RU2420212C1 - Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn - Google Patents
Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420212C1 RU2420212C1 RU2009145708/13A RU2009145708A RU2420212C1 RU 2420212 C1 RU2420212 C1 RU 2420212C1 RU 2009145708/13 A RU2009145708/13 A RU 2009145708/13A RU 2009145708 A RU2009145708 A RU 2009145708A RU 2420212 C1 RU2420212 C1 RU 2420212C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- sorbent
- peptide
- sea urchin
- carried out
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к медицине и фармакологии, в частности к технологии получения биологически активного вещества, и касается способа выделения из замороженной икры морских ежей средства для поддерживающей терапии, представляющего собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 300 до 3000 Да, которое может быть использовано в медицинской практике для профилактики и коррекции возрастных нарушений функций иммунной системы, головного мозга, сердца, репродуктивной системы.The group of inventions relates to medicine and pharmacology, in particular to a technology for the production of a biologically active substance, and relates to a method for isolating a supportive therapy agent from frozen sea urchin caviar, which is a peptide complex with a molecular weight of its peptide components ranging from 300 to 3000 Da , which can be used in medical practice for the prevention and correction of age-related disorders of the immune system, brain, heart, reproductive system.
В изобретении используется термин «поддерживающая терапия», принятый в той области, к которой относится использование целевого продукта, полученного по предлагаемой технологии. Термин «поддерживающая терапия» подразумевает использование полученного по предлагаемой технологии средства в комплексном лечении различных заболеваний с целью поддержания функции различных органов и тканей [см. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Позняковский В.М. Биологически активные добавки в питании человека (оценка качества и безопасности, эффективность, характеристика, применение в профилактической и клинической медицине). Томск, 1999, 295 с.].The invention uses the term "supportive therapy", adopted in the field to which the use of the target product obtained by the proposed technology. The term “supportive therapy” means the use of the product obtained according to the proposed technology in the complex treatment of various diseases in order to maintain the function of various organs and tissues [see Tutelian V.A., Sukhanov B.P., Austrievskikh A.N., Poznyakovsky V.M. Biologically active additives in human nutrition (quality and safety assessment, effectiveness, characterization, use in preventive and clinical medicine). Tomsk, 1999, 295 pp.].
Известно, что старение человека является результатом целого комплекса изменений в биохимическом статусе организма человека. В связи с тем, что настоящее время в соответствии с демографическими тенденциями сохраняется неуклонный рост людей пожилого и старческого возраста, в мире ведется активная работа по поиску и внедрению в практику новых фармакологических препаратов, биологически активных веществ, действие которых направлено на компенсацию возникающего с возрастом дефицита эндогенных протекторных факторов. Как указывалось выше, основной причиной возникновения многих заболеваний является переизбыток свободных окислительных радикалов. Кроме того, известно, что такой же процесс происходит и при старении организма. Свободные радикалы в первую очередь повреждают мембраны клеток, их липидные структуры, обусловливая нарушение гомеостаза.It is known that human aging is the result of a whole range of changes in the biochemical status of the human body. Due to the fact that at present, in accordance with demographic trends, there is a steady growth in the elderly and senile, people are actively working to find and introduce into practice new pharmacological preparations, biologically active substances, the action of which is aimed at compensating for the deficit that occurs with age endogenous protective factors. As mentioned above, the main cause of many diseases is an overabundance of free oxidative radicals. In addition, it is known that the same process occurs with the aging of the body. Free radicals primarily damage cell membranes, their lipid structures, causing a violation of homeostasis.
Неконтролируемому образованию свободных радикалов (помимо системы защитных сил организма) противостоят биологически ценные белки, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины А, Е, С и др., а также минеральные вещества - Са, К, Mg, Fe, Se, Zn, I и др., которые содержатся в продуктах моря.Biologically valuable proteins, polyunsaturated fatty acids, vitamins A, E, C, etc., as well as minerals - Ca, K, Mg, Fe, Se, Zn, I and others resist the uncontrolled formation of free radicals (in addition to the body's defenses). . contained in seafood.
В последние годы большое значение и спрос приобретают геропротекторные препараты на основе природных компонентов, обладающие, по сравнению с синтетическими препаратами, более мягким действием на организм. Необходимо отметить, что к указанным природным компонентам относят также гидробионты, которые используются в качестве сырья при разработке технологии выделения биологически активных веществ.In recent years, geroprotective drugs based on natural components, which have, in comparison with synthetic drugs, a milder effect on the body, have gained great importance and demand. It should be noted that these natural components also include hydrobionts, which are used as raw materials in the development of technology for the allocation of biologically active substances.
Известно, что морской еж, как пищевой продукт, не представляет интереса из-за своего специфического вкуса, но икра морских ежей является лечебно-профилактическим продуктом, в котором в зависимости от сезона добычи содержится 12-20% белка, 10-35% жира и до 3,5% минеральных веществ, оказывающих тонизирующее действие на организм.It is known that sea urchin, as a food product, is not interesting because of its specific taste, but sea urchin caviar is a therapeutic and prophylactic product, which, depending on the season of extraction, contains 12-20% protein, 10-35% fat and up to 3.5% of minerals that have a tonic effect on the body.
При разработке технологии выделения целевого продукта, получаемого из морских ежей, следует учитывать тот факт, что предприятия по производству лекарственных средств и предприятия, добывающие морских ежей, обычно территориально находятся на значительном отдалении друг от друга. Поэтому заготовка сырья и его обработка являются наиболее важными стадиями процесса получения биологически активного вещества для сохранения его биологической активности.When developing the technology for isolating the target product obtained from sea urchins, one should take into account the fact that enterprises producing medicines and enterprises that extract sea urchins are usually geographically located at a considerable distance from each other. Therefore, the procurement of raw materials and their processing are the most important stages in the process of obtaining a biologically active substance to maintain its biological activity.
Известен способ безотходной переработки икры морских ежей [патент РФ №2283006]. Сущность известного способа заключается в том, что замороженную икру морских ежей заливают 95%-ным этиловым спиртом, настаивают в течение 6-10 суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантируют. Икру вновь заливают 10%-ным водным раствором этилового спирта, настаивают в течение 2-4 суток при температуре 4-10°С, полученный экстракт декантируют. Оба экстракта объединяют, отстаивают при температуре не выше 10°С до получения прозрачного раствора, который затем фильтруют. Твердый остаток икры, оставшийся после обработки экстрагентами, сушат и измельчают. Полученная настойка из икры морских ежей представляет собой прозрачную жидкость желтовато-оранжевого цвета с характерным запахом морских гидробионтов. В результате чего происходит полная экстракция из сырья хиноидных соединений, обладающих антиоксидантной активностью, которые выделяются из сырья только при обработке этиловым спиртом с концентрацией не менее 95%. Твердый остаток икры морских ежей, полученный после обработки ее экстрагентами, высушенный и измельченный, представляет собой порошок от светло-серого до оранжево-коричневого цвета, со слабо выраженным запахом морских гидробионтов.A known method of waste-free processing of caviar of sea urchins [RF patent No. 2283006]. The essence of this method is that the frozen caviar of sea urchins is poured with 95% ethanol, insisted for 6-10 days at room temperature, the resulting extract is decanted. Caviar is again poured with a 10% aqueous solution of ethyl alcohol, insisted for 2-4 days at a temperature of 4-10 ° C, the resulting extract is decanted. Both extracts are combined, defended at a temperature not exceeding 10 ° C until a clear solution is obtained, which is then filtered. The solid caviar residue remaining after processing with extractants is dried and ground. The resulting tincture of sea urchin caviar is a clear yellowish-orange liquid with a characteristic smell of marine hydrobionts. As a result, complete extraction of quinoid compounds with antioxidant activity from the feed occurs, which are released from the feed only when treated with ethanol with a concentration of at least 95%. The solid residue of sea urchin caviar, obtained after processing it with extractants, dried and ground, is a powder from light gray to orange-brown in color, with a faint smell of marine hydrobionts.
К недостаткам описанного способа, описанного в патенте РФ №2283006 и включающего заготовку сырья путем замораживания икры морских ежей, экстракцию и фильтрование с целью получения целевого продукта, и принятого в качестве прототипа предлагаемой группы изобретений, следует отнести то, что целевой продукт, полученный в результате использования способа-прототипа, содержит хиноидные соединения и липидные фракции, обладающие только антиоксидантной активностью, при полном отсутствии пептидных компонентов, которые оказывают выраженное пролиферативное действие в отношении определенных тканей организма, вследствие чего могут быть использованы в качестве средств для поддерживающей терапии.The disadvantages of the described method described in the patent of the Russian Federation No. 2283006 and including the procurement of raw materials by freezing the eggs of sea urchins, extraction and filtration in order to obtain the target product, and adopted as a prototype of the proposed group of inventions, include the fact that the target product obtained as a result the use of the prototype method, contains quinoid compounds and lipid fractions with only antioxidant activity, in the complete absence of peptide components that have a pronounced proliferation Iterative action against certain tissues of the body, as a result of which they can be used as means for maintenance therapy.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в разработке технологии выделения из икры морских ежей пептидного комплекса с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов не более 3000 Да, очищенного от белковых, нуклеиновых и липидных примесей.The problem to which the present invention is directed is to develop a technology for isolating a peptide complex from the sea urchin eggs with a molecular weight of peptide components of not more than 3,000 Da, purified from protein, nucleic and lipid impurities.
Технический результат заключается в том, что согласно предлагаемому способу, включающему использование в качестве сырья замороженной икры морских ежей и определенную последовательность технологических операций, а также условий их осуществления, получают средство, представляющее собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 300 до 3000 Да, очищенный от белковых, нуклеиновых и липидных примесей и обладающий выраженным протекторным действием на основные системы организма, основанным на иммуностимулирующей, кардиопротекторной, церебропротекторной активности целевого продукта и его влиянии на репродуктивную систему.The technical result consists in the fact that according to the proposed method, which includes the use of frozen sea urchin caviar as a raw material and a certain sequence of technological operations, as well as the conditions for their implementation, a means is obtained which is a peptide complex with a molecular weight of peptide components from 300 to 3000 Yes, purified from protein, nucleic and lipid impurities and having a pronounced protective effect on the basic systems of the body, based on immunostim evidence of cardioprotective, cerebroprotective activity of the target product and its effect on the reproductive system.
Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.To solve the problem and achieve the technical result, a group of inventions is proposed, united by a common inventive concept.
Одним из аспектов предлагаемой группы изобретений является способ получения средства для поддерживающей терапии, включающий обработку сырья путем замораживания икры морских ежей, последовательную обработку его экстрагентами, с последующим фильтрованием, характеризующийся тем, что икру морских ежей замораживают не позднее чем через 2 часа после ее сбора при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев, после чего к измельченному сырью добавляют 5% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 10 объемов раствора уксусной кислоты к 1 объему измельченного сырья, повышают температуру суспензии до 60÷70°С и проводят экстракцию пептидов в раствор при постоянном перемешивании в течение не менее 2 часов, затем надосадочную жидкость сифонируют и фильтруют через ткань, имеющую плотность не менее 125 г/м2, для удаления макрочастиц размером более 5 мкм, после чего очищенный экстракт направляют на тангенциальную микрофильтрацию, которую проводят с использованием микрофильтрационных модулей на основе трековых мембран с номинальным размером пор 0,3÷0,4 мкм при скорости рециркуляции суспензии в камере концентрата 30÷38 л/ч и скорости фильтрации 1,8÷2,5 л/ч; полученный фильтрат направляют на твердофазную экстракцию, которую проводят с использованием ионообменного сорбента, сульфированного сополимера стирола и дивинилбензола с содержанием дивинилбензола 8÷10 моль %; при этом для проведения твердофазной экстракции сорбент помещают в массообменники колоночного типа, а фильтрат подают на массообменник насосом снизу в режиме рециркуляции со скоростью 3÷4 л/ч при температуре 25÷30°С таким образом, что сорбент находится в форме взвешенного слоя; твердофазную экстракцию проводят в течение 3 часов, после чего осуществляют вытеснение фильтрата из экстрактора и отмывку сорбента в условиях взвешенного слоя сорбента 5% водным раствором уксусной кислоты, которую подают в колонку снизу тем же насосом до выхода из колонки прозрачного бесцветного раствора; после получения прозрачного промывочного раствора 5% водный раствор уксусной кислоты подают в массообменник через верхний штуцер и таким образом укладывают сорбент на нижний дренаж ровным слоем; затем последовательно замещают раствор кислоты деминерализованной водой, проводят десорбцию пептидов с катионита в режиме вытеснительной ионообменной хроматографии, при этом в качестве вытеснителя используют катион аммония, а вытеснение осуществляют вначале нейтральным аммиачным буферным раствором при рН 5,5 и затем щелочным буферным раствором при рН 12,5, а хроматографию осуществляют со скоростями, не превышающими 4 мл/ч·см2 сечения колонки, на выходе из колонок собирают фракции растворов, при этом фракции, содержащие пептидные компоненты, объединяют и направляют на вакуум-выпарную установку при температуре в системе не выше 42±3°С, после чего полученный целевой продукт, характеризующийся рН 5,5÷7,0, содержанием пептидных компонентов с молекулярной массой в пределах от 300 до 3000 Да, лиофилизируют.One of the aspects of the proposed group of inventions is a method of obtaining funds for maintenance therapy, including processing raw materials by freezing sea urchin caviar, sequentially treating it with extractants, followed by filtration, characterized in that the sea urchin caviar is frozen no later than 2 hours after collection at a temperature of at least minus 40 ° C, incubated at a temperature of minus 20 ÷ 22 ° C for at least two months, after which a 5% solution of acetic acid in volume is added to the crushed raw materials a large ratio of 10 volumes of acetic acid solution to 1 volume of crushed raw materials, increase the temperature of the suspension to 60 ÷ 70 ° C and carry out the extraction of peptides into the solution with constant stirring for at least 2 hours, then the supernatant is siphoned and filtered through a tissue having a density not less than 125 g / m 2 to remove particles larger than 5 microns, after which the purified extract is sent to tangential microfiltration, which is carried out using microfiltration modules based on track membranes with nom the total pore size of 0.3 ÷ 0.4 μm with a suspension recirculation rate in the concentrate chamber of 30 ÷ 38 l / h and a filtration rate of 1.8 ÷ 2.5 l / h; the obtained filtrate is directed to solid-phase extraction, which is carried out using an ion-exchange sorbent, a sulfonated copolymer of styrene and divinylbenzene with a divinylbenzene content of 8 ÷ 10 mol%; at the same time, for carrying out solid-phase extraction, the sorbent is placed in column-type mass exchangers, and the filtrate is fed to the mass exchanger by a pump from below in the recirculation mode at a rate of 3–4 l / h at a temperature of 25–30 ° C so that the sorbent is in the form of a suspended layer; solid-phase extraction is carried out for 3 hours, after which the filtrate is displaced from the extractor and the sorbent is washed under the conditions of a weighed sorbent layer with a 5% aqueous solution of acetic acid, which is fed into the column from the bottom by the same pump until a clear, colorless solution leaves the column; after receiving a clear wash solution, a 5% aqueous solution of acetic acid is fed into the mass exchanger through the upper nozzle and thus the sorbent is placed on the lower drainage with an even layer; then the acid solution is successively replaced with demineralized water, peptides are desorbed from the cation exchanger in the mode of displacement ion-exchange chromatography, the ammonium cation being used as the displacer, and the displacement is carried out first with a neutral ammonia buffer solution at pH 5.5 and then with an alkaline buffer solution at pH 12, 5, and chromatography is carried out at speeds not exceeding 4 ml / h · cm 2 of the column cross section; at the outlet of the columns, fractions of solutions are collected, while fractions containing peptide composites nts, are combined and sent to a vacuum evaporator at a temperature in the system of no higher than 42 ± 3 ° С, after which the obtained target product, characterized by a pH of 5.5 ÷ 7.0, with a content of peptide components with a molecular weight ranging from 300 to 3000 Yes, lyophilized.
Другим аспектом изобретения является средство для поддерживающей терапии, полученное вышеописанным способом из замороженной икры морских ежей и представляющее собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 300 до 3000 Да, поддерживающее функцию иммунной системы, сердца, головного мозга, мужской репродуктивной системы.Another aspect of the invention is a supportive therapy agent obtained by the method described above from frozen sea urchin caviar and which is a peptide complex with a molecular weight of peptide components ranging from 300 to 3000 Da, supporting the function of the immune system, heart, brain, male reproductive system.
Необходимо отметить, что средство, полученное непосредственно предлагаемым способом, в отличие от известных, позволяет получить пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 300 до 3000 Да, обладающий выраженным протекторным действием, направленным на поддержание функций определенных систем организма, что достигается предлагаемой последовательностью технологических операций с использованием микрофильтрационного оборудования и условиями их осуществления, включая температурные, временные и иные характеристики, а также использование веществ, включая исходное сырье, определенный экстрагент и сорбент.It should be noted that the agent obtained directly by the proposed method, in contrast to the known ones, allows one to obtain a peptide complex with a molecular weight of peptide components from 300 to 3000 Da, which has a pronounced protective effect aimed at maintaining the functions of certain body systems, which is achieved by the proposed the sequence of technological operations using microfiltration equipment and the conditions for their implementation, including temperature, time and other characteristics line providers, as well as the use of substances, including feedstock, defined extractant and sorbent.
Сущность изобретения поясняется таблицей и примерами.The invention is illustrated in the table and examples.
В таблице показано влияние пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, на развитие эксплантатов в органотипических культурах различных тканей.The table shows the effect of the peptide complex isolated from frozen eggs of sea urchins on the development of explants in organotypic cultures of various tissues.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения изобретения: пример осуществления способа - пример 1 - способ получения пептидных комплексов из замороженной икры морских ежей, а также пример 2, подтверждающий биологическую активность полученных пептидных комплексов, выделенных из замороженной икры морских ежей.The following are examples of specific embodiments of the invention: an example implementation of the method, example 1 is a method for producing peptide complexes from frozen caviar of sea urchins, as well as example 2, confirming the biological activity of the obtained peptide complexes isolated from frozen caviar of sea urchins.
Пример 1. Способ получения пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежейExample 1. A method of obtaining a peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins
В качестве сырья используют икру морских ежей, которую не позднее чем через 2 часа после ее сбора замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20-22°С в течение не менее двух месяцев.As raw materials, sea urchin caviar is used, which is frozen no later than 2 hours after its collection at a temperature of at least minus 40 ° C, kept at a temperature of minus 20-22 ° C for at least two months.
Замороженное сырье в количестве 350 г измельчают, помещают в стеклянную термостатируемую емкость с мешалкой объемом 4 л и заливают 5% водным раствором уксусной кислоты до суммарного объема 3 л. Затем повышают температуру суспензии до 60-70°С и при постоянном перемешивании проводят экстракцию в течение не менее 2 часов.Frozen raw materials in an amount of 350 g are crushed, placed in a glass thermostatically controlled container with a 4 L mixer and poured with a 5% aqueous solution of acetic acid to a total volume of 3 L. Then the temperature of the suspension is increased to 60-70 ° C and extraction is carried out for at least 2 hours with constant stirring.
Надосадочную жидкость сифонируют и фильтруют через ткань, имеющую плотность не менее 125 г/м2, для удаления макрочастиц (размером более 5 мкм) из экстракта. Полученный очищенный экстракт из икры морских ежей направляют на тангенциальную микрофильтрацию с использованием микрофильтрационных модулей на основе трековых мембран с номинальным размером пор 0,3-0,4 мкм, при этом скорость рециркуляции суспензии в камере концентрата составляет 30-38 л/ч, а скорость фильтрации - 1,8-2,5 л/ч.The supernatant is siphoned and filtered through a tissue having a density of at least 125 g / m 2 to remove particulate matter (larger than 5 microns) from the extract. The obtained purified extract from caviar of sea urchins is sent to tangential microfiltration using microfiltration modules based on track membranes with a nominal pore size of 0.3-0.4 μm, while the rate of recirculation of the suspension in the concentrate chamber is 30-38 l / h, and the speed filtration - 1.8-2.5 l / h.
Полученный фильтрат направляют на твердофазную экстракцию, которую проводят с использованием ионообменного сорбента - сульфированного сополимера стирола и дивинилбензола с содержанием дивинилбензола 8-10 моль %; при этом для проведения твердофазной экстракции сорбент помещают в массообменники колоночного типа, а фильтрат подают на массообменник перистальтическим насосом снизу в режиме рециркуляции со скоростью 3-4 л/ч при температуре 25-30°С так, что сорбент находится в форме взвешенного слоя для однородного обтекания гранул сорбента. Твердофазную экстракцию проводят в течение 3 часов, затем отбирают пробу из циркулирующего раствора и сохраняют ее при температуре 2-4°С для последующего анализа. Вытеснение фильтрата из экстрактора и отмывку сорбента проводят в условиях взвешенного слоя сорбента 5% водным раствором уксусной кислоты, подавая его в колонку снизу тем же насосом, до выхода из колонки прозрачного бесцветного раствора. После получения прозрачного промывочного раствора 5% водный раствор уксусной кислоты подают в массообменник через верхний штуцер, укладывая сорбент на нижний дренаж ровным слоем; затем последовательно замещают раствор кислоты деминерализованной водой.The obtained filtrate is directed to solid phase extraction, which is carried out using an ion-exchange sorbent - a sulfonated copolymer of styrene and divinylbenzene with a divinylbenzene content of 8-10 mol%; in order to conduct solid-phase extraction, the sorbent is placed in column-type mass exchangers, and the filtrate is fed to the mass exchanger with a peristaltic pump from below in the recirculation mode at a rate of 3-4 l / h at a temperature of 25-30 ° C so that the sorbent is in the form of a suspended layer for uniform flow around sorbent granules. Solid phase extraction is carried out for 3 hours, then a sample is taken from the circulating solution and stored at a temperature of 2-4 ° C for subsequent analysis. Displacement of the filtrate from the extractor and washing of the sorbent is carried out under conditions of a suspended sorbent layer with a 5% aqueous solution of acetic acid, feeding it to the bottom column with the same pump until a clear, colorless solution leaves the column. After receiving a clear wash solution, a 5% aqueous solution of acetic acid is fed into the mass exchanger through the upper fitting, laying the sorbent on the lower drainage with an even layer; then successively replace the acid solution with demineralized water.
Десорбцию пептидов икры морских ежей с катионита проводят в режиме вытеснительной ионообменной хроматографии, используя катион аммония в качестве вытеснителя, причем вытеснение осуществляют аммиачными буферными растворами в две стадии - вначале нейтральным (рН 5,5) и затем щелочным (рН 12,5), а хроматографию осуществляют со скоростями, не превышающими 4 мл/ч·см2 сечения колонки, что позволяет значительно сконцентрировать целевые пептиды. На выходе из колонок собирают фракции растворов, при этом фракции, содержащие пептидные компоненты, объединяют и направляют на вакуум-выпарную установку для удаления летучих компонентов и воды при температуре в системе не выше 42±3°С, после чего полученный целевой продукт лиофилизируют.The desorption of peptides of sea urchin caviar from cation exchange resin is carried out in the mode of displacement ion-exchange chromatography using ammonium cation as a displacer, the displacement being carried out by ammonia buffer solutions in two stages - first neutral (pH 5.5) and then alkaline (pH 12.5), and chromatography is carried out at speeds not exceeding 4 ml / h · cm 2 of the column section, which allows significant concentration of the target peptides. At the column outlet, fractions of solutions are collected, while fractions containing peptide components are combined and sent to a vacuum evaporator to remove volatile components and water at a temperature in the system of no higher than 42 ± 3 ° С, after which the obtained target product is lyophilized.
Выход целевого продукта (пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей) составляет 20,0 г на 1 кг исходного сырья.The yield of the target product (peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins) is 20.0 g per 1 kg of feedstock.
Целевой продукт (пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей) представляет собой порошок от светло-кремового до желтовато-кремового цвета и содержит биологически активные пептидные компоненты. Целевой продукт умеренно растворим в воде, рН раствора 5,8-6,3.The target product (a peptide complex isolated from frozen eggs of sea urchins) is a powder from light cream to yellowish cream color and contains biologically active peptide components. The target product is sparingly soluble in water, the pH of the solution is 5.8-6.3.
Для более подробной характеристики пептидного комплекса, полученного предлагаемым способом, проведено изучение его состава, основных физико-химических свойств, специфической биологической активности.For a more detailed description of the peptide complex obtained by the proposed method, a study was made of its composition, basic physicochemical properties, and specific biological activity.
Молекулярную массу пептидных компонентов, входящих в пептидный комплекс, определяют методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют набор маркеров Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия). Установлено, что в состав пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, входят вещества с молекулярной массой не более 3000 Да. С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав пептидного комплекса входят преимущественно низкомолекулярные пептидные фракции (от 70 до 90%), а высокомолекулярные компоненты в пептидном комплексе отсутствуют. По данным электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле, молекулярная масса пептидных компонентов пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, составляет от 300 до 3000 Да.The molecular weight of the peptide components included in the peptide complex is determined by gel chromatography on Sephadex G-25 and G-50 (Pharmacia, Sweden). To calibrate the 1.6 x 60 cm column, a Peptide Molecuar Weight Kit MS III marker set (Serva, Germany) was used. It was found that the peptide complex isolated from the frozen caviar of sea urchins includes substances with a molecular weight of not more than 3000 Da. Using reverse-phase high-performance liquid chromatography in an acetonitrile gradient (Lichrosorb C 18 sorbent, column 2 × 62 mm) it was found that the peptide complex consists mainly of low molecular weight peptide fractions (from 70 to 90%), and high molecular weight components in the peptide complex are absent. According to electrophoresis in a 15% polyacrylamide gel, the molecular weight of the peptide components of the peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins is from 300 to 3000 Da.
Для определения подлинности пептидного комплекса навеску целевого продукта 10 мг помещают в пробирку, растворяют при тщательном перемешивании в 5 мл воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Для приготовления биуретового реактива растворяют 90 г калия-натрия тартрата в 400 мл 0,2 н. раствора едкого натрия, прибавляют 10 г меди сернокислой 5-водной, после растворения добавляют 10 г йодида калия, и доводят объем раствора 0,2 н. раствором едкого натра до 2 л. К исследуемому раствору добавляют 5 мл биуретового реактива. В качестве вещества сравнения используют воду. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в комплексе пептидных связях.To determine the authenticity of the peptide complex, a sample of the target product 10 mg is placed in a test tube, dissolved with thorough stirring in 5 ml of water. The solution is filtered through a paper filter. To prepare a biuret reagent, 90 g of potassium-sodium tartrate is dissolved in 400 ml of 0.2 N. sodium hydroxide solution, add 10 g of copper sulfate 5-aqueous, after dissolution add 10 g of potassium iodide, and bring the volume of the solution to 0.2 N. caustic soda solution up to 2 l. 5 ml of biuret reagent is added to the test solution. As a comparison substance, water is used. Staining the solution with violet color indicates the peptide bonds present in the complex.
Идентификацию активного пептидного комплекса проводят с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Для этого 10 мг пептидного комплекса растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора водой до метки. На спектрофотометре измеряют ультрафиолетовый спектр пептидного комплекса в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм в области длин волн от 250 до 300 нм. В качестве раствора сравнения используют воду. Спектр должен иметь выраженный максимум при длине волны (270±5) нм. Соотношение оптических плотностей при длинах волн 275 нм (Д275) и 260 нм (Д260) - Д275/Д260 - должно быть не менее 1,0. В полученном целевом продукте - пептидном комплексе, выделенном из замороженной икры морских ежей, - соотношение оптических плотностей Д275/Д260 составило 1,16.The identification of the active peptide complex is carried out using ultraviolet spectrophotometry. For this, 10 mg of the peptide complex is dissolved in water in a 100 ml volumetric flask, and the volume of the solution is adjusted to the mark with water. An ultraviolet spectrum of the peptide complex is measured on a spectrophotometer in quartz cuvettes with a layer thickness of 10 mm in the wavelength range from 250 to 300 nm. As a comparison solution, water is used. The spectrum should have a pronounced maximum at a wavelength of (270 ± 5) nm. The ratio of optical densities at wavelengths of 275 nm (D 275 ) and 260 nm (D 260 ) - D 275 / D 260 - should be at least 1.0. In the obtained target product — a peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins — the ratio of optical densities D 275 / D 260 was 1.16.
Пример 2. Биологическая активность пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежейExample 2. The biological activity of the peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins
Для изучения биологической активности пептидного комплекса, выделенного предлагаемым способом из замороженной икры морских ежей, исследовали влияние целевого продукта на рост органотипических культур различных тканей молодых (3-месячных) половозрелых крыс линии «Wistar» с массой тела 150-200 г и старых крыс (24-месячных) с массой тела 420-450 г.To study the biological activity of the peptide complex isolated by the proposed method from frozen caviar of sea urchins, we studied the effect of the target product on the growth of organotypic cultures of various tissues of young (3-month) sexually mature Wistar rats weighing 150-200 g and old rats (24 -months) with a body weight of 420-450 g.
Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты различных тканей (хрящей, сердца, тимуса, коры головного мозга, шишковидной железы, поджелудочной железы, щитовидной железы, предстательной железы, семенников, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, слизистой оболочки бронхов, слизистой оболочки желудка, надпочечников) крыс разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 5% куриного эмбрионального экстракта, 0,6% глюкозы, 100 ед/мл гентамицина.Fragments of various tissues prepared under sterile conditions (cartilage, heart, thymus, cerebral cortex, pineal gland, pancreas, thyroid gland, prostate gland, testes, kidneys, bladder, blood vessels, ovaries, bronchial mucosa, gastric mucosa, adrenal glands ) rats were divided into smaller parts with a size of about 1 mm 3 , which were placed in Petri dishes with a collagen-coated bottom. The nutrient medium consisted of 35% Eagle medium, 35% Hanks solution, 25% fetal calf serum, 5% chicken fetal extract, 0.6% glucose, 100 u / ml gentamicin.
Исследуемый пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, вводили в культуральную среду в концентрациях от 0,01 до 20 нг/мл для выявления его эффективных концентраций. В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли по 3 мл питательной среды, содержащей пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, в исследуемой концентрации, а в чашки Петри с контрольными эксплантатами - по 3 мл питательной среды без пептидного комплекса; таким образом, экспериментальные и контрольные эксплантаты развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре (37±0,5)°С и через 3 сут просматривали под фазово-контрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как отношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу Photo M 1,2. Достоверность различий в индексах площади контрольных и экспериментальных эксплантатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения индекса площади выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.The studied peptide complex isolated from frozen eggs of sea urchins was introduced into the culture medium in concentrations from 0.01 to 20 ng / ml to reveal its effective concentrations. To the Petri dishes with experimental explants, 3 ml of the nutrient medium containing the peptide complex isolated from the frozen caviar of sea urchins in the test concentration was added, and 3 ml of the nutrient medium without the peptide complex were added to the Petri dishes with control explants; Thus, experimental and control explants developed in equal volumes of culture medium. Petri dishes were placed in a thermostat at a temperature of (37 ± 0.5) ° С and after 3 days they were examined under a phase contrast microscope. The area index (PI) was determined, which was calculated in arbitrary units as the ratio of the area of the entire explant together with the zone of evicted cells to the area of the central zone of the explant. To visualize the explants, a microfit nozzle was used for a microscope (series 10, MTN-13 Alfa-Telecom, Russia). To calculate the explant area index, the Photo M 1.2 program was used. The significance of differences in the area indices of the control and experimental explants was evaluated using Student's t-test. The values of the area index were expressed as a percentage, the control value of IP was taken as 100%.
При использовании пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, в концентрациях 0,01 и 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов сердца на 26-28% у молодых животных и на 21-23% - у старых крыс; эксплантатов тимуса - на 34-35% у молодых животных и на 30-31% - у старых крыс; эксплантатов коры головного мозга - на 22-23% у молодых животных и на 21-23% - у старых крыс; эксплантатов семенников - на 25-27% у молодых животных и на 22-23% - у старых крыс по сравнению с соответствующими контрольными значениями ИП. Полученные данные представлены в таблице.When using the peptide complex isolated from frozen eggs of sea urchins, at concentrations of 0.01 and 10 ng / ml, a significant increase in the PI of heart explants was observed by 26-28% in young animals and by 21-23% in old rats; thymus explants - by 34-35% in young animals and by 30-31% - in old rats; cerebral cortex explants - by 22-23% in young animals and by 21-23% - in old rats; seed test explants - by 25-27% in young animals and by 22-23% - in old rats compared with the corresponding control values of PI. The data obtained are presented in the table.
Следует отметить, что добавление пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, в эффективной концентрации в питательную среду органотипических культур других тканей крысы (хрящей, шишковидной железы, поджелудочной железы, щитовидной железы, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, слизистой оболочки бронхов, слизистой оболочки желудка, надпочечников) не приводило к достоверному увеличению ИП эксплантатов.It should be noted that the addition of the peptide complex isolated from frozen caviar of sea urchins in an effective concentration in the nutrient medium of organotypic cultures of other rat tissues (cartilage, pineal gland, pancreas, thyroid gland, prostate gland, kidneys, bladder, blood vessels, ovaries, the mucous membrane of the bronchi, the mucous membrane of the stomach, adrenal glands) did not lead to a significant increase in the explant PI.
Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что в отношении тканей сердца, тимуса, коры головного мозга и семенников пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, оказывает стимулирующее действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов соответствующих тканей, что подтверждает проявление биологической активности пептидного комплекса по отношению к основным системам организма. Это позволяет считать показанным использование пептидного комплекса в качестве средства для поддерживающей терапии.Thus, the studies conducted allow us to conclude that, with respect to the tissues of the heart, thymus, cerebral cortex, and testes, the peptide complex isolated from frozen eggs of sea urchins has a stimulating effect, which manifests itself in stimulating the growth of explants of the corresponding tissues, which confirms the peptide complex activity in relation to the main systems of the body. This allows us to consider the use of the peptide complex as a means for maintenance therapy shown.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009145708/13A RU2420212C1 (en) | 2009-12-09 | 2009-12-09 | Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009145708/13A RU2420212C1 (en) | 2009-12-09 | 2009-12-09 | Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2420212C1 true RU2420212C1 (en) | 2011-06-10 |
Family
ID=44736564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009145708/13A RU2420212C1 (en) | 2009-12-09 | 2009-12-09 | Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2420212C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2481119C1 (en) * | 2012-03-05 | 2013-05-10 | Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" | Peptide, amino acid and phospholipid rich agent |
| RU2520695C1 (en) * | 2013-02-04 | 2014-06-27 | Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" | Complex of biologically active substances for treating and preventing cardiovascular diseases |
-
2009
- 2009-12-09 RU RU2009145708/13A patent/RU2420212C1/en active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2481119C1 (en) * | 2012-03-05 | 2013-05-10 | Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" | Peptide, amino acid and phospholipid rich agent |
| RU2520695C1 (en) * | 2013-02-04 | 2014-06-27 | Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" | Complex of biologically active substances for treating and preventing cardiovascular diseases |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104745664B (en) | A kind of preparation process of animal placenta extract | |
| RU2290936C1 (en) | Method for preparing agent for maintaining therapy possessing tissue-specific activity | |
| RU2632710C2 (en) | Method for preparing sodium monosialic ganglioside and neuroprotective agent based on it | |
| RU2420212C1 (en) | Supporting therapy remedy and method for its production from frozen sea urchin spawn | |
| AU2014330867A1 (en) | Process for the preparation of xanthohumol | |
| RU2414914C1 (en) | Agent for supporting therapy and method for making agent of frozen-dried urchin hardroe | |
| CN101455750B (en) | Extraction method of coptis detoxifcation decoction active site and use thereof | |
| Bostwick et al. | Distinct influences of nerve growth factor and a central cholinergic trophic factor on medial septal explants | |
| US4687761A (en) | Pharmaceutical composition for increasing immunity and decreasing side effects of anticancer chemotherapy | |
| KR102152394B1 (en) | Composition comprising nucleobases as active ingredients for treating, preventing, or improving Osteoporosis | |
| RU2415676C1 (en) | Method of obtaining medication, which has tissue-specific activity, and medication, obtained by claimed method (versions) | |
| Brues et al. | Growth inhibition by substances in liver | |
| EP0197525B1 (en) | Plant culture cell and use thereof | |
| US4945115A (en) | Process for preparing ferulic acid | |
| RU2305548C1 (en) | Method for complex reprocessing of cake urchins | |
| Born et al. | Covalent coupling of neuralizing factors from Xenopus to Sepharose beads: no decrease of inducing activity | |
| CN113509530B (en) | A Chinese medicinal compound preparation for treating asthma, and its preparation method and quality control method | |
| CN107412730A (en) | A kind of glutinous rehmannia protein nano particle and preparation method thereof | |
| Moloney et al. | CONCENTRATION OF INSULIN BY ADSORPTION ON BENZOIC ACID. | |
| WO2007020222A2 (en) | Pharmaceutical composition containing as active substance a protein fraction extracted from oviparous embryos at the cell differentiation stage and preparation process thereof | |
| JP2002502887A (en) | Drugs for the treatment of abnormal apoptosis, including oligosaccharides | |
| RU2582952C2 (en) | Method of producing agent having adaptogenic action | |
| RU2726615C1 (en) | Method for recovering proteins from bone marrow of animals | |
| CN117205225B (en) | Application of geniposide in preparation of medicament for treating myeloproliferative neoplasm | |
| CN102036674B (en) | BCL-2 protein expressor, apoptosis inhibitor and preventive for UV-DNA damage in epidermal cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |