RU2488632C1

RU2488632C1 - PERMANENT CELL LINE OF SIBERIAL STURGEON (Acipenser baeri) FINS USED FOR VIRUSOLOGICAL RESEARCH OF FISH

Info

Publication number: RU2488632C1
Application number: RU2012114481/10A
Authority: RU
Inventors: Елена Александровна Завьялова; Алексей Евгеньевич Дрошнев; Михаил Иванович Гулюкин
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2013-07-27

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: presented cell line is produced from primarily trypsinized tissue of Siberial sturgeon fins by means of long-term passivation in the medium 199 with Hanks salts with 10% embryonal serum and is deposited in the Russian Academy of Agricultural Sciences (agricultural animals) under the No.76. The line may be used in laboratory research in production of virus vaccines and diagnostic preparations for extraction, accumulation, titration and study of a virus haemorrhagic septicemia virus (VHSV) of salmon fishes, infectious haemopoetic necrosis (IHNV) of salmon fish tissue, spring viremia of carps (SVCV), carp iridovirus (CCIV) and herpes of sturgeon virus (SbSHV).

EFFECT: cell line has a high coefficient of passage, which makes it possible to accumulate high number of biomaterial for a short period of time, and is a promising heterogenerous system for cultivation of viruses from fishes of non-sturgeon breeds, preventing development of non-specific reactions due to absence of antibodies to cell proteins.

Description

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.The present invention relates to the field of veterinary biotechnology, in particular to the production of transplantable cell lines used in virological and biotechnological studies.

Россия располагает крупнейшим в мире водным фондом внутренних водоемов и прибрежных акваторий морей, использование которого носит комплексный многоотраслевой характер. На протяжении длительного периода времени рыбохозяйственной эксплуатации внутренних водоемов не придавалось большого значения, так как производство рыбной продукции осуществлялось за счет промыслового изъятия природных популяций рыб и других гидробионтов в Мировом океане. В последние десятилетия мировой вылов стабилизировался на уровне 90-93 млн. тонн, а прирост рыбопродукции идет исключительно за счет бурно развивающейся аквакультуры. Ускоренное развитие аквакультуры и активизация международной торговли живыми объектами разведения несут угрозу распространения заразных болезней рыб, поэтому для ихтиовирусологии исследования по получению перевиваемых клеточных линий рыб, являющихся ключевым инструментом при разработке методов диагностики и профилактики вирусных заболеваний, по-прежнему высокоактуальны.Russia has the world's largest water fund of inland waters and coastal waters of the seas, the use of which is complex and diversified. Over a long period of time, the fishery exploitation of inland waters did not attach much importance, since the production of fish products was carried out due to commercial seizure of natural fish populations and other aquatic organisms in the World Ocean. In recent decades, global catches have stabilized at the level of 90-93 million tons, and the increase in fish production is solely due to the rapidly developing aquaculture. The accelerated development of aquaculture and the intensification of international trade in live breeding objects pose a threat to the spread of contagious fish diseases, therefore, for ichthyovirusology, studies on the production of transplantable fish cell lines, which are a key tool in the development of methods for diagnosing and preventing viral diseases, are still highly relevant.

В настоящее время существует более 10 линий клеток, полученных из разных органов и тканей рыб семейства Acipenseridae (осетровые), однако известна только одна линия сибирского осетра, полученная из клеток спинного плавника [1] (прототип).Currently, there are more than 10 cell lines obtained from different organs and tissues of fish of the Acipenseridae family (sturgeon), however, only one line of Siberian sturgeon obtained from dorsal fin cells is known [1] (prototype).

Чувствительность к вирусам которой определена не была, таким образом невозможно использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов-возбудителей опасных заболеваний рыб.Sensitivity to viruses of which has not been determined, so it is impossible to use it in the work on the isolation and study of viruses that cause harmful fish diseases.

В задачу наших исследований входило - получить перевиваемую линию клеток из плавников сибирского осетра, обладающую высокой чувствительностью к ихтиовирусам различных таксономических групп.The objective of our research was to obtain a transplantable cell line from the fins of the Siberian sturgeon, which is highly sensitive to ichthyoviruses of various taxonomic groups.

Предложенная линия клеток получена из первично-трипсинизированной ткани плавников сибирского осетра путем длительного пассирования на среде 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки.The proposed cell line was obtained from primary trypsinized tissue of the Siberian sturgeon fins by prolonged passage on medium 199 with Hanks salts with 10% fetal serum.

Линия клеток из плавников сибирского осетра (Acipenser baeri) названа авторами SSF (VIEV) - 1 и депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под номером 76 в 2010 году.The line of cells from the fins of the Siberian sturgeon (Acipenser baeri) was named by the authors SSF (VIEV) - 1 and deposited in the Specialized Collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals (CJS RASHN) under number 76 in 2010.

Предложенная линия обладает следующими свойствами:The proposed line has the following properties:

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ - постоянная линия плавников сибирского осетра представляет собой монослой из удлиненных фибробластоподобных клеток, лежащих пучками веерообразной формы под разными углами друг к другу, с крупными овальными ядрами, содержащими 2-3 ядрышка, в цитоплазме большинства клеток видны вакуоли разного размера. Клетки делятся обычным двуполюсным митозом. Кариотип соответствует виду сибирского осетра, модальный класс содержит 250 хромосом (2n=250±5) и составляет 70%, интервал изменчивости 190-290.MORPHOLOGICAL SIGNS - the constant line of the Siberian sturgeon fins is a monolayer of elongated fibroblast-like cells lying in fan-shaped bundles at different angles to each other, with large oval nuclei containing 2-3 nucleoli, in the cytoplasm of most cells, vacuoles of different sizes are visible. Cells divide by common bipolar mitosis. The karyotype corresponds to the species of Siberian sturgeon, the modal class contains 250 chromosomes (2n = 250 ± 5) and is 70%, the variability range is 190-290.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.Species identity is confirmed by karyological methods.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА - клетки выращивают при температуре - 21-22°С в пристеночных условиях в сосудах различной емкости; ростовой средой является среда 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков, рН среды 7,4-7,6. Дезагрегацию монослоя при субкультивировании осуществляют смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% (1:3), кратность рассева - 1:10. Посевная концентрация 250-300×10² клеток/мл. После формирования монослоя, клетки переносят на хранение при 15°С, рутинная частота пересева 1 раз 2-3 недели. При 22°С монослой формируется через сутки. При температуре 15°С может сохраняться до 2 месяцев без пересева.CULTURAL PROPERTIES - cells are grown at a temperature of - 21-22 ° C in wall conditions in vessels of various capacities; growth medium is medium 199 with Hanks salts with 10% fetal serum without antibiotics, pH 7.4–7.6. The monolayer is disaggregated by subculture with a mixture of trypsin 0.25% and versene 0.02% (1: 3), the sieving ratio is 1:10. Inoculum concentration of 250-300 × 10 ² cells / ml. After the formation of a monolayer, the cells are transferred to storage at 15 ° C, the routine frequency of reseeding 1 time 2-3 weeks. At 22 ° C, a monolayer forms in a day. At a temperature of 15 ° C it can remain up to 2 months without reseeding.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ - линия клеток чувствительна к вирусам-возбудителям вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовирусу карпов (CCIV), герпесвирусу осетровых (SbSHV).SENSITIVITY - the cell line is sensitive to the causative viruses of the salmonid hemorrhagic septicemia virus (VHSV), salmonid hematopoietic tissue infectious necrosis (IHNV), spring carp viremia (SVCV), carp iridovirus (CCIV), sturgeon virus S (S).

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ - криоконсервацию осуществляют по 2-ступечатому методу. Температуру снижают по 1-2°С до -30°С, далее по 3-5°С до -70°С. По достижении -70°С ампулы с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят следующим образом: среда культивирования - 50%, сыворотка эмбриональная телячья - 40%, ДМСО - 10%, концентрация - 3-4 млн кл/мл.CRYOCONSERVATION - cryopreservation is carried out according to the 2-stage method. The temperature is reduced by 1-2 ° C to -30 ° C, then by 3-5 ° C to -70 ° C. Upon reaching -70 ° C, ampoules with cells are placed in liquid nitrogen. Cryoprotective medium is prepared as follows: culture medium - 50%, fetal calf serum - 40%, DMSO - 10%, concentration - 3-4 million cells / ml.

КОНТРОЛЬ НА ПОСТОРОННИЕ КОНТАМИНАНТЫ - при исследовании клеточной линии SSF (VIEV) - 1 на наличие бактерий, грибов, микоплазм и латентных вирусов получены отрицательные результаты.CONTROL FOR EXTERNAL CONTAMINANTS - negative results were obtained in the study of the SSF (VIEV) - 1 cell line for the presence of bacteria, fungi, mycoplasmas and latent viruses.

ПРИМЕР: Культуру клеток SSF (VIEV) - 1 культивируют на среде 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков. При пересеве клетки снимают со стекла (пластика) 0,25% раствором трипсина и 0,02% раствором версена (1:3) при температуре 22°С. Монослой формируется на 1-2 сутки культивирования. После образования монослоя культуру заражают вирусом и инкубируют при температуре оптимальной для исследуемого вируса.EXAMPLE: A culture of SSF cells (VIEV) - 1 is cultured on medium 199 with Hanks salts with 10% fetal serum without antibiotics. When reseeding cells are removed from the glass (plastic) with 0.25% trypsin solution and 0.02% versene solution (1: 3) at a temperature of 22 ° C. A monolayer is formed on 1-2 days of cultivation. After the formation of a monolayer, the culture is infected with a virus and incubated at a temperature optimal for the studied virus.

Экспериментальные данные по чувствительности клеточной линии SSF (VIEV) - 1 к патогенным вирусам рыб приведены в таблице 1.Experimental data on the sensitivity of the SSF (VIEV) - 1 cell line to fish pathogenic viruses are shown in Table 1.

Таблица 1Table 1 Культуры клетокCell culture SSF (VIEV) - 1SSF (VIEV) - 1 Референтная для данного вирусаReference for this virus ВирусVirus Проявление ЦПД вируса, суток.The manifestation of the CPP virus, days. Титр вируса ТЦД_50/мл TCD virus titer _{50 / ml} Проявление ЦПД вируса, час.The manifestation of the virus CPP, hours. Проявление ЦПД вируса, час.The manifestation of the virus CPP, hours. геморрагической септицемии лососевых (VHSV)hemorrhagic salmon septicemia (VHSV) 33 10^9,0 10 ^9.0 22 ЕРС/10^7,5 EPC / 10 ^7.5 инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV)salmon hematopoietic tissue infectious necrosis (IHNV) 33 10^8,75 10 ^8.75 33 ЕРС/10^7,5 EPC / 10 ^7.5 весенней виремии карпов (SVCV)spring viremia carps (SVCV) 55 10^8,0 10 ^8.0 55 ЕРС/10^8,0 EPC / 10 ^8.0 иридовирус карпов (CCIV)carp iridovirus (CCIV) 22 10^7,2 10 ^7.2 22 FHM/10^6,0 FHM / 10 ^6.0 герпес-осетровых (SbSHV)herpes sturgeon (SbSHV) 33 10^8,0 10 ^8.0 55 WSSK-1/10^6,0 WSSK-1/10 ^6.0

Титры исследованных вирусов в культуре клеток SSF (VIEV) - 1 через 5 дней инкубации на порядок выше, чем в референтной для каждого вируса культуре.The titers of the studied viruses in the SSF (VIEV) - 1 cell culture after 5 days of incubation are an order of magnitude higher than in the reference culture for each virus.

Отличительной особенностью предложенной культуры клеток является высокий коэффициент пересева - 1:10, что позволяет накапливать большое количество биоматериала за короткий срок.A distinctive feature of the proposed cell culture is a high reseeding coefficient - 1:10, which allows you to accumulate a large amount of biomaterial in a short time.

При получении больших масс вирусов, выделенных от рыб неосетровых пород - лососевых, карповых (VHSV, IHNV, SVCV, CCIV), использование культуры клеток SSF (VIEV) - 1 более предпочтительно, так как титры не только не уступают, а даже превосходят таковые в референтной культуре, но при этом сама клеточная система является гетерогенной, что исключает возможность неспецифических реакций за счет отсутствия антител к клеточным белкам.When receiving large masses of viruses isolated from fish of non-sturgeon species - salmon, cyprinids (VHSV, IHNV, SVCV, CCIV), the use of SSF cell culture (VIEV) - 1 is more preferable, since the titers are not only inferior, but even surpass those in reference culture, but the cell system itself is heterogeneous, which eliminates the possibility of nonspecific reactions due to the absence of antibodies to cellular proteins.

Предложенная клеточная линия апробирована с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ с января 2010 по январь 2012 года для накопления, титрования и изучения вируса-возбудителя вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовируса карпов (CCIV), герпес вируса осетровых (SbSHV) и для диагностической работы по выявлению этих вирусов при мониторинговых исследованиях.The proposed cell line was tested with a positive result in the VIEV ichthyopathology laboratory from January 2010 to January 2012 for the accumulation, titration and study of the causative virus virus of the hemorrhagic salmon hemorrhagic septicemia (VHSV), salmon hematopoietic tissue infectious necrosis (IHNV), spring carp viremia (SVCV) , carp iridovirus (CCIV), sturgeon herpes virus (SbSHV) and for diagnostic work on the detection of these viruses in monitoring studies.

Постоянная линия клеток SSF (VIEV) - 1 найдет широкое применение в лабораторных исследованиях по вирусологии и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов.The permanent SSF cell line (VIEV) - 1 will find wide application in laboratory research in virology and in biotechnology in the production of virus vaccines and diagnostics.

ИСТОЧНИК ИНФОРМАЦИИTHE SOURCE OF INFORMATION

1. Fontana F. et al. Cytogenetic characterization of cell lines from three sturgeon species, Cariologia. - 1997 - V50 - N1 - p.91-95.1. Fontana F. et al. Cytogenetic characterization of cell lines from three sturgeon species, Cariologia. - 1997 - V50 - N1 - p. 91-95.

Claims

The permanent line of cells from the fins of the Siberian sturgeon (Acipenser baeri) used for virological studies of fish has been deposited in the Specialized Collection of transplantable somatic cell cultures of agricultural and commercial animals of the Russian Collection of Cell Cultures at the All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine (CJS RASHN) under No. 76.