RU2468035C2 - Сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство к лигандам, и его применение - Google Patents
Сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство к лигандам, и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2468035C2 RU2468035C2 RU2009144799/10A RU2009144799A RU2468035C2 RU 2468035 C2 RU2468035 C2 RU 2468035C2 RU 2009144799/10 A RU2009144799/10 A RU 2009144799/10A RU 2009144799 A RU2009144799 A RU 2009144799A RU 2468035 C2 RU2468035 C2 RU 2468035C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- gpcr
- seq
- polynucleotide
- protein
- Prior art date
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 title abstract description 14
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 title abstract description 14
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 title abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 154
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 154
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 113
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 113
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 79
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 79
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 79
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 43
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 11
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 claims description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 54
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 53
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 48
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 37
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 29
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 28
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- IENZQIKPVFGBNW-UHFFFAOYSA-N prazosin Chemical compound N=1C(N)=C2C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=1N(CC1)CCN1C(=O)C1=CC=CO1 IENZQIKPVFGBNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960001289 prazosin Drugs 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 229960004953 silodosin Drugs 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- XLZHXAXXJVKTFM-UHFFFAOYSA-N 1-(5-chloro-1H-indol-3-yl)-N-[2-[2-(cyclopropylmethoxy)phenoxy]ethyl]-2-methyl-2-propanamine Chemical compound C=1NC2=CC=C(Cl)C=C2C=1CC(C)(C)NCCOC1=CC=CC=C1OCC1CC1 XLZHXAXXJVKTFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 229940125633 GPCR agonist Drugs 0.000 description 5
- DRHKJLXJIQTDTD-OAHLLOKOSA-N Tamsulosine Chemical compound CCOC1=CC=CC=C1OCCN[C@H](C)CC1=CC=C(OC)C(S(N)(=O)=O)=C1 DRHKJLXJIQTDTD-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 5
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 5
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 229960002613 tamsulosin Drugs 0.000 description 5
- 101150061566 ADRA1A gene Proteins 0.000 description 4
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 4
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 4
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 4
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- NIBOMXUDFLRHRV-UHFFFAOYSA-N hydron;8-[2-[4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]ethyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione;dichloride Chemical compound Cl.Cl.COC1=CC=CC=C1N1CCN(CCN2C(CC3(CCCC3)CC2=O)=O)CC1 NIBOMXUDFLRHRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 description 3
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 description 3
- 229940125499 GPCR antagonist Drugs 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- PNCPYILNMDWPEY-QGZVFWFLSA-N silodosin Chemical compound N([C@@H](CC=1C=C(C=2N(CCCO)CCC=2C=1)C(N)=O)C)CCOC1=CC=CC=C1OCC(F)(F)F PNCPYILNMDWPEY-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006068 Gq proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052606 Gq-G11 GTP-Binding Protein alpha Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108091006065 Gs proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- MRBDMNSDAVCSSF-UHFFFAOYSA-N phentolamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1N(C=1C=C(O)C=CC=1)CC1=NCCN1 MRBDMNSDAVCSSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004204 2-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100024401 Alpha-1D adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150049660 DRD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004980 Dopamine D2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001111 Dopamine D2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000689685 Homo sapiens Alpha-1A adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000689696 Homo sapiens Alpha-1D adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 239000000951 adrenergic alpha-1 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000011496 cAMP-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- OYCZEIUVXUTJAQ-UHFFFAOYSA-N decane-2,4-dione;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CCCCCCC(=O)CC(C)=O OYCZEIUVXUTJAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 208000029436 dilated pupil Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002637 mydriatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229960001999 phentolamine Drugs 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000003087 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008327 renal blood flow Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002820 sympathetic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованию рецептору, сопряженному с G-белком, и может быть использовано в медицине. Получен белковый комплекс, обладающий сродством GPCRα1L к лиганду, включающий GPCRα1L и полипептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1. Связывание указанного рецептора, сопряженного с G-белком, с полипептидом изменяет сродство к лиганду рецептора. Также предложены методы скрининга агонистов или антагонистов рецептора, сопряженного с G-белком, с использованием трансформанта, в котором экспрессируется указанный измененный рецептор, сопряженный с G-белком. Заявленное изобретение обеспечивает проведение анализа функции многих предполагаемых рецепторов, сопряженных с G-белком, структура которых еще не известна. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к рецепторам, сопряженным с G-белком (GPCRs), которые характеризуются измененным сродством к лигандам, и применению указанных рецепторов. В частности, настоящее изобретение относится к GPCRs, сродство к лигандам которых изменено в результате образования комплекса с определенным белком, и их применению.
Уровень техники
Многие реакции в живых организмах вызваны проникновением в клетку внеклеточной информации и распространению информации по клетке. Мембранные рецепторы служат медиаторами, через которые внеклеточная информация передается в клетки. Хорошо известно, что GPCRs, имеющие 7 трансмембранных доменов, являются одним из основных типов связанных с мембраной рецепторов.
Когда лиганд (например, аминокислота, пептид или амид) связывается с GPCR, GPCR передает информацию в клетку через тримерный G-белок. G-белки, сопряженные с GPCRs, подразделяют на Gs, Gi, Gq и другие, которые активируют/инактивируют различные эффекторные пути (например, сигнальный путь цАМФ, сигнальный путь цГМФ и сигнальный путь фосфолипазы С), соответственно. Например, α1-адренэргический рецептор главным образом сопряжен с Gq-белком для активации системы фосфолипазы С, что приводит к образованию диацилглицерола и инозитолтрифосфата, таким образом повышая внутриклеточную концентрацию Са2+. α2-адренергический рецептор главным образом сопряжен с Gi-белком для подавления аденилатциклазной системы, что, таким образом, снижает уровень цАМФ. Кроме того, β-адренергический рецептор главным образом сопряжен с Gs-белком для активации аденилатциклазной системы, что, таким образом, приводит к повышению уровня цАМФ.
GPCRs повсеместно встречаются и функционируют в нашем организме. Например, α1-адренэргические рецепторы представлены в периферических кровеносных сосудах, предстательной железе и обеспечивают сокращения. Также известно, что α1-адренэргические рецепторы функционируют в центральной нервной системе, β-адренергические рецепторы в сердце и жировой ткани играют важную роль для регуляции частоты сердечных сокращений и расщепления жиров.
Известно, что GPCRs и зависимые от них системы передачи сигналов не только контролируют физиологический гомеостаз в нашем теле, но и определяют патофизиологическое состояние при различных заболеваниях. Поэтому для того, чтобы лечить такие заболевания, очень важно определить конкретные GPCRs, связанные с определенными заболеваниями, и затем разработать специфичные в отношении GPCRs лекарственные средства (например, агонисты или антагонисты).
Не патентная литература 1
Muramatsu, I. et al. Br. J. Pharmacol., 99: 197 (1990)
He патентная литература 2
Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)
He патентная литература 3
Morishima, S. et al. J. Urol. 177: 377-381 (2007)
He патентная литература 4
Molenaar, P. and Parsonage, W.A.Trends Pharmacol. Sci., 26: 368-375 (2005)
Не патентная литература 5
Samaha, A.N. et al., J. Neurosci. 27: 2979-2986 (2007)
Краткое описание изобретения
В изучении GPCR произошел значительный прогресс, в результате чего было обнаружено большое количество GPCR. Однако все еще существуют несколько предполагаемых GPCRs, для которых определены фенотипы, но структура которых пока неизвестна. Например, α1-адренергические рецепторы разделяют на три подтипа (α1A, α1B и α1D) на основе кодирующих их различных генов. Однако было выдвинуто предположение о существовании в дополнение к классическим α1-адренергическим рецепторам, дополнительного подтипа (α1L) рецепторов, отличающихся по фармакологическому профилю (фенотипу) от классических подтипов. Рецепторы подтипа α1L обладают существенно сниженным сродством к типичному блокатору α1- рецепторов (празозину) по сравнению с α1A-, α1B- и α1D-подтипами. α1L-подтип обнаруживается только в интактных полосках или сегментах нативных тканей, но не обнаруживается в гомогенатах тканей (см. Не патентная литература 1-3). Дополнительно, известно, что подтипы β1 адреналинового рецептора (β1H и β1L), отличающиеся по фенотипу, кодированы одними и теми же генами (см. Не патентная литература 4). Для этого подтипа известен только фенотип, но не его сущность. Подобное можно также отметить для допаминовых рецепторов, мускариновых рецепторов или эндотелиновых рецепторов (см. Не патентная литература 5 и т.п.). Однако механизмы формирование разных фенотипов продуктами одного и того же гена до сих пор не известны.
Настоящее изобретение было создано с учетом этой проблемы, и целью настоящего изобретения является обеспечить способ анализа функции рецептора, сопряженного с G-белком, структура которого не известна.
Белковый комплекс согласно настоящему изобретению характеризуется связыванием GPCR с: (1) полипептидом, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептидом (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, которой способен гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептидом (i), кодируемым полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Способ получения белкового комплекса согласно настоящему изобретению характеризуется наличием стадии осуществления совместного присутствия GPCR и белка на липидной мембране, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который способен гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение может изменять сродство GPCR к лиганду. Другими словами, способ получения белкового комплекса согласно настоящему изобретению также может представлять собой способ изменения сродства GPCR к его лигандам.
Липидная мембрана согласно настоящему изобретению характеризуется содержанием белкового комплекса. Способ получения липидной мембраны согласно настоящему изобретению характеризуется стадией осуществления совместного присутствия GPCR и белка на липидной мембране, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Дополнительно, трансформант (трансформированная клетка или организм) согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что он содержит белковый комплекс. Способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению характеризуется стадией экспрессии указанного белкового комплекса и предпочтительно включает стадию введения в клетку гена, кодирующего GPCR, и гена, кодирующего полипептид.
Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение облегчает анализ функции GPCR с измененным сродством к лиганду.
Способ скрининга агонистов или антагонистов GPCR с измененным сродством к лиганду согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадий: [1] получения белкового комплекса посредством обеспечения совместного присутствия GPCR и полипептида на липидной мембране; и [11] инкубирования указанного белкового комплекса совместно с исследуемым веществом (потенциальным агонистом или антагонистом), при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Способ получения трансформанта, экспрессирующего GPCR с измененным сродством к лиганду, согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии ингибирования экспрессии полипептида в клетке, в которой имеет место экспрессия GPCR, при этом указанный полипептид представляет собой: (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным при жестких условиях гибридизации гибридизоваться с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Благодаря указанным признакам, настоящее изобретение облегчает анализ функции GPCR с измененным сродством к лиганду и обеспечивает возможность изменения сродства GPCR к лиганду. Таким образом, настоящее изобретение также может рассматриваться как способ изменения сродства GPCR к его лигандам.
Способ получения согласно настоящему изобретению предпочтительно является таким, что полипептид представляет собой эндогенный белок, и стадию подавления экспрессии полипептида осуществляют способом РНК интерференции. Также, указанная клетка может представлять собой трансформант, экспрессирующий экзогенный белок GPCR.
Способ скрининга агонистов или антагонистов GPCR с измененным сродством к лиганду согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадий: [1] подавления экспрессии полипептида в клетке, в которой экспрессируется GPCR; и [11] инкубирования клетки совместно с исследуемым веществом (потенциальным агонистом или антагонистом), при этом полипептид представляет собой (1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептид (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду рецептора, сопряженного с G-белком, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым полипептид образовал комплекс; (5) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, способным гибридизоваться при жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептид (i), кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого на 70% и более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс.
Предпочтительно, способ скрининга согласно настоящему изобретению дополнительно включает стадию измерения внутриклеточной концентрации Са2+ или стадию измерения метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата.
Согласно настоящему изобретению GPCR, который входит в состав белкового комплекса, предпочтительно представляет собой адренергический рецептор, допаминовый рецептор, мускариновый рецептор или рецептор эндотелина, а указанный адренергический рецептор может представлять собой α-рецептор или β-рецептор. Дополнительно, указанный допаминовый рецептор предпочтительно являлся D2 рецептором. Предпочтительно, α-рецептор представляет собой α1-рецептор, и более предпочтительно, α1-рецептор представляет собой α1A-подтип указанного рецептора. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, белковый комплекс согласно настоящему изобретению представляет собой адренергический рецептор α1L-подтипа или β1L-подтипа.
Для более полного понимания сущности и преимуществ настоящего изобретения следует ссылаться на следующее ниже подробное описание изобретения совместно с прилагаемыми рисунками.
Краткое описание фигур
Фигура 1
На фигуре 1 показаны кривые насыщения связывания [3Н]-силодозина в клетках α1L (эксперимент по связыванию целыми клетками).
Фигура 2
На фигуре 2(а) приведены кривые конкурентного связывания празозина в клетках α1L и α1A (эксперимент по связыванию целыми клетками). На фигуре 2(b) показаны кривые конкурентного связывания празозина в гомогенатах клеток α1L и α1A. Пунктирная линия с закрашенными квадратами: кривая конкурентного связывания празозина в целых клетках α1L была описана для сравнения с кривыми в гомогенатах.
Описания вариантов реализации изобретения
1. Белковый комплекс.
Настоящее изобретение обеспечивает белковый комплекс GPCR и определенного полипептида. В описании настоящего изобретения термин «комплекс» означает находящуюся в виде единого целого комбинацию множества веществ и «образование комплекса» и «объединение» взаимозаменяемы. Следует отметить, что необходимо только, чтобы множество веществ, образующих комплекс, взаимодействовали друг с другом в непосредственной близости, при этом указанные вещества могут связываться или не связываться друг с другом. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения белковый комплекс согласно настоящему изобретению представляет собой GPCR и определенный полипептид, которые взаимодействуют друг с другом в непосредственной близости, и в итоге указанный белковый комплекс функционирует как GPCR с измененным сродством к лиганду.
Данное описание описывает настоящее изобретение на примере адренэргического рецептора (в частности α1A-подтипа) в качестве GPCR, сродство к лиганду которого изменено посредством взаимодействия с определенным полипептидом. Однако специалисту в данной области, который прочел настоящее описание, будет ясно, что GPCR, согласно настоящему изобретению, не ограничивается адренергическим рецептором. Кроме того, специалист в данной области сможет с легкостью получить информацию о последовательности GPCR, согласно настоящему изобретению.
Хорошо известно, что адренергические рецепторы опосредуют работу автономной нервной системы (симпатической нервной системы). Связывание адреналина, норадреналина и т.п. с адренергическим рецептором вызывает различные физиологические ответы, например сокращение гладкой мускулатуры сосудов, повышение кровяного давления и частоты сердечных сокращений, расширение зрачка и повышение уровня глюкозы в крови.
Прогресс в исследовании и развитие новых вариантов лекарственных средств позволили четко понять, что существуют различные типы адренергических рецепторов. Ранее, адренергические рецепторы подразделяли на α-рецепторы и β-рецепторы согласно их различиям в реакционной способности к изопротеренолу и фентоламину, и дополнительно классифицировали по фармакологическим подгруппам (α1-рецептор, α2-рецептор и β-рецептор). Известно, что эти рецепторы по-разному распределены в тканях и выполняют различные функции. Например, известно, что α1-адренэргические рецепторы выполняют функцию важных медиаторов, которые вызывают сокращения гладкой мускулатуры сосудов, предстательной железы и т.п., и также известно, что они участвуют в управлении сознанием и эмоциями в центральной нервной системе.
В настоящий момент, когда закончено картирование генома человека, можно определить структуру и функции многих белков на генетическом уровне. В случае α1-адренэргических рецепторов выделили три подтипа (α1A, α1B и α1D), на основании различных генов, которые их кодируют. Известно, что эти классические подтипы хорошо совпадают с фармакологическими подтипами. В этом отношении можно считать, что один подтип рецепторов в основном происходит от одного отдельного гена.
Однако давно показано, что в некоторых тканях нашего организма встречается и функционирует уникальный α1-адренэргический рецептор. Из-за его низкого сродства к типичному блокатору α1 (празозину), этот уникальный подтип был назван «α1L-подтипом», несмотря на то, что соответствующий ген пока не был клонирован.
В таблице 1 приведена классификация и избирательность к лекарственным средствам α1-адренэргических рецепторов.
[Таблица 1] | |||||
Классификация и селективность лекарственных средств в отношении α1-адренэргических рецепторов | |||||
подтип | сродство (pKb) | ||||
Силодозин1,3,4,5 | Тамсулозин1,3,4 | Празозин1,2,3,4,5 | RS-170532,4 | BMY 73784,5 | |
α1А | 10.7-9.5 | 10.4-9.9 | 10.6-9.3 | 9.1-8.4 | 6.9-5.6 |
α1L | 10.7-9.5 | 10.4-9.9 | 8.3-7.6 | 6.3 | 6.9-5.6 |
α1В | 8.1 | 9.3 | 10.6-10.1 | 7.8 | 7.4 |
α1D | 8.6 | 9.9 | 10.1-9.9 | 7.8 | 9.1 |
Данные для соединений, приведенных в таблице 1, основаны на приведенных ниже публикациях:
1. Muramatsu, I. et al. Pharmacol. Commun., 6: 23 (1995)
2. Ford, АР. et al. Mol. Pharmacol., 49: 209 (1996)
3. Murata, S. et al. J. Urol., 164: 578 (2000)
4. Hiraizumi-Hiraoka, Y. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 310: 995 (2004)
5. Murata, S. et al. Br. J. Pharmacol., 127: 19 (1999)
В биологических исследованиях было показано, что α1L-подтип является функциональным рецептором в нижних отделах мочеполовой системы человека и других млекопитающих. Также обнаружили α1L-подтип в интактных сегментах нативных тканей (например, предстательная железа человека). Однако α1L-подтип не обнаруживали с помощью традиционных экспериментов связывания, проводившихся на гомогенизированных тканях. Тот факт, что α1L-подтип не определяли в гомогенизированной ткани, означает, что очень трудно выделить α1L-подтип из ткани. Если неизвестна природа α1L-подтипа, то будет очень трудно исследовать функцию α1L-адренэргического рецептора, в частности, для разработки α1L-селективных лекарственных средств (например, агонистов или антагонистов).
Авторы настоящего изобретения предположили, что α1L-подтип, сущность которого неизвестна, образуется при связывании некой вспомогательной молекулы с уже известным подтипом (возможно, α1A-подтипом). То есть, авторы предположили, что взаимодействие между молекулой рецептора определенного подтипа и ее вспомогательной молекулой, которые совместно составляют α1L-подтип, разрушается при гомогенизации ткани, и в результате α1L-подтип меняет свои свойства на свойства α1A-подтипа. В результате, было обнаружено, что при гомогенизации ткани фармакологический профиль α1L-подтипа превратился в профиль α1A-подтипа. Более того, в результате кропотливых исследований авторы настоящего изобретения подтвердили, что определенный белок связывается с α1A-подтипом, и совместная экспрессия указанного белка с α1A-подтипом в культуре клеток приводит к экспрессии фенотипа α1L-подтипа. То есть, было обнаружено, что α1L-подтип состоит из белкового комплекса, был определен белок, входящий в состав данного комплекса, и таким образом осуществлено настоящее изобретение.
В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает комплекс, который образует α1L-подтип адренэргического рецептора. То есть, белковый комплекс согласно данному варианту реализации настоящего изобретения представляет собой α1L-подтип адренэргического рецептора. Данный вариант реализации изобретения позволяет обеспечить лечение любого заболевания, связанного с α1L-подтипом, сущность которого была определена.
Полипептид, составляющий белковый комплекс согласно настоящему изобретению, известен как CRELD (обогащенный цистеином с EGF-подобными доменами) 1а белок, миссенс мутация которого считается связанной с дефектом атриовентрикулярной перегородки (Gene 293: 47-57 (2002), Am. J. Hum. Genet. 72: 1047-1052 (2003)). Информация о последовательности полипептида может быть получена по номеру доступа NCBI: NM_015513 и в настоящем описании, представлена через SEQ ID NO:1 (последовательность аминокислот) и SEQ ID NO:2 (последовательность нуклеотидов). То есть, полипептид, составляющий белковый комплекс согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, может представлять собой полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, или может являться полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
Полипептид, который входит в состав белкового комплекса согласно данному варианту реализации настоящего изобретения не ограничивается полипептидом, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1, и может представлять собой мутантный полипептид, сохраняющий активность исходного полипептида. Примером такого мутантного полипептида является полипептид, который: (i) имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) обладает способностью образовывать комплекс с GPCR и изменять сродство указанного GPCR к лиганду.
С помощью общих методических принципов, известных в данной области, специалист может легко получить мутантный полипептид, из аминокислотной последовательности конкретного полипептида посредстовм делеции, вставки, замены или добавления одной или нескольких аминокислот. Кроме того, на основе информации, содержащейся в настоящем описании изобретения и общих методических принципов, специалист в данной области может легко определить, сохраняет ли мутантный полипептид ту же активность, что и первоначальный полипептид.
Кроме того, полинуклеотид, кодирующий полипептид, входящий в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению, не ограничивается полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и также может представлять собой мутантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, сохраняющий способность изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс. Примером такого мутантного полинуклеотида является, но не ограничен им: (1) полинуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов, (2) полинуклеотид, который способен гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2, или (3) полинуклеотид, последовательность которого на 70% или более, предпочтительно 80% или более, или более предпочтительно 85% или более, гомологична полинуклеотиду, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
С помощью общих методических подходов, известных в данной области, специалист может легко получить: мутантный полипептид из аминокислотной последовательности конкретного полинуклеотида посредством делеции, вставки, замены или добавления одной или нескольких аминокислот; мутантный полинуклеотид, способный при жестких условиях гибридизации гибридизоваться с определенным полинуклеотидом; или мутантный полинуклеотид, последовательность которого на 70% или более идентична последовательности определенного полинуклеотида. Далее, на основе описания настоящего изобретения и общих методических принципов специалист в данной области может легко определить, сохраняет ли полипептид, кодируемый указанным мутантным полинуклеотидом, ту же активность, что и полипептид, кодируемый исходным полинуклеотидом.
Применительно к настоящему описанию, термин «жесткие условия гибридизации» означает инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе для гибридизиации (содержащем 50% формамид, 5 х SSC [150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевого цитрата], 50 мМ фосфат натрия (рН=7.6), 5 х раствор Денгардса, 10% декстран сульфат и 20 мкг/мл денатурированной спермы лосося), с последующей промывкой фильтра при 65°С в 0.1 х SSC.
Необходимо только провести процедуру специфичной гибридизации по способу, хорошо известному в данной области (например, по способу, описанному в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., J. Sambrook and D.W.Russell ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)", который включен посредством ссылки на настоящее описание).
Настоящее изобретение описано выше с использованием адренэргических рецепторов в качестве примера GPCR, составляющих белковый комплекс согласно настоящему изобретению. Однако достаточно, чтобы белковый комплекс согласно настоящему изобретению представлял собой комплекс GPCR и (1) полипептида, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; (2) полипептида (i), который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (3) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2; (4) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 с делецией, вставкой, заменой или добавлением одной или нескольких нуклеотидов, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; (5) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, который способен в жестких условиях гибридизации гибридизоваться с полинуклеотидом, который имеет последовательность, комплементарную последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:2 и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс; или (6) полипептида (i), кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого на 70% или более идентична последовательности полинуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и (ii) способен изменять сродство к лиганду GPCR, с которым указанный полипептид образовал комплекс. То есть, GPCR, входящий в состав указанного белкового комплекса, не ограничен адренергическим рецептором, но также может представлять собой допаминовый рецептор, мускариновый рецептор или эндотелиновый рецептор. Кроме того, специалист в данной области может легко получить, из общедоступных баз данных, информацию о последовательности GPCR, к которому относится настоящее изобретение, и поэтому может легко получить желаемый белковый комплекс, на основе информации из описания настоящего изобретения и известных общих методических принципов.
2. Липидная мембрана, содержащая белковый комплекс.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения белкового комплекса GPCR и определенного полипептида. Способ получения белкового комплекса GPCR и определенного полипептида согласно настоящему изобретению характеризуется стадией осуществления совместного присутствия GPCR и определенного белка на липидной мембране. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает липидную мембрану, содержащую белковый комплекс, и способ ее получения.
Липидная мембрана согласно настоящему изобретению характеризуется содержанием белкового комплекса, описанного выше. Липидная мембрана согласно настоящему изобретению может представлять собой природную липидную мембрану или искусственной липидной мембраной. В тех случаях, когда мембрана представляет собой природную липидную мембрану, подразумевается, что мембрана является биологической мембраной. В тех случаях, когда мембрана представляет собой искусственную липидную мембрану, подразумевается, что мембрана представляет собой плоскую липидную мембрану или липосому.
В одном аспекте настоящего изобретения, липидная мембрана может представлять собой биологическую мембрану трансформанта, в который включен полинуклеотид, кодирующий полипептид, входящий в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению. Такой трансформант можно получить посредством введения в живой организм вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, таким образом, что полипептид экспрессируется в виде биологической мембраны. Следует отметить, что живой организм, который используют в качестве трансформанта, может представлять собой прокариотный или эукариотный организм.
В другом аспекте настоящего изобретения, липидная мембрана может представлять собой липидный бислой, содержащий полипептид, который входит в состав белкового комплекса согласно настоящему изобретению. Липидный бислой представляет собой мембранную структуру, состоящую из двух слоев полярных липидов (в частности, фосфолипидов). Структура липидного бислоя стабилизирована в виде двумерной структуры, если она принимает вид сферы, но она может являться плоской структурой, если ее концы изолированы от молекул воды. При использовании в настоящем описании термином «липосома» обозначается сферический липидный бислой, созданный искусственно, и термин «липидная плоская мембрана» означает плоский липидный бислой, созданный искусственно. В данной области искусственный липидный бислой используют при измерениях активности мембранных белков in vitro (например, белков каналов). Т.о., специалист в данной области может легко получить липидную плоскую мембрану и сделать так, чтобы указанная плоская липидная мембрана удерживала интересующий белок (полипептид). Дополнительно, липосома представляет собой искусственную липидную мембрану, которую также обозначают термином «везикула», и ее можно получить посредством взбивания суспензии липидов (например, фосфолипидов) и последующей обработки их ультразвуком. В этой области, широко известны работы с липосомами в качестве моделей клеточных мембран и способов доставки лекарств (DDS). Таким образом, специалист в данной области может легко получить липосому и заставить липосому удерживать интересующий белок (полипептид).
В одном варианте реализации, настоящее изобретение обеспечивает липидную мембрану, содержащую α1L-подтип адренэргического рецептора. Как описано выше, α1L-подтип адренэргического рецептора представляет собой белковый комплекс молекулы α1A-подтипа и белка CRELD1α. Как α1A-подтип адренэргического рецептора, так и CRELD1α оба являются мембранно связанными белками и, как описано выше, их взаимодействие друг с другом нарушается при гомогенизации (разрушении мембраны). То есть, их взаимодействие друг с другом выражается в размещении и сохранении их обоих на липидной мембране.
В тех случаях, когда липидная мембрана согласно данному варианту реализации настоящего изобретения является биологической мембраной, способ получения липидной мембраны согласно такому варианту реализации может также представлять собой способ получения трансформанта, экспрессирющего α1L-подтип адренэргического рецептора, и который необходимо только дополнить стадией совместной экспрессии белка α1A-адренэргического рецептора и белка CRELD1α. Информация о последовательности α1A-подтипа адренэргического рецептора доступна через номер доступа NCBI - No. U03866 или NM_000680 и, в настоящем описании, представлена как SEQ ID NO:3 (последовательность аминокислот) и SEQ ID NO; 4 (последовательность нуклеотидов). То есть, необходимо только, чтобы способ получения белкового комплекса согласно настоящему варианту реализации включал стадию трансформации хозяина вектором, содержащим полинуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2, и вектором, содержащим полинуклеотид, состоящий из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:4.
Предпочтительно, чтобы каждый из указанных векторов представлял собой вектор экспрессии, включающий представляющий интерес полинуклеотид, функционально связанный с ним. В настоящем описании термин "функционально связанный" означает, что полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес пептид (или белок), находится под контролем контрольного участка, например промотора, и находится в такой форме, что пептид (или белок) может экспрессироваться в клетке - хозяине. Способ получения желаемого вектора с помощью «функционального связывания» полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес пептид, с вектором экспрессии хорошо известен в данной области техники. Кроме того, способ введения вектора экспрессии в клетку-хозяина также хорошо известен в данной области. Поэтому специалист в данной области может с легкостью создать желаемый пептид в хозяине.
При использовании в настоящем описании термин «трансформант» означает не только клетку, ткань или орган, но также и отдельный живой организм. К примерам живых организмов, служащих объектами трансформации, относятся, но не ограничены ими, различные микроорганизмы, растения и животные. Следует отметить, что необходимо только ввести в трансформант по крайней мере полинуклеотид, кодирующий полипептид, образующий белковый комплекс согласно настоящему изобретению и нужно, чтобы указанный трансформант экспрессировал такие полипептиды. То есть, следует отметить, что трансформант, полученный с применением других средств, отличных от вектора экспрессии, также входит в область охвата настоящего изобретения. Дополнительно, несмотря на то, что предпочтительно, чтобы в трансформанте согласно настоящему изобретению стабильно экспрессировался полипептид, образующий белковый комплекс согласно настоящему изобретению, представляющий интерес полипептид может экспрессироваться временно. Следует отметить, что использование трансформанта совместно с белковым комплексом согласно данному варианту реализации изобретения позволяет провести скрининг агонистов или антагонистов указанного комплекса, изучая поведение вторичного посредника в клетке хозяина.
В тех случаях, когда липидная мембрана согласно данному варианту реализации настоящего изобретения является искусственной мембраной, способ получения липидной мембраны согласно такому варианту реализации также может представлять собой способ получения планарной липидной мембраны или липосомы, содержащей α1L-подтип адренэргического рецептора и, в частности, необходимо только, чтобы он включал стадию распределения белка α1A-адренэргического рецептора и белка CRELD1α на искусственной плоской мембране. С помощью общих принципов в данной области специалист в данной области может с легкостью перераспределить мембранный белок на искусственной липидной мембране. Применение искусственной липидной мембраны, существующей совместно с белковым комплексом согласно настоящему варианту реализации, позволяет измерить сродство комплекса к лиганду.
3. Применение липидной мембраны.
Специалисту в данной области будет очевидно, что приведенный выше способ получения липидной мембраны может представлять собой как способ получения белкового комплекса, так и способ изменения сродства к лиганду GPCR. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ изменения сродства GPCR к его лигандам.
Дополнительно, применение липидной мембраны согласно настоящему изобретению позволяет провести скрининг агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду. То есть, настоящее изобретение обеспечивает способ скрининга агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду.
Способ скрининга согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии получения белкового комплекса, описанного выше, на липидной мембране; и инкубации белкового комплекса вместе с исследуемым фактором. В настоящем описании термин «инкубация» означает осуществление совместного нахождения множества веществ и приведение их в такое состояние, что они могут в достаточной степени контактировать друг с другом.
В предпочтительном варианте реализации, способ скрининга согласно настоящему изобретению включает стадию инкубации совместно с исследуемым фактором-кандидатом, трансформанта, содержащего интересующий GPCR (например, клетки, в которой экспрессируется α1L-подтип адренэргического рецептора). Способ скрининга согласно указанному варианту реализации настоящего изобретения позволяет провести скрининг агонистов или антагонистов, представляющих интерес GPCR (например, адренэргического рецептораα1L-подтипа) с помощью измерения изменений вторичного посредника в клетке (например, количества цАМФ в тех случаях, когда G - белок представляет собой Gs или Gi белок, или концентрации инозинтрифосфата и Ca2+ в тех случаях, когда G -белок является Gq - белком).
Агонисты адренэргического рецептора α1L-подтипа можно использовать в качестве лекарственного средства против недержания мочи, в качестве мидриатического средства, лекарства от глаукомы и для стимуляции центральной нервной системы. Антагонисты адренэргического рецептора α1L-подтипа можно использовать в качестве лекарственного средства против расстройств мочеполовой системы, против болезни Рейно, против нарушения микроциркуляции, в качестве гипотензивного средства, депрессанта центральной нервной системы, средства для улучшения почечного кровотока, диуретического лекарственного средства. Далее, поскольку известно, что β1L-подтип адренэргического рецептора связан с болезнями сердца, и известно, что допаминовый D2 рецептор и мускариновый рецептор связаны с болезнями центральной нервной системы, агонисты или антагонисты этих рецепторов также могут быть полезны.
4. Клетки с «нокдауном» и их применение.
Настоящее изобретение также обеспечивает трансформант, в котором экспрессия полипептида, который образует белковый комплекс с GPCR, была нарушена (нокдаун), и способ его получения. Способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению характеризуется присутствием стадии ингибирования экспрессии эндогенного полипептида.
Например, белок CRELD1α, который является полипептидом, который образует комплекс с GPCR, экспрессируется в различных клетках. Поэтому, трансформант, в котором подавлена экспрессия эндогенного белка CRELD1α, является очень полезным в качестве контроля клеток, который используют для анализа функции белкового комплекса или скрининга целевого соединения (например, агониста или антагониста). Клетку с нокдауном, описанную в этом разделе, можно использовать отдельно, но предпочтительно использовать ее в сочетании с описанным выше белковым комплексом или описанной выше липидной мембраной, содержащей комплекс. Следует отметить, что GPCR, который экспрессируется в целевой клетке, может быть эндогенным или экзогенным.
В одном своем аспекте, настоящее изобретение может включать стадию подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1α в клетке, в которой экспрессировался GPCR. Это позволяет изменить сродство к лиганду GPCR, который экспрессируется в клетке. Таким образом, способ получения трансформанта согласно настоящему изобретению может представлять собой способ получения трансформанта, экспрессирующего GPCR с измененным сродством к лиганду и способ изменения сродства GPCR к его лиганду. В одном варианте реализации, настоящее изобретение может включать стадию подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1α в клетке, в которой экспрессируется α1L-подтип адренэргического рецептора. Это позволяет превратить клетку, проявляющую фенотип α1L-подтипа, в клетку, проявляющую фенотип α1A-подтипа. Предпочтительно, в качестве способа подавления экспрессии эндогенного белка CRELD1α используют способ РНК-интерференции. Способ РНК-интерференции представляет собой хорошо известный в данной области способ, например, экспрессию эндогенного белка CRELD1α можно успешно ингибировать посредством введения в интересующую клетку олигонуклеотида, состоящего из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:5. В том случае, когда для введения в интересующую клетку олигонуклеотида, состоящего из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:5, применяют вектор предпочтительно, чтобы в качестве антисмысловой последовательности использовали олигонуклеотид, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:6 без каких-либо ограничений.
Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает способ, который характеризуется использованием описанного выше трансформанта, для скрининга агониста или антагониста GPCR с измененным сродством к лиганду.
Настоящее изобретение не ограничивается описанием приведенных вариантов реализации, но может быть изменено специалистом в данной области в пределах формулы изобретения. Вариант реализации, основанный на правильном сочетании технических средств, раскрытых вариантов реализации включен в область охвата настоящего изобретения.
Вся академическая и патентная литература, размещенная здесь, включена посредством ссылки на настоящее описание.
Примеры
1. Структуры.
Ген α1А-адренэргического рецептора человека (ADRA1A) клонировали из библиотеки простаты человека с помощью метода ПЦР. Клонированный ген имеет общую длину 1465 п.н. и последовательность открытой рамки считывания (ОРС), которая идеально соответствует последовательности открытой рамки считывания гена α1А человека (NCBI номер доступа U03866 или NM_000680), о чем сообщали ранее. Дополнительно, последовательности, находящиеся до и после последовательности ОРС, совпадали с последовательностями, о которых сообщали Hirasawa et al. (1993).
Ген CRELD1α клонировали из библиотеки кДНК простаты человека. В результате определения последовательности клонированный ген совпадал с последовательностью, о который сообщали Rupp et al. (2002) (NCBI номер доступа NM_015513).
Затем кодирующий район гена ADRA1A субклонировали по сайту рестрикции EcoRI мультиклонального сайта A pIRES (Clonetech, каталожный номер РТ3266-5). Дополнительно, кодирующий участок CRELD1α субклонировали по сайту рестрикции Xbal мультиклонального сайта В pIRES. В целях субклонирования, к каждому концу каждого гена добавляли адаптер фермента рестрикции.
2. Получение трансформанта.
Вектор амплифицировали/очистили традиционным способом и затем провели трансфекцию клеток СНО-К1, которые представляют собой клетки яичника китайского хомячка, с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation) согласно протоколу изготовителя. Через 2 дня после трансфекции, в питательную среду DMEM добавили 1200 мкг/мл антибиотика Генетицина (G418). Клетки, которые не трансфицировали вектором, т.е. клетки, которые обработали так же Lipofectamine 2000 и т.п., и вектор не добавляли, погибали при концентрации G418 1000 мкг/мл. С418-устойчивые клетки разбавляли, суспендировали и распределяли по 96-луночному планшету так, что в среднем на лунку приходилось 0.5 клетки и затем отбирали отдельные колонии. Эту операцию повторяли трижды, в результате чего получили стабильный клон клеток (α1L клеток), в которых одновременно экспрессировался ген ADRA1A и ген CREDL1α. Далее, в качестве контрольной группы получили клетки, в которых стабильно экспрессировался только ген ADRA1A (α1A клетки), и клетки, в которых стабильно экспрессировался только ген CREDL1α (CREDL1α клетки).
3. Опыт по связыванию.
Препаратами, использованными в экспериментах по связыванию, и их правильными химическими названиями являются: силодозин, празозин, тамсулозин, RS-17053 (N-[2-(2-циклопропилметоксифенокси) этил)-5-хлор-α,α-диметил-1Н-индол-3-этанамин гидрохлорид), BMY 7378 (8-[2-[4-(2-метоксифенил)-1-пиперазинил]этил]8-ааспиро[4,5]декан7,9-дион дигидрохлорид).
Стабильный клон изучали с помощью способа фармакологического связывания с [3Н]-силодозином, который является радиолигандом. Эксперимент проводили с использованием способа связывания с целыми клетками. Иначе говоря, за 2-3 дня до эксперимента клетки рассеяли по поверхности для получения конфлюентности 50%, дважды отмыли ледяным PBS и затем соскребли скребком. Клетки, собранные таким образом, повторно суспендировали в растворе Krebs-HEPES и затем инкубировали при 4°С в течение 4 часов вместе с [3H]-силодозином и другим лекарством по мере необходимости. После этого клетки фильтровали/отмывали на фильтре Whatmann GC/F, предварительно обработанном полиэтиленомимином и измеряли радиоактивность с помощью жидкого сцинтилляционного счетчика. Неспецифичное связывание оценивали как связывание в присутствии 30 мкМ фенотоламина.
[А] Эксперименты по связыванию и насыщению согласно цельноклеточному способу.
Исследовали связывание [3H]-силодозина в различных концентрациях (30-1000 нМ) с клетками α1L (Фиг.1). На Фиг.1 изображена кривая насыщения-связывания, полученная с помощью способа анализа связывания с целыми клетками. Специфичное связывание [3H]-силодозина с α1L клетками демонстрирует максимальное связанное количество (Bmax) 134 фмоль/мг белка и значение Kd 843 пМ
(pKD=9.1).
[Б] Эксперимент по конкурентному связыванию.
Известно, что силодозин селективно с высоким сродством связывается с подтипами α1A- и α1L. Термин "высокое сродство" здесь означает, что Kd равна или меньше 1 нМ. Для того чтобы определить фармакологические свойства рецепторов, экспрессируемых на клетках α1L, проводили эксперименты по конкурентному связыванию с празозином в концентрации 300 пМ по сайтам связывания [3H]-силодозина с помощью способа анализа связывания с целыми клетками. В качестве контрольной клеточной линии использовали она клетки. Показано, что [3H]-силодозин является селективным антагонистом для обоих подтипов α1A- и α1L.
Как показано на конкурентной кривой на Фиг.2(а), большинство (88% или выше) рецепторов α1L клеток демонстрируют низкую чувствительность к празозину (pKi=7.6). Дополнительно, аналогично рецепторы имеют низкую чувствительность к RS-17053 и обладают высокой чувствительностью к тамсулозину. Кроме того, рецепторы α1L клеток демонстрируют только низкую чувствительность к BMY 7378 (Таблица 2). С другой стороны, чувствительность (значения pKi) α1A клеток, использованных в качестве контрольной группы, к празозину (Фиг.2), тамсулозину и RS-17053 достигает 9.5, 9.9 и 8.8, соответственно, что соответствует свойствам α1A, о которых сообщалось ранее (таблица 2).
[Таблица 2] | |||
Фармакологические свойства α1L-адренергических рецепторов в двух клеточных линиях и предстательной железе человека | |||
Лекарство | α1L клетки | α1A клетки | Предстательная железа человека |
[3H]-силодозин | 9.1 | 9.7 | 9.5 |
(pKD) | |||
Празозин | 7.6 | 9.5 | 8.3 |
Тамсулозин | 9.3 | 9.9 | 10.0 |
RS-17053 | <6.0 | 8.8 | 6.6 |
BMY 7378 | <6.0 | 6.5 | 5.9 |
В этой таблице константы ингибирования (Ki) конкурентных лекарственных средств по сайтам связывания [3H]-силодозина на α1L клетках, α1L клетки, и фрагменты ткани простаты человека приведены в виде logKi (pKi). Однако величина [3H]-силодозина показывает величину pKD (константа равновесия диссоциации), рассчитанную из кривой связывания насыщения. Величина представляет собой среднее для трех-четырех примеров.
Далее, Фиг.2(b) иллюстрирует результаты, полученные при исследовании чувствительности к празозину в гомогенатах α1L клеток и гомогенатах α1A клеток. Гомогенаты α1L клеток демонстрируют такую же высокую чувствительность к празозину, что и α1A клетки. Это хорошо соотносится с тем, что α1L рецепторы в простате и мозге разрушаются при гомогенизации тканей, и с тем, что фармакологический профиль меняется на α1A фенотип.
Данные по сродству различных лекарственных средств к α1-адренергическим рецепторам α1L и α1A клеток и простаты человека обобщены в таблице 2. α1L клетки, в которых одновременно экспрессируется ген ADRA1A и ген CRELD1α, отличаются по свойствам рецепторов от α1A рецепторов и по фармакологическим свойствам хорошо соотносятся с α1L рецепторами, о присутствии которых в простате человека и т.п. сообщали. Таким образом, считается, что в отличие от α1A клеток, α1L клетки являются клеточной линией, которая экспрессирует преимущественно α1L рецепторы.
4. Эксперимент по определению концентрации внутриклеточного Са2+.
Далее, для того чтобы полностью избавиться от влияния CRELD1α, которые могли эндогенно экспрессироваться в α1A клетках, применили способ РНК-интерференции для получения клеток, в которых экспрессия CRELD1α была полностью подавлена (такие клетки далее обозначают термином "KD клетки"). Для того чтобы подавить экспрессию гена с помощью способа РНК-интерференции, создали вектор посредством вставки олигонуклеотида (смысловая последовательность;
GATCCAGGCGACTTAGTGTTCACCTTCAAGAGAGGTGAACACTAAGTCG ССТТТА: SEQ ID NO:5, антисмысловая последовательность;
AGCTTAAAGGCGACTTAGTGTTCACCTCTCTTGAAGGTGAACACTAAGTC GCCTG: SEQ ID NO:6), содержавшего кодирующий участок мРНК CRELDIa китайского хомячка, в коммерчески доступный pSilencer™ 4.1-CMV hygro (Ambion, Inc.) согласно инструкциям изготовителя, и затем трансфицировали α1A клетки таким же способом, как описанный выше. Ответ Са2+ на норадреналин в KD клетках изучали с помощью флуоресцентного фотометрического способа с использованием Рига-2, который является флуоресцентным красителем. Значение рЕС50 Са2+ ответа на норадреналин в KD клетках составило 7.9. С другой стороны, когда клетки заранее обрабатывали празозином 10-8 М в течение 2 минут, дозозависимая кривая ответа Ca2+ на норадреналин смещалась вправо, и значение pKD оказалось равно 9.3. Это показывает, что ответ Ca2+ на норадреналин в KD клетках соответствует свойствам α1A-подтипа.
Таким образом, когда экспрессию эндогенного CRELD1α в СНО клетках, в которых экспрессировался ген α1A-подтипа, подавляли с помощью способа РНК-интерференции, идеально проявлялись свойства α1A рецептора. Следует отметить, что проводили некоторые эксперименты, в которых функции рецептора α1A-подтипа, например ответ Са2+, исследовали с использованием СНО клеток, в которых экспрессировался ген рецептора. Однако, не всегда было соответствие в свойствах рецептора, полученных в результате этих экспериментов.
Применение настоящего изобретения делает возможным определить GPCR, природа которых оставалась неизвестной, и таким образом, обеспечить лечение любого заболевания, связанного с данным рецептором, и также делает возможным изменить сродство GPCR к лиганду.
Варианты реализации и конкретные примеры выполнения настоящего изобретения, рассмотренные в предыдущем подробном объяснении, служат исключительно для иллюстрации технических подробностей настоящего изобретения, которое не должно быть узко истолковано в пределах таких вариантов реализации и конкретных примеров, но может быть применено в различных вариациях в пределах духа настоящего изобретения, при условии, что эти вариации не выходят за пределы формулы изобретения, приведенной ниже.
Промышленное применение
Известно, что α1L-AR является функциональным рецептором и главной мишенью для многих лекарственных средств системы нижних мочевыводящих путей. Поэтому, представленные клетки, экспрессирующие α1L-AR, созданные авторами настоящего изобретения, следует считать очень полезными для разработки лекарственных средств для лечения нарушения функций мочевых путей у пациентов с доброкачественной гиперплазией простаты и недержанием мочи. Дополнительно, клетки, экспрессирующие α1L-AR, следует считать очень полезными для применения в способе скрининга лекарственных средств для лечения любых заболеваний, связанных с α1L-AR.
Claims (12)
1. Белковый комплекс, обладающий сродством GPCRα1L к лиганду, включающий GPCRα1A, и полипептид, причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;
или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;
или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
2. Трансформированная клетка, экспрессирующая белковый комплекс по п.1, причем указанная клетка содержит:
(i) первый вектор, содержащий первый полинуклеотид, который кодирует GPCRα1A, и второй вектор, содержащий второй полинуклеотид, который кодирует пептид; или
(ii) третий вектор, включающий первый полинуклеотид, который кодирует GPCRα1A, и второй полинуклеотид, который кодирует пептид,
где указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;
или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
(i) первый вектор, содержащий первый полинуклеотид, который кодирует GPCRα1A, и второй вектор, содержащий второй полинуклеотид, который кодирует пептид; или
(ii) третий вектор, включающий первый полинуклеотид, который кодирует GPCRα1A, и второй полинуклеотид, который кодирует пептид,
где указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:1;
или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
3. Способ получения трансформированной клетки по п.2, включающий стадию совместной экспрессии GPCRα1A и полипептида в изолированной клетке, причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет
последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет
последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
4. Способ изменения сродства GPCRα1A к лиганду, включающий стадию экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRα1A, причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет
последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(3) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет
последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
5. Способ скрининга агониста или антагониста GPCRα1L, включающий стадии:
одновременной экспрессии в изолированной клетке GPCRα1A и полипептида с образованием GPCRα1L; и
инкубации клетки, экспрессирующей GPCRα1L с исследуемым фактором, и дополнительно включающий стадии:
измерения внутриклеточной концентрации Са2+ или метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRα1L, перед стадией инкубации или после нее;
и
определения того, является исследуемый фактор агонистом или
антагонистом GPCRα1L, причем
исследуемый фактор признают агонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, и исследуемый фактор признают антагонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, причем измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCRα1L,
где указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
одновременной экспрессии в изолированной клетке GPCRα1A и полипептида с образованием GPCRα1L; и
инкубации клетки, экспрессирующей GPCRα1L с исследуемым фактором, и дополнительно включающий стадии:
измерения внутриклеточной концентрации Са2+ или метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRα1L, перед стадией инкубации или после нее;
и
определения того, является исследуемый фактор агонистом или
антагонистом GPCRα1L, причем
исследуемый фактор признают агонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, и исследуемый фактор признают антагонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до стадии инкубации, причем измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCRα1L,
где указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
6. Способ получения трансформированной клетки, экспрессирующей GPCRα1A, включающий стадию подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRα1L,
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой эндогенный белок.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что стадию подавления экспрессии полипептида осуществляют способом РНК-интерференции.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что способ РНК-интерференции осуществляют посредством вставки олигонуклеотида, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:5.
10. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная изолированная клетка представляет собой трансформированную клетку, экспрессирующую экзогенный GPCRα1L.
11. Способ изменения сродства GPCRα1L к лиганду, включающий стадию подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRα1L,
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
12. Способ скрининга агониста или антагониста GPCRα1A, включающий стадии:
подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRα1L с образованием GPCRα1A; и
инкубации указанной клетки, экспрессирующей GPCRα1A,
совместно с исследуемым фактором,
и дополнительно включающий стадии:
измерения внутриклеточных концентраций Cа2+ или
метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRα1A, перед стадией инкубации и после нее; и
определения того, является исследуемый фактор агонистом или антагонистом GPCRα1A, причем
исследуемый фактор признают агонистом GPCRα1A, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до инкубации, и
исследуемый фактор признают антагонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до инкубации, при условии, что измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCRα1A,
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
подавления экспрессии полипептида в изолированной клетке, в которой экспрессируется GPCRα1L с образованием GPCRα1A; и
инкубации указанной клетки, экспрессирующей GPCRα1A,
совместно с исследуемым фактором,
и дополнительно включающий стадии:
измерения внутриклеточных концентраций Cа2+ или
метаболизма внутриклеточного инозитолфосфата в клетке, экспрессирующей GPCRα1A, перед стадией инкубации и после нее; и
определения того, является исследуемый фактор агонистом или антагонистом GPCRα1A, причем
исследуемый фактор признают агонистом GPCRα1A, если значение, полученное в результате измерения после стадии инкубации, выше значения, полученного в результате измерения до инкубации, и
исследуемый фактор признают антагонистом GPCRα1L, если значение, полученное в результате измерения после инкубации, не отличается от значения, полученного в результате измерения до инкубации, при условии, что измерение, осуществляемое после стадии инкубации, проводят в присутствии агониста GPCRα1A,
причем указанный полипептид представляет собой:
(1) полипептид, который имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1; или
(2) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007137275 | 2007-05-23 | ||
JP2007-137275 | 2007-05-23 | ||
PCT/JP2008/059459 WO2008146707A1 (ja) | 2007-05-23 | 2008-05-22 | リガンド親和性が改変されたgタンパク質共役型受容体およびその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009144799A RU2009144799A (ru) | 2011-06-27 |
RU2468035C2 true RU2468035C2 (ru) | 2012-11-27 |
Family
ID=40074960
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009144799/10A RU2468035C2 (ru) | 2007-05-23 | 2008-05-22 | Сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство к лигандам, и его применение |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8173378B2 (ru) |
EP (1) | EP2154154A4 (ru) |
JP (2) | JP4824815B2 (ru) |
KR (1) | KR20100017666A (ru) |
CN (1) | CN101679500B (ru) |
AU (1) | AU2008255927B2 (ru) |
CA (1) | CA2687908A1 (ru) |
RU (1) | RU2468035C2 (ru) |
WO (1) | WO2008146707A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2010207880B2 (en) * | 2009-01-29 | 2012-03-29 | Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation | Measuring G protein coupled receptor activation |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2260805C2 (ru) * | 2001-03-06 | 2005-09-20 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Способы идентификации соединений для регуляции мышечной массы или функции с применением рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина |
US20060019256A1 (en) * | 2003-06-09 | 2006-01-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1734051A3 (en) * | 1998-12-01 | 2007-09-12 | Genetech, Inc. | Composition and methods for the diagnosis of tumours |
-
2008
- 2008-05-22 US US12/451,558 patent/US8173378B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-05-22 RU RU2009144799/10A patent/RU2468035C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-05-22 KR KR1020097025467A patent/KR20100017666A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-05-22 EP EP08753090A patent/EP2154154A4/en not_active Withdrawn
- 2008-05-22 CA CA002687908A patent/CA2687908A1/en not_active Abandoned
- 2008-05-22 JP JP2009516280A patent/JP4824815B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-05-22 AU AU2008255927A patent/AU2008255927B2/en not_active Ceased
- 2008-05-22 CN CN2008800163976A patent/CN101679500B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-05-22 WO PCT/JP2008/059459 patent/WO2008146707A1/ja active Application Filing
-
2011
- 2011-09-08 JP JP2011196565A patent/JP5363543B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-04-12 US US13/445,358 patent/US20130149715A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2260805C2 (ru) * | 2001-03-06 | 2005-09-20 | Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани | Способы идентификации соединений для регуляции мышечной массы или функции с применением рецепторов рилизинг-фактора кортикотропина |
US20060019256A1 (en) * | 2003-06-09 | 2006-01-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
FOERSTER K. ET AL., Cardioprotection specific for the G protein Gi2 in chronic adrenergic signaling through beta2-adrenoceptors, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERI No.24, p.14475-14480. * |
FORD ANTHONY P. D. W. ET AL., Pharmacological pleiotropism of the human recombinant alpha-1A-adrenoceptor: Implications for alpha-1-adrenoceptor classification, BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLO No.6, p.1127-1135. * |
LI M. ET AL., Modulation of dopamine D2 receptor signaling by actin-binding protein (ABP-280), MOLECULAR PHARMACOLO No.3, p.446-452. * |
MCLATCHIE L.M. ET AL., RAMPS REGULATE THE TRANSPORT AND LIGAND SPECIFICITY OF THE CALCITONIN-RECEPTOR-LIKE RECEPTOR, NATU p.333-339. * |
XU JIANGUO ET AL., Heterodimerization of alpha2A- and betal-adrenergic receptors, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMIST No.l2, p.10770-10777. * |
XU JIANGUO ET AL., Heterodimerization of alpha2A- and betal-adrenergic receptors, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2003, v.278, №l2, p.10770-10777. LI M. ET AL., Modulation of dopamine D2 receptor signaling by actin-binding protein (ABP-280), MOLECULAR PHARMACOLOGY, 2000, v.57, №3, p.446-452. MCLATCHIE L.M. ET AL., RAMPS REGULATE THE TRANSPORT AND LIGAND SPECIFICITY OF THE CALCITONIN-RECEPTOR-LIKE RECEPTOR, NATURE, 1998, v.393, p.333-339. FORD ANTHONY P. D. W. ET AL., Pharmacological pleiotropism of the human recombinant alpha-1A-adrenoceptor: Implications for alpha-1-adrenoceptor classification, BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY, 1997, v.121, №6, p.1127-1135. FOERSTER K. ET AL., Cardioprotection specific for the G protein Gi2 in chronic adrenergic signaling through beta2-adrenoceptors, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 2003, v.100, №24, p.14475-14480. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130149715A1 (en) | 2013-06-13 |
JPWO2008146707A1 (ja) | 2010-08-19 |
WO2008146707A1 (ja) | 2008-12-04 |
KR20100017666A (ko) | 2010-02-16 |
CN101679500A (zh) | 2010-03-24 |
CN101679500B (zh) | 2013-05-15 |
JP4824815B2 (ja) | 2011-11-30 |
EP2154154A4 (en) | 2010-10-27 |
RU2009144799A (ru) | 2011-06-27 |
US8173378B2 (en) | 2012-05-08 |
AU2008255927B2 (en) | 2012-12-13 |
AU2008255927A1 (en) | 2008-12-04 |
US20100120068A1 (en) | 2010-05-13 |
CA2687908A1 (en) | 2008-12-04 |
JP2012036193A (ja) | 2012-02-23 |
EP2154154A1 (en) | 2010-02-17 |
JP5363543B2 (ja) | 2013-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Steinberg | The molecular basis for distinct β-adrenergic receptor subtype actions in cardiomyocytes | |
Pierce et al. | Classical and new roles of β-arrestins in the regulation of G-protein-coupled receptors | |
Leo et al. | Taar1-mediated modulation of presynaptic dopaminergic neurotransmission: role of D2 dopamine autoreceptors | |
Johnson et al. | The HSPGs Syndecan and Dallylike bind the receptor phosphatase LAR and exert distinct effects on synaptic development | |
Stallaert et al. | Purinergic receptor transactivation by the β2-adrenergic receptor increases intracellular Ca2+ in nonexcitable cells | |
Ji et al. | Epidermal growth factor signaling and mitogenesis in Plcg1 null mouse embryonic fibroblasts | |
Ohta et al. | B96Bom encodes a Bombyx mori tyramine receptor negatively coupled to adenylate cyclase | |
Ageta-Ishihara et al. | Control of cortical axon elongation by a GABA-driven Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase cascade | |
Bulley et al. | Arterial smooth muscle cell PKD2 (TRPP1) channels regulate systemic blood pressure | |
EP0486619A1 (en) | Method of screening for protein inhibitors and activators | |
Troppmann et al. | Inverse agonist and neutral antagonist actions of synthetic compounds at an insect 5‐HT1 receptor | |
JP2001505779A (ja) | Pyk2関連産物および方法 | |
Lu et al. | Epitope-tagged receptor knock-in mice reveal that differential desensitization of α2-adrenergic responses is because of ligand-selective internalization | |
RU2468035C2 (ru) | Сопряженный с g-белком рецептор, имеющий измененное сродство к лигандам, и его применение | |
US9771592B2 (en) | Methods and compositions for treating or preventing pruritis | |
Deraet et al. | The natural mutation encoding a C terminus-truncated 5-Hydroxytryptamine2B receptor is a gain of proliferative functions | |
Papadopoulos et al. | Modulation of human thrombopoietin receptor conformations uncouples JAK2 V617F-driven activation from cytokine-induced stimulation | |
Derangeon et al. | 5-HT4 and 5-HT2 receptors antagonistically influence gap junctional coupling between rat auricular myocytes | |
Gavi et al. | Insulin-like growth factor-I provokes functional antagonism and internalization of β1-adrenergic receptors | |
Weylie et al. | Phosphatidylinositide 3-kinase is important in late-stage fibroblast growth factor-1-mediated angiogenesis in vivo | |
US20020068361A1 (en) | Methods of evaluating specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases in a ligand independent manner | |
Xiao et al. | “Barcode” and differential effects of GPCR phosphorylation by different GRKs | |
Popp et al. | Stereoselectivity for interactions of agonists and antagonists at mouse, rat and human β3-adrenoceptors | |
Yeh et al. | β-Adrenergic-responsive activation of extracellular signal-regulated protein kinases in salivary cells: role of epidermal growth factor receptor and cAMP | |
Gao et al. | Activation of tyrosine kinase of EGFR induces Gβγ-dependent GRK–EGFR complex formation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140523 |