RU2493165C1

RU2493165C1 - Nanoantibody specifically binding muc1 protein, method of muc1 protein detection by nanoantibodies

Info

Publication number: RU2493165C1
Application number: RU2012107036/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Владимирович Тиллиб
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Технофарма"
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2013-09-20
Also published as: WO2013129978A3; WO2013129978A2; RU2012107036A

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: single-domain antibody (nanoantibody) is proposed, which specificaly binds a mucin 1 protein (MUC1) of a human being and characterised by a full amino acid sequence. Also the method is considered to detect a MUC1 protein in biological fluids of a human being with usage of a nanoantibody according to the invention.

EFFECT: invention may find further application in diagnostics and therapy of cancer.

3 cl, 3 dwg, 4 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины, в частности к получению и использованию специфических однодоменных антител (наноантител) для узнавания (детекции) и связывания белка MUC1 человека.The present invention relates to the field of molecular immunology, biotechnology and medicine, in particular to the production and use of specific single-domain antibodies (nanoantibodies) for the recognition (detection) and binding of human MUC1 protein.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Один из наиболее перспективных опухолевых маркеров Муцин-1 (MUC1) представляет собой сильно гликозилированный белок, присутствующий в норме во многих типах клеток человека (может выявляться как ассоциированный с поверхностной клеточной мембраной, а также как секретируемый или внутриклеточный белок). Экспрессия этого белка значительно повышена в большинстве злокачественных новообразований эпителиального генеза. Повышенную экспрессию MUC1 в опухолях и деполяризацию распределения антигена в клетках расценивают как фактор неблагоприятного течения заболевания. Особое значение придают существованию патологически измененных форм муцина, экспрессия которых является следствием нарушений в процессах гликозилирования молекулы в злокачественных клетках. Высокое содержание секретируемой формы MUC1 в кровотоке онкологических больных со злокачественными новообразованиями эпителиального генеза прямо коррелирует с распространенностью опухолевого процесса и неблагоприятным прогнозом заболевания. Предполагают, что муцин задействован в процессах межклеточной адгезии, в том числе в процессах взаимодействия опухолевых клеток с клетками иммунной системы. Таким образом, MUC1 традиционно рассматривается как потенциально эффективная мишень для иммунотерапии.One of the most promising tumor markers Mucin-1 (MUC1) is a highly glycosylated protein that is present normally in many types of human cells (can be detected as associated with the surface of the cell membrane, as well as as a secreted or intracellular protein). The expression of this protein is significantly increased in most malignant neoplasms of epithelial origin. Increased expression of MUC1 in tumors and depolarization of antigen distribution in cells is regarded as a factor in the adverse course of the disease. Of particular importance is the existence of pathologically altered forms of mucin, the expression of which is a consequence of disturbances in the glycosylation processes of the molecule in malignant cells. The high content of the secreted form of MUC1 in the bloodstream of cancer patients with malignant neoplasms of epithelial origin directly correlates with the prevalence of the tumor process and the poor prognosis of the disease. It is believed that mucin is involved in the processes of intercellular adhesion, including the interaction of tumor cells with cells of the immune system. Thus, MUC1 has traditionally been regarded as a potentially effective target for immunotherapy.

Муцин-1 является крупным белком из 1232 аминокислот, который включает 42 повторяющиеся последовательности из 20 аминокислот. Причем количество повторов может варьировать и является одной из причин высокой полиморфности гена MUC1. Участок между аминокислотами 1097-1098 является аутолизирующимся. В результате гидролиза этой связи образуются две субъединицы, которые после протеолиза образуют друг с другом нековалентный гетеродимер. Внеклеточная альфа-субъединица муцина-1 (фрагмент 24-1097) содержит адгезивные повторы, за счет которых связывается с 1САМ1 и участвует в клеточной миграции и метастазировании опухолевых клеток. Альфа-субъединица муцина-1 обладает свойствами клеточной адгезии, причем белок может действовать как адгезивный, так и антиадгезивный. Обеспечивает защитный слой эпителиальных клеток против бактерий и повреждающих ферментов. Цитоплазматическая бета-субъединица муцина-1 (фрагмент 1098-1255) содержит большое количество участков связывания с регуляторными белками и определяет участие муцина-1 в нескольких сигнальных путях. Бета-субъединица связывает SRC, CTNNB1 и белки группы ERB. Бета-субъединица играет роль в передаче сигнала клеткой, что опосредовано фосфорилированием белка и белок-белковыми взаимодействиями. Муцин-1 модулирует передачу сигнала через ERK, SRC и NF-κВ. В активированных Т-клетках оказывает влияние на Ras/MAPK сигнальный путь. Усиливает рост опухолей. Клетки более 80% карцином характеризуются высокой экспрессией муцина-1, изменением профиля гликозилирования и потерей поляризации. [Карцинома - вид злокачественной опухоли, развивающейся из клеток эпителиальной ткани различных органов (кожи, слизистых оболочек и многих внутренних органов)].Mucin-1 is a large protein of 1232 amino acids, which includes 42 repeating sequences of 20 amino acids. Moreover, the number of repeats can vary and is one of the reasons for the high polymorphism of the MUC1 gene. The area between amino acids 1097-1098 is autolizing. As a result of hydrolysis of this bond, two subunits are formed, which, after proteolysis, form a non-covalent heterodimer with each other. The extracellular alpha subunit of mucin-1 (fragment 24-1097) contains adhesive repeats, due to which it binds to 1CAM1 and is involved in cell migration and metastasis of tumor cells. The mucin-1 alpha subunit has cell adhesion properties, and the protein can act both adhesive and anti-adhesive. Provides a protective layer of epithelial cells against bacteria and damaging enzymes. The mucin-1 cytoplasmic beta subunit (fragment 1098-1255) contains a large number of regulatory protein binding sites and determines the participation of mucin-1 in several signaling pathways. The beta subunit binds SRC, CTNNB1 and proteins of the ERB group. The beta subunit plays a role in cell signaling, which is mediated by protein phosphorylation and protein-protein interactions. Mucin-1 modulates signal transmission through ERK, SRC and NF-κB. In activated T cells, the Ras / MAPK signaling pathway is affected. Enhances tumor growth. Cells with more than 80% carcinomas are characterized by high expression of mucin-1, a change in glycosylation profile, and loss of polarization. [Carcinoma is a type of malignant tumor that develops from cells of the epithelial tissue of various organs (skin, mucous membranes and many internal organs)].

Высокий уровень гликозилирования MUC1 и высокий уровень его экспрессии приводит к тому, что он образует на поверхности раковых клеток слой, который мешает проникновению, как правило, гидрофобных, хемотерапевтических препаратов. С другой стороны, муциновый слой задерживает многочисленные факторы роста из окружающей клетку среды, что приводит к их концентрированию на поверхности клеток и ускорению роста раковых клеток.A high level of glycosylation of MUC1 and a high level of its expression leads to the fact that it forms a layer on the surface of cancer cells that interferes with the penetration of, as a rule, hydrophobic, chemotherapeutic drugs. On the other hand, the mucin layer delays numerous growth factors from the environment surrounding the cell, which leads to their concentration on the cell surface and accelerate the growth of cancer cells.

Очевидно, что MUC1 является одним из важнейших факторов, стимулирующих метастазирование опухолей, что является следствием его суммарного стимулирующего действия на процессы повышения мобильности и инвазивности клеток, а также на процесс ангиогенеза. Многочисленные исследования последних лет убедительно продемонстрировали, что белок MUC1 является важным диагностическим маркером и важной мишенью для разработки новых терапевтических препаратов.Obviously, MUC1 is one of the most important factors stimulating tumor metastasis, which is a consequence of its total stimulating effect on the processes of increasing cell mobility and invasiveness, as well as on the process of angiogenesis. Numerous studies in recent years have convincingly demonstrated that the MUC1 protein is an important diagnostic marker and an important target for the development of new therapeutic drugs.

В последние годы все большее внимание при создании новых диагностических и терапевтических препаратов для выявления и лечения многих болезней уделяется препаратам на основе антител, как правило моноклональных классических антител. Антитело способно специфически связывать определенный антиген/белок как свободный или находящийся в комплексе с другими молекулами, так и белок, оверэкспрессированный и локализующийся на поверхности клетки определенного типа. Такое связывание может блокировать важный биологический процесс, каскад, а также стимулировать иммунную систему пациента атаковать клетки, с которыми связалось антитело. Антитело может быть также средством специфической доставки других терапевтических молекул, субстанций или радиоизотопов. Наконец, возможно использование ди- и полифункциональных и многокомпонентных конструкций на основе получаемых антител или их производных. В принципе, потенциально возможно получить антитела, специфичные практически к любой внеклеточной или ассоциированной с клеточной поверхностью мишени.In recent years, more and more attention when creating new diagnostic and therapeutic drugs for the detection and treatment of many diseases has been given to drugs based on antibodies, usually monoclonal classical antibodies. An antibody is capable of specifically binding a specific antigen / protein, either free or complexed with other molecules, or a protein that is overexpressed and localized on the surface of a cell of a certain type. Such binding can block an important biological process, a cascade, and also stimulate the patient’s immune system to attack the cells that the antibody has bound to. An antibody may also be a specific delivery vehicle for other therapeutic molecules, substances or radioisotopes. Finally, it is possible to use di- and multifunctional and multicomponent constructs based on the resulting antibodies or their derivatives. In principle, it is potentially possible to obtain antibodies specific for almost any extracellular or cell surface-associated target.

Антитела, связывающие муцин 1, могут препятствовать развитию опухоли, восстанавливая межклеточные взаимодействия, нарушенные опухолеассоциированным MUC1, тем самым предотвращая метастазирование и противодействуя иммунной супрессии. Некоторые анти-MUC1 антитела могут способствовать уничтожению опухолевых клеток с помощью антителозависимой цитотоксичности (с помощью клеток иммунной системы) (von Mensdorff-Pouilly et al. Natural and Induced Humoral Responses to MUC1. Cancers 2011, 3: 3073-3103. - Естественный и индуцированный гуморальные ответы на MUC1).Mucin 1 binding antibodies can inhibit tumor development by restoring intercellular interactions disrupted by tumor-associated MUC1, thereby preventing metastasis and counteracting immune suppression. Some anti-MUC1 antibodies may contribute to the destruction of tumor cells by antibody-dependent cytotoxicity (using cells of the immune system) (von Mensdorff-Pouilly et al. Natural and Induced Humoral Responses to MUC1. Cancers 2011, 3: 3073-3103. - Natural and Induced humoral responses to MUC1).

Ранее неоднократно уже предпринимались попытки получить антитела, связывающиеся с белком MUC1. В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующий пример.Attempts have repeatedly been made to obtain antibodies that bind to the MUC1 protein. As the closest analogue of the technical solution that forms the basis of the present invention, the following example can be given.

Известно однодоменное антитело для муцинового антигена-1 (заявка WO №2011099684, публ. 18.08.2011, Single domain antibody for Much antigen 1). Здесь заявлено получение особых однодоменных антител, связывающих белок MUC1 на поверхности опухолевых клеток, с целью выявления (диагностики) этих клеток, а также для использования полученного антитела в качестве мишени (MUC1) специфического противоопухолевого препарата.A single-domain antibody is known for mucin antigen-1 (application WO No. 20111099684, publ. 08/18/2011, Single domain antibody for Much antigen 1). It is claimed that the production of specific single-domain antibodies that bind the MUC1 protein on the surface of tumor cells, in order to identify (diagnose) these cells, as well as to use the obtained antibody as a target (MUC1) of a specific antitumor drug.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.This technical solution as the closest to the claimed by the composition of the active substance and the method of its use is selected by the authors of the present invention for the prototype.

Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:

1. Однодоменное антитело получали на основе последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина мыши путем генно-инженерного варьирования строго определенных аминокислотных позиций в гипервариабельных комплементарность определяющих участках (в CDR1: 24-30, в CDR2: 31-37, в CDR3: 38-44). Таким образом, способ получения антитела был трудоемким и малоэффективным, так как получаемые антитела1. A single domain antibody was obtained on the basis of the mouse immunoglobulin heavy chain sequence by genetic engineering variation of strictly defined amino acid positions in the hypervariable complementarity of the determining regions (in CDR1: 24-30, in CDR2: 31-37, in CDR3: 38-44). Thus, the method of producing antibodies was laborious and ineffective, since the resulting antibodies

а) не проходили важного этапа получения высокоаффинных антител - их аффинного дозревания in vivo,a) did not pass the important stage of obtaining high-affinity antibodies - their affinity maturation in vivo,

б) обычно такая вырванная из контекста традиционного моноклонального антитела белковая последовательность плохо растворима и склонна к агрегации.b) usually such a protein sequence taken out of the context of a traditional monoclonal antibody is poorly soluble and prone to aggregation.

2. Структурные особенности вариабельного антиген-узнающего домена традиционного антитела (в отличие от наноантител) делают невозможным формирование особых паратопов, способных узнавать некоторые «скрытые» эпитопы, такие как находящиеся в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.2. The structural features of the variable antigen-recognizing domain of a traditional antibody (in contrast to nanoantibodies) make it impossible to form special paratopes capable of recognizing some “hidden” epitopes, such as those located in recesses, small gaps in the protein structure.

3. Полученные антитела, скорее всего, могут быть относительно плохо растворимы, так как обычно такая вырванная из контекста традиционного моноклонального антитела белковая последовательность плохо растворима и склонна к агрегации.3. The resulting antibodies are most likely to be relatively poorly soluble, since usually a protein sequence taken out of the context of a traditional monoclonal antibody is poorly soluble and prone to aggregation.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител (антиген-узнающих молекул), лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих белок MUC1.Thus, in the prior art there is a need for the development of new antibodies (antigen-recognizing molecules), devoid of the above disadvantages and specifically recognizing the MUC1 protein.

Задачей настоящего изобретения явилось создание новых особых антител, способных эффективно связывать белок MUC1. Эти новые особые антитела должны обладать следующими преимуществами по отношению к прототипу (однодоменному антителу, являющемуся производным тяжелой цепи классического иммуноглобулина мыши): производство и хранение должны быть более экономичны, эффективны и относительно просты; их получение должно обязательно включать стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что должно способствовать более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных антител, они должны быть хорошо растворимы, они должны обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы.The present invention was the creation of new special antibodies that can effectively bind the MUC1 protein. These new specific antibodies should have the following advantages in relation to the prototype (single domain antibody, which is a derivative of the heavy chain of the classical mouse immunoglobulin): production and storage should be more economical, efficient and relatively simple; their preparation must necessarily include the stage of immunization and affinity maturation in vivo, which should contribute to higher affinity and a significant increase in the efficiency of selection of desired antibodies, they must be readily soluble, they must have new structural features, in principle, allowing them to recognize some of the “hidden” conventional antibody epitopes.

Поставленная задача решается за счет того, что создано наноантитело, специфически связывающее белок муцин 1 (MUC1) человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. При этом способ детекции белка MUC1 в биологических жидкостях человека включает приведение в контакт указанной биологической жидкости с заявленным наноантителом и детектирование связывания этого наноантитела с белком MUC1. The problem is solved due to the fact that a nanoantibody has been created that specifically binds human mucin 1 (MUC1) protein and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The method for detecting MUC1 protein in human biological fluids involves contacting the biological fluid with the claimed nanoantibody and detecting the binding of this nanoantibody to the MUC1 protein.

При этом детекцию белка MUC1 с помощью наноантитела осуществляют как в свободном виде в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток, например опухолевых, где этот белок оверэкспрессирован.In this case, the detection of MUC1 protein using nanoantibodies is carried out both in free form in biological fluids and on the surface of cells, for example, tumor cells, where this protein is overexpressed.

В основе настоящего изобретения находятся не однодоменные производные классических бивалентных антител, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые, исходно в норме существующие в организме животного (верблюда) однодоменные наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Существуют эффективные способы получения (и селекции) таких антител в отношении различных (в том числе низкоиммуногенных) антигенов муцина, а благодаря своей низкой иммуногенности наноантитела могут применяться для лечения инфекций, вызванных патогенами данной группы.The basis of the present invention are not single-domain derivatives of classical bivalent antibodies, which are considered as a prototype, but small, initially normal in the body of an animal (camel) single-domain nanoantibodies, which have several advantages compared with classical monoclonal antibodies for practical use in the field of therapy diseases. Since nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional antibodies, they acquire a number of new positive qualities of practical importance. There are effective ways to obtain (and select) such antibodies against various (including low immunogenic) mucin antigens, and due to their low immunogenicity, nanoantibodies can be used to treat infections caused by pathogens of this group.

Полным эквивалентом термина "однодоменные наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX (NANOBODY), а также «однодоменное мини-антитело».The full equivalent of the term "single-domain nanoantibodies" for the purposes of the present invention is the widely used designation "nanobody", introduced by ABLYNX (NANOBODY), as well as "single-domain mini-antibody".

Рекомбинантные однодоменные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса IgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти (Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem., 1996; 49, 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains, TIBS 2001; 26, 230-235. - Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов). В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3).Recombinant single-domain nanoantibodies are obtained on the basis of special non-canonical single-chain antibodies that exist normally along with classical antibodies in animals of the camelid family (and in some types of cartilaginous fish). These specific antibodies consist of a dimer of only one shortened (without the first constant region CH1) immunoglobulin heavy chain and are fully functional in the absence of an immunoglobulin light chain. For the specific recognition and binding of antigen proper, only one variable domain (VHH, "nanoantibody", "nanobody" or single domain nanoantibody) of this antibody is necessary and sufficient. The organization of the variable domains (VHH) of noncanonical antibodies is substantially similar to that of the variable domains (VH) of classical antibodies (in humans, the VH domains of immunoglobulins of the IgG3 subclass have a particularly pronounced homology with camelid VH and VHH). In both cases, V-domains consist of four conservative framework regions (FR, “framework regions”) surrounding three hypervariable regions (determining complementarity, CDR, from “complementarity determining regions”). In both cases, the domains form a spatial structure typical of the immunoglobulin V domain of two beta layers (sheets), one of four amino acid chains, and the second of five (Padlan E.A. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem., 1996; 49, 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains, TIBS 2001; 26, 230-235. - Recognition antigens by fragments of single-domain antibodies: excessive luxury of paired domains). In this structure, all three hypervariable regions are clustered on one side of the V domain (where they are involved in antigen recognition) and are located in loops connecting the beta structures. However, there are important differences associated with the functioning of VHH in a single domain format. Thus, the hypervariable regions of CDR1 and CDR3 are markedly increased in the case of VHH. Often, cysteine residues are found in the hypervariable regions of VHH, moreover, they are present in two regions at once (most often in CDR1 and CDR3, less often in CDR2 and CDR3).

По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.In comparison with traditional and purely recombinant antibodies, camel nanoantibodies have several advantages, which suggests a great potential for their future use in various studies and in the creation of new biotechnological devices, as well as for clinical purposes for the diagnosis and treatment of diseases.

Характерными особенностями однодоменных наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии (см. обзор: Тиллиб С.В. Верблюжьи наноантитела - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология, 2011; 45(1), 77-85), является следующее.The characteristic features of single-domain nanoantibodies, which determine their great potential for a wide variety of practical applications in immunobiotechnology (see review: Tilib S.V., Camel nanoantibodies, are an effective tool for research, diagnostics, and therapy. Molecular Biology, 2011; 45 (1), 77 -85) is the following.

1. Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.1. The presence of a highly efficient method for the generation and selection of nanoantibodies.

2. Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток).2. Small size, ~ 2 × 4 nm, 13-15 kDa (improved cell permeability).

3. Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.3. Structural features (the ability to form paratopes unusual for classical antibodies, allowing them to bind to recesses and active centers of proteins); can be used to identify “hidden” epitopes or epitopes that cannot be recognized by significantly larger conventional antibodies.

4. Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 л культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.4. High expression yield, cost-effective production in large quantities. Typically, nanoantibodies are produced in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 liter of culture). The possibility of their effective production in yeast, plants and mammalian cells is demonstrated.

5. Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.5. The simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives.

6. Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.6. Low immunogenicity; the ability to economically "humanize" antibodies without a noticeable loss of their specific activity.

Возможность получения рекомбинантных однодоменных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом (Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Существующие в природе антитела без легких цепей). Техническая реализация отбора однодоменных наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага (фаговый дисплей).The possibility of obtaining recombinant single-domain nanoantibodies with a given specificity is determined by the existence of functional and possessing a fairly wide recognition spectrum of noncanonical antibodies in representatives of the Camelidae family. Noncanonical antibodies consist of a dimer of only one shortened immunoglobulin heavy chain (without light chains), the recognition specificity of which is determined by only one variable domain (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Existing naturally-occurring antibodies without light chains). The technical implementation of the selection of single-domain nanoantibodies, which are genetically engineered derivatives of antigen-recognizing domains of single-chain camel antibodies, is based on a highly efficient selection procedure for antigen-recognizing polypeptides exposed on the surface of a filamentous phage particle (phage display).

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов (Brissette R & Goldstein NI. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. - Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаментальных исследований и исследований трансляции. Methods Mol Biol. 2007; 383:203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces Curr Opin Struct Biol., 2007; 17:481-7. - Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов).The phage display method is a very effective and widely used technology for the functional selection from large recombinant libraries of DNA sequences encoding peptides and proteins that have the desired properties and are expressed as part of the surface protein of filamentous phages (Brissette R & Goldstein NI. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research - Using peptide phage-display libraries for basic research and translation research. Methods Mol Biol. 2007; 383: 203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein intera ction interfaces Curr Opin Struct Biol., 2007; 17: 481-7. - Phage display for the construction and analysis of protein domain interactions).

Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов (Hoogenboom MR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol., 2005; 23:1105-16. - Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител. Обычно вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменения. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к агрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании однодоменных наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.One of the most important applications of this technology is the generation of specific recombinant antibodies for a wide variety of antigens (Hoogenboom MR. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol., 2005; 23: 1105-16. - Selection and analysis of recombinant antibody libraries. Usually instead of large entire molecules of classical antibodies are used for exposure on the surface of the phage using hybrid recombinant single-stranded proteins, which are random combinations of cloned sequences of the variable regions of the heavy and light chains of immunoglobulin connected by a short serine / glycine-rich linker sequence.This chimeric molecule, if the domains are correctly combined, can preserve the specificity of the original immunoglobulin, despite the changes introduced in comparison with the native antibody molecule. One of the problems of traditional recombinant technologies is the need to work with very large libraries of recombinant antibodies in which all possible combinations of two random variable regions (heavy and light chains) should be presented immunoglobulins) connected by a linker sequence. In addition to the problem of representation, the problem of the formation of the correct relative conformation of these two domains is also obvious, as well as the solubility of individual variable domains, which often tend to aggregate. The mentioned problems can be avoided by using single-domain nanoantibodies, since almost every cloned variable domain of single-chain antibodies in this case will have a certain antigen-recognizing specificity corresponding to one of the antibodies of the immunized animal, and selection from relatively small libraries of such domains can be effectively performed.

Однодоменные наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов (Conrath КЕ, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. - Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярных строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител. J Biol Chem., 2001, Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. - Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью; J Mol Biol. 2004, Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. - Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел; Cancer Res., 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stij'lemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor., Nat. Med., 2006, May; 12 (5): 580-4. - Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгированного с наотелом.; Coppieters К, Dreier Т, Silence К, Haard HD, Lauwereys М, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis., Arthritis Rheum., 2006, Jun; 54 (6): 1856-66. - Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита); мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы (Harbury P.В., Zhang Т., Kirn P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. - Перключение между двух-, трех- и четырехцепочечными спиральными структурами в мутантах ССМ4 - «лейциновой молнии»; Science, 1993, 262:1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. - Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии»; Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; ChenchikA., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides, 2010, заявка на выдачу патента США №20100305002, Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов; или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы (Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. Nat Biotechnol., 2003, 21(12):1486-92. - Дизайн мультивалентных комплексов, используя модуль барназа-барстар).Single-domain nanoantibodies with a given specificity or their derivatives can be used, like classical antibodies, in various applications, including, but not limited to, the detection of antigens (both for research and diagnostic purposes), blocking the activity of antigen protein, specific delivery by binding to the antigen of the desired molecules conjugated to the antibody. Also, single-domain nanoantibodies can be the original modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary single-domain nanoantibodies. These single domain nanoantibodies combined into a single construction can bind both to the same epitope of the target antigen and to its different epitopes or even to different target antigens. It is also possible to combine single domain nanoantibodies and other molecules or drugs into one design to obtain multifunctional drugs (Conrath KE, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. - Camel single domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. J Biol Chem., 2001, Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. - Pentamerization Isolation of Single-Domain Antibodies from Phage Libraries: A New Strategy for Rapidly Obtaining High Avidity Antibody Reagents; J Mol Biol. 2004, Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. - Effective cancer therapy with nanobody conjugates; Cancer Res., 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stij'lemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor., Nat. Med., 2006, May; 12 (5): 580-4. - Experimental therapy of African trypanosomy using the human trypanolytic factor conjugated to the body .; Coppieters K, Dreier T, Silence K, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis., Arthritis Rheum., 2006, Jun; 54 (6): 1856-66. - Formatted anti-TNFalpha VHH proteins isolated from camelids demonstrate a high affinity for inflamed joints in a mouse model of collagen-induced arthritis); multimerization by introducing additional amino acid sequences of interacting protein domains such as leucine zippers (Harbury P.V., Zhang T., Kirn PS, et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. - Switching between two-, three- and four-chain helical structures in CCM4 mutants - “leucine zipper”; Science, 1993, 262: 1401-1407; Shirashi T., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. - Enhanced cytotoxicity of soluble Fas ligand due to its combination with the "isoleucine zipper" motif; B iochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; ChenchikA., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides, 2010, U.S. Patent Application No. 2010305002, Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides; or sequences of small proteins forming stable complexes (Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase * barstar module. Nat Biotechnol., 2003, 21 (12): 1486-92. - Design of multivalent complexes using the Barnase-Barstar module).

Также было показано (Vincke С., Loris R., Saerens D., et al.; J. Biol. Chem., 2009. V., 284, №5. 3273-3284), что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела: многообещающие экспериментальные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].It was also shown (Vincke C., Loris R., Saerens D., et al .; J. Biol. Chem., 2009. V., 284, No. 5. 3273-3284) that such camel nanoantibodies can be “humanized” without a noticeable loss of their specific activity, having carried out a small number of point substitutions of amino acids. This opens up the potential for widespread use of nanoantibodies as passive immunization agents to prevent the development of various dangerous infectious diseases [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / "Single-domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in the field of infection and immunity." Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Способ получения наноантитела, связывающего антигенный эпитоп белка MUC1, включает следующие принципиальные этапы:A method for producing a nanoantibody binding an antigenic epitope of a MUC1 protein includes the following principal steps:

1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации представителя семейства верблюдовых (в частности, двугорбого верблюда) смешанной субстанцей, приготовленной на основе нативного муцина, выделенного из женского молока, а также опухолевого муцина;1) the induction of the formation of specific antibodies as a result of immunization of a representative of the camelid family (in particular, the two-humped camel) with a mixed substance prepared on the basis of native mucin isolated from human milk, as well as tumor mucin;

2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов - наноантител - особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующемся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;2) cloning of sequences of antigen-recognizing domains - nanoantibodies - specific single-chain antibodies synthesized in the lymphocytes of an immunized animal in a phagemid vector (used in the subsequent phage display procedure), obtaining a specifically enriched library of sequences encoding nanoantibodies;

3) селекция методом фагового дисплея (функционального отбора фаговых частиц, несущих на поверхности экспрессируемое наноантитело, а внутри - ДНК, кодирующую это наноантитело) клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком MUC1, из полученной библиотеки наноантител;3) selection by the phage display method (functional selection of phage particles carrying the expressed nanoantibody on the surface, and inside the DNA encoding this nanoantibody) of nanoantibody clones that bind to a given antigen, protein MUC1, from the obtained nanoantibody library;

4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).4) carrying out the cloning and genetic engineering modifications of the coding sequences of the selected nanoantibodies with the aim of their effective production in the bacterial expression system and subsequent effective purification (E. coli bacteria are used as the producer of the active substance).

В качестве MUC1-содержащего антигенного материала использовали смешанную субстанцию, приготовленную на основе нативного муцина, выделенного из плазмы и мембран жировых глобул женского молока, а также опухолевого муцина (гомогенат ткани опухоли молочной железы, а также препарат культуральных клеток эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, в которых происходит повышенная экспрессия поверхностного муцина).As a MUC1-containing antigenic material, we used a mixed substance prepared on the basis of native mucin isolated from plasma and membranes of the fat globules of human milk, as well as tumor mucin (homogenate of breast tumor tissue, as well as the preparation of culture cells of the epidermoid cancer of the larynopharynx, HEP2, in which there is an increased expression of surface mucin).

Способ получения однодоменных наноантител описан в примерах 1 и 2.A method of obtaining single-domain nanoantibodies is described in examples 1 and 2.

Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.Nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional antibodies and are fully functional antigen-recognizing units with a number of new positive qualities of practical importance. Nanoantibody is a single domain protein that is highly soluble and has increased stability (over a wide range of temperatures and pH). This avoids problems with the solubility and correct folding of antibody molecules during production by prokaryotic cells and leads to a significant reduction in the cost of their production compared to traditional methods for producing therapeutic monoclonal antibodies in eukaryotic expression systems. The procedure for storing and transporting antibodies is also significantly facilitated compared to markedly less stable traditional antibodies. Due to their smaller size, nanoantibodies are characterized by better ability to penetrate tissues. Finally, nanoantibodies make it easy to carry out genetic engineering manipulations for the purpose of subsequent production of bispecific nanoantibodies or chimeras, which in addition to the nanoantibodies include another protein with the desired properties.

Несмотря на то что, главным образом, в иллюстративных целях автором настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.Despite the fact that, mainly for illustrative purposes, the author of the present invention focuses on the production of antibodies using the E. coli bacterium, it will be obvious to a person skilled in the art that other embodiments of the present invention are directly covered by the scope of the present invention, directly not claimed in this document. For example, yeast cultures or any other systems obvious in the art can be used as a eukaryotic producer.

Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:The choice of implementation paths in order to obtain nanoantibodies with the claimed properties from a prokaryotic expression system in accordance with one of the preferred embodiments of the present invention is due to the following factors:

1. Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 л культуры).1. High expression yield, cost-effective production in large quantities, provided by the expression of nanoantibodies in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 l of culture).

2. Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.2. The simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives.

3. Высокая экономическая рентабельность производства. Автор настоящего изобретения исходит из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.3. High economic profitability of production. The author of the present invention proceeds from the fact that, as is well known to the average person skilled in the art, the primary, initially obtained sequences of single-domain nanoantibodies can then be adapted or “formatted” in various ways for subsequent practical use.

Так, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата однодоменного наноантитела, например увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных наноантител. Таким образом, автор настоящего изобретения понимает под термином "однодоменные наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например как минимум 10% от активности исходного однодоменного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.So, single-domain nanoantibodies can be the original modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary single-domain nanoantibodies. These single domain nanoantibodies combined into a single construction can bind both to the same epitope of the target antigen and to its different epitopes or even to different target antigens. It is also possible combined combination into a single design of single-domain nanoantibodies and other molecules or drugs to obtain multifunctional drugs; multimerization by introducing additional amino acid sequences, interacting protein domains, such as leucine zippers or sequences of small proteins forming stable complexes. To modulate the properties of the preparation of a single-domain nanoantibody, for example, to increase the lifetime or to improve the purification method, additional amino acid sequences can be introduced into the final compound. It will be apparent to one of ordinary skill in the art that such modifications and other antibody variants that underlie the present invention fall within the scope of the present invention as they are structural and functional variants of single domain nanoantibodies. Thus, the author of the present invention refers to the term "single-domain nanoantibodies" as the primary, initially obtained, "minimum" amino acid sequences of single-domain nanoantibodies, as well as their modifications resulting from the mentioned adaptations or "formatting" and their variants. The term "antibody variant" for the purposes of the present invention means a polypeptide that contains changes in the amino acid sequence, namely, deletion, insertion, addition or replacement of amino acids, provided that this maintains the necessary level of protein activity, for example at least 10% of the activity of the original single domain nanoantibodies. A number of changes in the variant of the protein depends on the position or type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. The number of changes can be, for example, from 1 to 30, more preferably from 1 to 15, and most preferably, from 1 to 5 changes in the sequence of the original single domain nanoantibody. These changes can occur in areas of the polypeptide that are not critical to its function. This is possible due to the fact that some amino acids have high homology with each other, and therefore the tertiary structure or activity of the protein is not violated by such a change. Therefore, as a variant of the protein can be a protein that is characterized by a homology of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with respect to the amino acid sequence of the original single domain nanoantibody, provided maintaining the activity of the polypeptide. Homology between amino acid sequences can be established using well-known methods, for example, using sequence alignment in the BLAST 2.0 computer program, which calculates three parameters: count, identity, and similarity.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как CDR) на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты (консервативных замен).Substitution, deletion, insertion, addition or replacement of one or more amino acid residues will be a conservative mutation or conservative mutations, provided that the protein activity is maintained. An example of a conservative mutation (s) is a conservative substitution (s). A “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acids having similar side chains are defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine , fe nilalanine, tryptophan, histidine). Since the hypervariable regions of nanoantibodies determine their specific interaction with the antigen, it is precisely the homologous substitutions of amino acids in these regions that can lead to the production of nanoantibodies slightly different in sequence, which have identical or similar properties. Thus, it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the scope of the present invention includes not only the nanoantibody sequences indicated in the appendix, but also those that can be obtained by substituting amino acids in the hypervariable regions (indicated in the sequence listing as CDRs) with other , but very similar in properties, amino acids (conservative substitutions).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное однодоменное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding the original single domain nanoantibody, for example, using the site-directed mutagenesis method, so that one or more amino acid residues at a particular site will be delegated, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using conventional processing methods to obtain a mutation.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного однодоменного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide of the original single domain nanoantibody can be obtained by expressing DNA fragments having the mutation described above and establishing the activity of the expressed product.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.Substitution, deletion, insertion or addition of nucleotides described above also includes mutations that occur in nature and, for example, are due to variability.

Полипептиды однодоменных наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих наноантитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением и подпадающие под объем настоящего изобретения.The single-domain nanoantibody polypeptides of the present invention can be encoded by a large number of nucleic acid molecules, which is the result of the degeneracy of the genetic code well known in the art. The essence of the phenomenon is that any amino acid (with the exception of tryptophan and methionine) that is part of natural peptides can be encoded by more than one triplet nucleotide codon. Any of these degenerate coding nucleic acid molecules may be included in cassettes expressing nanoantibodies of the invention and falling within the scope of the invention.

Получение функционально-активного наноантитела анти-MUC1, которое может быть использовано для специфического связывания и детекции белка MUC1 человека как находящегося в свободном состоянии, так и оверэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, показано в примерах 3 и 4.The preparation of a functionally active anti-MUC1 nanoantibody, which can be used for specific binding and detection of human MUC1 protein, both in a free state and over-expressed on the surface of a tumor cell, is shown in examples 3 and 4.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг.1 - нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая полученное однодоменное наноантитело aMUC1 (SEQ ID NO:1).Figure 1 - nucleotide sequence of cDNA encoding the obtained single-domain nanoantibody aMUC1 (SEQ ID NO: 1).

Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2).The corresponding amino acid sequence of the nanoantibody was derived from it (SEQ ID NO: 2).

В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом анти-MUC1 белка MUC1.In the indicated sequence, hypervariable regions of CDR1, CDR2, and CDR3 are underlined respectively (from left to right, from the N- to the C-terminus), which are crucial for the specific recognition of the anti-MUC1 protein MUC1 by nanoantibodies.

На фиг.2 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом анти-MUC1 иммобилизованного в лунках иммунологической плашки белка MUC1, выделенного из женского молока.Figure 2 presents the results of an enzyme immunoassay of recognition of a selected single-domain nanoantibody of anti-MUC1 immobilized in the wells of the immunological plate of the protein MUC1 isolated from human milk.

На фиг.3 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом анти-MUC1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки клеток НЕр2, содержащих на поверхности оверэкспрессированный белок MUC1.Figure 3 presents the results of an enzyme-linked immunosorbent assay of recognition of a single-domain nanoantibody of anti-MUC1 immobilized in the wells of the immunological plate of Hep2 cells containing on the surface an over-expressed MUC1 protein.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1Example 1

Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антителObtaining a library of variable domains of single-chain antibodies

ИммунизацияImmunization

Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. Вторую инъекцию проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще четыре иммунизации.Bactrian camel Camelus bactrianus was subsequently immunized 5 times by subcutaneous administration of antigenic material mixed with an equal volume of Freund's adjuvant (with the first injection) or incomplete (with the remaining injections). The second injection was carried out 3 weeks after the first, then four more immunizations were carried out with an interval of two weeks.

В качестве MUC1-содержащего антигенного материала использовали смешанную субстанцию, приготовленную на основе нативного муцина, выделенного из плазмы и мембран жировых глобул женского молока, а также опухолевого муцина (гомогенат ткани опухоли молочной железы, а также препарат культуральных клеток эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, в которых происходит повышенная экспрессия поверхностного муцина). Антигенный материал был получен из отделения проф. Якубовской Р.И. (МНИОИ им. П.А.Герцена). Нативный муцин MUC1 выделяли методом иммуноаффинной хроматографии на BrCN-сефарозе 4В, конъюгированной с МКА ИК025 (моноклональные антитела против муцина), из частично очищенной методом ионообменной хроматографии плазмы женского молока. Концентрацию муцина в растворе оценивали по величине оптического поглощения раствора, измеренной против контрольного образца буферного раствора, принимая 1 отн.ед. поглощения за 10000 ЕД/мл антигена. В ходе трех последовательных выделений на иммуноаффинном сорбенте с иммобилизованными на сефарозе 4В моноклональными антителами ИК025 наработано 6 мл раствора высокоочищенного препарата нативного антигена MUC1 из обезжиренного женского молока по описанной выше методике. Оптическое поглощение раствора приведено к 0,2 отн.ед. (2000 ЕД/мл). Специфическая активность антигена протестирована методом ингибиторного ИФА с использованием МКА ИК025. Полученный раствор антигена был заморожен и оставлен на хранение при -20°С.As a MUC1-containing antigenic material, we used a mixed substance prepared on the basis of native mucin isolated from plasma and membranes of the fat globules of human milk, as well as tumor mucin (homogenate of breast tumor tissue, as well as the preparation of culture cells of the epidermoid cancer of the larynopharynx, HEP2, in which there is an increased expression of surface mucin). Antigenic material was obtained from the prof. Yakubovskoy R.I. (Moscow Scientific Research Institute named after P.A. Herzen). Native mucin MUC1 was isolated by immuno-affinity chromatography on BrCN-Sepharose 4B conjugated with ICA IC025 (monoclonal antibodies against mucin) from partially purified breast milk plasma ion-exchange chromatography. The concentration of mucin in the solution was evaluated by the optical absorption of the solution, measured against the control sample of the buffer solution, taking 1 rel. absorption per 10,000 units / ml of antigen. During three sequential isolations on an immunoaffinity sorbent with monoclonal antibodies IK025 immobilized on Sepharose 4B, 6 ml of a solution of a highly purified native MUC1 antigen preparation from skimmed milk was prepared using the method described above. The optical absorption of the solution is reduced to 0.2 Rel. (2000 U / ml). The specific activity of the antigen was tested by the method of inhibitory ELISA using MCA IK025. The resulting antigen solution was frozen and stored at -20 ° C.

Гомогенат ткани опухоли молочной железы получали размельчением ткани в механическом гомогенизаторе. Образцы тканей опухоли 5 пациентов с клиническим диагнозом рак молочной железы получены при оперативном вмешательстве. Сразу после поступления каждый образец ткани максимально освобождали от жировой клетчатки, измельчали ножницами и замораживали при -20°С с добавлением физиологического раствора, содержащего 0,01% тимеросал (1 мл раствора на 1 г ткани). Все манипуляции проводили с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и/или с предварительной дезинфекцией металлических инструментов. После набора требуемого количества материала образцы были разморожены, объединены и подвергнуты дополнительному измельчению с использованием металлического сита и механического гомогенизатора, также с добавлением физиологического раствора (1/1 по объему). Полученные гомогенаты центрифугировали при 3000 об/мин для осаждения крупных фрагментов ткани и отделения тканевого жира. Надосадок отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С. Получено 3,5 мл осветленного гомогената. Наличие MUC1 подтверждено методом ИФА по ингибированию связывания МКА ИК025 с иммобилизованным антигеном.Breast tumor tissue homogenate was obtained by grinding tissue in a mechanical homogenizer. Tumor tissue samples from 5 patients with a clinical diagnosis of breast cancer were obtained with surgery. Immediately after admission, each tissue sample was maximally freed from fatty tissue, crushed with scissors and frozen at -20 ° C with the addition of physiological saline containing 0.01% thimerosal (1 ml of solution per 1 g of tissue). All manipulations were performed using sterile disposable plastic dishes and / or with preliminary disinfection of metal tools. After collecting the required amount of material, the samples were thawed, combined and subjected to additional grinding using a metal sieve and a mechanical homogenizer, also with the addition of physiological saline (1/1 by volume). The resulting homogenates were centrifuged at 3000 rpm to precipitate large tissue fragments and separate tissue fat. The supernatant was selected, aliquoted and stored at -80 ° C. Received 3.5 ml of clarified homogenate. The presence of MUC1 was confirmed by ELISA to inhibit the binding of MAB IC025 to immobilized antigen.

Клетки культуры эпидермоидного рака гортани человека НЕр2 получены из банка культур НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН, Москва. Клетки культивировали в 25 см²-флаконах на среде Игла-МЕМ с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Пассирование клеток осуществляли дважды в неделю. Выращенные в несколько этапов в культуральных флаконах примерно 150 млн клеток культуры эпидермоидного рака гортаноглотки, НЕр2, были разделены на 5 равных частей (соответственно количеству инъекций) и заморожены с 10% ДМСО.Cells of the culture of epidermoid cancer of the human larynx HEP2 obtained from the Bank of cultures of the Institute of Virology. D.I. Ivanovskogo, RAMS, Moscow. Cells were cultured in 25 cm ² vials on Igla-MEM medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 8% fetal calf serum at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% carbon dioxide. Cells were passaged twice a week. Approximately 150 million cells of the culture of epidermoid cancer of the larynxopharynx, HEp2 grown in several stages in culture bottles were divided into 5 equal parts (corresponding to the number of injections) and frozen with 10% DMSO.

Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 Ед/мл) и ЭДТА (3 мМ).Blood sampling (150 ml) was performed 5 days after the last injection. To prevent coagulation of the taken blood, 50 ml of standard phosphate-saline solution (PBS) containing heparin (100 U / ml) and EDTA (3 mM) was added.

Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.Blood was diluted 2 times with a PBS solution containing 1 mM EDTA. 35 ml of a diluted blood solution was layered on a step of a special medium (Histopaque-1077, Sigma) with a density of 1.077 g / ml and a volume of 15 ml and centrifugation was performed for 20 min at 800 g. Mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) were selected from the plasma / Histopaque interphase, and then washed with a PBS solution containing 1 mM EDTA.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.Total RNA from B lymphocytes was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen). Then, a poly (A) -containing RNA was purified on a column of oligo (dT) cellulose from total RNA. RNA concentration was determined using a biophotometer (Eppendorf) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% formaldehyde agarose gel.

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989) с использованием обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas) и праймера onnro(dT)₁₅ в качестве затравки.The reverse transcription reaction was carried out according to a standard protocol (Sambrook et al., 1989) using reverse transcriptase M-MuLV (Fermentas) and onnro primer (dT) ₁₅ as a seed.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам NcoI(PstI) и NotI в фагмидный вектор, как описано ранее (Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006). Процедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в котором в качестве фага-помощника использовали бактериофаг M13KO7 (New England Biolabs, США).Reverse transcription products were used as templates in a two-step polymerase chain reaction and the resulting amplification products were cloned at the NcoI (PstI) and NotI sites into a phagemid vector as previously described (Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006). The selection procedure was also carried out similarly to those in the indicated works. It was based on the phage display method, in which the bacteriophage M13KO7 (New England Biolabs, USA) was used as an assistant phage.

Пример 2Example 2

Селекция однодоменных наноантител, специфически узнающих MUC1Selection of single domain nanoantibodies that specifically recognize MUC1

Селекцию однодоменных наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием, в первую очередь, того же, что и для иммунизации, препарата нативного муцина MUC1, выделенного из женского молока. MUC1 (10 мкг в 100 мкл на 1 лунку) иммобилизовали на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного наноантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pill) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили как описано в публикациях (Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции наноантител методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman С., Atarhouch Т., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448.; Nguyen V.K., DesmyterA., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].Single domain nanoantibodies were selected by phage display using, first of all, the same as for immunization, the preparation of native mucin MUC1 isolated from human milk. MUC1 (10 μg in 100 μl per 1 well) was immobilized at the bottom of the wells of a 96-well ELISA plate. Used polystyrene immunological plates with high sorption MICROLON 600 (Greiner Bio-One). For blocking, 1% BSA (Sigma-Aldrich, USA) and / or 1% skim milk (Bio-Rad, USA) in PBS were used. The selection and subsequent amplification of the selected phage particles (containing the single-domain nanoantibody gene inside, and the expressed single-domain nanoantibody as part of the surface phage protein pill) was repeated, as a rule, three times in succession. All manipulations were performed as described in publications (Tillib S.V., Ivanova T.I., Vasiliev L.A. 2010. Fingerprint analysis of the selection of nanoantibodies by phage display using two variants of phage assistants. Acta Naturae 2010; 2 (3) : 100-108; Hamers-Casterman S., Atarhouch T., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448 .; Nguyen VK, Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261- 296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].

Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (HinfI, MspI, RsaI). Последовательность кДНК однодоменного наноантитела анти-MUC1 (SEQ ID NO:1) была определена (фиг.1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом анти-MUC1 белка MUC1.Clone sequences of selected nanoantibodies were grouped according to the similarity of their fingerprints obtained by electrophoretic separation of the hydrolysis products of amplified sequences of single-domain nanoantibodies in parallel with three frequently digested restriction endonucleases (HinfI, MspI, RsaI). The cDNA sequence of the single-domain anti-MUC1 nanoantibody (SEQ ID NO: 1) was determined (FIG. 1). The corresponding amino acid sequence of the nanoantibody was derived from it (SEQ ID NO: 2). In the indicated sequence, hypervariable regions of CDR1, CDR2, and CDR3 are underlined respectively (from left to right, from the N- to the C-terminus), which are crucial for the specific recognition of the anti-MUC1 protein MUC1 by nanoantibodies.

Продукция нанонтителNanoConductor Products

Последовательности кДНК отобранных наноантител переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор-модифицированный вектор pHEN6 (Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807-12 - Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у верблюдовых), позволяющий присоединение к С-концу однодоменного наноантитела (His)₆-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных наноантител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).The cDNA sequences of the selected nanoantibodies were cloned into an expression plasmid vector-modified vector pHEN6 (Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frere JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elic in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 2807-12 - Beta-lactase inhibitors derived from fragments of single-domain antibodies induced in camelids), which allows the addition of a single domain (His) ₆ epitope to the C-terminus (immediately after NA epitope). Due to the presence of the signal peptide sequence (peIB) at the N-terminus of the expressed sequence, the produced recombinant protein (single-domain nanoantibody) accumulates in the periplasm of bacteria, which allows it to be efficiently isolated by the osmotic shock method without destroying the actual bacterial cells. The production of single domain nanoantibodies was carried out in E. coli (strain BL21). Expression was induced by adding 1 mM indolyl-beta-D-galactopyranoside and the cells were incubated with vigorous stirring for 7 hours at 37 ° C or overnight at 29 ° C. A single domain nanoantibody was isolated from the periplasmic extract using affinity chromatography on Ni-NTA agarose using the QIAExpressionist purification system (QIAGEN, USA).

Пример 3Example 3

Детекция белка MUC1 человека с помощью отобранного наноантитела анти-MUC1Detection of human MUC1 protein using selected anti-MUC1 nanoantibodies

Способность наноантитела анти-MUC1 связываться с иммобилизованным в лунке иммунологической плашки белком MUC1 человека проверяли с использованием стандартного протокола метода иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычьим сывороточным альбумином (неспецифические белки).The ability of the anti-MUC1 nanoantibody to bind to the human MUC1 protein immobilized in the well of the immunological plate was tested using the standard protocol of the enzyme immunoassay. As a control, wells with immobilized chicken ovalbumin protein or bovine serum albumin (non-specific proteins) were used.

В качестве вторичных антител к НА-тагу, присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела анти-MUC1, использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованным неспецифическим белком, бычьим сывороточным альбумином белком или овальбумином кур) не содержали антиген и далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).Secondary anti-HA tag antibodies present at the C-terminus of the tested anti-MUC1 nanoantibody were horseradish peroxidase conjugated anti-HA monoclonal antibodies (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). The horseradish peroxidase activity was determined using ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as a chromogenic substrate. The optical density was measured at a wavelength of 405 nm using a plate fluorimeter. Control wells (with immobilized non-specific protein , bovine serum albumin protein or chicken ovalbumin) did not contain antigen and were then blocked and processed in parallel with experimental cells (with antigen).

На фиг.2 представлен результат иммуноферментного анализа, из которого следует, что наноантитело анти-MUC1 специфически связывается с иммобилизованным белком MUC1 человека. Наноантитело брали в четырех последовательных разведениях (1:2), начиная с концентрации 100 нг/мл и заканчивая концентрацией 12,5 нг/мл. Четкий специфический сигнал получали для наноантител в концентрации 25 нг/мл, что соответствует антителам с хорошей аффинностью. Величина столбцов на чертеже соответствует относительным величинам поглощения при длине волны 405 нм, количественно отражающим эффективность связывания наноантитела анти-MUC1.Figure 2 presents the result of an enzyme immunoassay, from which it follows that the anti-MUC1 nanoantibody specifically binds to the immobilized human MUC1 protein. Nanoantibodies were taken in four consecutive dilutions (1: 2), starting from a concentration of 100 ng / ml and ending with a concentration of 12.5 ng / ml. A clear specific signal was obtained for nanoantibodies at a concentration of 25 ng / ml, which corresponds to antibodies with good affinity. The size of the columns in the drawing corresponds to the relative values of the absorption at a wavelength of 405 nm, quantitatively reflecting the binding efficiency of the anti-MUC1 nanoantibody.

Таким образом, наноантитело анти-MUC1 способно специфически и эффективно узнавать (детектировать) белок MUC1 человека.Thus, the anti-MUC1 nanoantibody is able to specifically and efficiently recognize (detect) the human MUC1 protein.

Пример 4Example 4

Детекция белка MUC1, экспрессированного на поверхности иммобилизованных клеток линии НЕр2, с помощью отобранного наноантитела анти-MUC1Detection of MUC1 protein expressed on the surface of immobilized Hep2 cell lines using selected anti-MUC1 nanoantibodies

Узнавание наноантителами изолированного белка MUC1 еще не означает, что узнаваемый эпитоп этого белка будет также доступен, когда этот белок локализуется на поверхности клетки. Для проверки возможности использования полученного наноантитела анти-MUC1 для детекции MUC1, оверэкспрессированного на поверхности опухолевой клетки, был проведен иммуноферментный анализ на культуре клеток эпидермоидного рака гортани человека НЕр2. Клетки культуры НЕр2 получены из банка культур НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН, Москва. Клетки культивировали в 25 см²-флаконах на среде Игла-МЕМ с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Пассирование клеток осуществляли дважды в неделю. В качестве негативного контроля использовали клетки яичников китайского хомячка СНО, которые культивировали на среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки растили в лунках 96-луночного планшета до достижения 80% конфлуэнтности, затем 3 раза промывали раствором стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS) и фиксировали в 3,7% растворе забуференного формальдегида в течение 10 минут, фиксацию останавливали, добавляя раствор глицина до концентрации 125 мМ, фиксированные клетки промывали 3 раза раствором PBS. Фиксированные клетки блокировали в растворе 1% БСА, 1×PBS в течение 2 часов, после чего споласкивали 1×PBS и добавляли раствор (1×PBS, 0,1% БСА) с наноантителом анти-MUC1 в четырех разведениях (с фактором 2), начиная со 100 нг/мл и заканчивая концентрацией 12,5 нг/мл.The recognition by nanoantibodies of an isolated MUC1 protein does not mean that a recognizable epitope of this protein will also be available when this protein is localized on the cell surface. To test the feasibility of using the obtained anti-MUC1 nanoantibody for the detection of MUC1 overexpressed on the surface of a tumor cell, an enzyme-linked immunosorbent assay was performed on a culture of human laryngeal cancer epidermoid cancer cells HEP2. HEp2 culture cells were obtained from the Bank of Cultures of the Institute of Virology D.I. Ivanovskogo, RAMS, Moscow. Cells were cultured in 25 cm ² vials on Igla-MEM medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 8% fetal calf serum at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% carbon dioxide. Cells were passaged twice a week. As a negative control, ovarian Chinese hamster CHO cells were used, which were cultured on DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% fetal calf serum. Cells were grown in the wells of a 96-well plate until 80% confluency was reached, then washed 3 times with a standard phosphate-saline solution (PBS) solution and fixed in a 3.7% buffered formaldehyde solution for 10 minutes, fixation was stopped by adding glycine solution to a concentration 125 mM, fixed cells were washed 3 times with PBS. Fixed cells were blocked in a solution of 1% BSA, 1 × PBS for 2 hours, then rinsed with 1 × PBS and a solution (1 × PBS, 0.1% BSA) with anti-MUC1 nanoantibody in four dilutions (with factor 2) was added. starting from 100 ng / ml and ending with a concentration of 12.5 ng / ml.

В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела анти-MUC1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованными клетками СНО) были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками.Secondary antibodies to the HA tag (present at the C-terminus of the tested anti-MUC1 nanoantibody) were horseradish peroxidase conjugated anti-HA monoclonal antibodies (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). The horseradish peroxidase activity was determined using ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as a chromogenic substrate. The optical density was measured at a wavelength of 405 nm using a plate fluorimeter. Control wells (with immobilized CHO cells ) were blocked and processed in parallel with the experimental cells.

На фиг.3 представлены результаты описанного иммуноферментного анализа узнавания наноантителом анти-MUC1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки клеток НЕр2, содержащих на поверхности оверэкспрессированный белок MUC1. Видно, что подобно детекции изолированного белка MUC1 наноантитело анти-MUC1 и в этом случае эффективно работает в концентрации 25 нг/мл. Специфическое узнавание клеток НЕр2, скорее всего, связано с повышенной экспрессией в этих клетках белка MUC1, который располагается на поверхности этих клеток. Напротив, в контрольных клетках СНО белок MUC1 практически не экспрессируется, и этому соответствует фоновое значение оптической плотности в соответствующих ячейках.Figure 3 presents the results of the described enzyme-linked immunosorbent assay for recognition by the nanoantibody of anti-MUC1 immobilized in the wells of the immunological plate HEP2 cells containing on the surface overexpressed MUC1 protein. It can be seen that, like the detection of an isolated MUC1 protein, the anti-MUC1 nanoantibody also works effectively at a concentration of 25 ng / ml in this case. The specific recognition of HEP2 cells is most likely due to the increased expression of the MUC1 protein in these cells, which is located on the surface of these cells. On the contrary, in the CHO control cells, the MUC1 protein is practically not expressed, and this corresponds to the background optical density in the corresponding cells.

Таким образом, наноантитело анти-MUC1 способно специфически и эффективно узнавать (детектировать) белок MUC1 человека, экспрессированный на поверхности опухолевой клетки.Thus, the anti-MUC1 nanoantibody is able to specifically and efficiently recognize (detect) human MUC1 protein expressed on the surface of a tumor cell.

Приведенные примеры с иллюстрациями доказывают выполнение поставленной данным изобретением задачи. Созданы новые особые наноантитела, способные эффективно связывать белок MUC1. Эти новые особые наноантитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (однодоменному антителу, являющемуся производным тяжелой цепи классического иммуноглобулина мыши): их получение, производство и хранение более экономично, эффективно и относительно просто; их получение включает стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что способствует более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных наноантител, они хорошо растворимы, обладают новыми структурными особенностями, позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. На базе создаваемых наноантител появятся новые возможности для более эффективного таргетирования белка MUC1 и влияния на связанные с ним биологические процессы и заболевания.The above examples with illustrations prove the fulfillment of the task posed by this invention. New special nanoantibodies capable of efficiently binding the MUC1 protein have been created. These new special nanoantibodies have the following advantages relative to the prototype (single domain antibody, which is a derivative of the heavy chain of the classical mouse immunoglobulin): their preparation, production and storage are more economical, efficient and relatively simple; their preparation includes the stage of immunization and affinity maturation in vivo, which contributes to higher affinity and a significant increase in the efficiency of selection of the desired nanoantibodies, they are highly soluble, have new structural features that allow them to recognize some epitopes that are “hidden” for ordinary antibodies. On the basis of the created nanoantibodies, new opportunities will appear for more effective targeting of the MUC1 protein and the effect on biological processes and diseases associated with it.

Claims

1. A nanoantibody that specifically binds a human mucin 1 (MUC1) protein and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

2. A method for detecting a MUC1 protein in human biological fluids, comprising contacting said biological fluid with a nanoantibody according to claim 1 and detecting the binding of a nanoantibody according to claim 1 with a MUC1 protein.

3. The method according to claim 2, characterized in that the detection of MUC1 protein using the nanoantibody according to claim 1 is carried out both in free form in biological fluids and on the surface of cells, such as tumor cells, where this protein is overexpressed.