеаз превышает эффект от внесения алкилоксибензола.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивали при температуре 28°С в конической колбе общим объемом 250 мл при инкубировании на лабораторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 120 об./мин. Количество питательной среды составляло 50 мл. Пробу культуры отбирали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста, к ней добавляли алкилоксибензол в концентрации 0,25 г/л и инкубировали в течение 2 ч. Устойчивость к окислительному стрессу проверялась после 30 минут инкубации пробы с перекисью водорода в концентрации 100 мМ. Пробу культуры, подвергнутой окислительному стрессу, с помощью метода последовательных разведении рассевали на чашки Петри с агаризованной средой и осуществляли подсчет колоний. Было показано, что в данных условиях внесение алкилоксибензола повышает устойчивость клеток дрожжей в 2 раза.
Пример 2. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивали при температуре 28°С в конической колбе общим объемом 250 мл при инкубировании на лабораторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью 150 об./мин. Количество питательной среды составляло 50 мл. Пробу культуры отбирали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста, препарат ингибитора Кунитца в концентрации 0,10 г/л и инкубировали в течение 6 ч. Устойчивость к окислительному стрессу проверялась после 30 минут инкубации пробы с перекисью водорода в концентрации 740 мМ. Определение доли выживших клеток проводили с помощью микроскопирования с красителем метиленовым синим. Установлено, что при внесении ингибитора Кунитца в концентрации 0,10 г/л в условиях окислительного стресса (Н2О2, 740 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,1 раза.
Пример 3. Культуру дрожжей выращивали в тех же условиях, которые описаны в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Кунитца в концентрации 1,00 г/л и инкубировали в течение 6 ч. После инкубации пробу переносили на чашку Петри, которую помещали под бактерицидную лампу, и проводили облучение дрожжевой суспензии жестким ультрафиолетовым излучением в течение 30 секунд. После окончания облучения в пробе подсчитывали количество живых и мертвых клеток по описанному в Примере 2 способу. При внесении ингибитора Кунитца в концентрации 1,00 г/л при облучении культуры жестким ультрафиолетовым облучением в течение 30 секунд доля выживших клеток увеличивается в 2,8 раз.
Пример 4. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л, инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H2O2, 740 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,5 раза.
Пример 5. Культуру дрожжей выращивали в условиях, описанных в Примере 2. Затем к пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л и осуществляли с культурой операции, описанные в Примере 3. После облучения и подсчета живых и мертвых клеток было обнаружено, что при внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л при облучении культуры жестким ультрафиолетовым облучением в течение 30 секунд доля выживших клеток увеличивается в 4,7 раз.
Пример 6. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л, инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H2O2, 700 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,4 раза.
Пример 7. Культуру выращивали в условиях, описанных в Примере 2. К пробе добавляли ингибитор Кунитца в концентрации 1,00 г/л и инкубировали с пероксидом водорода и проводили подсчет живых и мертвых клеток аналогично Примеру 2. При внесении ингибитора Баумана-Бирк в концентрации 1,00 г/л в условиях окислительного стресса (H2O2, 750 мМ, 30 мин) доля выживших клеток увеличивается в 2,9 раза.
Как видно из приведенных примеров, при осуществлении данного способа защиты клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae достигается более высокая по сравнению с прототипом эффективность защиты от облучения (в 1,2-5,4 раза). Кроме того, во всем исследованном диапазоне концентраций вносимых ингибиторов не отмечалось угнетение роста культуры. Также, несмотря на увеличение концентрации пероксида водорода до концентрации 700-750 мМ, что в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом, эффект от введения соевых ингибиторов протеаз находится на уровне аналога. В условиях окислительного стресса (H2O2, 700-750 мМ, 30 мин) показано, что ингибитор Кунитца увеличивает долю выживших клеток в 1,5-3 раза по сравнению с контролем, ингибитор Баумана-Бирк - в 1,5-2,5 раза. В следующей серии экспериментов стресс индуцировали облучением жестким ультрафиолетом при аналогичных условиях обработки ингибиторами в тех же концентрациях. В этом в случае ингибитор Кунитца увеличивает долю выживших клеток в 1,2-2,7 раз по сравнению с контролем, ингибитор Баумана-Бирк - в 2,3-4,7 раза. Выживаемость дрожжевых клеток при облучении выше по сравнению с прототипом, а доля живых клеток, обработанных перекисью водорода, находится на уровне прототипа несмотря на увеличение концентрации перекиси до концентрации 700-750 мМ (в 7,0-7,5 раз выше по сравнению с прототипом), что свидетельствует о более высокой антиоксид антной активности ингибиторов протеаз. Кроме того, в отличие от прототипа не наблюдается угнетения культуры во всем исследованном диапазоне концентраций ингибиторов протеаз.
Claims (1)
- Способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода, включающий выращивание культуры дрожжей в стандартных условиях до конца логарифмической или начала стационарной фазы роста, инкубацию с защитным агентом, воздействие пероксидом водорода с последующим определением числа выживших клеток, отличающийся тем, что в качестве защитных агентов используют соевые ингибиторы протеаз, причем время инкубации с защитным агентом составляет 5-6 ч, концентрация защитного агента - 0,1-2,0 г/л, концентрация перекиси водорода - 700-750 мМ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012106867/10A RU2493248C1 (ru) | 2012-02-27 | 2012-02-27 | Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012106867/10A RU2493248C1 (ru) | 2012-02-27 | 2012-02-27 | Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012106867A RU2012106867A (ru) | 2013-09-10 |
| RU2493248C1 true RU2493248C1 (ru) | 2013-09-20 |
Family
ID=49164366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012106867/10A RU2493248C1 (ru) | 2012-02-27 | 2012-02-27 | Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2493248C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6461857B1 (en) * | 2000-07-19 | 2002-10-08 | Arch Personal Care Products, L.P. | Producing water-soluble yeast extract by adding peroxide to growing yeast cells |
| RU2394098C2 (ru) * | 2007-11-28 | 2010-07-10 | Сергей Владимирович Калёнов | Способ культивирования дрожжей для спиртового производства |
-
2012
- 2012-02-27 RU RU2012106867/10A patent/RU2493248C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6461857B1 (en) * | 2000-07-19 | 2002-10-08 | Arch Personal Care Products, L.P. | Producing water-soluble yeast extract by adding peroxide to growing yeast cells |
| RU2394098C2 (ru) * | 2007-11-28 | 2010-07-10 | Сергей Владимирович Калёнов | Способ культивирования дрожжей для спиртового производства |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КОНАНЫХИНА И.А. и др. Регулирующее действие микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008, том 44, No.5, с.571-575. * |
| КОНАНЫХИНА И.А. и др. Регулирующее действие микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008, том 44, №5, с.571-575. ХАБИБУЛИНА Н.В. и др. Разработка научных основ технологии получения ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов производства изолята белка сои // Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности. I Международная конференция Российского химического общества имени Д.И. Менделеева, 29-30 сентября 2009. Найдено в интернете: http://www.chemsoc.ru/docs/simposium/2009/chemsoc 2009-pdf. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012106867A (ru) | 2013-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Stomatal closure and SA-, JA/ET-signaling pathways are essential for Bacillus amyloliquefaciens FZB42 to restrict leaf disease caused by Phytophthora nicotianae in Nicotiana benthamiana | |
| Jung et al. | Bacterial persistence: Fundamentals and clinical importance | |
| Yu et al. | An algicidal Streptomyces amritsarensis strain against Microcystis aeruginosa strongly inhibits microcystin synthesis simultaneously | |
| Luo et al. | Visible light mediated killing of multidrug-resistant bacteria using photoacids | |
| Das et al. | Vitexin alters Staphylococcus aureus surface hydrophobicity to obstruct biofilm formation | |
| Wen et al. | Phenyl-α-tert-butyl nitrone reverses mitochondrial decay in acute Chagas' disease | |
| Lurwanu et al. | Increasing temperature elevates the variation and spatial differentiation of pesticide tolerance in a plant pathogen | |
| Wang et al. | Overexpression of toll-like receptor 4 affects autophagy, oxidative stress, and inflammatory responses in monocytes of transgenic sheep | |
| Wang et al. | Influence of arginine on the biocontrol efficiency of Metschnikowia citriensis against Geotrichum citri-aurantii causing sour rot of postharvest citrus fruit | |
| Zhang et al. | Analysis of cylindrospermopsin-and microcystin-producing genotypes and cyanotoxin concentrations in the Macau storage reservoir | |
| Teplitski et al. | Microbial interactions on coral surfaces and within the coral holobiont | |
| Park et al. | A comparative study of three different viability tests for chemically or thermally inactivated Escherichia coli | |
| RU2493248C1 (ru) | Способ защиты дрожжей saccharomyces cerevisiae от окислительного стресса в результате воздействия перекиси водорода | |
| Li et al. | Lactobacillus fermentum HFY06 reduced CCl 4-induced hepatic damage in Kunming mice | |
| Min et al. | Managing two simultaneous issues in concrete repair: healing microcracks and controlling pathogens | |
| Sarenqimuge et al. | Dormancy and germination of microsclerotia of Verticillium longisporum are regulated by soil bacteria and soil moisture levels but not by nutrients | |
| Zavatti et al. | Investigation of the effects of oxidative stress‐inducing factors on culturing and productivity of Bordetella pertussis | |
| RU2461631C1 (ru) | Способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы | |
| Kim et al. | 4-Chloro-2-isopropyl-5-methylphenol exhibits antimicrobial and adjuvant activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
| Kotova et al. | Role of reactive oxygen species in the bactericidal action of quinolones as inhibitors of DNA gyrase | |
| Williams et al. | Gram‐negative anaerobes elicit a robust keratinocytes immune response with potential insights into HS pathogenesis | |
| CN106729610B (zh) | N15多肽在抑制金黄色葡萄球菌抑制剂中的用途 | |
| WO2014133378A1 (en) | Compositions for controlling ganoderma disease in plants and method thereof by using soil actinomycetes | |
| CN109452286B (zh) | 甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用 | |
| HOMMA et al. | Studies on the Control of Plant Diseases by Amino Acid Derivatives (3) Effect of sodium N-lauroyl-valinate on the growth of rice blast fungus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150228 |