RU2483309C1 - Способ обнаружения экзогенных стероидов в биологической жидкости человека - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, и описывает способ обнаружения экзогенных стероидов в биологической жидкости человека, включающий приготовление анализируемой пробы путем экстракции, упаривания экстракта, растворения сухого остатка в мобильной фазе и последующее хроматографическое разделение, фотоионизацию и масс-спектральный анализ анализируемой пробы, регистрацию полученных результатов и определение наличия стероидов, причем хроматографическое разделение анализируемой пробы проводят в колонке из пористого графита, в качестве подвижной фазы при фотоионизации используют вещества с низким сечением поглощения фотонов и низким потенциалом ионизации и хроматографическое разделение анализируемой пробы ведут при температуре по меньшей мере 100°С. Способ обеспечивает расширение спектра определяемых стероидов за счет повышения селективности и обеспечения возможности определения изомеров, а также сокращение продолжительности проведения анализа. 1 з.п. ф-лы, 10 табл., 8 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии и, в частности, к способам определения наличия экзогенных стероидов в организме.

Известны способы определения органических веществ, в том числе и стероидов, методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, например [1-3].

Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных для стероидов, что существенно усложняет ход анализа и увеличивает его продолжительность.

Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ определения стероидов в биологической жидкости человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) [4].

Указанный способ включает приготовление анализируемой пробы путем экстракции, упаривания экстракта, растворения сухого остатка в мобильной фазе, хроматографическое разделение, ионизацию и масс-спектральный анализ анализируемой пробы, регистрациию полученных результатов и определение экзогенных стероидов путем сравнения зарегистрированных времени удержания и соотношений интенсивности характеристичных ионов пробы и веществ-эталонов.

Недостатком указанного способа является низкая селективность, особенно при анализе смеси изомеров экзогенных стероидов, а также высокий порог чувствительности определения стероидов, что требует, во-первых, анализа больших объемов исследуемой биологической жидкости, а во-вторых, существенно сказывается на продолжительности проведения анализа.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является расширение спектра определяемых стероидов за счет повышения селективности и обеспечения возможности определения изомеров, а также сокращение продолжительности проведения анализа.

Поставленный технический результат достигается тем, что хроматографическое разделение приготовленой анализируемой пробы проводят в колонке из пористого графита, при фотоионизации при атмосферном давлении в качестве подвижной фазы используют вещества с низким сечением поглощения фотонов и низким потенциалом ионизации и хроматографическое разделение анализируемой пробы ведут при температуре по меньшей мере 100°С, причем в качестве подвижной фазы используют, например, изопропанол тетрагидрофуран, ацетон или этанол.

Известно, что стероиды химически неполярны и поэтому они слабо ионизируются в процессе проведения ВЭЖХ-МС анализа с электрораспылительной ионизацией. Указанное обстоятельство приводит к тому, что для получения достоверных результатов анализа приходится исследовать большие объемы биологической жидкости (например, плазмы крови 1,5-2,5 мл). Кроме того, пределы детектирования стероидов при проведении вышеуказанного анализа составляют от 100 нг/мл до 500 нг/мл.

По мнению авторов фотоионизация при атмосферном давлении при анализе стероидов является предпочтительней, однако в этом случае существенным фактором, ограничивающим использование фотоионизации, является высокий потенциал ионизации и, соответственно, высокое сечение поглощения фотонов, присущие использующимися при этом подвижным фазам (метанол-вода, ацетонитрил-вода). Для ограничения влияния указанных факторов на выходе из хроматографической колонки в подвижную фазу разбавляли бензолом или толуолом (вещества с низким потенциалом ионизации и сечением поглощения фотонов), однако в этом случае компоненты ограниченно растворялись друг в друге и образующаяся таким образом гетерофазная система вносила высокую вероятность получения недостоверных результатов анализа, особенно с количественной стороны.

Авторы предлагают неожиданное решение.

Использовать в качестве подвижной фазы вещества, заранее известные как обладающие низким потенциалом ионизации и низким сечением поглощения фотонов, например изопропанол, тетрагидрофуран (ТГФ), этанол. При этом следует принять во внимание, что указанные вещества легко протонируются и, что парадоксально, как оказалось, легко отдают этот же протон анализируемому веществу, являясь, таким образом, своеобразным посредником в процессе фотоионизации исследуемых стероидов.

Далее, вторым неожиданным решением является разделение исследуемого образца на хроматографической колонке из пористого графита [5] и третьим - проведение процесса разделения исследуемого образца при высокой, не менее 100°С, температуре, что, по мнению авторов, позволит (как будет показано на примерах конкретного осуществления заявляемого способа) не только существенно сократить продолжительность проведения анализа, но и обеспечить разделение изомеров исследуемых веществ (в данном случае экзогенных стероидов).

Стандартные растворы аналитов могут быть приготовлены растворением точных навесок в точном объеме растворителя, например метанола. Рабочие растворы могут быть получены разбавлением до соответствующей концентрации.

В качестве подвижной фазы могут быть использованы, например, ТГФ, этанол, изопропанол, ацетон и др. тому подобные растворители с низким потенциалом фотоионизации и низким сечением поглощения фотонов.

В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован диэтиловый эфир (ДТЭ).

В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.

В качестве системы ВЭЖХ-МСВР могут быть использованы, например, хромато-масс-спектрометр с орбитальной ионной ловушкой Exactive или хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным масс-анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенные с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col^®, США - для ЖЖЭ;

- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;

- упариватель фирмы Barnstead Inc.(CШA), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта;

- колонка HYPRCARB 100Х1 мм, размер частиц 3 мкм, размер пор 100 Å, фирмы Thermo Scientific (США) для хроматографического разделения.

В качестве подвижной фазы может быть использована система: 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты (рН 1.3) (А) и изопропанол (В) или этанол, или тетрагидрофуран (также В). В качестве внутренних стандартов (ISTD) может быть использован, например, метилтестостерон.

В качестве веществ-эталонов могут быть использованы, например, тренболон, эпитренболон, оксандролон, эпиоксандролон, болденон, эпиболденон, 13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан (метаболит норболетона), 13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан (метаболит норболетона), 17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона), 17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона), 17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол (метаболит метилтестостерона), 17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол (метаболит метилтестостерона), 19-норандростерон, 19-норэтиохоланолон.

Экзогенный стероид или его метаболит	Изомер
тренболон	эпитренболон
оксандролон	эпиоксандролон
болденон	эпиболденон
13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан (метаболит норболетона)	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан (метаболит норболетона)
17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона)	17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона)
17α-метил-5α-андростан-3α, 17β-диол (метаболит метилтестостерона)	17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол (метаболит метилтестостерона)
19-норандростерон	19-норэтиохоланолон

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Растворяют точные навески веществ-эталонов в органических растворителях и вводят в систему ВЭЖХ-МСВР с фотоионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов, определяют время удержания, молекулярную массу, характеристичные ионы и нижний предел обнаружения и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например Xcalibur версии 2.0 фирмы Thermo Finnigan, США.

Далее проводят пробоподготовку, при которой к образцу исследуемой мочи добавляют внутренний стандарт, экстрагируют ДТЭ (диэтиловый эфир), органический слои количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе и далее вводят в систему ВЭЖХ-МСВР с фотоионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Наличие экзогенных стероидов определяют путем сравнения времени удерживания, характеристичных ионов и др. характеристик с таковыми у веществ-эталонов.

Примечание. В Таблице 1 представлены параметры и условия проведения анализа экзогенных стероидов по примерам.

Таблица 1
Пример	Вид ионизации	Тип колонки	Подвижн. Фаза(В)	Температура колонки	Примечание
1	фотоиониз.	порист. графит	изопропанол	100°С
2	фотоиониз.	порист. графит	этанол	100°С
3	фотоиониз.	порист. графит	ТГФ	100°С
4	фотоиониз.	порист. графит	ТГФ	без нагрева
5	фотоиониз.	порист. графит	метанол	100°С
6	фотоиониз.	С18	изопропанол	без нагрева	С нагревом колонка разрушается
7	эл-спрей	порист. графит	изопропанол	100°С
8 по прототипу	эл-спрей	С18	метанол	без нагрева	С нагревом колонка разрушается

Пример 1

Анализ ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.1 Таблицы 1.

А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования исследуемых экзогенных стероидов

Готовят стандартные растворы экзогенных стероидов-аналитов (1 мг/мл): тренболон, эпитренбололон, оксандролон, эпиоксандролон, болденон, эпиболденон, 13β, 17α-диэтил-3α, 17β-дигидрокси-5α-гонан (метаболит норболетона), 13β,17α-диэтил-3α, 17β-дигидрокси-5β-гонан (метаболит норболетона), 17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона), 17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол (метаболит норэтандролона), 17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол (метаболит метилтестостерона), 17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол (метаболит метилтестостерона), 19-норандростерон, 19-норэтиохоланолон (естественно разумеется, что из имеющегося массива известных экзогенных стероидов вышеперечисленые стероиды выбраны по случайной схеме). Рабочие растворы готовят растворением точной навески стероидов-эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы стероидов разбавлением стандартных растворов до содержания 100 пг/мкл.

Приготовленные таким образом рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МСВР (хромато-масс-спектрометр с орбитальной ионной ловушкой Exactive, соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).

Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.14 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 0% В; 7 мин - 100% В; 14-18 мин - 0% В; общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют фотоионизацией в режиме регистрации положительных ионов. Температура капилляра 250°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.7 л/мин; температура в источнике ионов 250°С.

Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации точных масс. Обработку полученных данных (характеристичный ион, время удержания исследуемых экзогенных стероидов) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 2.0 фирмы Thermo Finnigan, США. Результаты анализа смесей стероидов-эталонов представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Стероид-эталон	Точная масса характеристичного иона	Время удержания (мин)	Отношение сигнал/шум	Примечание
19-норандростерон	259.2057	12.89	158075
19-норэтиохоланолон	259.2057	11.15	165100
тренболон	271.1693	8.74	351278
эпитренбололон	271.1693	11.66	333714
17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол	271.2419	13.61	189690
17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол	271.2419	12.07	207254
17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол	271.2419	13.35	221305
17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол	271.2419	12.23	238869
13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан	285.2574	13.09	256432
13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан	285.2574	14.46	263458
болденон	287.2011	15.51	221305
эпиболденон	287.2011	7.43	203741
оксандролон	307.2268	15.94	399933
эпиоксандролон	307.2268	14.02	439097

Б. Подготовка пробы и анализ исследуемой мочи

У пациента (мужчина, 35 лет) получают образец мочи, заведомо не содержащей экзогенных стероидов. Далее к указанному образцу мочи добавляют растворы (100 мкл) всех определяемых экзогенных стероидов (100 пг/мкл). Полученный таким образом модельный образец биологической жидкости подвергают анализу, для чего в него добавляют 50 мкл раствора внутреннего стандарта, содержащего метилтестостерон (10 нг/мкл), подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 5 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МСВР с фотоионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при тех же параметрах, что и при анализе веществ-эталонов

В Таблице 3 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи.

Таблица 3
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
7.43	287.2011	197628	эпиболденон
8.74	271.1693	340739	тренболон
11.15	259.2057	160147	19-норэтиохоланолон
11.66	271.1693	323702	эпитренбололон
12.07	271.2419	201036	17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол
12.23	271.2419	231702	17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол
12.89	259.2057	153332	19-норандростерон
13.09	285.2574	248739	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан
13.35	271.2419	214665	17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол
13.61	271.2419	183999	17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол
14.02	307.2268	425924	эпиоксандролон
14.46	285.2574	255554	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан
15.51	287.2011	214665	болденон
15.94	307.2268	387935	оксандролон

Пример 2

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.2 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

В Таблице 4 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 2.

Таблица 4
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
8.12	287.2011	167983	эпиболденон
9.61	271.1693	289628	тренболон
12.03	259.2057	136124	19-норэтиохоланолон
12.48	271.1693	275146	эпитренбололон
12.66	271.2419	170880	17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол
12.81	271.2419	196946	17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диол
13.59	259.2057	130332	19-норандростерон
13.77	285.2574	211428	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан
14.02	271.2419	182465	17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол
14.20	271.2419	156399	17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол
14.73	307.2268	404627	эпиоксандролон
15.07	285.2574	217220	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан
16.15	287.2011	182465	болденон
16.36	307.2268	329744	оксандролон

Пример 3

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.3 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

В Таблице 5 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 3.

Таблица 5
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
3.05	287.2011	266797	эпиболденон
3.54	271.1693	459997	тренболон
5.17	259.2057	216198	19-норэтиохоланолон
5.21	271.1693	436997	эпитренбололон
5.26	271.2419	271398	17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол
5.33	271.2419	312797	17α-метил-5β-андростан-3a,17β-диол
6.12	259.2057	206998	19-норандростерон
6.17	285.2574	335797	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5α-гонан
6.80	271.2419	289797	17α-метил-5α-андростан-3α,17β-диол
6.81	271.2419	248398	17α-этил-5α-эстран-3α,17β-диол
6.89	307.2268	574997	эпиоксандролон
7.15	285.2574	344997	13β,17α-диэтил-3α,17β-дигидрокси-5β-гонан
7.80	287.2011	289797	болденон
7.83	307.2268	523712	оксандролон

Как видно из данных Таблицы 5, продолжительность анализа сократилась примерно в три раза по сравнению с Примером 2. Однако при этом несколько ухудшилось разделение изобаров, в частности 17α-этил-5β-эстран-3α, 17β-диола и 17α-метил-5β-андростан-3α,17β-диола, что объясняется высокой элюирующей способностью тетрагидрофурана.

Пример 4

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.4 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

В Таблице 6 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 4.

Таблица 6
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
11.54	287.2011	178753	эпиболденон
13.33	271.1693	308197	тренболон
14.69	259.2057	144852	19-норэтиохоланолон
15.75	271.1693	292787	эпитренбололон
16.45	271.2419	181836	17α-этил-5β-эстран-3α,17β-диол

Из таблицы 6 становится очевидным, что без нагрева колонки анализ не может быть выполнен корректно по определяемым экзогенным стероидам и по заданному времени.

Пример 5

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.5 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

В Таблице 7 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 5.

Таблица 7
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
17.74	271.1693	3467	тренболон

Из Таблицы 7 следует, что при заданных условиях проведения анализа (см. Пример 5 Таблицы 1) определяется тоько один стероид - тренболон.

Примечание

Из Таблицы 7 следует, что использование в заявляемом способе в качестве подвижой фазы вещества с высоким сечением поглощения фотонов и соответственно высоким потенциалом ионизации (в данном случае метанола) приводит к резкому падению чувствительности и к значительному увеличению продолжительности анализа.

Пример 6

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.6 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

Предлагаемая аналитическая система с колонкой С18 не работает, поскольку не удается достичь хроматографического разделения исследуемых веществ.

Пример 7

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.7 Таблицы 1. Ход анализа такой же, как и при анализе веществ-эталонов.

В Таблице 9 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 7.

Таблица 9
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
8.74	271.1693	194	тренболон
11.66	271.1693	186	эпитренбололон
14.02	307.2268	242	эпиоксандролон
15.94	307.2268	220	оксандролон

Как видно из результатов анализа, представленных в Таблице 9, не все исследуемые экзогенные стероиды удается обнаружить, причиной чего является низкая эффективность ионизации.

Пример 8 (по прототипу)

Анализ модельного образца биологической жидкости ведут с параметрами и при условиях, представленных в п.8 Таблицы 1. Ход анализа по прототипу.

Приготовленные рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В; общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе - 2 атм.

Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс.

В Таблице 10 представлены вещества (стероиды), обнаруженные в модельном образце мочи по Примеру 8.

Таблица 10
Время удерж.	Точная масса характеристичного иона	Отношение сигнал/шум	Найденный стероид	Примечание
5.46	271.1693	152	тренболон
5.89	271.1693	144	эпитренбололон
7.43	307.2268	190	эпиоксандролон
7.64	307.2268	173	оксандролон

Как видно из описания, примеров осуществления заявляемого способа в полном и не полных объемах патентных притязаний и сравнения с прототипом, заявляемое изобретение обеспечивает расширение спектра определяемых стероидов за счет повышения селективности и обеспечения возможности определения изомеров, а также сокращение продолжительности проведения анализа.

Источники информации

1. Хим. фарм. Журнал, 1988, т.22, с.622.

2. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.

3. J. Anal. Toxicol., 2005, v.29, №4, p.217.

4. http://www.gooqle.ru/search& - (19)RU(11)2010104106 (13)A - прототип.

5. Journal of Chromatography A, 975 (2002), 229-243.

Claims (2)

1. Способ обнаружения экзогенных стероидов в биологической жидкости человека, включающий приготовление анализируемой пробы путем экстракции, упаривания экстракта, растворения сухого остатка в мобильной фазе и последующее хроматографическое разделение, фотоионизацию и масс-спектральный анализ анализируемой пробы, регистрацию полученных результатов и определение наличия стероидов, отличающийся тем, что хроматографическое разделение анализируемой пробы проводят в колонке из пористого графита, в качестве подвижной фазы при фотоионизации используют вещества с низким сечением поглощения фотонов и низким потенциалом ионизации, и хроматографическое разделение анализируемой пробы ведут при температуре по меньшей мере 100°С.

2. Способ обнаружения экзогенных стероидов в биологической жидкости человека по п.1, отличающийся тем, что в качестве подвижной фазы используют изопропанол, или тетрагидрофуран, или ацетон, или этанол.