RU2485502C1 - Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека - Google Patents
Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2485502C1 RU2485502C1 RU2012105560/15A RU2012105560A RU2485502C1 RU 2485502 C1 RU2485502 C1 RU 2485502C1 RU 2012105560/15 A RU2012105560/15 A RU 2012105560/15A RU 2012105560 A RU2012105560 A RU 2012105560A RU 2485502 C1 RU2485502 C1 RU 2485502C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- platelets
- cells
- points
- granules
- platelet
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 title abstract description 183
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- -1 or plasma Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 11
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 10
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 7
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 claims description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 71
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 16
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000001139 pH measurement Methods 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 3
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- QKEWQOJCHPFEAF-UHFFFAOYSA-N 3,6-diaminohexanoic acid Chemical class NCCCC(N)CC(O)=O QKEWQOJCHPFEAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002306 Glycocalyx Polymers 0.000 description 1
- 208000024659 Hemostatic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010061225 Limb injury Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 208000014759 blood platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000023 hypocoagulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010060284 von Willebrand factor receptor Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для оценки качества тромбоцитов и эффективности их применения в клинической практике. Образцы крови, или плазмы, или концентрата тромбоцитов, окрашивают в микропробирке трипафлавином и акридиновым оранжевым, с помощью флуоресцентного микроскопа оценивают количество тромбоцитов с гранулами, измеряют яркость свечения 100-200 витально окрашенных клеток, суммируют значения яркости и делят на количество обследованных тромбоцитов, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита и выражают в фут-канделах на 1 клетку, соответствующего одному баллу, характеризующую морфофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ). Далее препарат с витально окрашенными тромбоцитами помещают в термостат, с помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают число распластанных тромбоцитов с выходящими наружу гранулами, делят на общее число обследованных клеток и выражают в %, причем один процент соответствует одному баллу, характеризующих адгезивную активность тромбоцитов (ААТ). Затем по сумме МФАТ и ААТ оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов. Способ обеспечивает объективную оценку морфофункционального статуса тромбоцитов человека. 6 ил., 6 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для оценки качества тромбоцитов и эффективности их применения в клинической практике при лечении больных с неотложными состояниями.
Тромбоциты предупреждают и прекращают кровотечения и кровоточивость, связанные с их недостатком в циркулирующей крови (тромбоцитопения) или с их функциональной неполноценностью (тромбоцитопатия). Определены показания к переливанию концентрата тромбоцитов (КТ): спонтанная мелкоточечная кровоточивость или локальные кровотечения при уровне тромбоцитов менее 20·109/л, обусловленном депрессией кроветворения; гипокоагуляционная фаза ДВС синдрома; острая массивная кровопотеря, сопровождающаяся снижением уровня тромбоцитов менее 100·109/л [Инструкция по применению компонентов крови, утверждена приказом Минздрава РФ №363 от 25.11.2002]. Биологическая полноценность и функциональная активность клеток, используемых в клинической практике, определяют проведение обоснованной компенсации нарушений в системе клеточного гомеостаза и лечебную эффективность [Приложение 1 к «ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГЛАМЕНТУ О ТРЕБОВАНИЯХ БЕЗОПАСНОСТИ КРОВИ, ЕЕ ПРОДУКТОВ, КРОВЕЗАМЕЩАЮЩИХ РАСТВОРОВ И ТЕХНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТРАНСФУЗИОННО-ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ», постановление правительства РФ №29 от 26.01.2010 года, таблица 1]. Анализ показывает, что в представленных показателях нет данных, регламентирующих биологическую полноценность и функциональную активность тромбоцитов. Следовательно, требуется разработка и внедрение адекватной оценки функциональной активности тромбоцитов, используемых в клинической практике.
| Таблица 1 | |
| Перечень показателей биологической полноценности, функциональной активности и лечебной эффективности донорской крови и ее компонентов (приведены только тромбоциты) | |
| Показатель | Приемлемые характеристики |
| Тромбоциты, восстановленные из дозы крови [тромбоцитный концентрат из дозы крови] | |
| Объем | Не менее 40 мл |
| Тромбоциты* | Не менее 60×109 / эквивалент одной дозы крови |
| Лейкоциты* - до удаления лейкоцитов | |
| а. из обогащенной тромбоцитами плазмы | Не более 0,2×109 / эквивалент одной дозы крови |
| б. из лейкотромбослоя | Не более 0,05×109 / эквивалент одной дозы крови |
| Лейкоциты** - после удаления лейкоцитов |
Не более 0,2×106 / эквивалент одной дозы крови |
| рН*** (при +22°С) в конце рекомендованного срока хранения | от 6,4 до 7,4 |
| * - должны соответствовать не менее 75% обследованных доз ** - должны соответствовать не менее 90% обследованных доз *** - измерение рН предпочтительно проводить в закрытой системе во избежание выхода СО2; измерение может быть выполнено при любой температуре, и значение расчетным методом конвертировано применительно к рН +22°С; другие пределы рН могут применяться, если при конкретном методе приготовления и хранения тромбоцитов будет приемлемый прирост тромбоцитов in vivo; если срок хранения тромбоцитов не превышает трех суток - измерение рН может не проводиться |
|
| Тромбоциты, полученные методом афереза [тромбоцитный концентрат, полученный методом афреза] | |
| Объем | Не менее 40 мл на 60×109 тромбоцитов |
| Тромбоциты* | Не менее 200×109 / доза |
| Лейкоциты* - после удаления лейкоцитов | Не более 1,0×106 / доза |
| рН** (при +22°С) в конце рекомендованного срока хранения | от 6,4 до 7,4 |
| * - должны соответствовать не менее 90% обследованных доз ** - измерение рН предпочтительно проводить в закрытой системе во избежание выхода СО2; измерение может быть выполнено при любой температуре, и значение расчетным методом конвертировано применительно к рН +22°С; другие пределы рН могут применяться, если при конкретном методе приготовления и хранения тромбоцитов будет приемлемый прирост тромбоцитов in vivo; если срок хранения тромбоцитов не превышает трех суток - измерение рН может не проводиться |
|
| Криоконсервированные тромбоциты, полученные методом афереза | |
| Объем | От 50 до 200 мл |
| Количество тромбоцитов | Не менее 40% от содержания до замораживания |
| Остаточные лейкоциты | Не более 0,2×106 на 60×109 тромбоцитов |
Тромбоцит рассматривают как клетку с полифункциональной активностью - коагулологическая, ангиотрофическая и эндотелиальноподдерживающая, транспортная, рост стимулирующая функции, участие в воспалении, репарации и регенерации [Мининкова А.И. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). I ЧАСТЬ; ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ДИТОФЛЮОРИМЕТРИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). II ЧАСТЬ. Клиническая лабораторная диагностика, 2010, №11, с.21-26; 2011, №4, с.25-30; Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб. ГМУ, 2000, 227 с.; Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М.-Тверь, «Триада», 2005, 227 с.]. Морфологически в тромбоцитах выделяют четыре зоны: 1-я - надмембранный слой (гликокаликс); 2-я - мембрана, 3-я зона - матрикс или гель-зона: 4-я - зона органелл, содержащая в высоких концентрациях гранулы с биологически активными веществами, синтезируемые и выделяемые тромбоцитами (таблица 2).
| Таблица 2 | |
| Химический состав содержимого гранул тромбоцитов | |
| Вещество | Биологическое действие |
| Фракция плотных гранул | |
| Серотонин | Увеличивает проницаемость сосудов |
| АДФ | Вызывает агрегацию тромбоцитов; |
| АТФ | Активирует нейтрофилы; увеличивает адгезию нейтрофилов; при разрушении образуется аденозин (ингибитор нейтрофилов) |
| Гистамин | Повышает проницаемость сосудов |
| Фракция α-гранул | |
| Фибриноген | Агрегирует тромбоциты; фактор свертывания |
| Фактор V α | Фактор свертывания |
| Катионные белки | Антибактериальное действие |
| Фактор VII | Фактор свертывания |
| Фактор 4 | Хемоаттрактант нейтрофилов |
| Фактор роста | Индуцирует пролиферацию фибробластов и гладких мышц сосудов |
| Тромбоспондин | Молекула адгезии тромбоцитов и моноцитов |
| Гликопротеины 11b | Молекула адгезии тромбоцитов к субэндотелию |
| Гликопротеин 1b | Рецептор фактора Виллебранда |
| ТФР-β | Индуцирует пролиферацию сосудов |
| β-лизины | Антибактериальное действие |
| Фракция лизосом и пузырьков | |
| Протеазы (нейтральные) | Расщепляют С 5 до С 5 α |
| Катепсин А, коллагеназа, эластаза, галактозилтрансфераза | Переваривание бесклеточного матрикса |
| Продукты, образуемые de novo | |
| 12-гидроэйкозатетраеноевая кислота | Повышает продукцию ПГЕ2 эндотелиальными клетками; стимулирует респираторный взрыв нейтрофилов |
| ФАТ | Хемотаксический фактор для нейтрофилов; стимулирует респираторный взрыв; агрегирует нейтрофилы и тромбоциты; увеличивает проницаемость сосудов |
| Тромбоксан А2 | Агрегирует тромбоциты, увеличивает адгезию нейтрофилов |
| Реактивные продукты кислорода | Антимикробное, антипаразитарное действие |
Следовательно, морфологическое исследование фракции плотных гранул, фракции α-гранул, фракции лизосом и пузырьков тромбоцитов человека позволяет адекватно оценить их морфофункциональный статус. Значимость такого подхода эффективна при диагностике различных типов тромбоцитопатий [Amy D. Shapiro Platelet Function Disorders. Treatment of Hemophilia Monograph Series, Number 19. World Federation of Hemophilia: 1999]. Таким образом, исследование гранул тромбоцитов может служить интегральным параметром оценки их функции.
Исследование морфологии тромбоцитов с помощью электронной и атомно-силовой микроскопии имеет ряд существенных недостатков: высокая стоимость оборудования, трудоемкость и длительность подготовки и фиксация образцов препятствуют активному использованию метода в целях клинической диагностики [Донников М.Ю., Орлов С.А., Зиновьева А.В. КАЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ ПО ДАННЫМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ. Клиническая лабораторная диагностика, 2009, №8, с.30-32].
Прототип - оценка функциональной полноценности концентрата живых тромбоцитов с помощью метода витальной компьютерной морфометрии на основе отечественного фазово-интерференционного микроскопа «Цитоскан». Из локтевой вены осуществляют забор крови в объеме 1,0 мл в стандартную пробирку из ареактивного пластика с антикоагулянтом (ЭДТА). Исследуют тромбоциты в капле плазмы, обогащенной тромбоцитами, для получения которой кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Алгоритм морфометрии обеспечивает автоматическое определение заданных размерных параметров отдельных клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем), подсчет процента активированных тромбоцитов, статистическую обработку данных на популяционном уровне и документирование результатов в виде цитограмм. Уровень функциональной активности тромбоцитов определяли на основании подсчета различных морфологических типов. Подавляющее большинство тромбоцитов представлено плоскими, округлыми клетками с гладкой или складчатой поверхностью - «гладкие» и «рифленые» дискоциты, идентифицируемые как клетки «покоя» (1-й морфологический тип). Ко 2-му типу тромбоцитов были отнесены дискоидные клетки округлой, неправильной формы с гладкой или складчатой поверхностью и одним-тремя короткими (меньше диаметра клетки) отростками-псевдоподиями, являющимися выростами поверхностной мембраны - тромбоциты с низким уровнем активности. Клетки, имеющие от двух до пяти длинных (больше диаметра клетки) отростков-«антенн», отнесены к 3-му типу и отличались большим многообразием форм: от плоских дисков до неправильной причудливой формы - высокоактивированные тромбоциты. Тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной длины и многочисленными вакуолями были отнесены к 4-му морфологическому типу - дегенеративно-измененным клеткам, практически исчерпавшим свой функциональный резерв. Распределение морфологических типов клеток в концентрате тромбоцитов (КТ) оказалось 56,7%; 26,2%; 14,1%; 3,0%. В крови соматически здоровых людей соотношение морфологических типов клеток составляет - 64, 21, 12 и 3% соответственно. Метод позволяет исследовать живые нативные тромбоциты, не подвергавшихся предварительной обработке или фиксации [прототип - Колосова Е.Н., Василенко И.А., Ковалева Л.Г. Оценка морфофункционального состояния тромбоцитов у больных идиопатической тромбоцитопеничской пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. Бюллетень СО РАМН, 2011, 31, №2, с.58-63]. Недостатками данного метода являются: необходимость получения плазмы, богатой тромбоцитами; предлагаемый алгоритм морфометрии клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) не позволяет оценить целостность внутреннего состава исследуемых тромбоцитов; отсутствие адекватного анализа высокой и низкой функциональной активностью среди дисковидных тромбоцитов; использование дорогостоящей уникальной микроскопической аппаратуры. Итак, предлагаемый биофизический метод не отражает структурно-функциональную целостность тромбоцитов. Следовательно, для оценки клетки как единого целого необходимо использовать методы, витального окрашивания тромбоцитов, позволяющие оценить функциональную активность живых клеток [Pollard M.D., Earnshaw W.C. Cell Biology // - Elsivier Science, 2007, 928 с.].
Достигаемым техническим результатом является объективная оценка морфофункционального статуса тромбоцитов человека за счет учета данных, полученных путем исследования витально окрашенных клеток во флуоресцентном микроскопе.
Значительную часть цитоплазмы тромбоцита составляют везикулы (гранулы) с различными секреторными веществами [Хэм А., Кормак Д. Гистология / Пер. с англ. // М.: Мир, 1983]. При различных заболеваниях увеличивается доля тромбоцитов, не содержащих гранул: такие клетки обладают сниженной функциональной активностью или являются дегенеративными [Walker HK, Hall WD, Hurst JW Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd edition. // Boston: Butter-worth's; 1990]. Следовательно, наличие в тромбоците гранул, а также их количество можно рассматривать в качестве критериев жизнеспособности и функциональной активности клеток. Известно, что часть тромбоцитарных гранул обладает сродством к акридиновым красителям - в частности, к акридиновому оранжевому. Флуорохром акридиновый оранжевый (АО) широко используется в клеточной биологии, в том числе и для прижизненных исследований. Другой акридиновый краситель - трипафлавин - обладает способностью прижизненно окрашивать мембранные компоненты клеток, т.е. с помощью этого флуорохрома возможно окрасить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов. Таким образом, имеются весомые основания полагать, что прижизненный краситель на основе этих флуорохромов (трипафлавина и АО) позволит выявить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов и гранулы в их составе. Для дифференциального прижизненного окрашивания тромбоцитов нами предложен краситель, изготовленный на основе 2-х флуорохромов - трипафлавина и акридинового оранжевого. В нефиксированных тромбоцитах после окрашивания отчетливо выявляются гранулы, имеющие характерное красное свечение во флуоресцентном микроскопе, при этом контуры тромбоцитов четко различимы.
Изготовление красителя. Смесь трипафлавина и акридинового оранжевого готовят на 0,15 М фосфатном буфере Зеренсена (рН 7.3). Для получения 100 мл 0,15 М этого буфера смешивают 23 мл 0,15 М NaH2PO4·Н2О (18,38 г в 1000 мл диет H2O) и 77 мл 0.15 М Na2HPO4 (18.92 г в 1000 мл дист. Н2О).
Приготовление красителя состоит из двух этапов. На первом этапе готовят концентрированные растворы трипафлавина (раствор А) и акридинового оранжевого (Раствор Б): Раствор А - трипафлавин разводят 0.15 М буфером Зеренсена в соотношении 1:2000-1:5000. Необходимо добиться полного растворения кристаллов трипафлавина. Раствор Б - акридиновый оранжевый разводят 0.15 М буфером Зеренсена в соотношении 1:1500-5000. Затем оба красителя смешивают в соотношении 1:1, получают рабочий раствор. Прижизненную окраску тромбоцитов можно производить как в пробирке, так и на предметном стекле. Тромбоциты крови, плазма обогащенная тромбоцитами, тромбоконцентрат заготавливали на соответствующем антикоагулянте. Соотношение крови и антикоагулянта (CPD) составляло 7:1; соотношение плазмы, обогащенной тромбоцитами, и антикоагулянта (ACD-A) - 16:1; соотношение тромбоцонцентрата, полученного методом афереза, и антикоагулянта (Haemonetics) - 12:1 [Инструкция Министерства здравоохранения РФ по заготовке и консервированию донорской крови от 29.05.1995 г., новая редакция от 08.09.1999 г.].
В пробирке смешивают 10-20 мкл анализируемого образца и 10-20 мкл рабочего раствора красителя. Окрашивание проводят в течение 5-10 минут. Затем пипеткой отбирают 10-15 мкл смеси, переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Оценку прижизненно окрашенных тромбоцитов проводят с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×100, числовая апертура 1.25, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. С помощью цифровой фотокамеры при экспозиции 0.25-0.5 сек получают цифровые изображения тромбоцитов и переносят в компьютер. Для морфометрического исследования тромбоцитов используют программу Adobe Photoshop. Анализ характера и интенсивности свечения прижизненно окрашенных тромбоцитов можно наблюдать в течение длительного времени (24-48 часов). При этом среди пула анализируемых тромбоцитов отчетливо выявляются клетки с гранулами и клетки без гранул (рисунок 1. Обозначения: А) клетки без гранул; Б) клетка содержат 2 гранулы; В) клетки содержат от 3 до 7 гранул; Г) клетки содержат более 10 гранул). Подчеркнем, что интенсивность свечения тромбоцитов зависит от количества в них гранул и существенно выше интенсивности свечения клеток без гранул (таблица 3). Тромбоциты с гранулами содержат от 3 до 15 визуально различимых везикул диаметром 300-600 нм, которые распределены по всему объему клетки и интенсивно окрашиваются также на Са2+ и серотонин. Тромбоциты без гранул не содержат везикул диаметром 300-600 нм или содержат 1-2 меньших размеров гранулы, которые всегда связаны с клеточной оболочкой и практически не окрашиваются на Са2+ и серотонин. Тромбоциты, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым, сохраняют свою адгезивную и агрегационную активность, которая зависит от количества тромбоцитов, содержащих более 3 гранул (таблица 4). Кроме того, в экспериментах показано, что как неокрашенные, так и окрашенные флуохромами тромбоциты после их активации кальцием проявляют ростстимулирующее действие в культуре фибробластов человека.
Таким образом, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым тромбоциты человека полностью сохраняют свою функциональную активность. Результаты этих исследований обосновывают возможность оценки морфофункциональной активности этих клеток.
| Таблица 3 | ||
| Интенсивность (яркость) свечения тромбоцитов, прижизненно окрашенных трипафлавином и акридиновым оранжевым | ||
| Количество гранул в тромбоците | Яркость свечения тромбоцита (единиц измерения): | |
| фут-кандел/клетку | в баллах | |
| 0 | 5-30 | 5-30 |
| 1-2 | 31-41 | 31-41 |
| 3-10 | 42-55 | 42-55 |
| ≥10 | 57-75 76-85* |
57-75 76-85* |
| * В редких случаях наблюдали очень высокую яркость тромбоцитов, содержащие гранулы очень крупных размеров в количестве менее 10. Полагаем, что это связано с оптическим слиянием более мелких гранул. | ||
| Таблица 4 | |||
| Сравнение функциональной активности тромбоцитов человека до и после прижизненного окрашивания трипафлавином-АО гранул клеток | |||
| Анализируемый пул тромбоцитов человека | Содержание тромбоцитов с гранулами | Параметры функциональной активности тромбоцитов | |
| Концентрация клеток 250-275 тыс/мкл | (%) | Агрегационная активность Индуктор - коллаген -2 мкг/мл (в Ом·мин) | Адгезивная активность на стекле (в % или баллах) |
| До окрашивания | 10-20 | 0 | 0-3 |
| После окрашивания | 10-20 | 0 | 0-2 |
| До окрашивания | 21-35 | 10-21 | 5-18 |
| После окрашивания | 21-35 | 8-22 | 5-20 |
| До окрашивания | 40-45 | 28-35 | 37-48 |
| После окрашивания | 40-45 | 25-38 | 35-40 |
| До окрашивания | 50-65 | 50-65 | 55-70 |
| После окрашивания | 50-65 | 47-59 | 57-69 |
| До окрашивания | 70-85 | 65-85 | 75-90 |
| После окрашивания | 70-85 | 63-80 | 74-85 |
Установлено, что прижизненно окрашенные тромбоциты после воздействия индуктором агрегации (коллаген) образуют тесное скопление клеток (агрегатов), которые не содержат гранул (рис 2.). Следовательно, отсутствие или уменьшение количества тромбоцитов с гранулами указывает на прошедший процесс активирования клеток в анализируемой популяции. Эти клетки либо потеряли, либо снизили свой функциональный потенциал. Клиническая эффективность трансфузии такой популяции тромбоцитов для коррекции система гемостаза у больных не высока или отсутствует. С другой стороны, выявление популяции тромбоцитов без или с повышенным количеством гранул в крови имеет большое диагностическое значение. Такая информация указывает на активацию (возможность тромбообразования) или подавления (возможность кровотечения) системы гемостаза и обосновывает необходимость проведения соответствующей коррекции у больного.
Единицы оценки качества тромбоцитов.
1. Концентрация тромбоцитов (Стр) в анализируемом образце (тыс/мкл) (определяют с помощью гематологического анализатора).
2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр), выражают в %. При большом увеличении (объектив ×100) оценивают от 150 до 200 прижизненно окрашенных клеток и регистрируют количество тромбоцитов, содержащих более 3 гранул в цитоплазме, и выражают в %. Например, при исследовании 150 тромбоцитов 85 клеток содержали гранулы. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dт.гр) равна 85:150×100-56,5%.
Относительное содержание тромбоцитов без гранул (Dтр.безгр.) рассчитывают по формуле Dтр.безгр.=100%-Dт.гр., или 100,0%-56,5%=43,5%.
3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (Cтр.гр) в анализируемом образце (тыс/мкл). Определяется по формуле - Стр.гр=Стр×Dтр.гр, т.е.количество тромбоцитов в образце (тыс/мкл) × долю тромбоцитов с гранулами (100%=1,0; 25%=0,25; 50%=0,5; 75%=0.75 и т.д.)
Например, при исследовании концентрата тромбоцитов количество клеток составило 2000 тыс/мкл, а доля тромбоцитов с гранулами составила 69,3% или в доле 0,693. Количество тромбоцитов с гранулами в концентрате тромбоцитов равнялось 2000 тыс/мкл×0,693=1386 тыс/мкл.
4. Морфофункциональная активность тромбоцита (МФАТ) в популяции анализируемого образца крови, плазмы, обогащенной тромбоцитами, тромбоцитном концентрате. Измеряют яркость свечения от 100 до 200 витально окрашенных трипафлавином-АО клеток, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита. Единицу яркости свечения выражают в фут-канделах на 1 клетку или в баллах. 1 фут-кандел эквивалентен 1 баллу [Поликарпов И.А., Эрлихман В.Д. Photoshop 4, изучение на примерах, Харьков, Омега, 1997; 415 с.]. МФАТ или удельная яркость свечения тромбоцита = ∑ свечений обследованных тромбоцитов делят на количество обследованных тромбоцитов.
По сумме морфофункциональной и адгезивной активностей, выраженных в баллах, оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ), который при 80-130 баллах считают нормальным, при 60-79 баллах - сниженным, при 41-59 баллах - низким, при менее чем 40 баллах - очень низким, при 131-150 баллах - высоким, при 151-170 баллах - очень высоким.
Пример 1. При исследовании популяции из 100 тромбоцитов 72 клетки (72% или 0,72) содержали более трех гранул и 28 клеток (28% или 0,28) не содержали гранул. Яркость свечения клеток с гранулами ваьировала от 60 до 70, составляя в среднем 66,3 фут-кандел на 1 тромбоцит; яркость свечения клеток без гранул - варьировала от 10 до 30, составляя в среднем 17,7 фут-кандел на 1 тромбоцит. Расчет морфофункциональной активности тромбоцитов анализируемой популяции:
МФАТ = 66,3×0.72+17.7×0,28=47,7+5,0=52,7 фут-кандел на 1 клетку или 52.7 балла
Пример 2. При исследовании популяции из 200 тромбоцитов 40 клеток (20% или 0,2) содержали более трех гранул и 160 клеток (80% или 0,8) не содержали гранул. Яркость клеток с гранулами варьировала от 25 до 40, составляя в среднем 33,1 фут-кандел на 1 тромбоцит, яркость клеток без гранул - варьировала от 5 до 20, составляя в среднем 12,7 фут-кандел на 1 тромбоцит. Расчет морфофункциональной активности тромбоцитов анализируемой популяции:
МФАТ = 33,7×0.20+12.7×0,80=6,7+10,2=16,9 фут-кандел на 1 клетку или 16,9 балла.
5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле морфологический анализ. Препарат с прижизненно окрашенными трипафлавином-АО клетками на стекле помещают на 10-15 мин в термостат при 37°С, затем с помощью флуоресцентного микроскопа определяют количество адгезировавших тромбоцитов в расчете на 100 или 150 анализируемых клеток. Адгезировавшие тромбоциты представляют собой большие распластанные клетки овальной или округлой формы (их диаметр в 2-3 раза больше диаметра исходных неадгезировавших тромбоцитов), в которых гранулы распределены по периферии клетки вблизи ее границ или уже выходят за пределы клетки (рис.3). Адгезивная активность выражают в % адгезировавших тромбоцитов к общему числу обследованных тромбоцитов или в баллах. 1% адгезивной активности равен 1 баллу.
Например, при исследовании 150 витально окрашенных тромбоцитов отмечено 95 больших распластанных по стеклу клеток. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) равна 95:150×100=63,3% или 63,3 балла.
6. Морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ). Расчет этого показателя осуществляют по формуле МФСТ=МФАТ+ААТ и выражают в баллах.
Проведена оценка качества тромбоцитов в крови, ее компонентах (плазма, обогащенная тромбоцитами, концентрат тромбоцитов) у доноров и больных по 6 предложенным параметрам (таблица 5).
У доноров крови концентрация тромбоцитов (Стр) варьировала от 180 до 320 тыс/мкл, относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр) - от 35 до 80%, концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр) - от 60 до 180 тыс/мкл, морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ)- от 37 до 57 фут-кандел/клетку или 37-57 баллов; адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - от 40 до 70% и или 40-70 баллов: морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - от 77 до 127 баллов.
Проведен анализ распределения тромбоцитов крови доноров по морфофункциональной активности (МФАТ). Выявлено три популяции клеток: основная - 82% клеток (МФАТ - 42-55 фут-кандел/тромбоцит или 42-55 баллов); с пониженной активностью клеток - 16% (МФАТ - 37-40 фут-кандел/тромбоцит или 37-40 баллов) и умеренно повышенной активностью - 2% (МФТА - 57-60 фут-кандел/тромбоцит или 57-60 баллов). С учетом этих данных представлен анализ распределения тромбоцитов в крови у 4 группы больных с различными заболеваниями (Рис.4. На абсциссе МФАТ в фут-канделах на клетку или баллах). Больные с травмой конечностей (группа №3) по 6 анализируемым параметрам качества тромбоцитов соответствовали таковым у доноров. Больные с экзогенными отравлениями (группа №2) имели снижение морфофункциональной активности клеток - МФАТ варьировала от 32 до 42 фут-кандел/тромбоцит или 32-42 балла, подавление адгезивной активности клеток (ААТ), которая варьировала от 10 до 45% или 10-45 баллов и уменьшение морфофункционального статуса тромбоцитов (МФСТ) - 40-87 баллов.
| Таблица 5 | ||||||
| Морфофункциональные параметры оценки качества тромбоцитов человека | ||||||
| Объект исследования | Концентрация тромбоцитов (тыс/мкл) | Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (%) | Концентрация тромбоцитов с гранулами (тыс/мкл) | МФАТ, (фут-кандел на клетку) или баллах | ААТ(в %) или баллах | МФСТ (в баллах) |
| Доноры. Кровь | 180-320 | 35-80 | 60-180 | 37-57 | 40-70 | 77-127 |
| Доноры. Плазма, обогащенная тромбоцитами | 400-800 | 30-75 | 180-490 | 37-56 | 30-70 | 67-126 |
| Доноры. Концентрат тромбоцитов, нативный | 1000-5000 | 20-60 | 200-1500 | 30-52 | 20-60 | 50-112 |
| Доноры Концентрат тромбоцитов после криоконсервирования | 1000-5000 | 12-50 | 100-1200 | 28-49 | 10-50 | 38-99 |
| Больные с травмой конечностей. Кровь. | 160-340 | 35-80 | 60-210 | 36-60 | 35-80 | 71-140 |
| Больные с экзогенными отравлениями. Кровь. | 160-300 | 10-50 | 25-100 | 30-42 | 10-45 | 40-87 |
| Гематологические больные с геморрагическим синдромом. Кровь. | 2-100 | 0-10 | 0-5 | 10-30 | 0 | 10-30 |
| Больные с тромбоэмболическими осложнениями. Кровь. | 340-800 | 80-90 | 270-700 | 65-80 | 80-90 | 145-170 |
У гематологических больных с геморрагическим синдромом (группа №1) морфофункциональная активность была крайне подавлена, что привело к угнетению клеточного звена системы гемостаза и развитию геморрагического синдрома. С другой стороны, у больных с тромбоэмболиболическими осложнениями (группа 4) имела место резкая активация системы клеточного звена гемостаза, что проявлялось в резком увеличении концентрации тромбоцитов, содержащих гранулы (до 700 тыс/мкл), МФАК была максимальной - 65-80 фут-кандел на клетку или 65-80 баллов, адгезивная активность составляла 80-90% или 80-90 баллов.
Апробация предложенного способа оценки морфофункционального статуса тромбоцитов в клинической практике выявила тесную взаимосвязь МФАТ с относительным содержанием тромбоцитов с гранулами (рис.5).
Обоснованность и достоверность предложенного способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека подтверждена корреляционным и математическим анализом тесной взаимосвязи агрегационной, адгезивной и морфофункциональной активности анализируемых тромбоцитов человека (рис.6.)
Для лучшего понимания предложенного «Способа оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека» приводим несколько конкретных примеров:
№1а Методом афереза от донора получен тромбоцитный концентрат в объеме 100 мл. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов предлагаемым способом.
№1б Тот же тромбоцитный концентрат в объеме 100 мл на 5 сутки хранения при комнатной температуре. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов предлагаемым способом. Результаты исследования отражены в таблице 6.
| Таблица 6. | ||
| Анализируемые параметры | Тромбоконцентрат в первые сутки хранения пример №1а | Тромбоконцентрат через 5 суток хранения пример №1б |
| Концентрация тромбоцитов (Стр), тыс/мкл | 3000 | 2000 |
| Количество тромбоцитов в 100 мл (млрд в дозе) | 300 | 200 |
| Относительное содержание | 55 | 1 |
| тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр), % | ||
| Концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр), млрд в дозе | 165 | 2 |
| Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ), фут-кандел/клетку или баллах | 47 | 12 |
| Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ), % или баллах | 53 | 0 |
| Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ), баллы | 100 | 12 |
| ЗАКЛЮЧЕНИЕ | Тромбоциты имеют нормальный морфофункциональный статус. Рекомендованы к использованию в клинической практике. | Тромбоциты имеют очень низкий морфофункциональный статус. Противопоказано их использование в клинической практике. |
Пример 2. Б-й М., возраст 32 года. Диагноз: острый миелоидный лейкоз, выраженный геморрагический синдром 1-й степени (на коже). Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов крови предлагаемым способом. Получены следующие результаты
1. Концентрация тромбоцитов (Стр) - 14 тыс/мкл, или 14×109/л, или 14 млрд клеток в л.
2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр) - 5%.
3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр) - 0.7 тыс/мкл или 0,7 млрд/л.
4. Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ) - 10 фут-кандел/клетку или 10 баллов.
5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - от 0% или 0 баллов.
6. Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - 10+0=10 баллов.
Заключение: тромбоциты крови имеют очень низкий морфофункциональный статус, что может привести к развитию клинических осложнений в виде геморрагического синдрома.
Пример 3. Больной К., диагноз - тромбоз сосудов печени, тромбоцитоз. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов крови предлагаемым способом. Получены следующие результаты
1. Концентрация тромбоцитов (Стр) в крови - 800 тыс/мкл, или или 800×109/л, или 800 млрд клеток в л.
2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр) - 85%.
3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр) - 640 тыс/мкл или 640×109/л, или 640 млрд/л.
4. Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ) - 64 фут-кандел/клетку или 64 балла.
5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - 85% или 85 баллов.
6. Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - 64+85=149 баллов.
Заключение: тромбоциты крови имеют высокий морфофункциональный статус. Активирована система клеточного звена гемостаза, возможно тромбообразование.
Claims (1)
- Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов, включающий морфометрию параметров отдельных клеток, подсчет процента активированных тромбоцитов, отличающийся тем, что образцы крови, или плазмы, или концентрата тромбоцитов окрашивают в микропробирке в течение 5-10 мин при комнатной температуре витальным флуорохромным красителем на буферном растворе, содержащим трипафлавин и акридиновый оранжевый в соотношении 1:1, затем окрашенные клетки переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и с помощью флуоресцентного микроскопа - объектив ×100, длина волны возбуждения 450-490 нм, длина волны эмиссии - от 520 нм, оценивают количество тромбоцитов с гранулами, измеряют яркость свечения витально окрашенных трипафлавином и акридиновым оранжевым клеток, измеряют яркость свечения 100-200 витально окрашенных трипафлавином-АО клеток, суммируют значения яркости обследованных клеток, делят на количество обследованных тромбоцитов, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита и выражают в фут-канделах на 1 клетку, соответствующего одному баллу, характеризующую морфофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ) анализируемого образца, далее препарат с витально окрашенными тромбоцитами помещают в термостат при 37°С на 5-15 мин, после чего с помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают число распластанных тромбоцитов с выходящими наружу гранулами, делят на общее число обследованных клеток и выражают в %, причем один процент соответствует одному баллу, характеризующих адгезивную активность тромбоцитов (ААТ) анализируемого образца, затем по сумме морфофункциональной и адгезивной активностей, выраженных в баллах, оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ), который при 80-130 баллах считают нормальным, при 60-79 баллах - сниженным, при 41-59 баллах - низким, при менее чем 40 баллах - очень низким, при 131-150 баллах - высоким, при 151-170 баллах - очень высоким.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105560/15A RU2485502C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012105560/15A RU2485502C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2485502C1 true RU2485502C1 (ru) | 2013-06-20 |
Family
ID=48786463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012105560/15A RU2485502C1 (ru) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2485502C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623073C1 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-06-21 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ отбора тромбоцитов человека, пригодных для криоконсервирования |
| RU2623074C1 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-06-21 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Экспресс-метод морфофункционального анализа тромбоцитов, пригодных для клинического использования |
| RU2814398C1 (ru) * | 2022-11-08 | 2024-02-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ интегральной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при экспериментальных ортопедических хирургических вмешательствах |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2151402C1 (ru) * | 1999-11-29 | 2000-06-20 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии | Способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии |
| UA44405A (uk) * | 2000-04-24 | 2002-02-15 | Інститут Геронтології Академії Медичних Наук України | Спосіб визначення функціонального стану тромбоцитів |
| RU2431838C1 (ru) * | 2010-04-22 | 2011-10-20 | ФГУ "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по высокотехнологичной медицинскоей помощи" (ФГУ "НИИ ОММ Росмедтехнологий") | Способ диагностики гиперагрегации тромбоцитов |
-
2012
- 2012-02-17 RU RU2012105560/15A patent/RU2485502C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2151402C1 (ru) * | 1999-11-29 | 2000-06-20 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии | Способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии |
| UA44405A (uk) * | 2000-04-24 | 2002-02-15 | Інститут Геронтології Академії Медичних Наук України | Спосіб визначення функціонального стану тромбоцитів |
| RU2431838C1 (ru) * | 2010-04-22 | 2011-10-20 | ФГУ "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по высокотехнологичной медицинскоей помощи" (ФГУ "НИИ ОММ Росмедтехнологий") | Способ диагностики гиперагрегации тромбоцитов |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| КОЛОСОВА Е.Н.Оценка морфофункционального состояния тромбоцитов у больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. - БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, т. 31, No.2, 2011, с.58-63. * |
| КОЛОСОВА Е.Н.Оценка морфофункционального состояния тромбоцитов у больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. - БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, т. 31, №2, 2011, с.58-63. ЛОБОДИНА И.М.и др. Диагностическое применение компьютерной морфометрии тромбоцитов при маточных кровотечениях у подростков. - Проблемы репродукции, 2008, №3, с.43-47. ПАВЛОВА Т.В. Внутрисосудистая активность тромбоцитов: региональные и возрастные особенности. - Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия, 2006, №6/1(46), с.265-273. * |
| ЛОБОДИНА И.М.и др. Диагностическое применение компьютерной морфометрии тромбоцитов при маточных кровотечениях у подростков. - Проблемы р * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2623073C1 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-06-21 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ отбора тромбоцитов человека, пригодных для криоконсервирования |
| RU2623074C1 (ru) * | 2015-12-29 | 2017-06-21 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Экспресс-метод морфофункционального анализа тромбоцитов, пригодных для клинического использования |
| RU2814398C1 (ru) * | 2022-11-08 | 2024-02-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ интегральной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при экспериментальных ортопедических хирургических вмешательствах |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5138372B2 (ja) | 凍結乾燥血小板の調製法、凍結乾燥血小板を含む組成物、および使用法 | |
| Burkman et al. | The hemizona assay (HZA): development of a diagnostic test for the binding of human spermatozoa to the human hemizona pellucida to predict fertilization potential | |
| US7811558B2 (en) | Use of stabilized platelets as hemostatic agent | |
| Adelson et al. | Platelet and fibrinogen survival in normal and abnormal states of coagulation | |
| Hirsch et al. | Thrombopathic thrombocytopenia: successful transfusion of blood platelets | |
| Greenburg et al. | Intravascular persistence and oxygen delivery of pyridoxalated, stroma-free hemoglobin during gradations of hypotension | |
| US20060035383A1 (en) | Dry platelet preparations for use in diagnostics | |
| Kottke‐Marchant et al. | Vascular graft‐associated complement activation and leukocyte adhesion in an artificial circulation | |
| RU2485502C1 (ru) | Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека | |
| Wang et al. | An in vitro study of coagulation properties in refrigerated whole blood and reconstituted whole blood | |
| Ognean et al. | Transfusion Triggers and therapeutic efficacy in a group of dogs that underwent whole blood therapy | |
| Daland et al. | Hematologic observations in bacterial endocarditis: especially the prevalence of histiocytes and the elevation and variation of the white cell count in blood from the ear lobe | |
| Tanaka et al. | A hollow‐fibre column system to effectively prepare washed platelets | |
| Jackson et al. | Prothrombin utilization in radiation injury | |
| Igorevna Berezina et al. | Comparative physiological aspects of plasma hemostasis of some commercial fish species | |
| Kretschmer | Clinical implications of in vitro bleeding test–A review | |
| Yogev et al. | Andrology: The use of hemizona assay in the evaluation of the optimal sperm preparation technique | |
| RU2327467C1 (ru) | Способ лечения диспепсии у новорожденных телят | |
| Iryna | Physiology of the blood system. Methodological instructions for laboratory classes of subject «Animal physiology» for foreign students of the speciality 221 «Veterinary medicine», branch of knowledge 21 «Veterinary Medicine» | |
| Aleem et al. | Correlation of blood groups, Bleeding time and Clotting time in male and female students; an observational study | |
| Laroche et al. | Clinical Uses of Blood Components | |
| Izmest’eva et al. | Effect of rat exposure to moderate pressure oxygen atmosphere on resistance of erythrocytes against hemolysis | |
| Abbas et al. | THE HAEMATOLOGICAL ABNORMALITIES IN APPARENTLY HEALTHY SUDANESE BLOOD DONORS ATTENDING CENTRAL BLOOD BANK IN WAD MADANI, GEZIRA STATE, SUDAN | |
| Moyananda et al. | The Effect of Bajakah Tampala Stem (Spatholobus littoralis Hassk) Extract on Clotting Time In Vitro | |
| Ali | Normal reference values of some hematological parameters among adult sudanese people in elmatama locality |