RU2449290C2 - Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума - Google Patents
Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума Download PDFInfo
- Publication number
- RU2449290C2 RU2449290C2 RU2009129696/15A RU2009129696A RU2449290C2 RU 2449290 C2 RU2449290 C2 RU 2449290C2 RU 2009129696/15 A RU2009129696/15 A RU 2009129696/15A RU 2009129696 A RU2009129696 A RU 2009129696A RU 2449290 C2 RU2449290 C2 RU 2449290C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- diagnosticum
- obtaining
- cultures
- antigens
- antibodies
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии и касается способа получения эритроцитарного антигенного диагностикума. Сущность изобретения включает использование штаммов Е. coli, способных продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, их культивирование с получением культуральной жидкости, инактивацию культур формалином, объединение равных объемов культур с получением комплексного препарата, содержащего 3 вида антигенов, стерилизующую фильтрацию с отделением микробной массы от среды культивирования, разведение антигена фосфатно-буферным раствором pH 7, 2 и сенсибилизацию посредством его соединения в равных объемах с 2,5% формалинизированными эритроцитами барана в течение 2-часов при 37°С. Преимущество изобретения заключается в возможности одновременного определения экзотоксинов 3-х видов. 1 пр., 2 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и иммунологии и может быть использовано в качестве серологического метода выявления в сыворотке крови животных антител к экзотоксинам Escherichia coli - возбудителя эшерихиоза (колибактериоза) сельскохозяйственных животных.
Важным звеном в системе мероприятий по профилактике эшерихиоза является иммунизация животных специфическими вакцинами. При этом установлено, что наиболее эффективными являются те вакцины, которые содержат в своем составе инактивированные экзотоксины возбудителя (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К.Пирожков // Дисс. док. вет. наук. - Москва, 2002, - 298 с.). Однако данные вещества в меньшей степени, чем соматические O-антигены обладают иммунногенной активностью. Поэтому при разработке вакцинных препаратов, дозы и схемы их применения необходимо устанавливать величину выработки специфических антител. В настоящее время общедоступным и простым методом выявления антител к растворимым антигенам является реакция преципитации в агаровом геле (Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическая диагностика. Ч.1. под общей ред. проф. М.Х.Турьянова. М.: КАППА, 1995. - С.90). Однако данная реакция хотя и является специфичной, но не обладает высокой чувствительностью, а самое главное проявляется только через 48 ч.
Известен более чувствительный метод - реакция непрямой гемагглютинации, в которой используются сенсибилизированные эритроциты барана (Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. - М.: Медицина. 1976). Данным методом можно выявлять антитела или антигены уже через 2 ч.
Известен способ получения пастереллезного эритроцитарного диагностикума (патент РФ на изобретение №2110801. - 1995). Данный диагностикум в качестве носителя содержит стабилизированные бараньи эритроциты, а в качестве сенситина - пастереллезную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эпизоотического штамма Pasteurella multocida. Данным диагностикумом выявляется капсульный антиген пастереллы.
Известен способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума (патент РФ на изобретение №2120300. - 1998), заключающийся в сенсибилизаци формалинизированных эритроцитов барана смесью антигенов, экстрагируемых мочевиной из возбудителя иерсиниоза серовариантов 03; 09; 05, 27; 06, 30. Данный диагностикум позволяет выявлять в крови животных и человека антитела сразу к нескольким соматическим O-антигенам иерсиний.
Однако эти диагностикумы разработаны для выявления в сыворотке крови антител только к пастереллам и иерсиниям определенных серотипов.
Известен способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума с использованием в качестве антигена капсульного полисахарида из Escherichia coli при сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана посредством инкубации антигена с формалинизированными эритроцитами в течение 2 часов при 37°C (SU 1072863 A, 15.02.1984, (D2)) - прототип.
Данный диагностикум предназначен для выявления антител к капсульному антигену кишечной палочки, но он не может быть использован для выявления в сыворотке крови животных антител к экзотоксинам Escherichia coli. В доступной научно-технической литературе не обнаружено информации о способе приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к экзотоксинам Escherichia coli.
Техническим решением задачи является обеспечение возможности выявления в сыворотке крови животных антител в экзотоксинам Escherichia coli и расширения диагностических возможностей.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума включает использование штаммов E.coli, способных продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, их культивирование с получением культуральной жидкости, инактивацию культур формалином, объединение равных объемов культур с получением комплексного препарата, содержащего 3 вида антигенов, стерилизующую фильтрацию с отделением микробной массы от среды культивирования, разведение антигена фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и сенсибилизацию посредством его соединения в равных объемах с 2,5% формалинизированными эритроцитами барана в течение 2 часов при 37°C.
Данный диагностикум позволяет определить антитела в сыворотке крови животных сразу к трем токсинам кишечной палочки - термолабильному (TL), термостабильному (TS) и шигаподобному (STX), путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана одновременно смесью растворимых антигенов - инактивированных формалином термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, находящихся в среде культивирования токсигенных Escherichia coli.
Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума включает в себя следующие этапы: 1) получение антигенов; 2) сенсибилизация эритроцитов смесью антигенов.
Пример конкретного осуществления получения эритроцитарного антигенного диагностикума.
1. Для получения антигенов (экзотоксинов) используют токсигенные штаммы Escherichia coli, обладающие способностью продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины. Отобранные штаммы по отдельности засевают в пробирки с 10 мл бульона Хоттингера, после чего их помещают в термостат, где культивируют при 37°C в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Затем полученные культуры переносят в колбы с 200-300 мл бульона Хоттингера и инкубируют при 37°C в течение 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивают. Перед окончанием инкубирования из каждой колбы отбирают по 10 мл культуральной жидкости и используют ее после центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 30 мин для определения наличия токсинов.
Наличие токсинов в культуральной среде определяют с помощью биотеста на инфузориях стилонихиях по Пат. РФ №2262529, а именно по проценту выживания инфузорий. Для этого на предметное стекло наносят 3 капли среды со стилонихиями (суточная культура), проводят с помощью бинокулярной лупы или микроскопа (увеличение 2×8) их предварительный подсчет (для удобства подсчета желательно, чтобы количество живых активных стилонихий составляло 10-20 особей), затем добавляют 1 каплю исследуемой бульонной культуры E.coli. После чего, спустя 5 минут производят предварительный просмотр и подсчет количества живых инфузорий, для того чтобы исключить погрешность, связанную с влиянием различных факторов окружающей среды - запах, перепад температуры, избыточное осмотическое давление и прочее, так как инфузории являются весьма чувствительными к ним. Стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри, которые ставят в термостат с температурой, оптимальной для инфузорий - 18-23°C. Чтобы капли с инфузориями не высыхали, на дно чашки помещают фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. По истечении 2-х часов производят окончательный подсчет числа живых инфузорий, который сравнивают с первоначальным значением. Подсчитывают всех стилонихий (как подвижные, так и не подвижные), погибшими считаются только лизированные. Для получения достоверных данных, каждую пробу культуральной среды токсигенной кишечной палочки исследуют трижды (ставим биотест одновременно на 3 стеклах), затем подсчитывается средний показатель. При наличии в культуральной среде экзотоксина количество погибших инфузорий должно быть не менее 70-80%, в то время как количество погибших инфузорий в контрольной пробе (стерильный питательный бульон), не содержащей токсин, не должно превышать 5%.
При наличии токсинов в оставшиеся культуры добавляют формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводят в течение 14 суток при температуре 37°C с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур объединяют, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий 3 вида антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделяют микробную массу от среды культивирования.
2. Сенсибилизацию эритроцитов осуществляют следующим образом. Антиген разводят фосфатно-буферным раствором (pH 7,2) в соотношении 1:2 и соединяют (сенсибилизируют) в равных объемах с формалинизированными эритроцитами барана, предварительно разведенными тем же буферным раствором до 2,5% концентрации. Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при температуре 37°C. После этого сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин 5-кратным объемом фосфатно-буферным раствором с pH 7,2. Осадок отмытых сенсибилизированных эритроцитов суспензируют в фосфатно-буферном растворе до 10% концентрации и хранят в условиях холодильника.
Контроль сенсибилизации проводят в реакции непрямой гемагглютинации с сыворотками крови кроликов, иммунизированных токсинами кишечной палочки.
Оптимальные условия сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана подобраны опытным путем. Для сенсибилизации эритроцитов лучше использовать антиген в разведении 1:2, т.к. при более сильном разведении (1:4 и выше) чувствительность реакции снижалась в 4-8 раз, а при более меньшем разведении (1:1) чувствительность не изменялась, но требовалось увеличить количество отмываний эритроцитов от остатков антигена. При сокращении времени сенсибилизации эритроцитов наблюдали снижение чувствительности диагностикума, а при увеличении - чувствительность не повышалась.
Полученный таким образом эритроцитарный диагностикум применяют для выявления в реакции непрямой гемагглютинации антител в сыворотке крови животных, иммунизированных инактивированными экзотоксинами (термолабильным, термостабильным и шигаподобным) кишечной палочки.
Результаты определения различными серологическими методами специфических антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных отдельными инактивированными токсинами, представлены в таблице 1. Из материалов данной таблицы видно, что чувствительность реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием приготовленного эритроцитарного антигенного диагностикума в 16 раз превосходит чувствительность реакции диффузной преципитации (РДП) в агаром геле. Методом РНГА с использованием разработанного диагностикума выявляются антитела к термолабильному и шигаподобному токсинам при разведении сыворотки крови 1:128, а к термостабильному токсину - 1:64. Антитела к этим же токсинам в реакции иммуннодиффузии выявлялись только в разведении сыворотки 1:4-1:8.
Таблица 1 | ||
Уровень антитоксических антител у иммунизированных TL-, TS- и STX-анатоксинами кроликов, выявленных методом РНГА (с использованием разработанного диагностикума) и РДП | ||
Титры антител к токсинам E.coli | Титры антител, установленные с помощью | |
РНГА | РДП | |
TL | 1:128 | 1:8 |
TS | 1:64 | 1:4 |
STX | 1:128 | 1:8 |
Аналогичный результат был получен при выявлении поствакцинальных антител при использовании для иммунизации кроликов комплексного препарата (анатоксина), содержащего антигены сразу трех токсинов кишечной палочки. Результаты данного опыта отражены в таблице 2, из данных которой видно, что
Таблица 2 | |||||||||
Выявление антител к токсинам E.coli у иммунизированных комплексным антигеном (содержащим антигены термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов) кроликов | |||||||||
Метод | Разведение сыворотки | ||||||||
1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | |
РНГА | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | +++ | + | - |
РДП | ++++ | ++++ | +++ | - | - | - | - | - | - |
выраженная реакция (4 и 3 креста) гемагглютинации наблюдается до разведения сыворотки крови 1:128, в то время как выраженная зона преципитации образовывалась только при разведении сыворотки крови 1:8, следовательно, с помощью РНГА антитела выявляются в гораздо меньших количествах, чем с помощью РДП, а это значит, что реакция непрямой гемагглютинации более чувствительная.
Таким образом, авторами разработан простой, дешевый и чувствительный диагностикум, позволяющий в течение 2 ч проводить обнаружение специфических (антитоксических) антител после иммунизации животных эшерихиозным анатоксином.
Claims (1)
- Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума, включающий использование штаммов Е. coli, способных продуцировать термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, их культивирование с получением культуральной жидкости, инактивацию культур формалином, объединение равных объемов культур с получением комплексного препарата, содержащего 3 вида антигенов, стерилизующую фильтрацию с отделением микробной массы от среды культивирования, разведение антигена фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и сенсибилизацию посредством его соединения в равных объемах с 2,5% формалинизированными эритроцитами барана в течение 2 ч при 37°C.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009129696/15A RU2449290C2 (ru) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009129696/15A RU2449290C2 (ru) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009129696A RU2009129696A (ru) | 2011-02-10 |
RU2449290C2 true RU2449290C2 (ru) | 2012-04-27 |
Family
ID=46297713
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009129696/15A RU2449290C2 (ru) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2449290C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2764600C1 (ru) * | 2021-03-15 | 2022-01-18 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Вакцина против эшерихиоза телят и поросят |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1072863A1 (ru) * | 1982-11-09 | 1984-02-15 | Московский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток Им.И.И.Мечникова Министерства Здравоохранения Ссср | Способ получени эритроцитарного диагностикума дл вы влени антител к @ @ типа " @ |
RU2212688C1 (ru) * | 2002-07-29 | 2003-09-20 | Томский политехнический университет | Способ определения плотности потока радона с поверхности земли |
RU2240822C2 (ru) * | 2002-07-17 | 2004-11-27 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого |
-
2009
- 2009-08-03 RU RU2009129696/15A patent/RU2449290C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1072863A1 (ru) * | 1982-11-09 | 1984-02-15 | Московский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток Им.И.И.Мечникова Министерства Здравоохранения Ссср | Способ получени эритроцитарного диагностикума дл вы влени антител к @ @ типа " @ |
RU2240822C2 (ru) * | 2002-07-17 | 2004-11-27 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого |
RU2212688C1 (ru) * | 2002-07-29 | 2003-09-20 | Томский политехнический университет | Способ определения плотности потока радона с поверхности земли |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ГАУРОВУЦ Ф. Иммунохимия и биосинтез антител. - М.: Из-во Мир, 1969, с.327. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2764600C1 (ru) * | 2021-03-15 | 2022-01-18 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Вакцина против эшерихиоза телят и поросят |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2009129696A (ru) | 2011-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Craven et al. | Serogroup identification of Neisseria meningitidis: comparison of an antiserum agar method with bacterial slide agglutination | |
EP0098557B1 (en) | Preparation for the diagnosis of chlamydial infections and for the production of chlamydial group-specific antibodies | |
RU2449290C2 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума | |
Genigeorgis et al. | Immunofluorescent Detection of Staphylococcal Enterotoxin B I. Detection in Culture Media | |
Byvalov et al. | Immunochemical activity of the Yersinia pseudotuberculosis B-antigen | |
RU2566555C1 (ru) | ШТАММ Burkholderia cepacia B-7518, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Burkholderia cepacia В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ | |
RU2388489C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
RU2410699C1 (ru) | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену | |
RU2812350C1 (ru) | Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в R-форме | |
CN106771274A (zh) | 牛布鲁氏菌参考血清库 | |
RU2566554C1 (ru) | ШТАММ Stenotrophomonas maltophilia, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Stenotrophomonas maltophilia В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ | |
RU2416429C2 (ru) | Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме | |
RU2627897C1 (ru) | Способ получения антигена для определения противобруцеллезного иммунитета | |
CN108892725A (zh) | 一种e型产气荚膜梭菌抗毒素血清的制备方法 | |
RU2422832C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума | |
Benfield et al. | An indirect fluorescent antibody test for antibodies to transmissible gastroenteritis of swine. | |
CN106526205A (zh) | 羊布鲁氏菌参考血清库 | |
RU2063769C1 (ru) | Способ получения специфической сальмонеллезной поливалентной н-сыворотки для ускоренного выявления сальмонелл в пищевых продуктах, кормах, объектах окружающей среды и клиническом материале | |
RU2301077C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и стрептококкоза нутрий | |
Basak et al. | Investigation on the efficacy of Salmonella bivalent vaccine | |
RU2145353C1 (ru) | Штамм бактерий moraxella bovis "г97-вниви", используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота | |
Nakamura | Inhibition of Entamoeba histolytica in vitro by specific antibody | |
RU2505819C1 (ru) | СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Legionella pneumophila 1,3 И 6 СЕРОГРУПП (ВАРИАНТЫ) | |
Holmes | Type specific antibodies to Streptococcus pyogenes. | |
Fedorchenko et al. | Medical microbiology: guide for preparing for the licensed integrated exam “Krok 1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120319 |