RU2415937C1 - Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes - Google Patents
Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2415937C1 RU2415937C1 RU2009139127/10A RU2009139127A RU2415937C1 RU 2415937 C1 RU2415937 C1 RU 2415937C1 RU 2009139127/10 A RU2009139127/10 A RU 2009139127/10A RU 2009139127 A RU2009139127 A RU 2009139127A RU 2415937 C1 RU2415937 C1 RU 2415937C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- beta
- dna
- genes
- ctx
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и аналитической биотехнологии и может быть использовано в клинических микробиологических лабораториях и службах эпидемиологического контроля для выявления устойчивости микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к антибиотикам группы пенициллинов и цефалоспоринов по наличию мутаций в кодирующих генах.The invention relates to the field of molecular biology and analytical biotechnology and can be used in clinical microbiological laboratories and epidemiological control services to detect the resistance of Enterobacteriaceae microorganisms to antibiotics of the penicillins and cephalosporins group by the presence of mutations in coding genes.
Антибиотики группы пенициллинов и цефалоспоринов являются наиболее широко применяемыми в настоящее время при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae. Основным фактором, ограничивающим их клиническую эффективность, является антибиотикорезистентность, т.е. способность микроорганизмов вырабатывать устойчивость к их действию. Основной причиной резистентности является ферментативный гидролиз ферментами бета-лактамазами, образующимися в клеточной стенке [Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev., 2005, 18, стр.657-686]. Из всего разнообразия бета-лактамаз наибольшую угрозу представляют бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), вызывающие резистентность у изначально чувствительных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae [Perez F. et. al. The continuing challenge of ESBLs. Curr Opin Pharmacol. 2000, 7, 459-469]. Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих ферментов среди возбудителей инфекционных болезней человека, прежде всего - инфекций увеличивается с каждым годом. Наиболее известными и распространенными типами БЛРС являются типы ТЕМ, SHV и СТХ-М. Все описанные ферменты ТЕМ типа являются вариантами бета-лактамазы ТЕМ-1 и отличаются от исходного фермента единичными аминокислотными заменами (от одной до семи). Ключевыми для расширения спектра субстратной специфичности являются мутации в положениях 104, 164, 238 и 240.Antibiotics of the penicillin and cephalosporin groups are currently the most widely used in the treatment of infectious diseases caused by gram-negative microorganisms of the Enterobacteriaceae family. The main factor limiting their clinical effectiveness is antibiotic resistance, i.e. the ability of microorganisms to develop resistance to their action. The main cause of resistance is enzymatic hydrolysis with beta-lactamase enzymes formed in the cell wall [Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev., 2005, 18, pp. 657-686]. Of the diversity of beta-lactamases, the greatest threat is extended-spectrum beta-lactamases (BLRS), which cause resistance in the initially sensitive microorganisms of the Enterobacteriaceae family [Perez F. et. al. The continuing challenge of ESBLs. Curr Opin Pharmacol. 2000, 7, 459-469]. Due to the plasmid localization of genes, the distribution of these enzymes among pathogens of human infectious diseases, especially infections, is increasing every year. The most famous and common types of BLRS are the types TEM, SHV and CTX-M. All described TEM type enzymes are variants of TEM-1 beta-lactamase and differ from the initial enzyme by single amino acid substitutions (from one to seven). The key to expanding the spectrum of substrate specificity are mutations at
Ферменты SHV типа являются производными бета-лактамазы SHV-1 и отличаются от него наличием точечных мутаций. Ключевыми для изменения профиля субстратной специфичности являются мутации в положениях 35, 238 и 240.SHV type enzymes are derivatives of SHV-1 beta-lactamase and differ from it by the presence of point mutations. The key to changing the profile of substrate specificity are mutations at
В последнее время во многих странах мира, в том числе и в РФ, отмечается стремительное распространение БЛРС СТХ-М типа [Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of СТХ-М extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 3724-3732]. На основании гомологии аминокислотных последовательностей эти ферменты разделяются на 4 филогенетические группы (субкластеры). Расширение спектра их субстратной специфичности также связано возникновением единичных мутаций. Ключевыми мутациями, определяющими спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов, являются мутации в положениях 167 и 240. Мутации в положениях 26, 230, 253, 278 для субкластера СТХ-М-2, в положениях 121, 231 для субкластера СТХ-М-9 важны для распознавания ферментов СТХ-М типа, распространенных в различных странах, в том числе и в России.Recently, in many countries of the world, including the Russian Federation, there has been a rapid spread of STX-M type BLRS [Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX- M extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 3724-3732]. Based on the homology of amino acid sequences, these enzymes are divided into 4 phylogenetic groups (subclusters). The expansion of the spectrum of their substrate specificity is also associated with the occurrence of single mutations. The key mutations that determine the spectrum of substrate specificity for cephalosporins are mutations at
Перспективным методом идентификации генов являются методы генотипирования на микрочипах. ДНК-микрочипы представляют собой подложку из стекла, кремния, пористых мембранных материалов, полимерных носителей, на которую нанесены в виде матрицы синтетические олигонуклеотиды или фрагменты ДНК. Технология ДНК-микрочипов для идентификации генов и мутаций в них основана на амплификации необходимого участка нуклеиновой кислоты с одновременным введением метки и последующей гибридизацией на поверхности микрочипа исследуемой нуклеотидной последовательности с иммобилизованными в определенном порядке на микрочипе известными олигонуклеотидами или ДНК-последовательностями [Heller MJ. DNA microarray technology: devices, systems, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2002, 4, 129-53]. Результат гибридизации меченой ДНК образца с иммобилизованными олигонуклеотидами определяется по активности метки на различных участках носителя с помощью специальных устройств. Технология ДНК-чипов позволяет осуществлять многопараметрический анализ и проводить идентификацию патогена и его устойчивости к антибиотикам на молекулярном уровне. Данная технология является более информативной и имеет значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. позволяет миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца.A promising method for identifying genes is microarray genotyping methods. DNA microarrays are a substrate of glass, silicon, porous membrane materials, polymer carriers onto which synthetic oligonucleotides or DNA fragments are applied in a matrix. The technology of DNA microarrays for identifying genes and mutations in them is based on the amplification of the required nucleic acid region with simultaneous labeling and subsequent hybridization of the studied nucleotide sequence on the microchip surface with known oligonucleotides or DNA sequences immobilized in a specific order on the microchip [Heller MJ. DNA microarray technology: devices, systems, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2002, 4, 129-53]. The result of hybridization of labeled DNA of the sample with immobilized oligonucleotides is determined by the activity of the label in different parts of the carrier using special devices. The technology of DNA chips allows for multi-parameter analysis and identification of the pathogen and its resistance to antibiotics at the molecular level. This technology is more informative and has significant advantages over traditional molecular biological methods, because it allows miniaturization of the test sample and analyzer, which significantly reduces the cost of analysis and the time it takes, as well as simultaneously determine the various parameters of the test sample.
Описан ДНК-макрочип на основе мембранного носителя, для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и отдельных мутаций в них методом гибридизационного анализа [Ensor V.M., Livermore D.M., Hawkey P.M. A novel reverse-line hybridization assay for identifying genotypes of CTX-M-type extended-spectrum P-lactamases. J. Antimicrob. Chemotherapy, 2007, 59, 387-395]. Недостатком данного подхода является «макро» формат чипа, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются фрагменты генов бета-лактамаз СТХ-М типа, в результате возможно определить только ограниченное число мутаций. Условия определения мутаций в генах, относящихся к разным субкластерам бета-лактамаз СТХ-М типа, различаются, поэтому определение проводится на разных типах чипов, что затрудняет использование метода в эпидемиологических исследованиях.A DNA macrochip based on a membrane carrier has been described to identify STX-M type beta-lactamase genes and individual mutations in them by hybridization analysis [Ensor V.M., Livermore D.M., Hawkey P.M. A novel reverse-line hybridization assay for identifying genotypes of CTX-M-type extended-spectrum P-lactamases. J. Antimicrob. Chemotherapy, 2007, 59, 387-395]. The disadvantage of this approach is the “macro” format of the chip, fragments of the CTX-M type beta-lactamases are amplified during the polymerase chain reaction, and as a result, only a limited number of mutations can be determined. The conditions for determining mutations in genes belonging to different subclusters of CTX-M type beta-lactamases are different, therefore, the determination is carried out on different types of chips, which complicates the use of the method in epidemiological studies.
Наиболее близким к заявляемому является ДНК-микрочип для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ типа и мутаций в них методом гибридизационного анализа с флуоресцентной детекцией [European Patent 1580281 A2, date of publication 28.09.2005 Bulletin 2005/39]. На данном микрочипе из стекла иммобилизованы олигонуклеотиды, по структуре идентичные различным участкам гена бета-лактамазы ТЕМ-1 и его мутантов, идентификация проводится методом гибридизационного анализа с флуоресцентной детекцией.Closest to the claimed is a microarray for the identification of TEM type beta-lactamase genes and mutations in them by hybridization analysis with fluorescence detection [European Patent 1580281 A2, date of publication September 28, 2005 Bulletin 2005/39]. On this glass microchip, oligonucleotides are immobilized that are identical in structure to different regions of the TEM-1 beta-lactamase gene and its mutants; identification is carried out by hybridization analysis with fluorescence detection.
Задачей данного изобретения является разработка ДНК-микрочипа с иммобилизованными специфическими олигонуклеотидами для высокоспецифичного одновременного выявления основных типов генов бета-лактамаз класса А (ТЕМ, SHV и СТХ-М) и ключевых точечных мутаций в них, ответственных за развитие устойчивости микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам групп пенициллинов и цефалоспоринов.The objective of the invention is the development of a DNA microarray with immobilized specific oligonucleotides for the highly specific simultaneous detection of the main types of beta-lactamase class A genes (TEM, SHV and CTX-M) and key point mutations in them, responsible for the development of resistance of microorganisms that cause infectious diseases to antibiotics of penicillins and cephalosporins.
Для решения поставленной задачи выполнен молекулярный дизайн структуры олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и определения ключевых мутаций в них. Для идентификации типа гена использовали последовательность, комплементарную консервативному участку генов данного типа и не имеющую гомологии с генами других типов. Для идентификации субкластера бета-лактамаз СТХ-М типа использовали последовательность, комплементарную участку гена, высокогомологичного для генов одного субкластера и с низкой степенью гомологии с генами, относящимися к другим субкластерам.To solve this problem, a molecular design of the structure of oligonucleotides was performed to identify beta-lactamase genes TEM, SHV, and CTX-M types and to determine key mutations in them. To identify the type of gene, a sequence was used that is complementary to the conserved region of genes of this type and does not have homology with genes of other types. To identify the CTX-M type beta-lactamase subcluster, a sequence was used that is complementary to a gene region highly homologous to the genes of one subcluster and with a low degree of homology with genes belonging to other subclusters.
Для определения точечной мутации первоначально тестировали набор из четырех олигонуклеотидов с последовательностью оснований, соответствующих структуре гена бета-лактамазы в исследуемом участке и отличающихся друг от друга нуклеотидом в центральной позиции, соответствующей точечной мутации, в качестве которого использовали один из четырех нуклеотидов A, G, С или Т. При гибридизации исследуемой ДНК с набором олигонуклеотидов наиболее стабильный дуплекс образуется с полностью комплементарным олигонуклеотидом и, соответственно, в этом случае детектируется более высокий аналитический сигнал. При образовании дуплексов в результате гибридизации с тремя остальными олигонуклеотидами или только некоторыми из них наблюдаемый аналитический сигнал свидетельствует об уровне неспецифической гибридизации. Молекулярный дизайн состоял в оптимизации длины олигонуклеотидов и введении искусственных замен в их последовательность для обеспечения высокой специфичности идентификации генов и определения мутаций при их одновременном использовании в реакции гибридизации, проводимой в выбранных условиях при фиксированной температуре. Высокая специфичность определения отдельных мутаций в генах бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов методом гибридизационного анализа продемонстрирована на фиг.1. Использование биотина в качестве метки ДНК с последующей колориметрической детекцией обеспечило наиболее высокую специфичность определения мутаций.To determine the point mutation, a set of four oligonucleotides with a sequence of bases corresponding to the structure of the beta-lactamase gene in the studied area and differing from each other with a nucleotide in the central position corresponding to the point mutation, which was used as one of the four nucleotides A, G, C, was initially tested. or T. Upon hybridization of the studied DNA with a set of oligonucleotides, the most stable duplex is formed with a fully complementary oligonucleotide and, accordingly, in this case, a higher analytical signal is detected. When duplexes are formed as a result of hybridization with the other three oligonucleotides or only some of them, the observed analytical signal indicates the level of non-specific hybridization. The molecular design consisted of optimizing the length of oligonucleotides and introducing artificial substitutions in their sequence to ensure high specificity of gene identification and determination of mutations while using them in a hybridization reaction carried out under selected conditions at a fixed temperature. The high specificity of the determination of individual mutations in the genes of beta-lactamases TEM, SHV and CTX-M types by the method of hybridization analysis is shown in figure 1. The use of biotin as a DNA label followed by colorimetric detection provided the highest specificity for determining mutations.
В дальнейшем для определения одной мутации используют набор из двух или в отдельных случаях большего числа олигонуклеотидов. Последовательность первого олигонуклеотида комплементарна последовательности гена «дикого» типа, второго или других - последовательности одного или нескольких мутантов. Для контроля процессов иммобилизации и гибридизации на ДНК-микрочипе используют контрольные олигонуклеотиды (контроль иммобилизации, положительный контроль гибридизации и отрицательный контроль гибридизации). Последовательности специфических и контрольных олигонуклеотидов приведены в таблице 1.In the future, to determine one mutation, a set of two or, in some cases, a larger number of oligonucleotides is used. The sequence of the first oligonucleotide is complementary to the sequence of the gene of the "wild" type, the second or others - the sequence of one or more mutants. To control the processes of immobilization and hybridization on a DNA microarray, control oligonucleotides are used (immobilization control, positive hybridization control and negative hybridization control). The sequence of specific and control oligonucleotides are shown in table 1.
Специфические олигонуклеотиды и контрольные олигонуклеотиды иммобилизуются одновременно в виде матрицы на поверхности микрочипов из нерастворимого носителя, в качестве которого может быть использовано стекло, пористые мембранные носители и другие материалы. Общий вид ДНК-чипа и расположение специфических олигонуклеотидов на нем изображены на фиг.2. Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. Размер пятен определяется параметрами используемого оборудования и принципа нанесения. Контроли иммобилизации и гибридизации наносят на линии, ограничивающие микрочип сверху и снизу, либо справа и слева. Олигонуклеотиды для выявления одной точечной мутации располагают в виде двух линий, каждая из трех точек, друг под другом. Число линий для определения одной мутации увеличивается, если имеется несколько вариантов полиморфизма гена в исследуемом участке. В качестве специфических олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и выявления положений мутации 238/240 в генах SHV типа используют смесь двух олигонуклеотидов в соотношении 1:1 (смесь олигонуклеотидов 30 и 31 для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа, смесь олигонуклеотидов 20 и 21 для положения, соответствующего ферменту «дикого» типа SHV-1, смесь олигонуклеотидов 22 и 23 и смесь олигонуклеотидов 28 и 29 для мутантов S_238/240_MT_1 и S_238/240_MT_6, соответственно).Specific oligonucleotides and control oligonucleotides are immobilized simultaneously in the form of a matrix on the surface of microchips from an insoluble carrier, which can be used glass, porous membrane carriers and other materials. General view of the DNA chip and the location of specific oligonucleotides on it are shown in Fig.2. Each oligonucleotide is applied in the form of three spots located in a horizontal line. The size of the spots is determined by the parameters of the equipment used and the principle of application. Immobilization and hybridization controls are applied to lines limiting the microchip from above and below, or to the right and left. Oligonucleotides for detecting one point mutation are arranged in the form of two lines, each of three points, one under the other. The number of lines for determining one mutation increases if there are several variants of gene polymorphism in the study area. As specific oligonucleotides for identifying STX-M type beta-lactamases genes and identifying 238/240 mutation positions in SHV type genes, a 1: 1 mixture of two oligonucleotides is used (a mixture of oligonucleotides 30 and 31 for identifying STX-M type beta-lactamases , a mixture of oligonucleotides 20 and 21 for the position corresponding to the wild-type enzyme SHV-1, a mixture of oligonucleotides 22 and 23 and a mixture of oligonucleotides 28 and 29 for mutants S_238 / 240_MT_1 and S_238 / 240_MT_6, respectively).
Определение генов бета-лактамаз и точечных мутаций в них проводят методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе:The determination of beta-lactamase genes and point mutations in them is carried out by the method of hybridization analysis on a DNA microarray:
1. Выделение ДНК из клинического образца;1. Isolation of DNA from a clinical sample;
2. Амплификация ДНК методом ПЦР с одновременным введением метки-биотина;2. Amplification of DNA by PCR with the simultaneous introduction of biotin tags;
3. Фрагментация меченой ДНК с помощью ДНКазы;3. Fragmentation of labeled DNA using DNase;
4. Гибридизация меченой ДНК с иммобилизованными на ДНК-микрочипе олигонуклеотидами;4. Hybridization of labeled DNA with oligonucleotides immobilized on a DNA microchip;
5. Детекция активности метки на поверхности микрочипа;5. Detection of label activity on the surface of the microchip;
6. Получение изображения микрочипа на сканере и анализ результатов.6. Obtaining a microchip image on a scanner and analyzing the results.
В результате использования микрочипа с иммобилизованным набором олигонуклеотидов в гибридизационном анализе образцов ДНК, выделенных из клинических образцов возбудителей, достигается следующий технический результат:As a result of using a microchip with an immobilized set of oligonucleotides in the hybridization analysis of DNA samples isolated from clinical samples of pathogens, the following technical result is achieved:
высокоспецифичное одновременное определение генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и ключевых мутаций в них.highly specific simultaneous determination of beta-lactamase genes TEM, SHV and CTX-M types and key mutations in them.
Состав олигонуклеотидов на ДНК-микрочипе может быть расширен путем добавления новых специфических нуклеотидов для идентификации других мутаций в генах бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов, либо для идентификации бета-лактамаз других типов при сохранении способа проведения анализа.The composition of oligonucleotides on a DNA microarray can be expanded by adding new specific nucleotides to identify other mutations in the TEM, SHV, and CTX-M types of beta-lactamases, or to identify other types of beta-lactamases while maintaining the method of analysis.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Examples confirming the possibility of carrying out the invention.
Приведенные далее примеры предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не ограничивают объем защиты изобретения.The following examples are intended only to confirm the feasibility of the invention and do not limit the scope of protection of the invention.
Пример 1.Example 1
Сравнение специфичности определения точечных мутаций в генах бета-лактамаз методом гибридизационного анализа на микрочипах с флуоресцентной и колориметрической детекцией.Comparison of the specificity of determining point mutations in beta-lactamase genes by hybridization analysis on microarrays with fluorescence and colorimetric detection.
На поверхности микрочипа из стекла с эпоксигруппами или пористого мембранного носителя иммобилизуют олигонуклеотиды из растворов с концентрацией 20 мкМ в солевом буфере (160 мМ Nа2SO4, 130 мМ Na2HPO4) нанесением на микрочип зон в виде пятен с диаметром от 50 до 350 мкм с помощью миниплоттера «Xact Arrayer» (LabNEXT Inc, США). Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. После нанесения микрочипы из стекла инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, отмывают 5 мин в 0,1% TritonX-100, 4 мин в 0,05% растворе НCl, 10 мин в 100 мМ КCl при постоянном встряхивании на горизонтальном шейкере при комнатной температуре. Для блокирования свободных эпоксигрупп инкубируют микрочипы в блокирующем растворе (25% раствор этиленгликоля, содержащий 0,05% НCl) при 50°С в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.Oligonucleotides from solutions with a concentration of 20 μM in salt buffer (160 mM Na 2 SO 4 , 130 mM Na 2 HPO 4 ) are immobilized on the surface of a microchip of glass with epoxy groups or a porous membrane carrier by applying spots to the microchip in the form of spots with diameters from 50 to 350 μm using a mini-plotter "Xact Arrayer" (LabNEXT Inc, USA). Each oligonucleotide is applied in the form of three spots located in a horizontal line. After application, glass microchips are incubated in a thermostat for 30 min at 60 ° C, washed for 5 min in 0.1% TritonX-100, 4 min in a 0.05% HCl solution, 10 min in 100 mM KCl with constant shaking on a horizontal shaker at room temperature. To block free epoxy groups, microarrays are incubated in a blocking solution (25% ethylene glycol solution containing 0.05% HCl) at 50 ° C for 15 min with constant stirring, then washed in deionized water for 1 min and dried.
После нанесения микрочипы из мембранного носителя инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.After application, the microarrays from the membrane carrier are incubated in a thermostat for 30 minutes at 60 ° C, then washed in deionized water for 1 minute and dried.
Для гибридизации 500 нг фрагментированной меченной биотином или флуоресцентной меткой Су3 ДНК растворяли в 400 мкл гибридизационного буфера (2×SSPE (0,8 М NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 5 мМ ЭДТА), рН 7.7, содержащем 0,2% додецилсульфата натрия). Гибридизационную смесь наносили на ДНК-микрочип и инкубировали в течение 2 часов при температуре 45°С. После гибридизации проводили отмывку микрочипа в три стадии: 1) 2×SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, содержащем 0,1% SDS, 2) 2×SSC и 3) 0,2×SSC, каждая стадия по 10 мин при комнатной температуре. Затем микрочипы с флуоресцентной детекцией сканировали на сканере ScanArray (Perkin Elmer) с разрешение 5 мкм. Микрочипы с биотином в качестве метки инкубировали в растворе конъюгата стрептавидин-пероксидаза (разведение 1/1000) в ФБСТ (0,01 М КН2РO4, 0,15 М NaCl, 0,05% Tween20 pH 7.0), содержащем 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере. После инкубации микрочипы отмывали (2 раза по 5 мин в ФБСТ, 1 раз - 5 мин в ФБС (0,01 М КН2РO4, 0,15 М NaCl, рН 7.0)) и помещали в субстратный раствор, содержащий 9,5 мл 0.1 М ацетатного буфера рН 5,5, 0,75 мл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (6,3 мг/мл диметилсульфоксида), 1,5 мл 5% декстран сульфата натрия и 0,075 мл 0,2 М пероксида водорода, на 10 мин при комнатной температуре. После окрашивания микрочипы промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Далее микрочипы сканировали на оптическом сканере Perfection V750 Pro (Epson) при разрешении 4800 dpi. Полученные изображения результатов гибридизации (в tiff формате) обрабатывали количественно с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0). Результаты представлены на фиг.1.For hybridization, 500 ng of fragmented biotin-labeled or fluorescent Su3 tag DNA was dissolved in 400 μl of hybridization buffer (2 × SSPE (0.8 M NaCl, 50 mm NaH 2 PO 4 , 5 mm EDTA), pH 7.7, containing 0.2% dodecyl sulfate sodium). The hybridization mixture was applied to a DNA microarray and incubated for 2 hours at a temperature of 45 ° C. After hybridization, the microchip was washed in three stages: 1) 2 × SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate containing 0.1% SDS, 2) 2 × SSC and 3) 0.2 × SSC, each stage 10 min at room temperature. Then, fluorescence detection microarrays were scanned on a ScanArray scanner (Perkin Elmer) with a resolution of 5 μm. Microchips with biotin as a label were incubated in a solution of streptavidin peroxidase conjugate (1/1000 dilution) in PBS (0.01 M KN 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, 0.05% Tween20 pH 7.0) containing 1% BSA , for 1 hour at room temperature with shaking on a horizontal shaker. After incubation, the microchips were washed (2 times, 5 min in FBST, 1 time - 5 min in PBS (0.01 M KN 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH 7.0)) and placed in a substrate solution containing 9.5 ml of 0.1 M acetate buffer pH 5.5, 0.75 ml of a solution of 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (6.3 mg / ml of dimethyl sulfoxide), 1.5 ml of 5% dextran sodium sulfate and 0.075 ml 0, 2 M hydrogen peroxide, for 10 min at room temperature. After staining, the microchips were washed with distilled water and dried in air. Next, the microchips were scanned on a Perfection V750 Pro optical scanner (Epson) at a resolution of 4800 dpi. The obtained images of hybridization results (in tiff format) were processed quantitatively using the Scan Array Express program (PerkinElmer, version 3.0). The results are presented in figure 1.
Пример 2.Example 2
Иммобилизация специфических олигонуклеотидов на поверхности микрочипа из стекла.Immobilization of specific oligonucleotides on the surface of a glass microchip.
На поверхности микрочипа из стекла с эпоксигруппами или пористого мембранного ностеля иммобилизуют олигонуклеотиды из растворов с концентрацией 20 мкМ в солевом буфере (160 мМ Na2SO4, 130 мМ Na2HPO4) нанесением на микрочип зон в виде пятен с диаметром от 50 до 350 мкм с помощью миниплоттера «Xact Arrayer» (LabNEXT Inc, США) по схеме, представленной на фиг.2. Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. Олигонуклеотиды для выявления одной точечной мутации располагают в виде двух линий, каждая из трех точек, друг под другом. В качестве специфических олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и выявления положений мутации 238/240 в генах SHV типа используют смесь двух олигонуклеотидов в соотношении 1:1 (смесь олигонуклеотидов 30 и 31 для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа, смесь олигонуклеотидов 20 и 21 для положения, соответствующего ферменту «дикого» типа SHV-1, смесь олигонуклеотидов 22 и 23 и смесь олигонуклеотидов 28 и 29 для мутантов S_238/240_MT_1 и S_238/240_MT_6, соответственно).Oligonucleotides from solutions with a concentration of 20 μM in salt buffer (160 mM Na 2 SO 4 , 130 mM Na 2 HPO 4 ) are immobilized on the surface of a microchip made of glass with epoxy groups or a porous membrane nostel. μm using a mini-plotter "Xact Arrayer" (LabNEXT Inc, USA) according to the scheme shown in figure 2. Each oligonucleotide is applied in the form of three spots located in a horizontal line. Oligonucleotides for detecting one point mutation are arranged in the form of two lines, each of three points, under each other. As specific oligonucleotides for identifying STX-M type beta-lactamases genes and identifying 238/240 mutation positions in SHV type genes, a 1: 1 mixture of two oligonucleotides is used (a mixture of oligonucleotides 30 and 31 for identifying STX-M type beta-lactamases , a mixture of oligonucleotides 20 and 21 for the position corresponding to the wild-type enzyme SHV-1, a mixture of oligonucleotides 22 and 23 and a mixture of oligonucleotides 28 and 29 for mutants S_238 / 240_MT_1 and S_238 / 240_MT_6, respectively).
После нанесения микрочипы из стекла инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, отмывают 5 мин в 0,1% TritonX-100, 4 мин в 0,05% растворе НCl, 10 мин в 100 мМ КCl при постоянном встряхивании на горизонтальном шейкере при комнатной температуре. Для блокирования свободных эпоксигрупп инкубируют микрочипы в блокирующем растворе (25% раствор этиленгликоля, содержащий 0,05% НCl) при 50°С в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.After application, glass microchips are incubated in a thermostat for 30 min at 60 ° C, washed for 5 min in 0.1% TritonX-100, 4 min in a 0.05% HCl solution, 10 min in 100 mM KCl with constant shaking on a horizontal shaker at room temperature. To block free epoxy groups, microarrays are incubated in a blocking solution (25% ethylene glycol solution containing 0.05% HCl) at 50 ° C for 15 min with constant stirring, then washed in deionized water for 1 min and dried.
После нанесения микрочипы из мембранного носителя инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.After application, the microarrays from the membrane carrier are incubated in a thermostat for 30 minutes at 60 ° C, then washed in deionized water for 1 minute and dried.
Пример 3.Example 3
Идентификация гена бета-лактамаз ТЕМ типа и определение точечных мутаций в нем методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией.Identification of the TEM type beta-lactamase gene and determination of point mutations in it by the method of hybridization analysis on a DNA microarray with colorimetric detection.
Для выделения ДНК исследуемые образцы энтеробактерий рассеивались до отдельных колоний на чашки с агаром. Чашки инкубировали в термостате при 37°С в течение 12-15 часов. Затем 2-3 одинаковые колонии (1/2 петли) переносили с помощью стерильной 1-мкл петли в 0,5-мл центрифужную пробирку с 400 мкл стерильной деионизированной воды, суспендировали и микробные клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 7000 g. Затем удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 100 мкл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7.5). Инкубировали пробирки на водяной бане при 99°С в течение 20 мин. Встряхивали и центрифугировали пробирку при 7000 g в течение 3 мин, далее для ПЦР использовали супернатант.To isolate DNA, the studied samples of enterobacteria were scattered to separate colonies on agar plates. The cups were incubated in a thermostat at 37 ° C for 12-15 hours. Then 2-3 identical colonies (1/2 loops) were transferred using a sterile 1 μl loop into a 0.5 ml centrifuge tube with 400 μl of sterile deionized water, suspended and microbial cells were pelleted by centrifugation for 2 min at 7000 g. The supernatant was then removed and the pellet resuspended in 100 μl TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Tubes were incubated in a water bath at 99 ° C for 20 minutes. The tube was shaken and centrifuged at 7000 g for 3 min, then the supernatant was used for PCR.
Амплификацию методом ПЦР проводили в пробирках на 0,5 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1×Taq ДНК полимеразный буфер (2,5 мМ ацетата магния, 50 мМ КCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8.3), 2,5 ед. Taq ДНК-полимераза, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-биотин, по 0,4 мкМ смеси прямых праймеров (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3', 5'-TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3') и 5 мкл раствора образца ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 30 циклов амплификации (20 сек денатурация при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при 55°С, 45 сек элонгации при 72°С), затем 8 мин финальная элонгация при 72°С.PCR amplification was carried out in 0.5 ml tubes in a volume of 25 μl. The composition of the reaction mixture included: 1 × Taq DNA polymerase buffer (2.5 mm magnesium acetate, 50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl, pH 8.3), 2.5 units Taq DNA polymerase, 100 μM dATP, dGTP, dCTP, 60 μM dTTP, 40 μM dUTP-biotin, 0.4 μM direct primer mixes (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3 ', 5'-TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3) μl DNA sample solution. Amplification was carried out in a Mastercycler gradient amplifier (Eppendorf, Germany) according to the following protocol: denaturation for 2 min at 94 ° C, then 30 cycles of amplification (20 sec denaturation at 94 ° C, 30 sec annealing of primers at 55 ° C, 45 sec elongation at 72 ° C), then 8 min final elongation at 72 ° C.
Для фрагментации амплифицированный ген бета-лактамазы растворяли в концентрации 30 нг/мкл в реакционном буфере (40 мМ Трис-НCl, 10 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2, рН 8.0) и добавляли ДНКазу в концентрации 0,2 мU/нг ДНК. Фрагментацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Реакцию останавливали, добавляя 3 мМ ЭДТА и инкубируя 10 мин в термостате при 65°С.For fragmentation, the amplified beta-lactamase gene was dissolved at a concentration of 30 ng / μl in the reaction buffer (40 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 1 mM CaCl 2 , pH 8.0) and DNase was added at a concentration of 0.2 mU / ng DNA. Fragmentation was carried out at room temperature for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 3 mm EDTA and incubating for 10 min in an incubator at 65 ° C.
Для гибридизации 500 нг фрагментированной меченой ДНК растворяли в 400 мкл гибридизационном буфере (2×SSPE (0,8 М NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 5 мМ ЭДТА), рН 7.7, содержащем 0,2% додецилсульфата натрия). Гибридизационную смесь наносили на ДНК-микрочип и инкубировали в течение 2 часов при температуре 45°С. После гибридизации проводили отмывку микрочипа в три стадии: 1) 2×SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, содержащем 0,1% SDS, 2) 2×SSC и 3) 0,2×SSC, каждая стадия по 10 мин при комнатной температуре. Затем микрочипы инкубировали в растворе конъюгата стрептавидин-пероксидаза (разведение 1/1000) в ФБСТ (0,01 М КН3РO4, 0,15 М NaCl, 0,05% Tween20 pH 7.0), содержащем 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере. После инкубации микрочипы отмывали (2 раза по 5 мин в ФБСТ, 1 раз - 5 мин в ФБС (0,01 М КН2РO4, 0,15 М NaCl, pH 7.0)) и помещали в субстратный раствор, содержащий 9,5 мл 0.1 М ацетатного буфера, pH 5,5, 0,75 мл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (6,3 мг/мл диметилсульфоксида), 1,5 мл 5% декстран сульфата натрия и 0,075 мл 0,2 М пероксида водорода, на 10 мин при комнатной температуре. После окрашивания микрочипы промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Далее микрочипы сканировали на оптическом сканере Perfection V750 Pro (Epson) при разрешении 4800 dpi. Полученное изображение (в tiff формате) обрабатывали количественно с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0). Результаты представлены на фиг.3.For hybridization, 500 ng of fragmented labeled DNA was dissolved in 400 μl of hybridization buffer (2 × SSPE (0.8 M NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM EDTA), pH 7.7, containing 0.2% sodium dodecyl sulfate). The hybridization mixture was applied to a DNA microarray and incubated for 2 hours at a temperature of 45 ° C. After hybridization, the microchip was washed in three stages: 1) 2 × SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate containing 0.1% SDS, 2) 2 × SSC and 3) 0.2 × SSC, each stage 10 min at room temperature. Then, the microarrays were incubated in a solution of streptavidin peroxidase conjugate (1/1000 dilution) in PBS (0.01 M KN 3 PO 4 , 0.15 M NaCl, 0.05% Tween20 pH 7.0) containing 1% BSA for 1 hours at room temperature with shaking on a horizontal shaker. After incubation, the microchips were washed (2 times, 5 min in FBS, 1 time - 5 min in PBS (0.01 M KH 2 PO 4 , 0.15 M NaCl, pH 7.0)) and placed in a substrate solution containing 9.5 ml of 0.1 M acetate buffer, pH 5.5, 0.75 ml of a solution of 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (6.3 mg / ml of dimethyl sulfoxide), 1.5 ml of 5% dextran sodium sulfate and 0.075 ml 0 , 2 M hydrogen peroxide, for 10 min at room temperature. After staining, the microchips were washed with distilled water and dried in air. Next, the microchips were scanned on a Perfection V750 Pro optical scanner (Epson) at a resolution of 4800 dpi. The resulting image (in tiff format) was processed quantitatively using the Scan Array Express program (PerkinElmer, version 3.0). The results are presented in figure 3.
Пример 4.Example 4
Идентификация смеси генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и определение точечных мутаций методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией.Identification of a mixture of TEM, SHV and CTX-M beta-lactamase genes and determination of point mutations by hybridization analysis on a DNA microarray with colorimetric detection.
Микрочип готовили, как описано в примере 2. Выделение ДНК из образца проводили, как описано в примере 3. Амплификацию методом ПЦР проводили в пробирках на 0,5 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1×Taq ДНК полимеразный буфер (2,5 мМ ацетата магния, 50 мМ КCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.3), 2,5 ед. Taq ДНК-полимераза, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-биотин, по 0,4 мкМ смеси прямых праймеров (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3', 5 '-TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3', 5'-ATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAG-3', 5'-ATGATGACTCAGAGCATTCGCC-3', 5'-GGTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3') и обратных праймеров (5'-CTTAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3', 5'-GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG-3', 5'-CCGTCGGTGACGATTTTAGCCG-3', 5'-CCGTGGGTTACGATTTTCGCCG-3', 5'-CCCTTCGGCGATGATTCTCGC-3') и 5 мкл раствора образца ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 30 циклов амплификации (20 сек денатурация при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при 65°С, 45 сек элонгации при 72°С), затем 8 мин финальная элонгация при 72°С. Фрагментирование гена, гибридизацию на ДНК микрочипе и детекцию проводили, как описано в примере 3. Результаты представлены на фиг.4.A microchip was prepared as described in example 2. DNA was extracted from the sample as described in example 3. Amplification by PCR was carried out in 0.5 ml tubes in a volume of 25 μl. The reaction mixture included: 1 × Taq DNA polymerase buffer (2.5 mm magnesium acetate, 50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl, pH 8.3), 2.5 units Taq DNA polymerase, 100 μM dATP, dGTP, dCTP, 60 μM dTTP, 40 μM dUTP-Biotin, 0.4 μM direct primer mixes (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3 ', 5' -TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3 -ATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAG-3 ', 5'-ATGATGACTCAGAGCATTCGCC-3', 5'-GGTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3 ') and reverse primers (5'-CTTAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3', 5GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCGTCGTGTGTGTGTGTCGTGTGTGTGTGTCGTCGTGTGTCGTCGTGTCGTC 5'-CCGTGGGTTACGATTTTCGCCG-3 ', 5'-CCCTTCGGCGATGATTCTCGC-3') and 5 μl DNA sample solution. Amplification was carried out in a Mastercycler gradient thermocycler (Eppendorf, Germany) according to the following protocol: denaturation for 2 min at 94 ° С, then 30 cycles of amplification (20 sec denaturation at 94 ° С, 30 sec annealing of primers at 65 ° С, 45 sec. Elongation at 72 ° C), then 8 min final elongation at 72 ° C. Fragmentation of the gene, hybridization on a DNA microarray and detection were performed as described in example 3. The results are presented in figure 4.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009139127/10A RU2415937C1 (en) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009139127/10A RU2415937C1 (en) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2415937C1 true RU2415937C1 (en) | 2011-04-10 |
Family
ID=44052143
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009139127/10A RU2415937C1 (en) | 2009-10-23 | 2009-10-23 | Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2415937C1 (en) |
-
2009
- 2009-10-23 RU RU2009139127/10A patent/RU2415937C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Уляшова М.М., Рубцова М.Ю., Егоров A.M. Метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией для определения точечных мутаций в генах, выставка инновационных проектов, МГУ им. М.В.Ломоносова, химический факультет, сборник тезисов. - М., 2008, с.34. Ling-Xiang Zhu et al. Multiplex Asymmetric PCR-Based Oligonucleotide Microarray for Detection of Drug Resistance Genes Containing Single Mutations in Enterobacteriaceae, Published online 2007 July 23. doi: 10.1128/AAC.01461-06 Copyright © American Society for Microbiology, 2007 October; 51(10): 3707-3713. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI410491B (en) | A novel method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system | |
US20110269130A1 (en) | Antibiotice Susceptibility Profiling Methods | |
US20110245094A1 (en) | Detection of microbial nucleic acids | |
US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
US20120171681A1 (en) | Oligonucleotides, methods and kits for detecting and identifying vancomycin-resistant enterococcus | |
JP4662578B2 (en) | Methods and kits for identifying antibiotic-resistant microorganisms | |
Kim et al. | Detection of representative enteropathogenic bacteria, Vibrio spp., pathogenic Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., and Yersinia enterocolitica, using a virulence factor gene-based oligonucleotide microarray | |
JP2006525809A5 (en) | ||
US20230175076A1 (en) | Primer set and probe for detecting klebsiella spp. bacteria | |
US20090215638A1 (en) | Antibiotic susceptibility and virulence factor detection in pseudomonas aeruginosa | |
US20100167956A1 (en) | Dna chip for detection of escherichia coli | |
EP2473630B1 (en) | Optimized probes and primers and methods of using same for the detection, screening, isolation and sequencing of vancomycin resistance genes and vancomycin resistant enterococci | |
WO2009126517A2 (en) | Optimized probes and primers and methods of using same for the detection, quantification and grouping of hiv-1 | |
RU2415932C1 (en) | Method for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes | |
RU2415937C1 (en) | Dna microchip for identifying extended spectrum class a beta-lactamase genes | |
US20080124736A1 (en) | Detection of virulence markers of staphylococci | |
WO2019221219A1 (en) | Method for examining bacterium, microarray for examining bacterium, kit for examining bacterium, probe set for examining bacterium, and primer set for examining bacterium | |
RU2685188C2 (en) | Dna-chip for identifying genetic determinant of antibiotic resistance of infectious agents leading to disturbed human reproductive functions, kit of oligonucleotides for immobilization on dna-chip | |
RU2636457C2 (en) | Oligonucleotide biochip for identification of genetic determinant of neisseria gonorrhoeae resistance to antimicrobial preparations, set of oligonucleotides used for immobilisation on biochip | |
US20100167951A1 (en) | Dna chip for detection of staphylococcus aureus | |
KR20200048076A (en) | Kit for diagnosing infection due to severe fever with thrombocytopenia syndrome virus | |
RU2741099C1 (en) | Method for identifying mutations in the gene of penicillin-binding protein 2 pena neisseria gonorrhoeae, leading to resistance to beta-lactam antibiotics, on biological microchips | |
Nsofor et al. | DNA microarray-based detection of antibiotic resistance genes of human isolates of Escherichia coli in Nigeria | |
KR20140019219A (en) | Development of species-specific pcr method for detection of acinetobacter species | |
ES2711509T3 (en) | Detection of Streptococcus pneumoniae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131024 |