RU2412443C1

RU2412443C1 - Method for immunoenzymometric detection of t-2 mycotoxin in liquid samples

Info

Publication number: RU2412443C1
Application number: RU2009133506/15A
Authority: RU
Inventors: Михаил Юрьевич Дубровин (RU); Михаил Юрьевич Дубровин; Алексей Александрович Кытманов (RU); Алексей Александрович Кытманов; Людмила Владимировна Бакулина (RU); Людмила Владимировна Бакулина; Константин Анатольевич Воробьев (RU); Константин Анатольевич Воробьев; Илья Владимирович Дармов (RU); Илья Владимирович Дармов
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2011-02-20

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: during immunoenzymometric analysis, a solid-phase antigen is immobilised on the surface of a solid phase. Further, a sample and a preparation which contains specific antigens with which free mycotoxin and the solid phase compete to bind are added. An anti-specific immunoenzymometric conjugate is then added and finally results are evaluated using a substrate-indicator mixture. The solid-phase antigen used is a conjugate of T-2 mycotoxin with an antigen of fraction 1 of a pestilential microbe. Rabbit hyperimmune serum is used at the competitive binding step.

EFFECT: invention increases sensitivity and specificity during detection of T-2 mycotoxin in liquid samples.

2 ex

Description

Изобретение относится к биохимическим методам анализа, в частности к иммуноферментному анализу, и может быть использовано в санитарно-эпидемиологических, медицинских и ветеринарных исследованиях.The invention relates to biochemical methods of analysis, in particular to enzyme immunoassay, and can be used in sanitary-epidemiological, medical and veterinary studies.

Микотоксин Т-2 (3-гидрокси-4,15-диацетокси-8-изобутирилокси-12,13-эпокси-трихтец-9-ен) является вторичным метаболитом плесневых грибов рода Fusarium, развивающихся на зерновых и некоторых других сельскохозяйственных культурах.Mycotoxin T-2 (3-hydroxy-4,15-diacetoxy-8-isobutyryloxy-12,13-epoxy-trichtec-9-ene) is a secondary metabolite of mold fungi of the genus Fusarium, developing on cereals and some other agricultural crops.

В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксином Т-2, основной мерой защиты от неблагоприятного воздействия этого токсина является гигиеническое регламентирование его содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах, с последующим контролем качества и отбраковкой загрязненных продуктов. В связи с этим, важное значение приобретает поиск и изучение способов обнаружения микотоксина Т-2 в продовольственном сырье и пищевых продуктах.Due to the fact that it is practically impossible to completely prevent the infection of agricultural products with microscopic fungi and their contamination with mycotoxin T-2, the main measure of protection against the adverse effects of this toxin is the hygienic regulation of its content in food raw materials and food products, followed by quality control and rejection of contaminated products. In this regard, the search and study of methods for the detection of T-2 mycotoxin in food raw materials and foods is of great importance.

Известны физико-химические способы обнаружения микотоксина Т-2: тонкослойная хроматография (Scott P.M. et al. // Appl. Microbiol. - 1970; Методика выполнения измерений массовой доли микотоксинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом тонкослойной хроматографии. М-МВИ-68-00/НПО «Мониторинг». - С.-П., М., 2000), газожидкостная хроматография (Cohen, H et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1984; Rood, H.D. et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1988; Rosen J.D. // J. Chromatogr., 1988), газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (Roach J.А. // Biomed. Environ. Mass Spectrom. - 1989), высокоэффективная жидкостная хроматография (Kuronen P. // Arch. Environ. Contam. Toxcicol. - 1989). Однако эти способы для достижения приемлемого уровня чувствительности анализа предполагают проведение продолжительной и трудоемкой пробоподготовки, обеспечивающей концентрирование токсина в пробе и удаление из нее балластных примесей; кроме того, пробоподготовка в таких случаях включает химическую модификацию очищенного токсина для обеспечения его летучести, и(или) для обеспечения его окраски, так как микотоксин Т-2 не поглощает свет ни в видимой, ни в ультрафиолетовой областях и не флуоресцирует. Такой сложный комплекс пробоподготовки вынуждает исследователя использовать для анализа дорогостоящее оборудование, большие объемы различных химических реагентов, что обусловливает необходимость проведения анализа только в специализированных лабораториях и только высококвалифицированными специалистами, что в свою очередь затрудняет применение этих методов для массового контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов.Known physico-chemical methods for the detection of T-2 mycotoxin: thin layer chromatography (Scott PM et al. // Appl. Microbiol. - 1970; Method for measuring the mass fraction of mycotoxins in food products and food raw materials by thin layer chromatography. M-MVI-68- 00 / NPO Monitoring. - S.-P., M., 2000), gas-liquid chromatography (Cohen, H et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1984; Rood, HD et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1988; Rosen JD // J. Chromatogr., 1988), gas chromatography combined with mass spectrometry (Roach J.A. // Biomed. Environ. Mass Spectrom. - 1989), high performance liquid chromatography (Kuronen P. // Arch. Environ. Contam. Toxcicol. - 1989). However, these methods, in order to achieve an acceptable level of analysis sensitivity, require a lengthy and laborious sample preparation, which ensures concentration of the toxin in the sample and removal of ballast impurities from it; in addition, sample preparation in such cases involves the chemical modification of the purified toxin to ensure its volatility, and (or) to ensure its color, since the T-2 mycotoxin does not absorb light in the visible or ultraviolet regions and does not fluoresce. Such a complex set of sample preparation forces the researcher to use expensive equipment, large volumes of various chemical reagents for analysis, which necessitates analysis only in specialized laboratories and only highly qualified specialists, which in turn makes it difficult to use these methods for mass control of food raw materials and food products.

Известен ряд серологических способов обнаружения микотоксина Т-2.A number of serological methods for the detection of mycotoxin T-2 are known.

Может быть использован радиоиммунный анализ (Fontelo P.A. // Appl. Environ. Microbiol. - 1983), однако использование радиоактивных изотопов предусматривает наличие специально оборудованных лабораторий и квалифицированного персонала, что делает его весьма дорогостоящим, а так же малоприменимым для массового использования.Radioimmune analysis can be used (Fontelo P.A. // Appl. Environ. Microbiol. - 1983), however, the use of radioactive isotopes provides for the presence of specially equipped laboratories and qualified personnel, which makes it very expensive and also unsuitable for mass use.

Известен способ прямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализ (Gendloff Е.Н. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984; De Saeger S., Peteghem C.V. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996; Sibanda L. // J. Agric. Food Chem. - 2000). В данном способе на первом этапе специфические антитела иммобилизуют на твердой поверхности, затем на иммобилизованные антитела наносят одновременно раствор, содержащий свободный микотоксин (контроль или проба) и раствор, содержащий конъюгат микотоксина с ферментной меткой (чаще всего конъюгат с пероксидазой хрена), при этом конъюгат и свободный микотоксин конкурируют за места связывания с антителами. На следующем этапе вносят субстратно-индикаторный раствор, происходит цветная реакция, после чего либо визуально, либо инструментально учитывают результат. У данного метода, общим с заявленным, является наличие стадии конкурентного связывания, однако проведение такого анализа связано со сложной процедурой подготовки иммобилизованных антител, к тому же для такой процедуры как правило необходимы моноклональные антитела против микотоксина, приготовление которых сопряжено с целым рядом дорогостоящих процедур.A known method of direct competitive solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (Gendloff E.N. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984; De Saeger S., Peteghem CV // Appl. Environ. Microbiol. - 1996; Sibanda L. // J. Agric Food Chem. - 2000). In this method, at the first stage, specific antibodies are immobilized on a solid surface, then a solution containing free mycotoxin (control or sample) and a solution containing mycotoxin conjugate with an enzyme label (most often horseradish peroxidase conjugate) are applied to immobilized antibodies simultaneously, while the conjugate is horseradish peroxidase) and free mycotoxin compete for binding sites with antibodies. At the next stage, a substrate-indicator solution is introduced, a color reaction occurs, after which the result is either visually or instrumentally taken into account. This method, in common with the claimed one, has a competitive binding stage, however, such an analysis is associated with a complex procedure for preparing immobilized antibodies; moreover, monoclonal antibodies against mycotoxin are usually required for this procedure, the preparation of which involves a number of expensive procedures.

Известны методы иммуноферментного обнаружения микотоксина Т-2 путем непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (Nagayama S. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984; Hart L.P. et al. // United states patent №4772551. - 1988; Pal A. et al. // Anal. Chem. - 2004). Наиболее близким к заявленному является способ, предложенный Г.Кононенко и соавт. (Кононенко Г.П. и др. Иммуноферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Том 35, №4, - стр.457-462). На поверхности лунок планшета для иммуноферментного анализа иммобилизуют конъюгат микотоксина Т-2 с белковым носителем, на следующей стадии в лунки вносят раствор, содержащий микотоксин (проба или контроль) и раствор специфических поликлональных кроличьих антител, после инкубации планшет промывают. Затем вносят иммуноферментный конъюгат, специфичный к кроличьим антителам, планшет вновь промывают. Вносят субстратно-индикаторный раствор, после остановки цветной реакции серной кислотой учитывают результаты.Known methods for enzyme-linked immunosorbent detection of T-2 mycotoxin by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Nagayama S. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1984; Hart LP et al. // United states patent No. 47772551. 1988; Pal A . et al. // Anal. Chem. - 2004). Closest to the claimed is the method proposed by G. Kononenko et al. (Kononenko G.P. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for determining T-2 toxin in contaminated grain. // Applied Biochemistry and Microbiology. - 1999. - Volume 35, No. 4, - pp. 457-462). Mycotoxin T-2 conjugate with a protein carrier is immobilized on the surface of the wells of the plate for enzyme-linked immunosorbent assay, at the next stage, a solution containing mycotoxin (sample or control) and a solution of specific polyclonal rabbit antibodies are added to the wells, and the plate is washed after incubation. Then, an enzyme-specific immunosorbent conjugate specific for rabbit antibodies was introduced; the plate was washed again. A substrate-indicator solution is introduced, after stopping the color reaction with sulfuric acid, the results are taken into account.

Общим заявленного способа и ближайшего известного являются все стадии (иммобилизация твердофазного антигена, конкурентное связывание, введение ферментной метки, цветная реакция), однако имеются особенности, затрудняющие использование этого способа. Поскольку чистый токсин является гаптеном, т.е. не вызывает иммунный ответ, следовательно, не может сам по себе использоваться для иммунизации животных, для этой цели используют антиген, синтезированный из микотоксина и белка-носителя (обычно бычий сывороточный альбумин). Таким образом, в сыворотке крови животного после иммунизации таким антигеном появляются антитела не только к микотоксину, но и к белку-носителю (т.е. к бычьему сывороточному альбумину), при этом антитела против белка-носителя могут быть специфичны к различным детерминантам молекулы белка. Эти детерминанты могут быть схожи у различных белков, особенно внутри групп, например альбумины. Поскольку микотоксин Т-2 является низкомолекулярным соединением, он не может быть в чистом виде использован в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе в качестве антигена твердой фазы, для этой цели так же используется конъюгат, синтезированный из микотоксина Т-2 и белка носителя. У ближайшего способа в качестве антигена твердой фазы предлагается использовать конъюгат с желатином, либо кроличьим сывороточным альбумином, либо яичный альбумин. В связи с тем, что для иммунизации животных предлагается использовать конъюгат микотоксина Т-2 с бычьим сывороточным альбумином при использовании в конкурентном иммуноферментном анализе нативной гипериммунной сыворотки, полученной от этих животных, невозможно добиться специфичности, что и вынуждает на этапе конкурентного связывания для этой цели использовать особым образом выделенные специфические поликлональные антитела. Процесс получения специфических поликлональных антител является весьма трудоемким и включает целый ряд физико-химических методов с использованием специального оборудования, что существенно повышает стоимость анализа. Кроме того, по этой же причине ближайший способ характеризуется определенным уровнем специфичности и как следствие определенным пределом обнаружения микотоксина Т-2 в пробе.A common claimed method and the closest known are all stages (immobilization of solid-phase antigen, competitive binding, the introduction of an enzyme label, a color reaction), however, there are features that make it difficult to use this method. Since pure toxin is a hapten, i.e. does not cause an immune response, therefore, cannot by itself be used to immunize animals; for this purpose, an antigen synthesized from mycotoxin and a carrier protein (usually bovine serum albumin) is used. Thus, after immunization with such an antigen, antibodies not only to mycotoxin, but also to the carrier protein (i.e., bovine serum albumin) appear in the animal’s blood serum, while antibodies against the carrier protein can be specific to various determinants of the protein molecule . These determinants may be similar in various proteins, especially within groups, such as albumin. Since mycotoxin T-2 is a low molecular weight compound, it cannot be used in its pure form in indirect enzyme-linked immunosorbent assay as a solid phase antigen, a conjugate synthesized from mycotoxin T-2 and a carrier protein is also used for this purpose. In the closest method, it is proposed to use a conjugate with gelatin or rabbit serum albumin or egg albumin as the solid phase antigen. Due to the fact that it is proposed to use mycotoxin T-2 conjugate with bovine serum albumin for immunization of animals when using native hyperimmune serum obtained from these animals in a competitive enzyme immunoassay, it is impossible to achieve specificity, which forces the use of competitive binding for this purpose Specifically isolated specific polyclonal antibodies. The process of obtaining specific polyclonal antibodies is very time-consuming and includes a number of physicochemical methods using special equipment, which significantly increases the cost of analysis. In addition, for the same reason, the closest method is characterized by a certain level of specificity and, as a result, a certain detection limit for T-2 mycotoxin in the sample.

Задачей изобретения является повысить специфичность конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа за счет снижения неспецифических взаимодействий между подложкой и специфическими компонентами.The objective of the invention is to increase the specificity of competitive enzyme-linked immunosorbent assay by reducing non-specific interactions between the substrate and specific components.

Техническим решением задачи является использование в процессе проведения иммуноферментного анализа твердофазного антигена, в состав которого входит такой белок-носитель, к которому у животного продуцента сыворотки гарантированно отсутствуют антитела, что приводит к повышению специфичности анализа при обнаружении микотоксина, повышению чувствительности, а также позволяет при проведении конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа использовать в качестве препарата антител гипериммунную сыворотку.The technical solution to the problem is to use a solid-phase antigen in the process of conducting an enzyme-linked immunosorbent assay, which includes such a carrier protein, to which the animal serum producer is guaranteed to have no antibodies, which increases the specificity of the analysis when mycotoxin is detected, increases sensitivity, and also allows for use a competitive enzyme-linked immunosorbent assay to use hyperimmune serum as an antibody preparation.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве белка-носителя в составе твердофазного антигена используют антиген фракции 1 чумного микроба (по Baker), который является абсолютно видоспецифичным белком, то есть у животных - продуцентов сыворотки, не болевших чумой, исключается наличие антител к этому белку.This object is achieved in that as a carrier protein in the composition of the solid-phase antigen, a plague microbe fraction 1 antigen is used (according to Baker), which is an absolutely species-specific protein, that is, in animals producing serum without plague, the presence of antibodies to this protein is excluded .

Пример 1Example 1

В лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 0,1 мл раствора твердофазного антигена в рабочем разведении. Планшет инкубируют в течение 30 минут при температуре 35°С. После инкубации лунки планшета трижды промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором с добавлением твина-20. После удаления остатков буфера из лунок в них последовательно вносят по 0,05 мл контрольных растворов микотоксина Т-2 или анализируемых проб, затем по 0,05 мл кроличьей гипериммунной сыворотки в рабочем разведении. Стадию конкурентного связывания так же проводят в течение 30 минут при температуре 35°С. После инкубации планшет вновь трижды промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором с добавлением твина-20, затем в лунки вносят по 0,1 мл раствора иммуноферментного пероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кролика, который инкубируют в лунках при температуре 35°С в течение 30 минут. После трехкратной промывки лунок в них вносят по 0,1 мл раствора перекисной субстратно-индикаторной смеси, реакция перекисного окисления субстрата проводят в течение 20 минут в темноте. После чего реакцию останавливают внесением раствора серной кислота по 0,1 мл в лунку. Результаты анализа учитывают визуально, либо с помощью планшетного фотометра. Отсутствие окрашенного продукта перекисной реакции в лунке указывает на наличие в пробе внесенного в эту лунку микотоксина Т-2.0.1 ml of solid-phase antigen in working dilution is added to the wells of the polystyrene plate for enzyme-linked immunosorbent assay. The plate is incubated for 30 minutes at a temperature of 35 ° C. After incubation, the wells of the plate are washed three times with phosphate-buffered saline with the addition of Tween-20. After removing buffer residues from the wells, 0.05 ml of control solutions of T-2 mycotoxin or analyzed samples are successively added to them, then 0.05 ml of rabbit hyperimmune serum in working dilution. Stage competitive binding is also carried out for 30 minutes at a temperature of 35 ° C. After incubation, the plate is again washed three times with phosphate-buffered saline with the addition of Tween-20, then 0.1 ml of a solution of the enzyme-linked immunosorbent anti-rabbit immunoglobulin conjugate is added to the wells, which are incubated in the wells at a temperature of 35 ° C for 30 minutes. After washing the wells three times, they add 0.1 ml of a solution of peroxide substrate-indicator mixture to them, the reaction of peroxidation of the substrate is carried out for 20 minutes in the dark. After which the reaction is stopped by introducing a solution of sulfuric acid at 0.1 ml per well. The results of the analysis are taken into account visually, or using a tablet photometer. The absence of a colored peroxide reaction product in the well indicates the presence of T-2 mycotoxin added to the well in the sample.

Пример 2Example 2

На нитроцеллюлозную полоску наносят точечно 5 мкл твердофазного антигена, подсушивают, полоску помещают в физиологический раствор, содержащий 20% твин-20. После этого погружают полоску в раствор гипериммунной сыворотки, с одновременным внесением в этот раствор анализируемой пробы (контрольную полоску погружают в раствор, не содержащий микотоксин Т-2), проводят конкурентное связывание в течение 20 минут. После этого полоску вновь промывают физиологическим раствором с твином-20. Затем полоску инкубируют в растворе антивидового иммуноферментного конъюгата в течение 20 минут. После промывки полоску переносят в раствор субстратно-индикаторной смеси. Результаты учитывают визуально по истечении 10 минут. Отсутствие окрашенного продукта перекисной реакции указывает на наличие в анализируемой пробе микотоксина Т-2.On a nitrocellulose strip, 5 μl of solid-phase antigen is applied pointwise, dried, the strip is placed in physiological saline containing 20% tween-20. After that, a strip is immersed in a solution of hyperimmune serum, while an analyzed sample is introduced into this solution (a control strip is immersed in a solution that does not contain T-2 mycotoxin), competitive binding is carried out for 20 minutes. After that, the strip is again washed with saline with tween-20. Then the strip is incubated in a solution of anti-enzyme immunoassay conjugate for 20 minutes. After washing, the strip is transferred to a solution of a substrate-indicator mixture. Results are taken into account visually after 10 minutes. The absence of a colored product of peroxidation indicates the presence of T-2 mycotoxin in the analyzed sample.

Claims

An enzyme-linked immunosorbent detection method for T-2 mycotoxin in liquid samples, which involves the immobilization of a solid-phase antigen on the surface of a solid phase, competitive binding of antibodies against T-2 mycotoxin to a solid-phase antigen, the introduction of an enzyme label, the evaluation of the results using a substrate-indicator mixture, characterized in that as a solid-phase antigen, a conjugate of mycotoxin T-2 with plague microbe F1 antigen is used, and rabbit hyperimmune serum is used at the stage of competitive binding.