RU2411943C2 - PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER - Google Patents
PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER Download PDFInfo
- Publication number
- RU2411943C2 RU2411943C2 RU2009113808/15A RU2009113808A RU2411943C2 RU 2411943 C2 RU2411943 C2 RU 2411943C2 RU 2009113808/15 A RU2009113808/15 A RU 2009113808/15A RU 2009113808 A RU2009113808 A RU 2009113808A RU 2411943 C2 RU2411943 C2 RU 2411943C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriochlorin
- methyl ester
- ethoxycycloimide
- photosensitizer
- derivative
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к медицине, а более конкретно - к фотосенсибилизаторам (ФС) и способам фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей с их использованием.The present invention relates to medicine, and more specifically to photosensitizers (PS) and methods of photodynamic therapy (PDT) of tumors using them.
Метод ФДТ основан на применении фотосенсибилизаторов, которые обладают способностью селективно накапливаться в опухоли и при последующем световом облучении патологического участка катализировать образование цитотоксических агентов, главным образом, синглетного кислорода.The PDT method is based on the use of photosensitizers, which have the ability to selectively accumulate in tumors and, upon subsequent light irradiation of a pathological site, catalyze the formation of cytotoxic agents, mainly singlet oxygen.
Для повышения эффективности ФДТ опухолей больших размеров необходимы фотосенсибилизаторы с интенсивным поглощением в спектральной области "окна прозрачности биологической ткани" - 710-850 нм. Однако при ФДТ пигментных опухолей (например, меланомы) с использованием фотосенсибилизаторов, длина волны поглощения которых меньше 780 нм, высокое поглощение меланином света в этой спектральной области может превысить поглощение света фотосенсибилизатором. Это приведет к тому, что свет будет поглощаться преимущественно меланином, вызывая разогрев клеток меланомы, а доля энергии, поглощенная молекулами фотосенсибилизатора, окажется недостаточной для эффективной фотодинамической реакции. Если же увеличить дозу вводимого фотосенсибилизатора для повышения его поглощения, то суммарное поглощение фотосенсибилизатора и меланина станет настолько высоким, что фотодинамическому воздействию будет подвергнут лишь поверхностный слой опухоли, тогда как более глубокие слои меланомы подвергаться этому воздействию не будут, особенно при значительных размерах опухоли. Такое воздействие не только не приведет к разрушению опухоли, но, наоборот, может инициировать ее дальнейший рост. Поэтому для эффективной фотодинамической терапии меланомы и других пигментных опухолей необходимо использовать фотосенсибилизаторы, длина волны поглощения которых превышает 780 нм.To increase the efficiency of PDT of large tumors, photosensitizers with intensive absorption in the spectral region of the “biological tissue transparency window” of 710-850 nm are needed. However, with PDT of pigmented tumors (for example, melanoma) using photosensitizers, the absorption wavelength of which is less than 780 nm, the high absorption of light by melanin in this spectral region can exceed the absorption of light by a photosensitizer. This will lead to the fact that light will be absorbed mainly by melanin, causing heating of melanoma cells, and the fraction of energy absorbed by the photosensitizer molecules will be insufficient for an effective photodynamic reaction. If the dose of the introduced photosensitizer is increased to increase its absorption, the total absorption of the photosensitizer and melanin will become so high that only the surface layer of the tumor will be subjected to photodynamic effects, while the deeper layers of melanoma will not be exposed to this, especially with significant tumor sizes. Such an effect not only does not lead to the destruction of the tumor, but, on the contrary, can initiate its further growth. Therefore, for effective photodynamic therapy of melanoma and other pigmented tumors, it is necessary to use photosensitizers whose absorption wavelength exceeds 780 nm.
Известен фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе производного бактериохлорина p-метилового эфира оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина p C35H40N6O6. Известен также способ ФДТ, включающий системное введение этого фотосенсибилизатора с последующим облучением патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм через 0,15-0,6 часа после введения фотосенсибилизатора [Меерович И.Г., Грин М.А., Меерович Г.А., Ципровский А.Г., Масс О.А., Журов А.В., Барканова С. В., Борисова Л.М., Оборотова Н.А., Лощенов В.Б., Барышников А.Ю., Миронов А.Ф. Новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона на основе производных бактериохлорина p: предварительные результаты изучения in vivo. (2006) Российский Биотерапевтический Журнал, т.5, №2, с.73-76]. Вышеуказанные фотосенсибилизатор и способ фотодинамической терапии являются ближайшими аналогами настоящего изобретения.A photosensitizer is known, which is a nanostructured aqueous dispersion based on a bacteriochlorin derivative of p-methyl ester of N-methoxycycloimide bacteriochlorin oxime p C 35 H 40 N 6 O 6 . There is also a known PDT method, including the systemic administration of this photosensitizer, followed by irradiation of the pathological area with optical radiation in the spectral range of 790-810 nm 0.15-0.6 hours after administration of the photosensitizer [Meerovich IG, Green MA, Meerovich G.A., Tsiprovsky A.G., Mass O.A., Zhurov A.V., Barkanova S.V., Borisova L.M., Oborotova N.A., Loshchenov V.B., Baryshnikov A. Yu., Mironov A.F. New near-infrared photosensitizers based on derivatives of bacteriochlorin p: preliminary in vivo studies. (2006) Russian Biotherapeutic Journal, t.5, No. 2, p. 73-76]. The above photosensitizer and method of photodynamic therapy are the closest analogues of the present invention.
Недостатки известных фотосенсибилизатора и способа ФДТ связаны с тем, что, во-первых, концентрация С35Н40Н6О6 в опухоли достаточно быстро (менее чем за 1 час) снижается, что делает необходимым проведение сеанса ФДТ в достаточно короткое время (через 0,15-0,6 часа после введения), когда концентрация еще достаточно высока. Необходимость проведения ФДТ в таком коротком временном интервале создает определенные трудности, например, при лечении множественных опухолей. Во-вторых, в этом интервале времени низка селективность накопления C35H40N6O6 в опухоли по отношению к нормальным тканям (индекс селективности не превышает 1.3), то есть концентрация C35H40N6O6 высокая и в опухоли, и в прилегающих нормальных тканях. Проведение ФДТ в этом интервале времени может оказать нежелательное разрушающее воздействие на прилегающие к опухоли нормальные ткани.The disadvantages of the known photosensitizer and PDT method are due to the fact that, firstly, the concentration of C 35 H 40 H 6 O 6 in the tumor decreases quite quickly (in less than 1 hour), which makes it necessary to conduct a PDT session in a fairly short time (after 0.15-0.6 hours after administration), when the concentration is still high enough. The need for PDT in such a short time interval creates certain difficulties, for example, in the treatment of multiple tumors. Secondly, in this time interval, the selectivity of accumulation of C 35 H 40 N 6 O 6 in the tumor in relation to normal tissues is low (the selectivity index does not exceed 1.3), that is, the concentration of C 35 H 40 N 6 O 6 is also high in the tumor, and in adjacent normal tissues. Conducting PDT in this time interval can have an undesirable destructive effect on normal tissues adjacent to the tumor.
Известен способ получения производного бактериохлорина p-метилового эфира оксима N-метоксициклоимида бактериохлорина р C35H40N6O6 [Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G. J. Porphyrins Phthalocyanines. 2002, 6, 358], представляющий собой двухстадийный процесс, на первой стадии которого получают оксим N-гидроксициклоимида бактериохлорина p при обработке бактериопурпурина раствором сильного нуклеофила в пиридине, в качестве которого используют хлоргидрат гидроксиламина. Вторая стадия включает обработку полученного оксима N-гидроксициклоимида бактериохлорина р диазометаном с получением метилового эфира оксима N-метоксициклоимида.A known method of obtaining a derivative of bacteriochlorin p-methyl ester of oxime N-methoxycycloimide bacteriochlorin p C 35 H 40 N 6 O 6 [Mironov AF, Grin MA, Tsiprovskiy AGJ Porphyrins Phthalocyanines. 2002, 6, 358], which is a two-stage process, in the first stage of which the bacteriopurpurine N-hydroxycycloimide p oxide is obtained by treating bacteriopurpurine with a solution of a strong nucleophile in pyridine, using hydroxylamine hydrochloride as the solution. The second step involves treating the resulting bacteriochlorin r-diazomethane N-hydroxycycloimide oxime with the formation of N-methoxycycloimide oxime methyl ester.
Известный способ получения производного бактериохлорина р является ближайшим аналогом заявляемого способа.A known method of obtaining a derivative of bacteriochlorin p is the closest analogue of the proposed method.
К недостаткам известного способа следует отнести его технологическую сложность, связанную с двухстадийностью технологического процесса и необходимостью контроля каждой из реакций, последующих очисток полупродуктов и конечных продуктов процесса, а также недостаточно высокий общий выход. Использование диазометана, являющегося газообразным, высокотоксичным и взрывоопасным веществом, существенно ограничивает возможность промышленной реализации данной технологической схемы и делает ее потенциально опасной.The disadvantages of this method include its technological complexity associated with the two-stage process and the need to control each of the reactions, subsequent purifications of intermediates and final products of the process, as well as not enough high overall yield. The use of diazomethane, which is a gaseous, highly toxic and explosive substance, significantly limits the possibility of industrial implementation of this technological scheme and makes it potentially dangerous.
В настоящем изобретении решается задача обеспечения высокой эффективности и избирательности действия фотодинамической терапии опухолей большого размера и пигментных опухолей, включая меланому, путем создания фотосенсибилизатора на основе производного бактериохлорина р, способа получения этого производного бактериохлорина р и способа проведения фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора.The present invention solves the problem of ensuring high efficiency and selectivity of the photodynamic therapy of large tumors and pigmented tumors, including melanoma, by creating a photosensitizer based on a bacteriochlorin p derivative, a method for producing this bacteriochlorin p derivative, and a method for conducting photodynamic therapy using this photosensitizer.
Дополнительно решается задача упрощения и повышения безопасности способа получения субстанции фотосенсибилизатора.Additionally, the task of simplifying and improving the safety of the method of obtaining the substance of the photosensitizer is additionally solved.
Задача решается тем, что в качестве фотосенсибилизатора предлагается наноструктурированная водная дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р C38H46N6O6 со структурной формулой:The problem is solved in that as a photosensitizer, a nanostructured aqueous dispersion based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p C 38 H 46 N 6 O 6 with the structural formula is proposed:
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р представляет собой липосомальную дисперсию на основе лецитина и холестерина, а метиловый эфир O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р включен в липидный бислой липосом.The problem is also solved by the fact that the nanostructured aqueous dispersion of methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is a liposomal dispersion based on lecithin and cholesterol, and the methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is included in the lipid bilayer liposome.
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р представляет собой мицеллярную дисперсию с поверхностно-активным веществом - блок-сополимером оксиэтилена и оксипропилена.The problem is also solved by the fact that the nanostructured aqueous dispersion of the dispersion based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is a micellar dispersion with a surfactant - a block copolymer of hydroxyethylene and oxypropylene.
Задача решается также тем, что наноструктурированная водная дисперсия дисперсия на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p представляет собой Кремофорную наноэмульсию.The problem is also solved by the fact that the nanostructured aqueous dispersion of the dispersion based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is a Cremophor nanoemulsion.
Задача решается тем, что в способе получения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, включающем воздействие сильного нуклеофила на производное бактериохлорофилла а, в качестве производного бактериохлорофилла а используют метиловый эфир бактериопурпурина в основном растворителе (пиридине или другом органическом растворителе с добавлением органического основания для нейтрализации соляной кислоты), в качестве сильного нуклеофила используют хлоргидрат этоксиамина, взятый в 1,5-кратном избытке по отношению к метиловому эфиру бактериопурпурина, реакцию проводят при комнатной температуре в течение 72-80 часов и завершают после смещения спектрального максимума поглощения реакционной смеси до 802 нм.The problem is solved in that in the method for producing methyl ester of O-ethyloxy N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p, comprising the action of a strong nucleophile on a derivative of bacteriochlorophyll a, bacteriochlorpurine methyl ester in a basic solvent (pyridine or another organic solvent with the addition of a base) is used as a bacteriochlorophyll a derivative to neutralize hydrochloric acid), ethoxyamine hydrochloride taken in 1.5-fold excess relative to etilovomu bakteriopurpurina ester, the reaction is carried out at room temperature for 72-80 hours and is complete after the offset spectral maximum absorption of the reaction mixture to 802 nm.
Задача решается тем, что в способе фотодинамической терапии, включающем системное введение фотосенсибилизатора и облучение патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм, в качестве фотосенсибилизатора используют наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, а облучение осуществляют через 0,7-5 часов после введения.The problem is solved in that in the method of photodynamic therapy, which includes systemic administration of a photosensitizer and irradiation of the pathological area with optical radiation in the spectral range of 790-810 nm, a nanostructured aqueous dispersion of methyl ethyl ester of N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is used as a photosensitizer, carried out 0.7-5 hours after administration.
Предлагаемый способ получения субстанции метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р осуществляют одностадийной реакцией по нижеприведенной схеме, обрабатывая метиловый эфир бактериопурпурина 1,5-кратным избытком хлоргидрата этоксиамина.The proposed method for the preparation of the substance of methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is carried out by a one-step reaction according to the scheme below, by treating bacteriopurpurine methyl ester with a 1.5-fold excess of ethoxyamine hydrochloride.
Реакцию проводят в течение 72-80 часов при спектрофотометрическом контроле, об окончании реакции судят по смещению спектрального максимума поглощения реакционной смеси до 802 нм.The reaction is carried out for 72-80 hours with spectrophotometric control, the end of the reaction is judged by the shift of the absorption spectral maximum of the reaction mixture to 802 nm.
Строение полученного соединения 2 доказано электронной, ИК-, 1Н ЯМР-спектроскопией, а также подтверждено данными масс-спектрометрии (MALDI).The structure of the obtained
Для оценки динамики, уровня и селективности накопления метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в тканях используют группу из 7 мышей F1 с внутримышечно перевитой опухолью Эрлиха. Концентрацию метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли оценивают чрескожно методом спектроскопии диффузного рассеяния с использованием спектроанализатора "ЛЭСА-01-Биоспек" по пропорциональному ей уровню интегрального поглощения в ткани. Концентрацию метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в нормальной ткани измеряют в контралатеральной зоне левой лапы животных. На основе полученных данных рассчитывают значения индекса селективности накопления метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в опухоли по отношению к нормальной ткани.To assess the dynamics, level and selectivity of the accumulation of methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in tissues, a group of 7 mice F 1 with an intramuscularly inoculated Ehrlich tumor is used. The concentration of methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in a tumor is assessed percutaneously by diffuse scattering spectroscopy using a LESA-01-Biospek analyzer using a proportional level of integral absorption in the tissue. The concentration of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in normal tissue is measured in the contralateral zone of the left paw of animals. Based on the obtained data, the values of the selectivity index of the accumulation of methyl ester of O-ethylloxim N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in the tumor relative to normal tissue are calculated.
Предлагаемый способ фотодинамической терапии осуществляют следующим образом: внутривенно вводят фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р C38H46N6O6, через определенное время в интервале 0,7-5 часов после введения производят облучение патологического участка оптическим излучением в спектральном диапазоне 790-810 нм.The proposed method of photodynamic therapy is carried out as follows: a photosensitizer is introduced intravenously, which is a nanostructured aqueous dispersion of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p C 38 H 46 N 6 O 6 , after a certain time in the range of 0.7-5 hours after the introduction irradiates the pathological area with optical radiation in the spectral range of 790-810 nm.
Эффективность ФДТ оценивают по динамике роста объема опухолей, значения которого определяют по формулеThe effectiveness of PDT is evaluated by the dynamics of the growth of the volume of tumors, the values of which are determined by the formula
Vоп=π×D1×D2×D3/6,V op = π × D 1 × D 2 × D 3/6,
где D1, D2 и D3 - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли.where D 1 , D 2 and D 3 are three mutually perpendicular diameters of the tumor.
Эффективность ФДТ оценивают также по значениям индексов торможения роста опухоли (ТРО), рассчитанным по значениям объема опухоли в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, и контрольной группе.The effectiveness of PDT is also evaluated by the values of the tumor growth inhibition index (SRW) calculated from the values of the tumor volume in the experimental group subjected to PDT and the control group.
ТРО={(Vоп(контроль)-Vоп(опыт)/Vоп(контроль))}×100%.TPO = {(V op (control) -V op (experience) / V op (control) )} × 100%.
Эффективность ФДТ оценивают также по значениям индекса увеличения продолжительности жизни животных (УПЖ) в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, по отношению к контрольной группе.The effectiveness of PDT is also evaluated by the values of the index of the increase in the life expectancy of animals (VLC) in the experimental group exposed to PDT, relative to the control group.
УПЖ={(<L>(контроль)-<L>(опыт))/<L>(контроль))}×100%,UPZ = {(<L> (control) - <L> (experience) ) / <L> (control) )} × 100%,
где <L>(опыт) и <L>(контроль) - средняя продолжительность жизни в опытной (после ФДТ) и контрольной группах.where <L> (experience) and <L> (control) is the average life expectancy in the experimental (after PDT) and control groups.
Сущность изобретения поясняется Фиг.1-5.The invention is illustrated Fig.1-5.
На Фиг.1 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде липосомальной дисперсии.Figure 1 shows the dependences of the integral absorption of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in an Ehrlich tumor (1) and normal tissue (2) proportional to its concentration after intravenous administration in the form of a liposome dispersion.
На Фиг.2 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде мицеллярной дисперсии с поверхностно-активным веществом - блок-сополимером оксиэтилена и оксипропилена.Figure 2 shows the dependence of the integral absorption of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in an Ehrlich tumor (1) and normal tissue (2), proportional to its concentration, after intravenous administration in the form of a micellar dispersion with a surfactant - block a copolymer of oxyethylene and oxypropylene.
На Фиг.3 приведены зависимости интегрального поглощения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2), пропорционального его концентрации, после внутривенного введения в виде Кремофорной наноэмульсии.Figure 3 shows the dependences of the integral absorption of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in an Ehrlich tumor (1) and normal tissue (2) proportional to its concentration after intravenous administration in the form of a Cremophor nanoemulsion.
Из приведенных на Фиг.1-3 результатов следует, что высокие значения концентрации метилового эфира этоксиоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в опухоли достигаются в интервале времени 0,7-5 часов после введения (Фиг.1-3).From the results shown in Fig.1-3, it follows that high concentrations of methyl ester of ethoxyoxy N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in the tumor are achieved in the time interval of 0.7-5 hours after administration (Fig.1-3).
На Фиг.4 приведены динамика роста (А) меланомы В 16 в контрольной (1) и опытной (2) группах мышей BDF1 после проведения ФДТ с фотосенсибилизатором на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р и индекс торможения роста опухолей (Б) (доза субстанции 1 мг/кг массы тела животного, плотность мощности 220 мВт/см2, время облучения 20 мин).Figure 4 shows the growth dynamics of (A) melanoma B 16 in the control (1) and experimental (2) groups of BDF 1 mice after PDT with photosensitizer based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p and tumor growth inhibition index ( B) (the dose of the substance is 1 mg / kg of the animal’s body weight, the power density is 220 mW / cm 2 , the irradiation time is 20 minutes).
На Фиг.5 приведена динамика выживаемости мышей BDF1 с меланомой В 16 в контрольной (1) и опытной (2) группах после ФДТ с фотосенсибилизатором на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p.Figure 5 shows the dynamics of survival of BDF 1 mice with melanoma B 16 in the control (1) and experimental (2) groups after PDT with a photosensitizer based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p.
Ниже приведены конкретные примеры получения метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, фотосенсибилизатора на основе липосомальной, мицеллярной и Кремофорной дисперсий этой субстанции и способа фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора.The following are specific examples of the preparation of the methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p, a photosensitizer based on liposomal, micellar and Cremophor dispersions of this substance and a method of photodynamic therapy using this photosensitizer.
ПРИМЕР 1. Получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.EXAMPLE 1. Obtaining methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p.
К раствору 60 мг (0,1 ммоль) метилового эфира бактериопурпурина в 20 мл пиридина добавляют 27 мг (0,28 ммоль) хлоргидрата этоксиамина, растворенного в 10 мл пиридина. Реакцию проводят при комнатной температуре. Ход реакции контролируют спектрофотометрически, отбирая каждые 30 минут по 0,2 мл реакционной смеси, которую экстрагируют хлороформом, промывают водой и высушивают сульфатом натрия. Полноту протекания реакции контролируют по смещению основной полосы поглощения Q в электронном спектре продукта до 802 нм. Время реакции 72 ч. Продукт очищают с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (12:1). Выход O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р 19,4 мг (63%).To a solution of 60 mg (0.1 mmol) of bacteriopurpurin methyl ester in 20 ml of pyridine, 27 mg (0.28 mmol) of ethoxyamine hydrochloride dissolved in 10 ml of pyridine are added. The reaction is carried out at room temperature. The progress of the reaction is monitored spectrophotometrically, taking every 30 minutes 0.2 ml of the reaction mixture, which is extracted with chloroform, washed with water and dried with sodium sulfate. The completeness of the reaction is controlled by the shift of the main absorption band Q in the electronic spectrum of the product up to 802 nm. The reaction time is 72 hours. The product is purified using preparative TLC on silica gel in the chloroform-methanol system (12: 1). The yield of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p 19.4 mg (63%).
Электронный спектр в хлороформе, λmax, нм (ε/103): 368.5, 420.5, 542.5, 802 (35.4).Electronic spectrum in chloroform, λ max , nm (ε / 10 3 ): 368.5, 420.5, 542.5, 802 (35.4).
Масс-спектр (MALDI), m/z: 668.8 (M+).Mass spectrum (MALDI), m / z: 668.8 (M + ).
ИК (KBr, ν, см-1): 1737, 1699, 1668, 1621, 1521, 1400IR (KBr, ν, cm -1 ): 1737, 1699, 1668, 1621, 1521, 1400
1Н ЯМР (CDCl3, δ, м.д.): 8.61 (Н, с, 5-Н), 8.55 (Н, с, 10-Н), 8.37 (Н, с, 20-Н), 5.18 (Н, д, 17-Н), 4.52 (4Н, м, O-CH2-СН3), 4.20 (2H, m, 7-H, 18-H), 4.02 (Н, m, 8-H), 3.62 (3Н, с, 12-СН3), 3.57 (3Н, m, 17-CH2), 3.27 (3Н, с, 2-СН3), 2.72 (3Н, с, 32-СН3), 2.38 (4Н, m, 171-CH2, 172-СН2), 1.96 (2Н, m, 8-CH2), 1.79 (3Н, m, 7-СН3), 1.62 (9Н, m, 18-CH3, O-СН2-CH3), 1.10 (3H, t, 82-CH3), -0.035 (1H, s, NH), -0.25 (1H, s, NH). 1 H NMR (CDCl 3 , δ, ppm): 8.61 (H, s, 5-H), 8.55 (H, s, 10-H), 8.37 (H, s, 20-H), 5.18 ( N, d, 17-H), 4.52 (4H, m, O-CH2-CH3), 4.20 (2H, m, 7-H, 18-H), 4.02 (H, m, 8-H), 3.62 ( 3H, s, 12-CH 3 ), 3.57 (3H, m, 17-CH 2 ), 3.27 (3H, s, 2-CH 3 ), 2.72 (3H, s, 3 2 -CH3), 2.38 (4H, m, 17 1 -CH2, 17 2 -CH2), 1.96 (2H, m, 8-CH2), 1.79 (3H, m, 7-CH3), 1.62 (9H, m, 18-CH3, O-CH2-CH3 ), 1.10 (3H, t, 8 2 -CH3), -0.035 (1H, s, NH), -0.25 (1H, s, NH).
ПРИМЕР 2. Получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.EXAMPLE 2. Obtaining methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p.
К раствору 60 мг (0,1 ммоль) метилового эфира бактериопурпурина в 25 мл хлористого метилена добавляют 29 мг (0,30 ммоль) хлоргидрата этоксиамина, растворенного в 10 мл хлористого метилена, и 20 мкл триэтиламина. Реакцию проводят при комнатной температуре. Ход реакции контролируют спектрофотометрически, отбирая каждые 20 минут по 0,2 мл реакционной смеси. Полноту протекания реакции контролируют по смещению основной полосы поглощения Q в электронном спектре до 802 нм. Время реакции 80 ч. Продукт очищают с помощью препаративной ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол (12:1). Выход метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p 27 мг (49%).To a solution of 60 mg (0.1 mmol) of bacteriopurpurine methyl ester in 25 ml of methylene chloride, 29 mg (0.30 mmol) of ethoxyamine hydrochloride dissolved in 10 ml of methylene chloride and 20 μl of triethylamine are added. The reaction is carried out at room temperature. The progress of the reaction is monitored spectrophotometrically, taking 0.2 ml of the reaction mixture every 20 minutes. The completeness of the reaction is controlled by the shift of the main absorption band Q in the electronic spectrum up to 802 nm. The reaction time is 80 hours. The product is purified using preparative TLC on silica gel in the chloroform-methanol system (12: 1). The yield of methyl ester of O-ethylloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p 27 mg (49%).
ПРИМЕР 3. Получение липосомальной дисперсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.EXAMPLE 3. Obtaining a liposomal dispersion of methyl ester of O-ethyl-oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p.
Смешивают 676 мг фосфатидилхолина (лецитина яичного чистотой >98%) и 81 мг холестерина, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 мл и растворяют в 50 мл хлороформа. К раствору добавляют 5,4 мг метоксиполи-(2000)-этиленгликольфосфатидилэтаноламина в 5 мл хлороформа и перемешивают 10 минут. 5 мг C38H46N6O6 растворяют в 10 мл хлороформа, добавляют к реакционной смеси и перемешивают, после чего упаривают на роторном испарителе до полного испарения хлороформа с получением однородной аморфной пленки. В колбу добавляют 10 мл дистиллированной воды и ресуспендируют пленку энергичным встряхиванием до получения однородной дисперсии. Дисперсию переносят в стеклянный флакон и подвергают ультразвуковой обработке в течение 30 мин. Для унификации и уменьшения размеров везикул полученную липосомальной дисперсию экструдируют.676 mg of phosphatidylcholine (egg lecithin> 98% purity) are mixed with 81 mg of cholesterol, transferred to a round bottom flask with a capacity of 250 ml and dissolved in 50 ml of chloroform. To the solution was added 5.4 mg of methoxypoly- (2000) -ethylene glycolphosphatidylethanolamine in 5 ml of chloroform and stirred for 10 minutes. 5 mg of C 38 H 46 N 6 O 6 was dissolved in 10 ml of chloroform, added to the reaction mixture and stirred, after which it was evaporated on a rotary evaporator until the chloroform was completely evaporated to obtain a uniform amorphous film. 10 ml of distilled water is added to the flask and the film is resuspended by vigorous shaking until a uniform dispersion is obtained. The dispersion is transferred to a glass vial and sonicated for 30 minutes. To unify and reduce the size of the vesicles, the resulting liposome dispersion is extruded.
ПРИМЕР 4. Получение мицеллярной дисперсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р с использованием поверхностно активного вещества - блок-сополимера оксиэтилена и оксипропилена «Эмуксол-268».EXAMPLE 4. Obtaining a micellar dispersion of methyl ester of O-ethyliloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p using a surfactant - block copolymer of oxyethylene and hydroxypropylene "Emuxol-268".
Растворяют 5 мг метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 6 мл хлороформа. К 5 мл 4%-ного (масс.) раствора «Эмуксола-268» в дистиллированной воде с температурой 41-43°С при перемешивании с барботированием азотом прибавляют приготовленный раствор метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в хлороформе порциями по 1 мл, добавляя каждую последующую порцию после полного испарения хлороформа из предыдущей. После добавления полного объема раствора субстанции в хлороформе и удаления остатков хлороформа током азота дисперсию охлаждают, доводят дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через мембранный фильтр "Millipore" с размером пор 0,22 мкм.5 mg of N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p oxime methyl ester are dissolved in 6 ml of chloroform. To 5 ml of a 4% (mass.) Solution of Emuxol-268 in distilled water with a temperature of 41-43 ° C, while preparing with nitrogen sparging, the prepared solution of methyl ester of N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p oxime in chloroform is added in 1 ml portions, adding each subsequent portion after complete evaporation of chloroform from the previous one. After adding the full volume of a solution of the substance in chloroform and removing the chloroform residues with a nitrogen stream, the dispersion is cooled, adjusted to the original volume with distilled water and filtered through a 0.22 μm Millipore membrane filter.
ПРИМЕР 5. Получение наноэмульсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p с использованием Кремофора.EXAMPLE 5. Obtaining a nano-emulsion of methyl ester of O-ethylloxy N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p using Cremophor.
Растворяют 5 мг метилового эфира этоксиоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 6 мл хлороформа. К 5 мл 4%-ного (масс.) раствора Кремофора в дистиллированной воде с температурой 41-43°С при перемешивании с барботированием азотом прибавляют приготовленный раствор метилового эфира оксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в хлороформе порциями по 1 мл, добавляя каждую последующую порцию после полного испарения хлороформа из предыдущей. После добавления полного объема раствора субстанции в хлороформе и удаления остатков хлороформа током азота наноэмульсию охлаждают, доводят дистиллированной водой до первоначального объема и фильтруют через мембранный фильтр "Millipore" с размером пор 0,22 мкм.Dissolve 5 mg of methyl ester of ethoxyoxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p in 6 ml of chloroform. To 5 ml of a 4% (mass.) Solution of Cremophor in distilled water with a temperature of 41-43 ° C, while stirring with a sparge of nitrogen, the prepared solution of methyl ester of N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p oxime in chloroform is added in 1 ml portions, adding each subsequent portion after complete evaporation of chloroform from the previous one. After adding the full volume of a solution of the substance in chloroform and removing the chloroform residues by a stream of nitrogen, the nanoemulsion is cooled, adjusted to the original volume with distilled water and filtered through a 0.22 μm Millipore membrane filter.
ПРИМЕР 6. Фотодинамическая терапия меланомы В 16 с использованием фотосенсибилизатора на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р.EXAMPLE 6. Photodynamic therapy of melanoma B 16 using a photosensitizer based on methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p.
Фотодинамическую терапию с использованием фотосенсибилизатора на основе наноэмульсии метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р в 4%-ном Кремофоре проводят на группе из 7 мышей BDF1 с меланомой В16, перевитой подкожно на наружную поверхность бедра задней лапы. Вторая группа из 8 мышей - контрольная. Фотосенсибилизатор вводят животным в хвостовую вену однократно на 7 день роста опухоли в дозе 1 мг метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р на килограмм массы тела животного. Через 1 час после введения препарата сенсибилизированные опухоли облучают с помощью терапевтического лазерного аппарата для фотодинамической терапии ЛФД-800/01-Биоспек с длиной волны 797 нм, плотностью мощности излучения 220 мВт/см2, плотностью дозы 120 Дж/см2. Результаты исследований приведены на Фиг.4, 5. Из них следует, что в опытной группе, подвергавшейся ФДТ, среднее по группе значение объема опухоли увеличивается очень медленно по отношению к объему опухоли контрольной группы. Наблюдается выраженный некроз опухоли, прилегающие к опухоли здоровые ткани практически не повреждены. Индекс торможения роста опухоли (ТРО) достигает 91%, индекс увеличения продолжительности жизни (УПЖ) превышает 61%.Photodynamic therapy using a photosensitizer based on an O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p methyl ester nanoemulsion in 4% Cremophor is performed on a group of 7 BDF 1 mice with B16 melanoma transplanted subcutaneously onto the outer surface of the hind paw thigh. The second group of 8 mice is the control. A photosensitizer is injected into the tail vein of animals once on the 7th day of tumor growth at a dose of 1 mg of methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p per kilogram of animal body weight. 1 hour after drug administration, sensitized tumors are irradiated with the LFD-800/01-Biospek therapeutic laser apparatus for photodynamic therapy with a wavelength of 797 nm, a radiation power density of 220 mW / cm 2 , and a dose density of 120 J / cm 2 . The research results are shown in Figures 4, 5. It follows from them that in the experimental group exposed to PDT, the average value of the tumor volume in the group increases very slowly relative to the volume of the tumor in the control group. Marked tumor necrosis is observed, healthy tissues adjacent to the tumor are practically not damaged. The index of inhibition of tumor growth (SRW) reaches 91%, the index of increase in life expectancy (VL) exceeds 61%.
Таким образом, заявляемые фотосенсибилизатор, представляющий собой наноструктурированную водную дисперсию на основе метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р, полученного по заявляемому способу, и способ фотодинамической терапии с использованием этого фотосенсибилизатора обеспечивают эффективное лечение опухолей больших размеров, в том числе меланомы, и высокую избирательность терапевтического действия за счет селективного накопления фотосенсибилизатора в опухоли. При этом получение метилового эфира O-этилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина р осуществляется одностадийным способом, в котором не используются газообразные, высокотоксичные и взрывоопасные реагенты, что значительно упрощает технологию получения этой субстанции в промышленных условиях и делает ее безопасной.Thus, the inventive photosensitizer, which is a nanostructured aqueous dispersion based on methyl ester of O-ethyloxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p obtained by the present method, and the method of photodynamic therapy using this photosensitizer provide effective treatment of large tumors, including melanoma, and high selectivity of the therapeutic effect due to the selective accumulation of the photosensitizer in the tumor. At the same time, the production of methyl ester of O-ethyl oxime N-ethoxycycloimide bacteriochlorin p is carried out in a one-step method, which does not use gaseous, highly toxic and explosive reagents, which greatly simplifies the technology for producing this substance under industrial conditions and makes it safe.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009113808/15A RU2411943C2 (en) | 2009-04-14 | 2009-04-14 | PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009113808/15A RU2411943C2 (en) | 2009-04-14 | 2009-04-14 | PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009113808A RU2009113808A (en) | 2010-10-20 |
| RU2411943C2 true RU2411943C2 (en) | 2011-02-20 |
Family
ID=44023657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009113808/15A RU2411943C2 (en) | 2009-04-14 | 2009-04-14 | PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2411943C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2521327C1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России) | Preparation for photodynamic therapy and method for photodynamic therapy of cancer with using it |
| RU2720806C2 (en) * | 2019-09-09 | 2020-05-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Photosensitiser of bacteriochlorine row for photodynamic therapy and method for its preparation |
| RU2739193C1 (en) * | 2020-03-24 | 2020-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА-Российский технологический университет" (РТУ МИРЭА) | Method of photodynamic therapy of inoculated tumour of b-16 melanoma of mice with chlorine photosensitizer with psma-ligand |
| RU2771237C1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-04-28 | федеральное государственное автоносное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» | Sensitizer for photodynamic destruction of tumor cells |
-
2009
- 2009-04-14 RU RU2009113808/15A patent/RU2411943C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МЕЕРОВИЧ И.Г. и др. Новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона на основе производных бактериохлорина p: предварительные результаты изучения in vivo. Российский биотерапевтический журнал, т.5, №2, 2006, с.73-76. MIRONOV A.F., и др. «New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring». J. Porphyrins Phthalocyanines., №7, 2003, с.725-730. SHARONOV G.V. et al «Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: Photodynamic properties and cellular and tissue distribution». Free Radical Biology and Medicine, Volume 40, Issue 3, 1 February 2006, pp.407-419. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2521327C1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России) | Preparation for photodynamic therapy and method for photodynamic therapy of cancer with using it |
| RU2720806C2 (en) * | 2019-09-09 | 2020-05-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Photosensitiser of bacteriochlorine row for photodynamic therapy and method for its preparation |
| RU2739193C1 (en) * | 2020-03-24 | 2020-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА-Российский технологический университет" (РТУ МИРЭА) | Method of photodynamic therapy of inoculated tumour of b-16 melanoma of mice with chlorine photosensitizer with psma-ligand |
| RU2771237C1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-04-28 | федеральное государственное автоносное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» | Sensitizer for photodynamic destruction of tumor cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009113808A (en) | 2010-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5330741A (en) | Long-wavelength water soluble chlorin photosensitizers useful for photodynamic therapy and diagnosis of tumors | |
| JP4976618B2 (en) | Long wavelength absorbing bacteriochlorin alkyl ether analogues | |
| RU2411943C2 (en) | PHOTOSENSITISER BASED ON BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE, METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLORIN p DERIVATIVE AND METHOD OF PHOTODYNAMIC THERAPY OF CANCER WITH APPLICATION OF SAID PHOTOSENSITISER | |
| CN108478794B (en) | Photosensitizer-chemotherapeutic drug photochemical integrated small molecule prodrug and construction of self-assembled nanoparticles thereof | |
| CA2873259A1 (en) | Conjugate of a photosensitiser and chitosan and uses thereof | |
| CN108658995B (en) | Zinc phthalocyanine modified by dipyridyl disulfide and preparation method and application thereof | |
| Moussaron et al. | Lipophilic phthalocyanines for their potential interest in photodynamic therapy: synthesis and photo-physical properties | |
| US20150315202A1 (en) | Chlorin derivative useful in photodynamic therapy and diagnosis | |
| KR20110085935A (en) | Chlorin derivatives and unsaturated fatty acids conjugate, a photosensitizer comprising the same, and a composition for treatment of cancer for using in photodynamic therapy comprising the same | |
| Gushchina et al. | Synthesis of amide derivatives of chlorin e6 and investigation of their biological activity | |
| CA2453997A1 (en) | Porphyrin derivatives for photodynamic therapy | |
| US20120323164A1 (en) | Photodynamic therapy with phthalocyanines and radical sources | |
| Zhang et al. | A hypoxia-activatable theranostic agent with intrinsic endoplasmic reticulum affinity and type-I photosensitivity | |
| Faustino et al. | Meso‐Tetraphenylporphyrin Dimer Derivative as a Potential Photosensitizer in Photodynamic Therapy | |
| US11021496B2 (en) | Mesoporous organosilica nanoparticles, production method thereof and uses of same | |
| CN112279862B (en) | Near-infrared porphyrin compound and preparation method and application thereof | |
| WO2010108056A1 (en) | Phthalocyanine salt formulations | |
| WO2006106383A1 (en) | Photosensitizers and mri enhancers | |
| ES2209536T3 (en) | METHOD FOR THE DEMETOXICARBONILATION OF PORPHYRINIC COMPOUNDS SUCH AS FEOFORBIDS. | |
| Wang et al. | Synthesis and evolution of S-Porphin sodium as a potential antitumor agent for photodynamic therapy against breast cancer | |
| RU2521327C1 (en) | Preparation for photodynamic therapy and method for photodynamic therapy of cancer with using it | |
| US20030087947A1 (en) | Novel photosensitizers of 9-hydroxypheophorbide-a derivatives used for photodynamic therapy | |
| RU2259200C1 (en) | Sensitizing agent for photodynamic disruption of malignant neoplasm cells and pharmaceutical composition for its using | |
| CN111825685B (en) | Hematoporphyrin monofluoroalkyl diether and fluorophenyl alkyl diether derivatives and application thereof in medicine field | |
| CN109053744A (en) | Novel porphines bis ether salt compounds and the preparation method and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170415 |