RU2454458C1 - Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов - Google Patents
Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2454458C1 RU2454458C1 RU2011111257/10A RU2011111257A RU2454458C1 RU 2454458 C1 RU2454458 C1 RU 2454458C1 RU 2011111257/10 A RU2011111257/10 A RU 2011111257/10A RU 2011111257 A RU2011111257 A RU 2011111257A RU 2454458 C1 RU2454458 C1 RU 2454458C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biosensor
- nanoparticles
- bioreceptor
- biosensor electrode
- polysaccharides
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, в частности к способу получения аналитического устройства - биосенсорного электрода, который может быть использован для определения содержания моно- и полисахаридов в углеводсодержащем растительном сырье и промежуточных продуктах на разных стадиях технологического процесса. Биосенсорный электрод изготавливают из платины на основе полипиррола с медиатором. В качестве медиатора используют производное пиррола, содержащее ферроцен. В качестве биорецептора используют фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах Fe3O4. с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбомидом, причем биосенсорный электрод с биорецептором размещают в корпусе из полупроводникового материала с возможностью подключения к цифроаналоговому преобразователю. Изобретение позволяет получить компактные устройства с малым временем отклика и высокой чувствительностью определения. 3 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Биосенсор может быть использован для определения содержания моно- и полисахаридов в углеводсодержащем растительном сырье и промежуточных продуктах на разных стадиях технологического процесса.
Пищевая промышленность нуждается в экспрессных и широко доступных методах анализа ключевых составных частей или продуктов обмена веществ, определяющих степень качества сырья и продукции. Среди ключевых показателей качества продуктов питания и параметров ряда технологических процессов в пищевой промышленности важное место занимает содержание сахаров, этилового спирта и крахмала.
Наиболее распространенными являются физико-химические методы анализа крахмала. Колориметрический метод основан на свойстве крахмала образовывать ярко-окрашенные комплексы с йодом (М.Рихтер, З.Аугустат, Ф.Ширбаум. Избранные методы исследования крахмала. Пер. с нем. М.: «Пищевая промышленность», 1975. - С.122-123). Однако процесс образования полисахарид-йодных комплексов очень специфичен и сильно зависит от внешних условий - температуры, рН, амилозо-амилопектинового соотношения в крахмале.
При применении поляриметрического метода определения крахмала (метод Эверса) необходимо отделять все оптически активные компоненты, например белки (Авдусь П.Б., Сапожникова А.С. Определение качества зерна, муки и крупы. Изд. 2-ое. М.: Колос, 1967. - С.166-169).
Существуют также биохимические способы определения крахмала. Для этих целей используются каскадные ферментативные реакции гидролиза крахмала и определения субстратов в гидролизате, например, основанные на амилоглюкозидаз-гексокиназ-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной или α-амилаз-глюкозидаз-пероксидазной трансформации (Beutler H. Methods of enzymatic activity. - 1984. - V.6. - P.2-10). Данные методы используют спектрофотометрическую детекцию конечного продукта. Однако такие анализы дороги и не могут быть широко использованы в технологических процессах.
Описаны различные биосенсорные подходы для детекции олиго- и полисахаридов. Один из способов заключается в проведении внешнего ферментативного гидролиза образца до глюкозы и определении содержания глюкозы глюкозооксидазным сенсором.
Биосенсор - это устройство, состоящее из биологического активного компонента и компонента, преобразующего аналитический эффект в какой-либо регистрируемый сигнал (световой, звуковой). Биохимический преобразователь, или биотрансдьюсер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а точнее информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры.
В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили электрохимические биосенсоры - устройства, действие которых основано на ферментативном катализе реакции, в которой освобождаются или поглощаются электроны.
Известен патент, описывающий способ непрерывного определения концентрации глюкозы в образцах (см. пат. США № US 2010304399 (A1), МПК G01N 33/53, опубл. 02.12.2010). Техническое решение заключается в создании биосенсора, состоящего из биотрансдьюсера и полисахарида на его поверхности. В этом случае детектирование глюкозы состоит из следующих стадий: получение раствора карбогидрата и белка, причем соединение карбогидрата и белка имеет, по крайней мере, один рецептор, способный связываться с полисахаридами и глюкозой; контакт смеси с биосенсором; детектирование количества соединения карбогидрата с белком, связанного с полисахаридом, с помощью биосенсора, в то время как концентрация глюкозы в образце обратно пропорциональна количеству соединения карбогидрата с белком; регенерация поверхности биосенсора высокой концентрацией раствора глюкозы. К недостаткам предлагаемого технического решения можно отнести нестабильность показаний сенсора во времени и довольно узкий диапазон детекции глюкозы.
Известен также способ стабилизации активности глюкозодегидрогеназы, модифицированной пирроло-хинолин хиноном, в электрохимических биосенсорах на глюкозу (см. пат. США № ZA 200708312 (A), МПК C12Q 1/00 B4, опубл. 26.11.2008). Авторы патента предлагают использовать глюкозодегидрогеназу, модифицированную пирроло-хинолин хиноном в качестве кофактора фермента в электрохимическом биосенсоре. Предлагаемая композиция включает гидрофильные полимеры, аморфный необработанный кремний, буферный раствор, поверхностно-активные вещества и медиаторы. Основные недостатки предлагаемого способа связаны с невозможностью хранения получаемых биосенсоров без потери их работоспособности, а также со сложностью и невысокой технологичностью процесса изготовления биосенсора.
Также известен подход к получению биоэлектрода на основе пероксидазы, иммобилизованной на коллоидном золоте (см. пат. Германия № WO 9424262 (А1), МПК C12M 1/40, опубл. 27.10.1994). В предлагаемом способе биоэлектрод получают из пероксидазы хрена, которую сначала адсорбируют на коллоидном золоте, а затем наносят на проводящую поверхность электрода. Затем добавляют фермент-оксидазу для определения выбранного аналита. Оксидаза, селективная к определенному аналиту, может добавляться к раствору образца в растворимой или иммобилизованной форме. Предлагаемое техническое решение характеризуется таким недостатком, как невозможность получения в ходе анализа достоверных количественных результатов.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее устройство для определения олиго- и полисахаридов с использованием иммобилизованных на носителе клеток штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280 (см. пат. РФ №66815, МПК G01N 27/26, опубл. 27.09.2007). Предлагаемое устройство состоит из следующих элементов: электрода Кларка, на котором размещен биорецептор, представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280, а также измерительной кюветы и магнитной мешалки. Иммобилизацию клеток штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280 осуществляют физической сорбцией на фильтрах из стекловолокна. Биосенсор чувствителен к наличию олигосахаридов - целлобиозы, мальтозы, мелибиозы - и может быть использован для их определения. Основными недостатками предлагаемого технического решения следует считать трудоемкость получения результатов, связанную с использованием микроорганизмов и кювет; узкий диапазон детекции определяемых компонентов; относительно большое время отклика сенсора; узкая субстратная специфичность используемого штамма микроорганизмов.
Задачей технического решения является упрощение процедуры выполнения анализа моно- и полисахаридов, создание портативных биосенсорных устройств, увеличение диапазона детекции компонентов и снижение времени отклика.
Технический результат достигается за счет использования в качестве биорецептора сенсора фермента, иммобилизованного на магнитных наночастицах Fe3O4. Применение нанообъектов позволяет получить компактные устройства с малым временем отклика и высокой чувствительностью определения.
Сущность изобретения заключается в том, что в качестве основы биосенсора используется платиновый электрод на основе полипиррола с медиатором, в качестве которого выступает производное пиррола, содержащее ферроцен. Роль анионного медиатора в данном случае заключается в обеспечении электронного переноса между ферментом и электродом. На первом этапе полипиррол осаждают на платиновую пластинку площадью 6 см2 путем полимеризации пиррола при сканировании потенциала электрода между 0 и 0,9 B при скорости развертки потенциала 50 мВ/с. Последующим добавлением производного пиррола, содержащего ферроцен, в полученное покрытие подготавливается электрод Pt/полипиррол - производное пиррола, содержащее ферроцен.
Биорецептор в данном техническом решении представляет собой фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах Fe3O4 с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбодиимидом. Наночастицы с карбоксильными группами на поверхности получают следующим образом: готовят смесь полиакриловой кислоты, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, нагревают ее при перемешивании в атмосфере азота до 220°C, затем к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 с карбоксильными группами акриловой кислоты отделяют центрифугированием.
Биорецептор (наночастицы Fe3O4 размером 100 нм с иммобилизованным ферментом) фиксируют с помощью специальных магнитов на измерительной поверхности платинового электрода, позволяющего измерять концентрацию образующегося пероксида водорода. Данная конструкция заключена в корпус, изготовленный из полупроводникового материала, и связана с цифроаналоговым преобразователем.
Биосенсор работает следующим образом. Датчик погружается в исследуемый раствор. При помещении биосенсора в анализируемый образец происходит химическая реакция между ферментом и анализируемым компонентом. Реакция происходит с участием кислорода O2 и воды H2O. Одним из конечных продуктов химической реакции является пероксид водорода H2O2.
При подаче 600 мВ на платиновый электрод перекись водорода распадается на 2 протона водорода, 2 электрона и кислород O2. С помощью специального цифроаналогового преобразователя происходит детекция двух образовавшихся электронов (тока). По току можно судить о концентрации компонента в анализируемом растворе, поскольку существует линейная зависимость между образовавшимся током датчика и концентрацией компонента в пробе.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
В случае биосенсора для определения глюкозы в качестве биохимического трансдьюсера используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная на наночастицах Fe3O4 посредством карбодиимида. Иммобилизацию фермента осуществляют путем выполнения следующей последовательности операций.
Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°C, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием.
Вторая стадия иммобилизации заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. В отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°C в течение 60 мин. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение 2 ч при температуре 50°C. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 5,8).
Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.
На следующей стадии растворяют 500 мкг глюкозооксидазы в 500 мкл фосфатного буфера (pH 5,8) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 5,8) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.
Полученный биорецептор высушивают и фиксируют с помощью специальных магнитов на измерительной поверхности платинового электрода, позволяющего измерять концентрацию образующегося пероксида водорода. Данная конструкция заключена в корпус, изготовленный из полупроводникового материала, и связана с цифроаналоговым преобразователем. Физико-химические характеристики биосенсора для определения глюкозы представлены в табл.1.
| Таблица 1 | ||||
| Физико-химические параметры биосенсора для определения глюкозы | ||||
| Способ детекции | Диапазон детекции, мМ | Время анализа, мин | Воспроизводимость сигнала, % | Стабильность при хранении, мес. |
| Предлагаемое техническое решение | 0,01-10,0 | 3-5 | 2,0 | 6 |
| Прототип | 0,05-5,0 | 10-15 | 5,0 | 4 |
Пример 2
Ферментом, используемым при конструировании биосенсора на крахмал, является амилосубтилин Г3х, иммобилизованный на частицах Fe3O4. Иммобилизация осуществляется следующим образом. Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода-этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 6,5).
Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.
На следующей стадии растворяют 500 мкг амилосубтилина Г3х в 500 мкл фосфатного буфера (pH 6,5) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 6,5) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.
Дальнейшие действия по получению биосенсора для определения крахмала аналогичны примеру 1. Физико-химические характеристики биосенсора для определения крахмала представлены в табл.2.
| Таблица 2 | ||||
| Физико-химические параметры биосенсора для определения крахмала | ||||
| Способ детекции | Диапазон детекции, % | Время анализа, мин | Воспроизводимость сигнала, % | Стабильность при хранении, мес. |
| Предлагаемое техническое решение | 0,001-0,5 | 2-3 | 2,0 | 6 |
| Прототип | 0,003-0,05 | 10-15 | 5,0 | 4 |
Пример 3
Роль биохимического трансдьюсера в биосенсоре на целлобиозу играет фермент целлобиаза, иммобилизованная на наночастицах Fe3O4. Иммобилизация фермента включает следующие операции. Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода-этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в фосфатном буфере (pH 5,5).
Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в фосфатном буфере в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл фосфатного буфера.
На следующей стадии растворяют 500 мкг целлобиазы в 500 мкл фосфатного буфера (pH 5,5) и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в фосфатном буфере (pH 5,5) при температуре 30°C в течение 2 ч. По окончании иммобилизации наночастицы промывают фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах.
Дальнейшие действия по получению биосенсора для определения целлобиозы аналогичны примеру 1. Физико-химические характеристики биосенсора для определения целлобиозы представлены в табл.3.
| Таблица 3 | ||||
| Физико-химические параметры биосенсора для определения целлобиозы | ||||
| Способ детекции | Диапазон детекции, мМ | Время анализа, мин | Воспроизводимость сигнала, % | Стабильность при хранении, мес. |
| Предлагаемое техническое решение | 0,01-10,0 | 3-5 | 2,0 | 6 |
| Прототип | 0,05-5,0 | 10-15 | 5,0 | 4 |
Таким образом, предлагаемый биосенсор на основе наночастиц Fe3O4 обеспечивает быстрое определение содержания глюкозы, крахмала и целлобиозы с использованием компактного электрохимического устройства. Можно выделить следующие преимущества данного изобретения перед прототипом:
- увеличение диапазона детекции компонентов;
- уменьшение продолжительности анализа;
- повышение стабильности при хранении.
Claims (1)
- Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов, включающий использование электрода, нанесение на поверхность его биорецептора, отличающийся тем, что биосенсорный электрод выполняют из платины на основе полипиррола с медиатором, в качестве которого выступает производное пиррола, содержащее ферроцен, в качестве биорецептора используют фермент, иммобилизованный на магнитных наночастицах Fе3O4 с поверхностными карбоксильными группами кросс-сшивкой с карбомидом, при этом биосенсорный электрод с распололженным на нем биорецептором размещают в корпусе, изготовленном из полупроводникового материала, с возможностью подключения к цифроаналоговому преобразователю.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011111257/10A RU2454458C1 (ru) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011111257/10A RU2454458C1 (ru) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2454458C1 true RU2454458C1 (ru) | 2012-06-27 |
Family
ID=46681893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011111257/10A RU2454458C1 (ru) | 2011-03-24 | 2011-03-24 | Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2454458C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU66815U1 (ru) * | 2007-03-28 | 2007-09-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Устройство для определения олиго- и полисахаридов |
-
2011
- 2011-03-24 RU RU2011111257/10A patent/RU2454458C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU66815U1 (ru) * | 2007-03-28 | 2007-09-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | Устройство для определения олиго- и полисахаридов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| РИХТЕР М. и др. Избранные методы исследования крахмала. Пер. с нем. - М.: «Пищевая промышленность», 1975, с.122-123. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jędrzak et al. | Bio-inspired magnetite/lignin/polydopamine-glucose oxidase biosensing nanoplatform. From synthesis, via sensing assays to comparison with others glucose testing techniques | |
| Arlyapov et al. | Use of biocompatible redox-active polymers based on carbon nanotubes and modified organic matrices for development of a highly sensitive BOD biosensor | |
| Zhang et al. | Immobilization of uricase on ZnO nanorods for a reagentless uric acid biosensor | |
| Kandimalla et al. | A conductive ormosil encapsulated with ferrocene conjugate and multiwall carbon nanotubes for biosensing application | |
| Yu et al. | Glucose sensor for flow injection analysis of serum glucose based on immobilization of glucose oxidase in titania sol–gel membrane | |
| Wen et al. | Application of a biosensor for monitoring of ethanol | |
| Qiu et al. | A label-free amperometric immunosensor based on biocompatible conductive redox chitosan-ferrocene/gold nanoparticles matrix | |
| Chawla et al. | An amperometric hemoglobin A1c biosensor based on immobilization of fructosyl amino acid oxidase onto zinc oxide nanoparticles–polypyrrole film | |
| Demirkol et al. | Enzyme immobilization in biosensor constructions: self-assembled monolayers of calixarenes containing thiols | |
| JPH08510833A (ja) | ポリマー変態を基礎とするセンサ | |
| CN101216450B (zh) | 用于检测黄曲霉毒素b1的生物传感器电极及其制备方法 | |
| CN110146580A (zh) | 一种基于柿单宁复合纳米材料检测l,5-脱水葡萄糖醇的方法 | |
| Wang et al. | Biocomposite of cobalt phthalocyanine and lactate oxidase for lactate biosensing with MnO2 nanoparticles as an eliminator of ascorbic acid interference | |
| Shams et al. | Application of biosensors in food quality control | |
| Hasanzadeh et al. | Nanosized hydrophobic gels: Advanced supramolecules for use in electrochemical bio-and immunosensing | |
| Akin et al. | Alcohol biosensing by polyamidoamine (PAMAM)/cysteamine/alcohol oxidase‐modified gold electrode | |
| CN119086680A (zh) | 一种检测葡萄糖的低触发电位电化学发光酶生物传感器及其构建方法和应用 | |
| Liang et al. | Silicon-based field-effect glucose biosensor based on reduced graphene oxide-carboxymethyl chitosan-platinum nanocomposite material modified LAPS | |
| CN117723612A (zh) | 一种检测葡萄糖的电化学发光酶生物传感器及其制备方法和应用 | |
| Tulli et al. | Ultrasensitive amperometric biosensing of polyphenols using horseradish peroxidase immobilized in a laponite/Au/DNA-bioinspired polycation nanocomposite | |
| Chen et al. | Amperometric Biosensor for Hydrogen Peroxide Based on Sol‐Gel/Hydrogel Composite Thin Film | |
| Apetrei et al. | Biosensors in food PDO authentication | |
| Song et al. | A novel conductance glucose biosensor in ultra-low ionic strength solution triggered by the oxidation of Ag nanoparticles | |
| RU2454458C1 (ru) | Способ получения биосенсорного электрода для определения моно- и полисахаридов | |
| Wang et al. | Carbon felt-based bioelectrocatalytic flow-through detectors: Highly sensitive amperometric determination of H2O2 based on a direct electrochemistry of covalently modified horseradish peroxidase using cyanuric chloride as a linking agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20121219 |